TY  - THES
A1  - Mekala, SubbaRao
T1  - Generation of cardiomyocytes from vessel wall-resident stem cells
T1  - Erzeugung von Kardiomyozyten aus Gefäßwand-residenten Stammzellen
N2  - Myocardial infarction (MI) is a major cause of health problems and is among the leading deadly ending diseases. Accordingly, regenerating functional myocardial tissue and/or cardiac repair by stem cells is one of the most desired aims worldwide. Indeed, the human heart serves as an ideal target for regenerative intervention, because the capacity of the adult myocardium to restore itself after injury or infarct is limited. Thus, identifying new sources of tissue resident adult stem or progenitor cells with cardiovascular potential would help to establish more sophisticated therapies in order to either prevent cardiac failure or to achieve a functional repair. Ongoing research worldwide in this field is focusing on a) induced pluripotent stem (iPS) cells, b) embryonic stem (ES) cells and c) adult stem cells (e. g. mesenchymal stem cells) as well as cardiac fibroblasts or myofibroblasts. However, thus far, these efforts did not result in therapeutic strategies that were transferable into the clinical management of MI and heart failure. Hence, identifying endogenous and more cardiac-related sources of stem cells capable of differentiating into mature cardiomyocytes would open promising new therapeutic opportunities. The working hypothesis of this thesis is that the vascular wall serves as a niche for cardiogenic stem cells. In recent years, various groups have identified different types of progenitors or mesenchymal stem cell-like cells in the adventitia and sub-endothelial zone of the adult vessel wall, the so called vessel wall-resident stem cells (VW-SCs). Considering the fact that heart muscle tissue contains blood vessels in very high density, the physiological relevance of VW-SCs for the myocardium can as yet only be assumed. The aim of the present work is to study whether a subset of VW-SCs might have the capacity to differentiate into cardiomyocyte-like cells. This assumption was challenged using adult mouse aorta-derived cells cultivated in different media and treated with selected factors. The presented results reveal the generation of spontaneously beating cardiomyocyte-like cells using specific media conditions without any genetic manipulation. The cells reproducibly started beating at culture days 8-10. Further analyses revealed that in contrast to several publications reporting the Sca-1+ cells as cardiac progenitors the Sca-1- fraction of aortic wall-derived VW-SCs reproducibly delivered beating cells in culture. Similar to mature cardiomyocytes the beating cells developed sarcomeric structures indicated by the typical cross striated staining pattern upon immunofluorescence analysis detecting α-sarcomeric actinin (α-SRA) and electron microscopic analysis. These analyses also showed the formation of sarcoplasmic reticulum which serves as calcium store. Correspondingly, the aortic wall-derived beating cardiomyocyte-like cells (Ao-bCMs) exhibited calcium oscillations. This differentiation seems to be dependent on an inflammatory microenvironment since depletion of VW-SC-derived macrophages by treatment with clodronate liposomes in vitro stopped the generation of Ao bCMs. These locally generated F4/80+ macrophages exhibit high levels of VEGF (vascular endothelial growth factor). To a great majority, VW-SCs were found to be positive for VEGFR-2 and blocking this receptor also stopped the generation VW-SC-derived beating cells in vitro. Furthermore, the treatment of aortic wall-derived cells with the ß-receptor agonist isoproterenol or the antagonist propranolol resulted in a significant increase or decrease of beating frequency. Finally, fluorescently labeled aortic wall-derived cells were implanted into the developing chick embryo heart field where they became positive for α-SRA two days after implantation. The current data strongly suggest that VW-SCs resident in the vascular adventitia deliver both progenitors for an inflammatory microenvironment and beating cells. The present study identifies that the Sca-1- rather than Sca-1+ fraction of mouse aortic wall-derived cells harbors VW-SCs differentiating into cardiomyocyte-like cells and reveals an essential role of VW-SCs-derived inflammatory macrophages and VEGF-signaling in this process. Furthermore, this study demonstrates the cardiogenic capacity of aortic VW-SCs in vivo using a chimeric chick embryonic model.
