TY - THES A1 - Brüning, Tanja T1 - Biomechanik des Wachslaufens bei Crematogaster (Decacrema)-Partnerameisen von Macaranga-Bäumen T1 - Biomechanics of waxrunning in Crematogaster (Decacrema) ant-partners of Macaranga-trees N2 - Durch die vorliegende Arbeit konnte die große Bedeutung biomechanischer Faktoren für die Ökologie und Evolution von Insekten-Pflanzen-Interaktionen, am Beispiel des Ameisenpflanzen-Mutualismus’ Crematogaster (Decacrema)-Macaranga aufgezeigt werden. Viele Macaranga-Ameisenpflanzen besitzen Sproßachsen mit einem Überzug epikutikulärer Wachskristalle. Nur die Ameisenpartner wachsbereifter Pflanzen können sich problemlos auf den Oberflächen ihrer Wirtspflanzen fortbewegen. Durch die rutschigen, wachsbereiften Sproßachsen werden generalistische Ameisenarten ferngehalten und damit die wachslaufenden Ameisenpartner vor Fraßfeinden und Konkurrenz geschützt. Die Wachsbarrieren fördern zudem die Wirtsspezifität innerhalb dieser Ameisen-Pflanzen-Symbiose und funktionieren so als ökologischer Isolationsmechanismus. Die mechanische Barrierefunktion der Wachsbereifung birgt eine Vielzahl ökologischer Konsequenzen für beide Mutualismuspartner. Ziel dieser Arbeit war es, die proximaten Einzelmechanismen dieser ökologisch wichtigen Barriere aufzuklären, d. h. die Ursache der Rutschigkeit wachsbereifter Macaranga-Oberflächen und den Mechanismus der Wachslauffähigkeit der spezialangepaßten Crematogaster (Decacrema)-Ameisen. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mehrere Mechanismen der Rutschigkeit wachsbereifter Macaranga-Sproßoberflächen für Insekten aufgezeigt werden. Durch die Fortbewegung von Insekten auf epikutikulären Wachskristallen werden Kristalle aus ihrem Verbund herausgebrochen und kontaminieren die Insektentarsen. Auf der Oberfläche der Haftorgane (Arolien) werden die Wachskristalle durch die Haftflüssigkeit partiell angelöst. Hierdurch entsteht ein amorpher Schmierfilm, der wahrscheinlich zu einer Verschlechterung der Haftleistung führt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß unabhängig vom Abbrechen der Kristalle und der Kontamination der Tarsen auch die Mikrorauhigkeit der Macaranga-Oberflächen zu einer Rutschigkeit der Sproßachse führen kann. Sie besitzt einen entscheidenden Einfluß auf die Haft- und Lokomotionsfähigkeit von Insekten. Die Rauhigkeit von Oberflächen führt zu einer Reduzierung der effektiven Kontaktfläche des Aroliums und verringert dadurch die Haftkräfte von Insekten. Die genannten Mechanismen der Rutschigkeit schließen sich nicht gegenseitig aus, sondern können einen synergistischen, bzw. additiven Effekt haben. Bei der Untersuchung der Wachslauffähigkeit der spezialisierten Macaranga-Partnerameisen zeigte sich, daß der unterschiedliche Lauferfolg verschiedener Crematogaster (Decacrema)-Morphospezies nicht auf einer größeren Haftung beruht, sondern vor allem auf einer günstigeren Laufkinematik der Wachsläufer. Durch morphometrische Untersuchungen an acht Crematogaster (Decacrema)-Arten konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, daß Wachsläufer längere Beine haben als Nichtwachsläufer. Diese längeren Beine können zu einem mechanischen Vorteil beim Klettern auf senkrechten Oberflächen führen, da sie zum einen ein weiteres Herumgreifen um den Ast ermöglichen und zum anderen aufgrund des längeren Hebelarms die auf die Vorderbeine wirkenden Zugkräfte reduzieren. Amputationsexperimente zeigten eindeutig, daß die prätarsalen Krallen entscheidend für das Laufen auf wachsbereiften Macaranga-Oberflächen sind, die prätarsalen Haftorgane (Arolien) hingegen nicht. Es ist zu vermuten, daß die Krallen durch das Eintauchen der Krallenspitzen in die Wachskristallschicht Halt finden, wodurch sie theoretisch auf senkrechten