TY - THES A1 - Gotthard, Hannes T1 - Targeting Colorectal Cancer Stem Cells with Hemibodies T1 - Eliminierung von Krebsstammzellen des kolorektalen Karzinoms mithilfe von Hemibodies N2 - The cancer stem cell hypothesis is a cancer development model which elicited great interest in the last decades stating that cancer heterogeneity arises from a stem cell through asymmetrical division. The Cancer Stem Cell subset is described as the only population to be tumorigenic and having the potential to renew. Conventional therapy often fails to eradicate CSC resulting in tumor relapse. Consequently, it is of great inter-est to eliminate this subset of cells to provide the best patient outcome. In the last years several approaches to target CSC were developed, one of them being immunotherapeu-tic targeting with antibodies. Since markers associated with CSC are also expressed on normal stem cells or healthy adjacent tissue in colorectal cancer, dual targeting strate-gies are preferred over targeting only a single antigen. Subsequently, the idea of dual targeting two CSC markers in parallel by a newly developed split T cell-engaging anti-body format termed as Hemibodies emerged. In a preliminary single cell RNA sequenc-ing analysis of colorectal cancer cells CD133, CD24, CD166 and CEA were identified as suitable targets for the combinatorial targeting strategy. Therefore, this study focused on trispecific and trivalent Hemibodies comprising a split binding moiety against CD3 and a binding moiety against either CD133, CD24, CD166 or CEA to overcome the occurrence of resistance and to efficiently eradicate all tumor cells including the CSC compartment. The study showed that the Hemibody combinations CD133xCD24, CD133xCD166 and CD133xCEA are able to eliminate double positive CHO cells with high efficacy while having a high specificity indicated by no killing of single antigen positive cells. A thera-peutic window ranging between one to two log levels could be achieved for all combina-tions mentioned above. The combinations CD133xCD24 and CD133xCD166 further-more proved its efficacy and specificity on established colorectal cancer cell lines. Be-sides the evaluation of specificity and efficacy the already introduced 1st generation of Hemibodies could be improved into a 2nd generation Hemibody format with increased half-life, stability and production yield. In future experiments the applicability of above-mentioned Hemibodies will be proven on patient-derived micro tumors to also include variables like tumor microenvironment and infiltration. N2 - In den letzten Jahrzenten wurde neben der klonalen Evolution ein weiteres Modell zur Krebsentstehung und dessen Heterogenität entwickelt: die Krebsstammzellhypothe-se. Diese Hypothese besagt, dass die Heterogenität eines Tumors durch asymmetri-sche Teilung von sogenannten Krebsstammzellen entsteht. Nur diese sind tumorigen und in der Lage Metastasen zu bilden. Außerdem werden Krebsstammzellen als re-sistent gegen konventionelle Therapien beschrieben, weshalb es nach einer anfängli-chen Tumorregression oft zu einem Rezidiv durch erneutes Auswachsen von zurück-bleibenden Krebsstammzellen kommt. Deshalb ist es von großem Interesse genau diese Population abzutöten, um eine erfolgreiche Therapie zu gewährleisten. In den letzten Jahren wurden zahlreiche Medikationen entwickelt, um Krebsstammzellen ge-zielt anzugreifen. Ein vielversprechender Ansatz ist hierbei die immuntherapeutische Adressierung mittels Antikörpern gegen Krebsstammzellmarkern. Einzelne Marker sind allerdings auch auf normalen Stammzellen und gesundem Gewebe exprimiert, weshalb Therapien, die auf mindestens zwei verschiedene Oberflächenproteine ab-zielen, erfolgsversprechender sind. In dieser Arbeit wurde ein neues T-Zell rekrutie-rendes Antikörperformat entwickelt, sogenannte Hemibodies. Hierbei handelt es sich um ein trispezifisches und trivalentes Format, bestehend aus jeweils zwei Fragmen-ten. Jedes Fragment besteht aus einer Bindedomäne gegen ein Krebsstammzellmar-ker und einer geteilten Bindedomäne gegen CD3. Durch Bindung beider Fragmente an einen Stammzellmarker kommt es zur Komplementierung der geteilten anti-CD3 Domäne und zur T-Zellrekrutierung. Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der bioin-formatischen Analyse von Einzelzell-RNA-Daten des kolorektalen Karzinoms (KRK) zur Identifizierung von potentiellen Krebsstammzellmarkern. Dabei konnten die Ober-flächenproteine CD24, CD133, CD166 und CEA und besonders deren Kombination als geeignete Zielstrukturen identifiziert werden. Die gegen oben genannte Antigene gerichteten Hemibodies zeigten in den Kombinationen CD133xCD24, CD133xCD166 und CD133xCEA auf doppelt positiven CHO-Zellen eine hohe Effektivität. Außerdem konnte die Spezifität durch ein Ausbleiben von Zelltod auf einzel-positiven CHO Zellen bewiesen werden. Die Kombinationen CD133xCD24 und CD133xCD166 konnten Effektivität und Spezifität auch auf etablierten Krebszellen zeigen. Die oben genann-ten Kombinationen waren in einem therapeutischen Fenster von ein bis zwei Logstu-fen funktional. Neben der Testung verschiedener Hemibody-Kombinationen konnten die bereits publizierten Hemibodies der ersten Generation in ein neues Format der zweiten Generation weiterentwickelt werden. Das neue Format zeigte eine verbesser-te Halbwertszeit, Stabilität und Produzierbarkeit. In zukünftigen Experimenten werden die in der Thesis benutzten Hemibodies auf Mikrotumoren getestet, um weitere Vari-ablen, die die Effektivität und Spezifität beeinflussen zu ermitteln. KW - Monoklonaler bispezifischer Antikörper KW - Antikörper KW - T-Lymphozyt KW - Immunreaktion KW - Dickdarmkrebs KW - Hemibody KW - Hemibodies KW - Colorectal Cancer KW - trispecific KW - T-cell engager KW - dual targeting KW - Bispecific T-cell engager KW - stem cells KW - Kolorektales Karzinom Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-303090 ER - TY - THES A1 - Gupta, Shishir Kumar T1 - Re-annotation of Camponotus floridanus Genome and Characterization of Innate Immunity Transcriptome Responses to Bacterial Infections T1 - Re-Annotation des Camponotus floridanus Genoms und Charakterisieren der unspezifischen Immun-Transkriptom-Antwort auf bakterielle Infektionen N2 - The sequencing of several ant genomes within the last six years open new research avenues for understanding not only the genetic basis of social species but also the complex systems such as immune responses in general. Similar to other social insects, ants live in cooperative colonies, often in high densities and with genetically identical or closely related individuals. The contact behaviours and crowd living conditions allow the disease to spread rapidly through colonies. Nevertheless, ants can efficiently combat infections by using diverse and effective immune mechanisms. However, the components of the immune system of carpenter ant Camponotus floridanus and also the factors in bacteria that facilitate infection are not well understood. To form a better view of the immune repository and study the C. floridanus immune responses against the bacteria, experimental data from Illumina sequencing and mass-spectrometry (MS) data of haemolymph in normal and infectious conditions were analysed and integrated with the several bioinformatics approaches. Briefly, the tasks were accomplished in three levels. First, the C. floridanus genome was re-annotated for the improvement of the existing annotation using the computational methods and transcriptomics data. Using the homology based methods, the extensive survey of literature, and mRNA expression profiles, the immune repository of C. floridanus were established. Second, large-scale protein-protein interactions (PPIs) and signalling network of C. floridanus were reconstructed and analysed and further the infection induced functional modules in the networks were detected by mapping of the expression data over the networks. In addition, the interactions of the immune components with the bacteria were identified by reconstructing inter-species PPIs networks and the interactions were validated by literature. Third, the stage-specific MS data of larvae and worker ants were analysed and the differences in the immune response were reported. Concisely, all the three omics levels resulted to multiple findings, for instance, re-annotation and transcriptome profiling resulted in the overall improvement of structural and functional annotation and detection of alternative splicing events, network analysis revealed the differentially expressed topologically important proteins and the active functional modules, MS data analysis revealed the stage specific differences in C. floridanus immune responses against bacterial pathogens. Taken together, starting from re-annotation of C. floridanus genome, this thesis provides a transcriptome and proteome level characterization of ant C. floridanus, particularly focusing on the immune system responses to pathogenic bacteria from a biological and a bioinformatics point of view. This work can serve as a model for the integration of omics data focusing on the immuno-transcriptome of insects. N2 - Das Sequenzieren mehrerer Ameisen Genome innerhalb der letzten 6 Jahre eröffnete neue Forschungswege, um nicht nur die genetische Grundlade sozialer Arten, sondern auch komplexere Systeme wie generelle Immunantworten zu untersuchen. Ähnlich zu anderen sozialen Insekten leben Ameisen in Kolonien, oft mit einer sehr hohen Dichte mit genetisch übereinstimmenden oder nah verwandten Individuen. Das Sozialverhalten und die engen Lebensumstände führen dazu, dass sich Krankheiten in Kolonien schnell ausbreiten können. Dennoch können Ameisen mit der Nutzung