N2  - Der Myokardinfarkt (MI) ist einer der Hauptgründe für gesundheitliche Probleme und zählt zu einer der am häufigsten tödlich verlaufenden Krankheiten weltweit. Daher ist es nicht verwunderlich, dass die Regeneration von funktionellem Myokardgewebe und/oder die kardiale Reparatur durch Stammzellen eines der weltweit am meisten angestrebten Ziele darstellt. Das adulte menschliche Herz stellt aufgrund seiner äußerst eingeschränkten endogenen Regenerationskapazität, die bei weitem nicht ausreicht, das geschädigte Gewebe zu erneuern, ein ideales Zielorgan für regenerative Therapieverfahren dar. Folglich könnte die Identifizierung neuer Quellen adulter Stamm- oder Vorläuferzellen mit kardiovaskulärem Differenzierungspotential dabei helfen, verfeinerte Therapien zu entwickeln, um entweder kardiale Fehlfunktionen zu verhindern oder eine deutlich verbesserte myokardiale Reparatur zu erreichen. Die aktuelle weltweite Forschung auf diesem Gebiet fokussiert sich auf: a) induzierte pluripotente Stammzellen (iPS), b) embryonale Stammzellen (ES) und c) adulte Stammzellen, wie z. B. mesenchymale Stammzellen, kardiale Fibroblasten und Mesangioblasten sowie Myofibroblasten. Bisher haben jedoch alle Bemühungen noch zu keinem Durchbruch geführt, so dass die teilweise vielversprechenden experimentellen Ergebnisse nicht in die klinische Therapie des MI und der kardialen Defekte mittels Stammzellen transferiert werden können. Abgesehen davon, ob und wie stark so ein endogenes herzeigenes Potential wäre, würde die Identifizierung neuer endogener Stammzellen mit kardiogenem Potential, die genaue Charakterisierung ihrer Nischen und der Mechanismen ihrer Differenzierung einen Meilenstein in der kardioregenerativen Stammzelltherapie darstellen. Die Arbeitshypothese der hier vorgelegten Dissertation besagt, dass die Gefäßwand als Nische solcher Zellen dienen könnte. Innerhalb der letzten Jahre konnte die Adventitia und die subendotheliale Zone der adulten Gefäßwand als Nische für unterschiedliche Typen von Vorläuferzellen und multipotenten Stammzellen, die sogenannten Gefäßwand-residenten Stammzellen (VW-SCs) identifiziert werden. In Anbetracht der Tatsache, dass die Blutgefäße aufgrund ihrer hohen Dichte im Herzen eine essentielle stromale Komponente des Herzgewebes darstellen, kann die mögliche klinische Relevanz von VW-SCs für das Myokardium im Moment nur erahnt werden. Ausgehend von der Annahme, dass eine Subpopulation dieser VW-SCs die Fähigkeit besitzt, sich in Kardiomyozyten-ähnliche Zellen zu differenzieren, sollte im Rahmen dieser Dissertationsarbeit das myokardiale Potential der Gefäßwand-residenten Stammzellen aus der Aorta adulter Mäuse studiert werden, indem die Zellen unter unterschiedlichen definierten Bedingungen kultiviert und dann sowohl morphologisch als auch funktionell charakterisiert werden. Erstaunlicherweise zeigten die ersten Ergebnisse die Generierung spontan schlagender Kardiomyozyten-ähnlicher Zellen, nur durch Verwendung eines speziellen Nährmediums und ohne jegliche genetische Manipulation. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Analysen belegen zudem, dass die Kardiomyozyten-ähnlichen Zellen reproduzierbar nach ca. 9-11 Tagen in der Kultur anfangen, spontan zu schlagen. In immunzytochemischen Analysen zeigten die schlagenden Zellen ein quergestreiftes Färbemuster für α sarkomeres Actinin. Passend dazu wiesen diese spontan schlagenden Zellen, wie reife Kardiomyozyten, Sarkomerstrukturen mit Komponenten des sarkoplasmatischen Retikulums in elektronenmikroskopischen Analysen auf. Sie zeigten dementsprechend eine mit dem spontanen Schlag assoziierte Kalzium-Oszillation. Erstaunlicherweise zeigten die hier vorgelegten Befunde erstmalig, dass es nicht die Sca-1+ (stem cell antigen-1) Zellen waren, denen seit Jahren eine kardiomyozytäre Kapazität zugeschrieben wird, sondern es waren die Sca-1- Zellen der Mausaorta, die sich zu den spontan schlagenden Zellen differenzierten. Des Weiteren scheint diese Differenzierung von einer endogen generierten inflammatorischen Mikroumgebung abhängig zu sein. Die hier vorgelegten Ergebnisse legen daher den Schluss nahe, dass die VW-SCs in der vaskulären Adventitia sowohl die inflammatorische Mikroumgebung als auch die spontan schlagenden Kardiomyozyten-ähnlichen Zellen bereitstellten. So entstanden in der Kultur aortaler Zellen unter anderem auch Makrophagen, die hohe Mengen des Gefäßwachstumsfaktors VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) aufweisen. Wurden die Makrophagen in der Zellkultur durch Zugabe von Clodtronat-Liposomen depletiert, so wurde damit auch die Generierung spontan schlagender Zellen aus den aortalen VW-SCs unterbunden. Um zu testen, ob und inwieweit dieser Einfluss der Makrophagen auf die Entstehung spontan schlagender Zellen aus den VW-SCs auf den VEGF zurückzuführen ist, wurden kultivierte Zellen der Mausaorta mit dem VEGF-Rezeptor-2-Blocker (E7080) behandelt. Auch diese Behandlung resultierte wie bei der Depletion von Makrophagen darin, dass keine spontan schlagenden Zellen entstanden. Um die von VW-SCs generierten spontan schlagenden Zellen funktionell zu charakterisieren, wurden die kultivierten Zellen der Mausaorta mit Isoproterenol (ß-Sympathomimetikum) und Propranolol (ß-Blocker) behandelt. Eine signifikante Steigerung der Schlagfrequenz unter Isoproterenol und eine Reduzierung bei Zugabe von Propranolol unterstreichen ebenfalls die Kardiomyozyten-ähnliche Eigenschaft der spontan schlagenden Zellen. Schließlich wurden die aus der Mausaorta isolierten Zellen Fluoreszenz-markiert und dann in das kardiale Feld des sich entwickelnden Hühnerembryos (am fünften Tag der Entwicklung) implantiert. Zwei Tage später wurden die Herzen entnommen. Immunfärbungen zeigten, dass ein Teil der implantierten Zellen auch unter diesen in vivo-Bedingungen für α-sarkomeres Actinin positiv wurde und somit einen kardiomyozytären Phänotyp aufwies.