Oberflächen jeden Durchmessers Halt finden können. Obwohl quantitative Unterschiede in der Krallenmorphologie (Höhe, Länge und Krümmungsdurchmesser) zwischen Crematogaster (Decacrema)-Wachsläufern und -Nichtwachsläufern nachgewiesen werden konnten, bleibt unklar, ob diese überhaupt eine Rolle für die unterschiedliche Wachslauffähigkeit spielen oder ob eher das Bewegungsmuster während des Einsatzes der Krallen entscheidend ist. Auch bei Crematogaster (Decacrema)-Wachsläufern kommt es zu einem Abbrechen von Wachskristallen und einer Kontamination der Tarsen. Crematogaster (Decacrema)-Wachsläufer zeigen im Vergleich zu -Nichtwachsläufern ein bisher nicht in der Literatur beschriebenes, Putzverhalten der Vorderbeine. Dieses Putzverhalten ist zeitsparend und effektiv in die Lokomotion der Tiere eingebunden und schließt selektiv nur die Reinigung der laufoberflächenkontaktierenden Tarsussegmente ein. Die hier beschriebenen Unterschiede in Morphologie, Kinematik und Verhalten zwischen Crematogaster (Decacrema)-Wachsläufern und -Nichtwachsläufern bringen funktionelle Vorteile der Wachsläufer auf den von ihnen besiedelten, wachsbereiften Macaranga-Pflanzenoberflächen mit sich. Die epikutikuläre Wachsbereifung kann als biomechanischer Schlüsselmechanismus angesehen werden, der im Rahmen der Evolution zu diesen vielschichtigen Veränderungen geführt hat. Die vorliegende Arbeit konnte zugrundeliegende biomechanische Faktoren, die auf beiden Seiten des Mutualismus’ eine Rolle spielen, aufklären. N2 - The present study illustrates the significance of biomechanical factors in the ecology and evolution of insect-plant interactions on the example of the ant-plant mutualism between Crematogaster (Decacrema) ants and -Macaranga trees. Many Macaranga ant-plants possess stems which are covered by epicuticular wax crystals. Only ant partners of waxy plants can move without any difficulty on the surfaces of their host plants. The slippery stems keep away generalist ant species and protect the waxrunning ants from predators and competitors and functions as an ecological isolation mechanism. The mechanical barrier function of the epicuticular wax crystal layer has several ecological consequences for both mutualistic partners. The goal of this study was to clarify the proximate mechanisms underlying this ecologically important barrier. In particular, I investigated why waxy Macaranga surfaces are slippery and how specially adapted Crematogaster (Decacrema) ants are capable of climbing the slippery waxy stems. In this study, several mechanisms underlying the slipperiness of waxy Macaranga stem surfaces were discovered. When moving on waxy stems, insects detach crystals from the compound structure and contaminate their tarsi. The adhesive secretion leads to a partial dissolution of the crystals on the surface of the adhesive pad (arolium). The resulting amorphous substance presumably results in reduced attachment. I showed that independent of detaching wax crystals and tarsal contamination, the slipperiness of the stem surface can also be caused by the microscopic surface roughness of waxy Macaranga surfaces. Microroughness has a major influence on adhesive and locomotive abilities of insects, because it reduces the adhesive pads’ effective contact area and their attachment forces. These mechanisms of slipperiness listed above do not exclude each other, but may have a synergistic or additive effect. The investigation of the waxrunning behaviour suggests that the difference in waxrunning capacity between Crematogaster (Decacrema) morphospecies does not rely on superior adhesion but on morphological and kinematic adaptations. Morphometric analysis of eight Crematogaster (Decacrema) species showed that waxrunners have