ihrer komplexen Immunsystemmechanismen Infektionen effektiv abwehren. Die Zusammensetzung des Immunsystems der Rossameise Camponotus floridanus (C. floridanus) und die Faktoren der Bakterien, welche die Infektionen verursachen sind noch nicht gut untersucht. Um einen besseren Überblick über die verschiedenen Gruppen der Immun- Gene zu bekommen und um die Immunantworten von C. floridanus gegen Bakterien zu untersuchen haben wir experimentelle Daten der Illumina Sequenzierung und der Massenspektrometrie (MS) aus der Hämolymphe unter normalen und unter infizierten Bedingungen analysiert und über verschiedene bioinformatische Ansätzen zusammengefasst. Die Aufgabe wurde in drei Ebenen unterteilt. Zuerst wurde das Genom von C. floridanus neu annotiert, die Verbesserung der existierenden Annotation wurde rechnerisch und mit Transkriptom- Daten erreicht. Mit der Nutzung der auf Homologie- basierenden Methoden, der umfassenden Überprüfung der Literatur und der Nutzung von mRNA Genexpressionsanalysen wurde für C. floridanus dieser Überblick erstellt. Anschließend wurden größere Protein- Protein- Interaktionen (PPI) und Signalnetzwerke von C. floridanus rekonstruiert und analysiert und daraufhin wurden die Infektions-induzierten funktionalen Module im Netzwerk entdeckt und die Expressionsdaten über Netzwerke abgebildet. Zusätzlich wurden die Anteile der Immunantwort bei der Interaktion mit Bakterien mittels der Rekonstruktion von zwischenartlichen PPI Netzwerken identifiziert und diese Interaktionen wurden mit Literaturwerten validiert. In der dritten und letzten Phase wurden Daten der Stadium- spezifischen Massenspektrometrie (MS) von Larven- und Arbeiterameisen analysiert und die Unterschiede in den Immunantworten aufgezeichnet. Zusammengefasst lieferten alle drei Omiks- Ebenen jeweils viele Ergebnisse, zum Beispiel führte die neue Annotation und das Transkription- Profil zu einer generellen Verbesserung der strukturellen und funktionalen Annotation und dem Aufspüren von alternativen Splicing- Ereignissen. Die Netzwerkanalyse deckte die unterschiedlich exprimierten topologisch wichtigen Proteine und die aktiven funktionalen Module auf, die Analyse der MS- Daten erbrachte Ergebnisse über die Stadium- spezifischen Unterschiede in der Immunantwort von C. floridanus gegen bakterielle Pathogene. Rundum, beginnend mit der neuen Annotation des Genoms von C. floridanus stellt diese Arbeit eine Transkriptom- und Protein Charakterisierung der Ameise C. floridanus dar. Besonders lag der Fokus auf die Antworten des Immunsystems auf Pathogene Bakterien aus biologischer- und bioinformatischer Sicht. Diese Arbeit kann als Vorlage für die Integration von Omiks Daten dienen, welche sich auf die Immun- Transkriptome von Insekten fokussieren. KW - Camponotus floridanus KW - Genom KW - Camponotus floridanus KW - Innate immunity KW - Transcriptome KW - Interactome KW - Host-pathogen interactions KW - Host-endosymbiont interactions KW - Re-annotation KW - Gene-prediction KW - Ants KW - Comparative genomics KW - Transkription KW - Immunreaktion KW - Re-Annotation KW - Immun-Transkriptom Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140168 ER - TY - THES A1 - Böhme, Linda T1 - Cellular response to double-stranded RNA in Chlamydia trachomatis-infected human host cells T1 - Zelluläre Antwort auf doppelsträngige RNA in Chlamydia trachomatis-infizierten humanen Wirtszellen N2 - Chlamydien sind Gram-negative, obligat-intrazelluläre Bakterien, die für ein weites Spektrum an relevanten Krankheiten verantwortlich sind. Auf Grund ihres zweiphasigen Entwicklungszyklusses sind Chlamydien von einer intakten Wirtszelle abhängig, um sich erfolgreich vermehren und im Organismus ausbreiten zu können. Daher haben Chlamydien anspruchsvolle Strategien entwickelt, um das Immunsystem des Wirtes auszuschalten oder den programmierten Zelltod ihrer Wirtszelle zu verhindern. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine Infektion mit C. trachomatis einen Einfluss auf die zelluläre Antwort auf dsRNA nehmen kann. Die Synthese von dsRNA ist ein charakteristisches Merkmal der Replikation von Viren, welche sowohl die Apoptose induzieren als auch das Immunsystem aktivieren kann. Um eine chlamydiale und virale Co-Infektion zu simulieren, wurden Chlamydien-infizierte Epithelzellen mit der synthetischen dsRNA Polyinosin-Polycytidinsäure (polyI:C) transfiziert. Im ersten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob Chlamydien die durch dsRNA eingeleitete Apoptose verhindern können. Eine signifikante Reduktion der dsRNA-induzierten Apoptose konnte in infizierten Zellen beobachtet werden. Es zeigte sich, dass die Prozessierung der Initiator-Caspase-8 in infizierten Zellen unterblieb. Dies war von der frühen bakteriellen Proteinsynthese abhängig und für die dsRNA-vermittelte Apoptose spezifisch, da der durch TNFalpha