KW  - vessel wall resident stem cells
KW  - cardiomyocytes
KW  - Herzmuskelzelle
KW  - Stammzelle
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146046
N1  - My PhD research work has been published in Circ Res. 2018 Aug 31;123(6):686-699.
ER  - 
TY  - THES
A1  - Esterlechner, Jasmina
T1  - Role of the DREAM complex in mouse embryonic stem cells and identification of ZO-2 as a new LIN9 interacting protein
T1  - Die Rolle des DREAM-Komplexes in embryonalen Stammzellen der Maus und Identifikation von ZO-2 als neues LIN9- interagierendes Protein
N2  - The DREAM complex plays an important role in regulation of gene expression during the cell cycle. It was previously shown that the DREAM subunits LIN9 and B-MYB are required for early embryonic development and for the maintenance of the inner cell mass in vitro. In this work the effect of LIN9 or B-MYB depletion on embryonic stem cells (ESC) was examined. It demonstrates that LIN9 and B-MYB knock down changes the cell cycle distribution of ESCs and results in an accumulation of cells in G2 and M and in an increase of polyploid cells. By using genome-wide expression studies it was revealed that the depletion of LIN9 leads to downregulation of mitotic genes and to upregulation of differentiation-specific genes. ChIP-on chip experiments determined that mitotic genes are direct targets of LIN9 while lineage specific markers are regulated indirectly. Importantly, depletion of LIN9 does not alter the expression of the pluripotency markers Sox2 and Oct4 and LIN9 depleted ESCs retain alkaline phosphatase activity. I conclude that LIN9 is essential for proliferation and genome stability of ESCs by activating genes with important functions in mitosis and cytokinesis. The exact molecular mechanisms behind this gene activation are still unclear as no DREAM subunit features a catalytically active domain. It is assumed that DREAM interacts with other proteins or co-factors for transcriptional activation. This study discovered potential binding proteins by combining in vivo isotope labeling of proteins with mass spectrometry
(MS) and further analysed the identified interaction of the tight junction protein ZO-2 with DREAM which is cell cycle dependent and strongest in S-phase. ZO-2 depletion results in reduced cell proliferation and decreased G1 gene expression. As no G2/M genes, typical DREAM targets, are affected upon ZO-2 knock down, it is unlikely that ZO-2 binding is needed for a functional DREAM complex. However, this work demonstrates that with (MS)-based quantitative proteomics, DREAM interacting proteins can be identified which might help to elucidate the mechanisms underlying DREAM mediated gene activation.
N2  - Der DREAM Komplex spielt eine bedeutende Rolle in der Genregulation im Verlauf des Zellzyklus. Es wurde gezeigt, dass die DREAM Untereinheiten LIN9 und B-MYB für die frühe Embryogenese und den in vitro Erhalt der inneren Zellmasse erforderlich sind. In der vorligenden Arbeit wurde die Auswirkung von LIN9 und B-MYB Depletierung auf embryonale Stammzellen untersucht. Es zeigt sich, dass Depletion von LIN9 und B-MYB die Zellzyklus-Verteilung von embryonalen Stammzellen beeinflusst, zur Akkumulation der Zellen in G2 und M Phase und zu erhöhter Polyploidie führt. Genomweite Expressionsstudien ergaben, dass die Verringerung von LIN9 in der Runterregulierung von mitotischen und in der Hochregulierung von differenzierungsspezifischen Genen resultiert. ChIP-on-chip Experimente ermittelten, dass LIN9 Mitosegene als direkte Ziele hat, wohingegen entwicklungslinienspezifische Marker indirekt reguliert werden. Wesentlich ist, dass LIN9 Depletion nicht die Expression der Pluripotenzgene Oct4 oder Sox2 beeinflusst und embryonale Stammzellen ihre Alkaline Phosphatase Aktivität behalten. Daraus lässt schließen, dass LIN9
essentiell für die Proliferation und genomische Stabilität von embryonalen Stammzellen ist, in dem es Gene aktiviert, die wichtige Funktionen in Mitose und Zytokinese ausüben. Der exakte Mechanismus hinter der Genaktivierung ist noch nicht geklärt, da keine DREAM
Untereinheit eine katalytisch aktive Domäne aufweist. Vermutlich ist die Interaktion mit weiteren Proteinen oder Co-Faktoren für die Genaktivierung vonnöten. Diese Studie entdeckte mit in vivo Isotop-Markierung von Proteinen und Massenspektrometrie (MS) potentielle
Bindungspartner und untersuchte die identifizierte Bindung mit dem Tight Junction Protein ZO-2 genauer. Diese Bindung ist zellzyklus-abhängig und ist am stärksten
während der S-Phase. ZO-2 Depletion führt zu reduzierter Zellproliferation und verringerter G1-Genexpression. Da keine G2/M Gene, typische DREAM Ziele, von einer ZO-2 Depletion beeinflusst werden, ist es unwahrscheinlich, dass die ZO-2 Bindung für einen funktionellen DREAM Komplex benötigt wird. Jedoch demonstriert diese Studie, dass mit (MS)-basierender, quantitativer Proteomik DREAM interagierende Proteine identifiziert werden können. Dies ist hilfreich um die Mechanismen hinter der DREAM vermittelten Genaktivierung aufzuklären.