longer legs than non-waxrunners. Longer legs may be a mechanically advantageous for vertical climbing, because on the one hand a branch can be encompassed further as well as the detachment forces acting on front legs can be reduced by having a larger lever arm. Kinematic analysis of climbing ants demonstrated that this effect is enhanced by the fact that waxrunners spread their legs more out during climbing. Furthermore, during vertical climbing of waxy surfaces the experimentally proved increased distance between front and hind legs of waxrunners can enhance the ant’s stability on these surfaces. Amputation experiments clearly showed that the pretarsal claws are crucial for running on waxy Macaranga surfaces. In contrast, adhesive pads were seldom in contact with the surface, and if so, with only little contact area. In addition, no effect of attachment enhancement could be demonstrated for adhesive pads. It can be assumed that claws attach by inserting their tips into the wax crystal layer, so that the ants are theoretically capable of attaching to any vertical surface, no matter which diameter the object has. Although I found quantitative differences in claw morphology (height, length and radius of curvature) between Crematogaster (Decacrema) waxrunners and non-waxrunners, it is still unclear if these parameters play a role for waxrunning ability or whether the movement pattern during claw usage is the decisive factor. Even Crematogaster (Decacrema) waxrunners break off wax crystals and have contaminated tarsi. I found that only the Crematogaster (Decacrema) waxrunners show a yet undocumented front leg grooming behaviour. This grooming behaviour is time saving and integrated effectively into the running pattern. The described differences in morphology, kinematics and behaviour between waxrunning und non-waxrunning Crematogaster (Decacrema) ants result in a functional advantage of waxrunners on their waxy host plants. The epicuticular wax layer represents a biomechanical key mechanism which has lead to complex changes during evolution. The presented study was able to clarify underlying biomechanical factors on both sides of this ant-plant mutualism. KW - Crematogaster KW - Macaranga KW - Mutualismus KW - Kutikularwachs KW - Crematogaster KW - Macaranga KW - Wachslaufen KW - Mutualismus KW - Crematogaster KW - Macaranga KW - waxrunning KW - mutualism Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21772 ER - TY - THES A1 - Förster, Tanja T1 - Molekulargenetik des Hereditären Angioödems T1 - Molecular genetics of hereditary angioedema N2 - Das Hereditäre Angioödem (HAE) ist eine seltene autosomal dominante Erkrankung, die durch einen angeborenen quantitativen oder funktionellen Defekt des C1-Inhibitors (C1-INH) verursacht wird. Das C1-INH-Protein, ein Serin Protease Inhibitor (Serpin) ist der einzige Inhibitor der C1s und C1r Komponenten des klassischen Wegs der Komplementaktivierung. Weiterhin reguliert er die Aktivierung der Faktoren XI und XII im intrinsischen Teil der Blutgerinnung und die Generierung von Kallikrein im Kontaktsystem. Durch die fehlende Kontrolle dieser Systeme kommt es zur vermehrten Bildung vasoaktiver Substanzen, die für die charakteristischen Symptome wie rezividierende, nicht juckende Schwellungen der Haut und Schleimhäute sowie krampfartige Schmerzen im Abdomen verantwortlich sind. HAE-Attacken werden durch psychologischen und/oder physiologischen Stress ausgelöst und manifestieren sich häufig isoliert im Kehlkopfbereich, wobei die Gefahr des Erstickens durch ein Larynx- oder Glottisödem droht. Die vorliegende Arbeit beschreibt die C1-INH-Genanalyse von 208 Familien mit 359 Mitgliedern, die aufgrund der Differentialdiagnose HAE zwischen 1999 und 2005 von