bewirkte Zelltod nicht auf der Ebene der Caspase-8 verhindert werden konnte. Die Aktivierung von zellulären Faktoren, die bei der Apoptoseinduzierung eine wichtige Rolle spielen, beispielsweise PKR und RNase L, war in infizierten Zellen jedoch unverändert. Stattdessen konnte durch RNA Interferenz-vermittelte Depletion gezeigt werden, dass der zelluläre Caspase-8-Inhibitor cFlip eine entscheidende Rolle bei der chlamydialen Blockierung der dsRNA-vermittelten Apoptose spielt. Mittels Co-Immunopräzipitation konnte ein erster Hinweis darauf gefunden werden, dass C. trachomatis eine Anreicherung von cFlip im dsRNA-induzierten Komplex von Caspase-8 und FADD bewirkt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob Chlamydien die Immunantwort auf virale Infektionen beeinflussen, welche vor allem die Expression von Interferonen und Interleukinen beinhaltet. Es stellte sich heraus, dass die Aktivierung des Interferon regulatory factor 3 (IRF-3) und des zur Familie von NF-kappaB Trankriptionsfaktoren gehörenden p65, zwei zentralen Regulatoren der Immunantwort auf dsRNA, in infizierten Epithelzellen verändert war. Die Degradation von IkappaB-alpha, des Inhibitors von NF-kappaB, war in infizierten Zellen beschleunigt, begleitet von einer Veränderung der Translokation des Transkriptionsfaktors in den Zellkern. Im Gegensatz dazu wurde die nukleäre Translokation von IRF-3 durch die Infektion signifikant verhindert. Die hier vorgestellten Daten zeigen erstmals, dass eine Infektion mit C. trachomatis die zelluläre Antwort auf dsRNA signifikant verändern kann und implizieren einen Einfluss von chlamydialen Infektionen auf den Ausgang von viralen Superinfektionen. N2 - Chlamydia are Gram-negative obligate intracellular bacteria responsible for a wide spectrum of relevant diseases. Due to their biphasic developmental cycle Chlamydia depend on an intact host cell for replication and establishment of an acute infection. Chlamydia have therefore evolved sophisticated strategies to inhibit programmed cell death (PCD) induced by a variety of stimuli and to subvert the host immune system. This work aimed at elucidating whether an infection with C. trachomatis can influence the cellular response to double-stranded RNA (dsRNA). The synthesis of dsRNA is a prominent feature of viral replication inside infected cells that can induce both PCD and the activation of a cellular innate immune response. In order to mimic chlamydial and viral co-infections, Chlamydia-infected cells were transfected with polyinosinic:polycytidylic acid (polyI:C), a synthetic dsRNA. In the first part of this work it was investigated whether C. trachomatis-infected host cells could resist apoptosis induced by polyI:C. A significant reduction in apoptosis, determined by PARP cleavage and DNA fragmentation, could be observed in infected cells. It could be shown that processing of the initiator caspase-8 was inhibited in infected host cells. This process was dependent on early bacterial protein synthesis and was specific for dsRNA because apoptosis induced by TNFalpha was not blocked at the level of caspase-8. Interestingly, the activation of cellular factors involved in apoptosis induction by dsRNA, most importantly PKR and RNase L, was not abrogated in infected cells. Instead, RNA interference experiments revealed the crucial role of cFlip, a cellular caspase-8 inhibitor, for chlamydial inhibition of dsRNA-induced apoptosis. First data acquired by co-immunoprecipitation experiments pointed to an infection-induced concentration of cFlip in the dsRNA-induced death complex of caspase-8 and FADD. In the second part of this work, the chlamydial influence on the first line of defense against viral infections, involving expression of interferons and interleukins, was examined. Activation of the interferon regulatory factor 3 (IRF-3) and the NF-kappaB transcription factor family member p65, both central regulators of the innate immune response to dsRNA, was altered in Chlamydia-infected epithelial cells. polyI:C-induced degradation of IkappaB-alpha, the inhibitor of NF-kappaB, was accelerated in infected cells which was accompanied by a change in nuclear translocation of the transcription factor. Translocation of IRF-3, in contrast, was significantly blocked upon infection. Together the data presented here demonstrate that infection with C. trachomatis can drastically alter the cellular response to dsRNA and imply an impact of chlamydial infections on the outcome of viral super-infections. KW - Chlamydia trachomatis KW - Signaltransduktion KW - Immunreaktion KW - Doppelhelix KW - RNS KW - Apoptosis KW - Apoptose KW - doppelsträngige RNA KW - Immunantwort KW - Apoptosis KW - Chlamydia trachomatis KW - double-stranded RNA KW - innate immunity KW - signal transduction Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46474 ER -