KW  - Zellzyklus
KW  - cellcycle
KW  - Stammzelle
KW  - Maus
KW  - stem cells
KW  - DREAM
KW  - Genregulation
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-90440
ER  - 
TY  - THES
A1  - Thoma, Eva Christina
T1  - Directed differentiation of pluripotent stem cells induced by single genes
T1  - Gerichtete Differenzierung pluripotenter Stammzellen induziert durch einzelne Gene
N2  - Pluripotency describes the ability of stem cells to form every cell type of the body.. Pluripotent stem cells are e.g. embryonic stem cells (ESCs), but also the so called induced pluripotent stem cells (IPS cells), that are generated by reprogramming differentiated somatic cells into a pluripotent state. Furthermore, it has been shown that spermatogonia (SG) derived from adult testes of mouse or human are pluripotent. Because of their ability to differentiate into every somatic cell type, pluripotent stem cells have a unique status in research and regenerative medicine. For the latter, they offer a valuable opportunity to replace destroyed tissues or organs. For basic research, stem cells represent a useful system to study differentiation or developmental processes that are difficult to access in the physiological situation e.g. during embryogenesis. Both applications, however, require methods that allow efficient and directed differentiation of stem cells into defined specialized cell types. This study first aims to investigate the differentiation potential of SG derived from the teleost fish medaka (Oryzias latipes). My results demonstrate that medaka SG are able to form different somatic cell types, namely adipocytes, melanocytes, osteoblasts, and neurons. This indicates that medake SG have retained a broad differentiation potential suggesting that pluripotency is not restricted to mouse and human SG but might be conserved among vertebrates. Next, I wanted to establish a differentiation method that is solely based on ectopic expression of genes known to be essential for the formation of certain somatic cell types – so called master regulators (MRs). My findings show that ectopic expression of the melanocyte-specific transcription factor mitf-m that has previously been shown to induce differentiation of medaka ESCs into pigment cells resulted in the formation of the same cell type in medaka SG. This approach could be used to generate other somatic cell types. Thus, ectopic expression of the MRs cbfa1 and mash1 in MF-SG was sufficient to induce differentiation into osteoblasts and neurons, respectively. Interestingly, these differentiation processes included the activation of genes that are expressed earlier during embryogenesis than the differentiation-inducing MR. Furthermore, my findings show that the approach of MR-induced differentiation can be transferred to mammalian stem cell systems. Ectopic expression of the neural transcription factor ngn2 was sufficient to induce efficient and rapid differentiation of neurons in mouse ESCs. This differentiation process also included the induction of genes that in vivo are activated at earlier stages that ngn2. By generating a transgenic cell line allowing induction of ectopic ngn2 expression, it was possible to obtain a relatively pure culture of functional neurons. Ngn2-induced differentiation did not require any additional signals and occurred even under pluripotency promoting conditions. Moreover, ectopic expression of ngn2 did also induce the formation of cells with neuronal morphology in IPS cells indicating that MR-induced differentiation is operative in different stem cell types. Furthermore, protein transduction of Ngn2 into mouse ESCs also resulted in a neuronal differentiation process up to the appearance of neural precursor cells. Last, my results show that MR-induced differentiation can also be used to generate other cell types than neurons from mouse ESCs. Myoblasts and macrophage-like cells were generated by ectopic expression of the MRs myoD and cebpa, respectively. Using transgenic cell lines enabling induction of MR expression it was possible to obtain mixed cultures with two different differentiation processes occurring in parallel. Altogether this study shows that ectopic expression of single genes is sufficient to induce directed differentiation of stem cells into defined cell types. The feasibility of this approach was demonstrated for different MRs and consequently different somatic cell types. Furthermore, MR induced differentiation was operative in different stem cell types from fish and mouse. Thus, one can conclude that certain genes are able to define cell fates in in vitro stem cell systems and that this cell fate defining potential appears to be a conserved feature in vertebrates. These findings therefore provide new insights in the role of MRs in cell commitment and differentiation processes. Furthermore, this study presents a new method to induce directed differentiation of stem cells that offers several advantages regarding efficiency, rapidness, and reproducibility. MR-induced differentiation therefore represents a promising tool for both stem cell research and regenerative medicine.