spezialisierten klinischen Zentren eingesandt wurden. Bei 32 Patienten wurden durch Southern-Blot und dHPLC Untersuchungen große Deletionen des C1-INH-Gens nachgewiesen. Weiterhin wurden durch Komplett-Sequenzierung der 8 Exons und angrenzenden Intronbereiche des Gens identifiziert. Bei 96 Familien mit 172 Mitgliedern wurden 80 verschiedene Punktmutationen nachgewiesen, die bei Abschluss der vorliegenden Arbeit nicht in der Literatur beschrieben waren. Die HAE-Datenbank kann als Folge auf insgesamt 279 bekannte Mutationen im C1-INH-Gen erweitert werden. Da viele Patienten Missense-Mutationen unbekannter Kausalität aufwiesen, wurden 29 anhand ihrer Lokalisation oder Homologie ausgewählte Mutationen durch zielgerichtete Mutagenese in einen Expressionvektor eingefügt und anschließend in HEK-293 Zellen exprimiert. Die Funktion der rekombinanten Proteine wurde mittels eines C1-INH-Aktivitäts-Assays überprüft. Während bei den meisten rekombinant exprimierten mutanten Proteinen die Kausalität für das HAE durch sehr geringe C1-INH-Restaktivitäten bestätigt werden konnten, zeigten einige mutante Proteine kaum beeinträchtige Aktivitäten. Die zugrunde liegenden Punktmutationen dürften deshalb sehr seltene Polymorphismen sein. Um weiteren Aufschluss über die Auswirkungen der verschiedenen Mutationen zu erhalten, wurden diese in ein 3D-Modell des C1-INH eingebaut und mit einem wildtypischen C1-INH-Modell verglichen. Das verfügbare Modell, das nicht auf Strukturdaten, sondern auf der Homolgie zu anderen Serpinen beruht und nur die Serpindomäne erfasst, erwies sich jedoch bei einigen inaktivierenden Mutationen als unzureichend bzw. unvollständig. Die C1-INH-Gendiagnostik konnte in den meisten Fällen eine Mutation bei den betroffenen Familien nachweisen und auch Mutationsträger vor der Erstmanifestation lebensbedrohender Symptome identifizieren. Die rekombinante Expression und Aktivitätsmessung mutanter C1-INH-Proteine ist ein nützliches Hilfsmittel um die Kausalität von Missense-Mutationen aufzuklären und liefert wertvolle Einblicke in die Funktion individueller Aminosäuren im C1-INH-Protein. N2 - Hereditary Angioedema (HAE) is a rare autosomal dominant disease due to quantitative or functional deficiency of the C1 inhibitor (C1-INH) protein. The C1-INH protein, a serine protease inhibitor (serpin), is the sole inhibitor of the C1r and C1s components of the classical complement pathway and the major regulator of factors XI and XII in the intrinsic blood coagulation and of plasma kallikrein in the contact system. With C1-INH deficiency, proper control of these systems is lacking and vasoactive peptides are generated in excess and are responsible for the characteristic symptoms like recurrent non pruritic swellings of the skin or mucosa as well as painful crampi of the abdomen. HAE episodes are triggered by psychological and/or physiological stress and often manifest in the laryngeal region with the risk of suffocation. This thesis describes the genetic analysis of the C1-INH gene in 208 families with 359 members which were suspicious for HAE and were sent from specialised outpatient clinics from 1999 to 2005. In 32 patients large deletions of the C1-INH gene were detected by Southern-Blot and dHPLC. Sequencing of all 8 exons and flanking intronic regions revealed 93 point mutations and small deletions/insertions. In 96 families with 172 members 80 different point mutations were detected which have not been published in the literature yet. As a result the HAE-database can be enlarged to 279 known mutations in the C1-INH gene. A large number of patients presented with missense mutations of unknown causality. On the basis of their localisation or homology, 29 mutations were chosen and inserted into an expression