N2  - Pluripotenz bezeichnet die Fähigkeit einer Stammzelle, jede Zelle des Körpers zu bilden. Zu den pluripotenten Stammzellen gehören embryonale Stammzellen (ESZ), aber auch so genannte induzierte pluripotente Stammzellen (IPS Zellen), die durch Rückprogrammierung ausdifferenzierter Körperzellen in einen pluripotenten Status gewonnen werden. Außerdem wurde gezeigt, dass adulte Spermatogonien (SG) in Maus und Mensch pluripotent sind. Pluripotente Stammzellen sind von großer Wichtigkeit für Forschung und regenerative Medizin. Für letztere bieten diese Zellen aufgrund ihrer Fähigkeit, jede Körperzellen zu bilden, eine vielversprechende Möglichkeit, zerstörte Gewebe oder Organe zu ersetzen. In der Forschung stellen sie ein nützliches System dar, um Entwicklungs- und Differenzierungsprozesse zu untersuchen, die in der physiologischen Situation z.B. der Embryonalentwicklung – schwer zugänglich sind. Eine wichtige Grundlage für diese Anwendungen sind jedoch Methoden, die die effiziente und gerichtete Differenzierung von Stammzellen in einen bestimmten Zelltyp erlauben. In dieser Arbeit wird zunächst das Differenzierungspotential von SG der Fischspezies Medaka (Oryzias latipes) untersucht, um festzustellen, ob Pluripotenz von SG, die bisher nur in Maus und Mensch gezeigt wurde, auch in anderen Wirbeltieren außerhalb der Säuger erhalten ist. Meine Ergebnisse zeigen, dass Medaka-SG fähig sind verschiedene somatische Zelltypen zu bilden. Das zweite Ziel dieser Studie ist die Entwicklung einer Differenzierungsmethode, die nur auf der Expression einzelner so genannter Masterregulatoren (MR) beruht – Gene, die als essentiell für die Entwicklung bestimmter Zelltypen bekannt sind. Meine Ergebnisse zeigen, dass der Pigmentzell-spezifische Transkriptionsfaktor Mitf-M, von dem gezeigt wurde, dass er die Differenzierung von Medaka-ESZ in Pigmentzellen induzieren kann, die Bildung desselben Zelltyps in Medaka-SG induziert. Dieser Ansatz ermöglichte auch die Bildung anderer somatischer Zelltypen. So führte Überexpression der MR cbfa1 und mash1 in Medaka SG zur Differenzierung in Osteoblasten bzw. Neuronen. Interessanterweise wurde bei diesen Differenzierungsprozessen die Aktivierung von Genen beobachtet, die während der Embryonalentwicklung vor dem Differenzierung-auslösenden MR aktiviert werden. Weiterhin zeigen meine Ergebnisse, dass der Ansatz einer gerichteten Differenzierung, ausgelöst durch einzelne MR, auch auf Säuger-Stammzellen übertragen werden kann. So wurde durch Überexpression des neuronalen Genes ngn2 in murinen ESZ die effiziente und schnelle Bildung von Nervenzellen induziert, wobei auch hier die Aktivierung von Genen beobachtet wurde, deren Expression in der Embryogenese der von ngn2 vorangeht. Die Herstellung einer transgenen Zelllinie, in der die Überexpression von ngn2 aktiviert werden kann, erlaubte die Entstehung einer fast reinen Kultur funktionaler Neuronen. Der durch ngn2 ausgelöste Differenzierungsprozess war unabhängig von zusätzlichen Faktoren und lief sogar unter Bedingungen ab, die normalerweise den pluripotenten Zustand unterstützen. Außerdem führte Überexpression von ngn2 auch in IPS Zellen zur Bildung von Zellen mit neuronalem Phenotyp. Weiterhin konnte auch durch Transduktion des Ngn2-Proteins in murine ESZ neuronale Differenzierung ausgelöst werden, und zwar die Bildung neuronaler Vorläuferzellen. Zuletzt wird bewiesen, dass gerichtete Differenzierung von murinen ESZ durch einzelne MR Gene neben neuronalen Zelltypen auch die Bildung anderer somatischer Zellen erlaubt: Überexpression der Gene myoD oder cebpa induzierte die Differenzierung in Muskelzellen bzw. Macrophagen-ähnliche Zellen. Unter Verwendung transgener Zelllinien, die die Aktivierung jeweils eines MRs erlauben, war es möglich, gemischte Kulturen zu erhalten, in denen zwei verschiedene Differenzierungsprozesse parallel abliefen. Diese Studie zeigt, dass die Überexpression einzelner Gene ausreichend ist, um gerichtete Differenzierungsprozesse in einen bestimmten Zelltyp auszulösen. Die erfolgreiche Durchführung dieses Ansatzes wird nicht nur mit verschiedenen Genen und somit verschiedenen resultierenden Zelltypen nachgewiesen, sondern auch in verschiedenen Stammzelltypen aus Fisch und Maus. Dies erlaubt die Schlussfolgerung, dass bestimmte Gene in vitro das Schicksal von Stammzellen festlegen können und dass diese Fähigkeit eine konservierte Eigenschaft in Wirbeltieren zu sein scheint. Somit präsentiert diese Arbeit neuen Erkenntnisse über die Rolle von MR bei der Festlegung von Zellidentitäten und in Differenzierungsprozessen. Weiterhin wird eine neue Methode zur Induktion gerichteter Differenzierung in Stammzellen aufgezeigt, die mehrere Vorteile in Bezug auf Effizienz, Geschwindigkeit und Reproduzierbarkeit hat. Auslösung von Differenzierung durch MR Gene bietet somit einen neuen vielversprechenden Ansatz mit potentieller Anwendung sowohl in Stammzellforschung, als auch in regenerativer Medizin.
KW  - Stammzelle
KW  - Zelldifferenzierung
KW  - Transkriptionsfaktor
KW  - Pluripotenz
KW  - Pluripotent stem cells
KW  - differentiation
KW  - transcription factors
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54706
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wang, Huiqiang
T1  - Enhanced Replication of Vaccinia Virus GLV-1h68 in Cancer Stem-like Cells of Human Breast Cancer Cell Preparations
T1  - Verbesserte Replikation desVerbesserte Replikation des Vaccinia Virus GLV-1h68 in Präparation von Tumorstammzell-ähnlichen Zellen
N2  - There is more and more evidence for the cancer stem cell hypothesis which believes that cancers are driven by a cellular subcomponent that has stem cell properties which is self-renewal, tumorigenicity and multilineage differentiation capacity. Cancer stem cells have been connected to the initiation of tumors and are even found to be responsible for relapses after apparently curative therapies have been undertaken. This hypothesis changes our conceptual approach of oncogenesis and shall have implications in breast cancer prevention, detection and treatment, especially in metastatic breast cancer for which no curative treatment exists. Given the specific stem cell features, novel therapeutic pathways can be targeted. Since the value of vaccinia virus as a vaccination virus against smallpox was discovered by E. Jenner at 18th century, it plays an important role in human medicine and molecular biology. After smallpox was successfully eradicated, vaccinia virus is mainly used as a viral vector in molecular biology and increasingly in cancer therapy. The outstanding capability to specifically target and destroy cancer cells makes it a perfect agent for oncolytic virotherapy. Furthermore, the virus can easily be modified by inserting genes which encode therapeutic or diagnostic proteins to be expressed when a tumor is infected. The emphasis in this study was the establishment of methods for the enrichment of human breast cancer stem-like cells from cancer cell lines and characterization of those cancer stem-like cells in vitro and in vivo. Furthermore, by using the Genelux Corporation vaccinia virus strain GLV-1h68, the isolated cancer stem-like cells can be targeted not only in vitro but also in vivo more efficiently. Side-population (SP) cells within cancers and cell lines are rare cell populations known to be enriched cancer stem-like cells. In this study, we used Hoechst 33342 staining and flow cytometry to identify SP cells from the human breast cancer cell lines MCF-7 and GI-101A as models for cancer stem-like cells. Considering the cytotoxicity of Hoechst dye and the restriction of instrument, we did not carry out further studies by this method. Utilizing in vitro and in vivo experimental systems, we showed that human breast cancer cell line GI-101A with aldehyde dehydrogenase activity (ALDH) have stemlike properties. Higher ALDH activity identifies the tumorigenic cell fraction which is capable of self-renewal and of generating tumors that could recapitulate the heterogeneity of the parental tumor. Furthermore, the cells with higher ALDH activity display significant resistance to chemotherapy and ionizing radiation, which proves their stem-like properties again. The cells which have higher ALDH activity also are more invasive compared to cells which have lower ALDH activity, which connects the cancer stem-like cells with cancer metastases. By analyzing the popular human breast cancer stem cells surface markers CD44, CD49f and CD24, it was discovered that the cells with higher ALDH activity have stronger CD44 and CD49f expression than in those cells with lower ALDH activity, which further confirms their stem-like properties. Finally, the cells with higher ALDH activity and lower ALDH activity were infected in vitro and used in virotherapy in a mouse xenograft model was performed. The results indicated that the vaccinia virus GLV-1h68 can replicate in cells with higher ALDH activity more efficiently than cells with lower ALDH activity. GLV-1h68 also can selectively target and eradicate the xenograft tumors which were derived from cells with higher ALDH activity. The epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a key developmental program that is often activated during cancer invasion and metastases. EMT was induced in immortalized human mammary epithelial cells (HMLEs) and in GI-101A cells, which results in the acquisition of mesenchymal traits and in the expression of stem cell markers. Furthermore, the EMT-induced