vector by site-directed mutagenesis and expressed in HEK-293 cells. The activity of the recombinant proteins was measured by a functional C1-INH assay. While most recombinant proteins resulted in almost no detectable activity thus verifying their causality for HAE, some mutant proteins showed only a reduced activity compared to wildtype. The underlying point mutations are therefore likely to be rare polymorphisms. In order to gain further insight into the effects of different mutations they were modelled into a 3D-model of the C1-INH protein and compared to a wildtype model of the C1-INH. While the model demonstrated remarkable structural alterations for some mutations it failed to do so for other clearly inactivating mutations. Since no 3D-crystallography of C1-INH is available yet, the model is based on sequence similarity of the serpin domain to other serpins with apparent limitations. Routine genetic analysis of the C1-INH gene has identified mutations in most of the HAE families and has characterised several HAE carriers prior to manifestation of life threatening symptoms. Recombinant expression and measurement of the activity of mutated C1-INH proteins is a useful tool to elucidate the causality of missense mutations and helps to characterize the role of individual amino acid residues within the C1-INH protein. KW - Gefäßkrankheit KW - Ödem KW - Erbkrankheit KW - Molekulargenetik KW - Hereditäres Angioödem KW - HAE KW - C1-Inhibitor KW - C1INH KW - Serpin KW - Hereditary Angioedem KW - HAE KW - C1 Inhibitor KW - C1INH KW - Serpin Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20340 ER - TY - THES A1 - Gareiß, Barbara T1 - Einfluss niedermolekularer Protein-Tyrosin-Phosphatasen von Listeria monocytogenes auf die listerielle Genexpression und Virulenz T1 - Influence of low molecular weight protein tyrosine phosphatases of Listeria monocytogenes on the listerial gene expression and virulence N2 - Im Genom von Listeria monocytogenes konnten zwei Gene identifiziert werden, die mutmaßlich für niedermolekulare Protein-Tyrosin Phosphatasen (LMW-PTPs) kodieren, Lmo0938/Ptp-1 und Lmo2540/Ptp-2, beide ähneln LMW-PTPs von B. subtilis. Einzel- und Doppeldeletionen der ptp-Gene beeinflussten die Transkription zahlreicher Gene, wie anhand von Gesamtgenom-DNA-Microarray-Analysen und quantitativer RT-PCR gezeigt werden konnten. Insbesondere waren die Gene für i) die Internaline A und B, ii) den Osmoprotektanten-Transporter OpuC, iii) MCP, notwendig zur Flagellen-Bewegung und iv) eine Anzahl von den Proteinen, die in die Nährstoffaufnahme sowie den intrazellulären Metabolismus involviert sind, in vitro herunterreguliert. Die PrfA-regulierten Virulenzgene wurden in den Mutanten verstärkt exprimiert. Im Wesentlichen konnte das gleiche Transkriptionsmuster in infizierten Caco-2-Enterocyten beobachtet werden. Die verringerte Invasivität (abhängig von InlA) und die Unbeweglichkeit der Mutanten passt zu den Transkriptionsergebnissen. Jedoch wurden weder die intrazelluläre Replikation innerhalb eukaryontischer Wirtszellen noch die Resistenz gegen Stressbedingungen durch die Deletion beeinträchtigt. Die Proteome des Wildtyps und der ptp-Mutanten wurden durch 2-dimensionale Gelelektrophorese verglichen und es zeigte sich, dass die Transkriptionsergebnisse nicht vollständig im Proteom reflektiert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Ptps in die Regulationsnetzwerke des alternativen Stress-Sigmafaktor SigB und von PrfA eingreifen. Der ähnliche Effekt beider Ptps auf die Transkription oder auf den Proteinlevel deutet eine Interaktion oder Kooperation der beiden Enzyme an. N2 - In the genome of Listeria monocytogenes we identified two genes putatively encoding low molecular weight