GI-101A cells showed resistance to chemotherapy and invasion capacity. CD44+/CD24- cells were enriched during the EMT induction. Following flow cytometry sorting by using CD44, CD24 and ESA surface marker, the sorted cells were tested in a mouse model regarding tumorigenicity. Unexpectedly, we found that CD44+/CD24+/ESA+ cells could initiate tumors more efficiently rather than CD44+/CD24-/ESA+ and other fractions in EMTinduced GI-101A cells. We also infected the CD44+/CD24+/ESA+ and CD44+/CD24- /ESA+ cells in vitro and performed virotherapy in a mouse xenograft model. The results indicated that the vaccinia virus GLV-1h68 is able to replicate in CD44+/CD24+/ESA+ cells more efficiently than in CD44+/CD24-/ESA+ cells. GLV-1h68 was also capable to selectively target and eradicate the xenograft tumors which derived from CD44+/CD24+/ESA+ cells. Moreover, CD44- cells have much lower tumorigenicity in the mouse model and CD44- cells derived-tumors are not responsive to vaccinia virotherapy. In summary, we have successfully established an in vitro and in vivo system for the identification, characterization and isolation of cancer stem-like cells from the human breast cancer cell line GI-101A by using the ALDEFLUOR assay. The vaccinia virus GLV-1h68 was able to efficiently target and eradicate the higher ALDH activity cells and tumors derived from those cells. Although contrary to the current assumption, CD44+/CD24+/ESA+ cells in the EMT-induced GI-101A cell line showed stem-like properties and GLV-1h68 was able to efficiently target and eradicate the CD44+/CD24+/ESA+ cells and tumors which derived from those cells. Finally, improved understanding of cancer stem cells may have tremendous relevance for how cancer should be treated. It is menacing that cancer stem cells are resistant to almost all anti-tumor approaches which have already been established for the treatment of metastatic diseases such as ionizing radiation, hormonal therapy, chemotherapy, and small molecular inhibitors. Therefore, it is promising that our results suggest that these cancer stem cells may be susceptible to treatment with oncolytic vaccinia virus.
N2  - Immer mehr experimentelle Hinweise stützen die Krebsstammzell-Hypothese, wonach Krebs durch eine zelluläre Teilkomponente angetrieben wird, die Stammzell- Eigenschaften hat, das heißt die Fähigkeit sich selbst zu erneuern, Tumorigenität und die Fähigkeit sich in verschiedene Richtungen zu differenzieren. Krebsstammzellen wurden mit der Enstehung von Tumorerkrankungen in Verbindung gebracht, und werden sogar für Rückfälle verantwortlich gemacht, nachdem scheinbar erfogreiche Behandlungen durchgeführt wurden. Diese Hypothese verändert unser Verständnis der Onkogenese und wird Auswirkungen auf die Brustkrebs-Prävention, -Erkennung und -Behandlung haben, vor allem in metastasierendem Brustkrebs, für den es keine kurative Behandlung gibt. Angesichts der besonderen Merkmale von Stammzellen können neue therapeutische Wege angestrebt werden. Seit sein Nutzen als Impfvirus gegen die Pocken von E. Jenner im 18. Jahrhundert entdeckt wurde, spielt das Vaccinia-Virus in der Humanmedizin und Molekularbiologie eine wichtige Rolle. Nachdem die Pocken erfolgreich ausgerottet wurden, wird das Vaccinia-Virus hauptsächlich als viraler Vektor in der Molekularbiologie und in zunehmendem Maße in der Krebstherapie verwendet. Die außerordentliche Fähigkeit, Krebszellen gezielt zu zerstören, macht es zu einem perfekten Wirkstoff für die onkolytische Virotherapie. Des Weiteren kann das Virus durch das Inserieren von Genen modifiziert werden, die für therapeutische oder diagnostische Proteine kodieren und im infizierten Tumor exprimiert werden. Der Schwerpunkt dieser Arbeit war die Etablierung von Methoden für die Anreicherung menschlicher Stammzell-ähnlicher Brustkrebszellen von Krebszelllinien und die Charakterisierung dieser Krebsstammzell-ähnlichen Zellen in vitro und in vivo. Darüber hinaus können mit Hilfe des Vaccinia-Virus-Stammes GLV- 1h68 von Genelux Corporation die isolierten Krebsstammzell-ähnlichen Zellen nicht nur in vitro, sondern auch in vivo effizienter eliminiert werden. Side-Population- (SP-) Zellen in Krebserkrankungen und Zelllinien sind seltene Zellpopulationen die dafür bekannt sind, reich an Krebsstammzell-ähnlichen Zellen zu sein. In dieser Studie verwendeten wir eine Hoechst 33342-Färbung und Durchflusszytometrie, um SP-Zellen aus der menschlichen Brustkrebs-Zelllinie MCF- 7 zu identifizieren, als Modell für Krebsstammzell-ähnliche Zellen. In