protein-tyrosine phosphatases (LMW PTPs), Lmo0938/Ptp-1 and Lmo2540/Ptp-2, similar to LMW PTPS of B. subtilis and S. aureus. Single and double deletions of the ptp genes affected transcription of numerous genes, shown by whole-genome DNA-microarray analysis and quantitative RT-PCR. In particular the genes for i) the internalins AB, ii) the osmoprotectant uptake system OpuC, iii) MCP, important for flagellar motion, and iv) a number of proteins involved in nutrient uptake and intracellular metabolism, were down regulated in vitro. The PrfA-regulated virulence genes were up regulated in the mutants. Essentially the same transcription pattern was observed in infected Caco-2 enterocytes. The decreased invasiveness (dependent on InlA) and non-motility of the mutants matches the transcription results. However, neither replication within eukaryotic host cells nor resistance against stress conditions was impaired by the deletions. The proteomes of wild type and Ptp-mutants were compared by 2-D-protein gel electrophoresis, surprisingly showing that the transcription results were not completely reflected in the proteome. The results show that the Ptps interfere with the stress sigma factor SigB and PrfA regulatory networks. The similar effect of both Ptps on transcription or on protein level suggests an interaction or cooperation of the two enzymes. KW - Listeria monocytogenes KW - Genexpression KW - Proteintyrosinphosphatase KW - Listeria monocytogenes KW - niedermolekulare Protein-Tyrosin-Phosphatasen KW - Transkriptionsregulation KW - Proteom KW - Invasion KW - Listeria monocytogenes KW - low molecular weight protein tyrosine phosphatase KW - transcription regulation KW - proteome KW - invasion Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19853 ER - TY - THES A1 - Gareiß, Martin T1 - Molekulare Charakterisierung und entwicklungsspezifische Expression der Kernmembranproteine Emerin und MAN1 im Tiermodell Xenopus laevis T1 - Molecular characterization and developmental expression of the nuclear membrane proteins ,emerin’ and ,MAN1’ in the model system Xenopus laevis N2 - Mutationen im humanen Emerin-Gen verursachen beim Menschen eine angeborene Muskelschwäche, die X-gebundene Emery-Dreifuss. Der Phänotyp dieser Störung manifestiert sich in der zweiten und dritten Lebensdekade durch Verkürzungen der Nacken , Ellenbogen- und Achillessehnen, progressiven Muskelschwund am Oberkörper sowie Störung der Reizweiterleitung und eine Kardiomyopathie. Zwar wurden die Funktionen dieses ubiquitären Kernmembranproteins bislang intensiv erforscht, allerdings blieben die krankheitsverursachenden Mechanismen, die für den späten Ausbruch der gewebespezifischen Erkrankung verantwortlich sind, noch weitestgehend unverstanden. Um Erkenntnisse über die pathologische(n) Funktion(en) des integralen Membranproteins Emerin zu gewinnen, wurde dessen spatio-temporäre Transkriptions- und Expressionsmuster während der frühen Embryonalentwicklung im Modellsystem Xenopus laevis charakterisiert. Durch EST-Datenbankanalysen konnten in der pseudotetraploiden Spezies zwei Emerin-Gene (Xemerin1 und -2) identifiziert werden. Im Unterschied zu dem längeren Säuger-Emerin (254 Reste bei Homo sapiens ) konnte allerdings kein Kernlokalisationssignal und auch kein serinreicher Sequenzbereich festgestellt werden. Durch Herstellung monoklonaler Antikörper wurde die subzelluläre und gewebespezifische Lokalisation der Xemerin-Proteine untersucht. Interessanterweise war Xemerin weder in der Immunfluoreszenz noch im Immunblot in Oozyten nachweisbar. Mit dem zweidimensionalen Gelektrophorese-Verfahren NEPHGE konnte gezeigt werden, dass der von uns hergestellte monoklonale Antikörper 59/7 beide Xemerin-Formen erkannte und die Proteine durch