Anbetracht der Zytotoxizität des Hoechst-Farbstoffes und der Beschränkung des Instruments, wurde diese Methode nicht weiter verfolgt. Mit Hilfe von Experimenten in vitro und in vivo wurde gezeigt, dass die menschliche Brustkrebs-Zelllinie GI-101A mit Aldehyd-Dehydrogenase-Aktivität (ALDH) Stammzell-ähnliche Eigenschaften hat. Höhere ALDH-Aktivität identifiziert die tumorigene Zellfraktion, die zur Selbsterneuerung und zur Erzeugung von Tumoren fähig ist, was die Heterogenität des ursprünglichen Tumors deutlich macht. Darüber hinaus weisen Zellen mit hoher ALDH-Aktivität eine beachtliche Fähigkeit zur Resistenz gegen Chemotherapie und ionisierende Strahlung auf, was wiederum ihre Stammzell-ähnlichen Eigenschaften beweist. Ferner sind Zellen mit hoher ALDHAktivität im Vergleich zu Zellen mit niedriger ALDH-Aktivität stärker invasiv, was die Krebsstammzell-ähnlichen Zellen mit Krebsmetastasierung in Verbindung bringt. Bei der Analyse der gängigen Oberflächenmarker CD44, CD24 und CD49f in menschlichen Brustkrebs-Stammzellen beobachteten wir, dass Zellen mit hoher ALDH-Aktivität CD44 und CD49f stärker exprimieren als Zellen mit niedriger ALDHAktivität, was wiederum deren Stammzell-ähnliche Eigenschaften aufzeigt. Schließlich wurden die Zellen mit hoher und niedriger ALDH-Aktivität in vitro infiziert und Virotherapie im Maus-Xenograft-Modell durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass das Vaccinia-Virus GLV-1h68 in Zellen mit höherer ALDH-Aktivität effizienter replizieren kann als in Zellen mit niedrigerer ALDH-Aktivität. GLV-1h68 kann auch selektiv Xenograft-Tumore finden und zerstören, welche von Zellen mit hoher ALDHAktivität abstammten. Der epithelial-mesenchymale Übergang (EMT) ist ein essentieller Entwicklungs- Schritt, der häufig während der Invasion und Metastasierung in Krebserkrankungen aktiviert wird. Wir induzierten EMT in immortalisierten humanen Brust-Epithelzellen (HMLEs) und GI-101A-Zellen, was im Erwerb von mesenchymalen Eigenschaften und der Expression von Stammzell-Markern resultiert. Außerdem zeigten die EMTinduzierten GI-101A-Zellen Chemoresistenz und Fähigkeit zur Invasion. CD44+CD24--Zellen waren während der EMT-Induktion angereichert. Es wurden durchflusszytometrische Sortierung mit Hilfe von CD44-, CD24- und ESAOberflächenmarkern durchgeführt, und die sortierten Zellen wurden danach auf Tumorigenität in einem Mausmodell getestet. Unerwarteterweise fanden wir, dass CD44+CD24-ESA+-Zellen effizienter Tumore initiieren konnten als CD44+CD24- ESA+-Zellen und andere Fraktionen in EMT-induzierten GI-101A-Zellen. Wir haben auch die infizierten CD44+CD24+ESA+- und CD44+CD24-ESA+-Zellen in vitro infiziert und Virotherapie im Maus-Xenograft-Modell durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass das Vaccinia-Virus GLV-1h68 in CD44+CD24+ESA+-Zellen effizienter replizieren kann als CD44+CD24-ESA+-Zellen. GLV-1h68 konnte selektiv Xenograft- Tumore finden und eliminieren, die von CD44+CD24+ESA+-Zellen abstammten. Darüber hinaus haben CD44--Zellen eine sehr niedrige Tumorigenität im Mausmodell und Tumore, die von CD44--Zellen abstammen, sprechen nicht auf Vaccinia-Virotherapie an. Zusammenfassend haben wir erfolgreich ein System zur Identifizierung, Charakterisierung und Isolierung von Krebsstammzell-ähnlichen Zellen aus der menschlichen Brustkrebs-Zelllinie GI-101A in vitro und in vivo mit Hilfe des ALDEFLUOR-Assays etabliert. Das Vaccinia-Virus GLV-1h68 konnte zielgenau Zellen mit erhöhter ALDH-Aktivität oder daraus etablierte Tumore finden und zerstören. Obwohl, im Gegensatz zur gängigen Annahme, CD44+CD24+ESA+-Zellen in der EMT-induzierten GI-101A-Zelllinie Stammzell-ähnliche Eigenschaften zeigten, konnte GLV-1h68 zielgenau CD44+CD24+ESA+-Zellen oder daraus etablierte Tumore finden und zerstören. Schließlich kann ein verbessertes Verständnis der Krebsstammzellen eine enorme Bedeutung dafür haben, wie Krebs behandelt werden sollte. Es ist verhängnisvoll, dass Krebsstammzellen gegen fast alle Anti-Tumor-Ansätze, die bereits für die Behandlung von Metastasen etabliert wurden, resistent sind, wie ionisierende Strahlung, Hormontherapie, Chemotherapie und kleine molekulare Inhibitoren. Gerade deshalb ist es vielversprechend, dass unsere Ergebnisse darauf hin deuten, dass diese Krebsstammzellen auf Behandlung mit dem onkolytischen Vaccinia-Virus ansprechen.
KW  - Vaccinia Virus
KW  - Brustkrebs
KW  - Stammzelle
KW  - cancer stem cells
KW  - vaccinia virus
KW  - human breast cancer
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-64750
ER  -