unterschiedliche molekulare Massen und isoelektrische Punkte voneinander zu trennen waren. Durch Immunoblotting embryonaler Proteine aus unterschiedlichen Entwicklungsstadien konnte gezeigt werden, dass Xemerin1 und -2 im Laufe der Embryogenese von Xenopus laevis erstmals im Entwicklungsstadium 43 exprimiert werden. Unerwarteterweise konnte durch RT-PCR-Analysen eine Aktivität der Xemerin-Gene während der gesamten Embryogenese belegt werden. Northernblot- und Sequenzanalysen der Xemerin-mRNA zeigten außerordentlich große untranslatierte Bereiche mit snRNP-Bindungsmotiven. Durch zwei voneinander unabhängige Analyseverfahren wurde festgestellt, dass die Xemerin-Genaktivität ab dem Stadium 30 deutlich zunahm. Äußerst interessant war in diesem Zusammenhang die Beobachtung, dass exakt zu diesem Zeitpunkt die Aktivität des XMAN1-Gens, einem weiteren Protein der inneren Kernmembran, signifikant herunterreguliert wurde. Whole-mount in situ Hybridisierungsversuche zeigten einen Xemerin-Expressionsschwerpunkt in neuro-ektodermalen Geweben von Tadpole-Embryonen, wie dies auch von XMAN1 (auch SANE genannt) berichtet wurde. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde angenommen, dass Xemerin und XMAN1 überlappende Funktionen aufweisen. Durch die Herstellung rekombinanter Fusionproteine konnte gezeigt werden, dass XMAN1 eine identische subzelluläre Verteilung wie Xemerin aufwies. In vitro Bindungsassays wiesen eine direkte Wechselwirkung von XMAN1 mit beiden Xemerin-Formen sowie mit Xenopus Lamin A nach. Diese Arbeit konnte durch die Charakterisierung von Xenopus Emerin die Grundlagen für weitere intensive Forschungen legen und zeigt eindeutig, dass das Modellsystem Xenopus laevis mit dem Säugermodell Maus konkurrenzfähig ist, um die krankheitsverursachende Mechanismen der Emery-Dreifuss Muskeldystrophie aufzuklären. N2 - Mutations in the human emerin gene EMD cause a rare form of an inheritated muscle dysfunction of striated muscle, named Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD1; OMIM 310300). The clinical phenotype of this genetic perturbance is manifested in 2nd-3rd decade by contraction of the cervical, elbow and Achilles tendons, by progressive muscle wasting and disturbance of the conduction system and cardiomyopathy, often leading to sudden death. Extensive investigations were made on the functions of this ubiquitous nuclear membrane protein, but the disease causing mechanisms remain obscure leading to the late onset of this tissue specific disease. To allure insights of the pathological function(s) of emerin this work examines the spatio-temporal transcription and expression patterns of emerin during development of the vertebrate model Xenopus laevis. Sequence analysis of EST-databases identified two emerin genes in the pseudo-tetraploid organism Xenopus laevis, Xemerin1 and Xemerin2, respectively. In comparison to the human and murine orthologues Xenopus emerins exhibit both similarities and differences. Structural analyses revealed an N-terminal conserved LEM-domain in the C-terminus and a unique hydrophobic transmembrane domain in the carboxy tail. Unlike the extended mammalian emerin (Homo sapiens 254 residues, Mus musculus 259 residues) neither a nucleus localization signal nor a serinerich region could be detected. However, comparison of the putative phosphorylation sites showed three equivalent sites as for the human emerin. Synthesis of specific monoclonal antibodies and recombinant fusion proteins elucidate the subcellular and tissue-specific localization of Xemerins. Similar to mammalian emerins immunofluorescence microscopy and immunoblotting showed clearly that both Xemerin1 and Xemerin2 are integral nuclear membrane proteins expressing ubiquitously in differentiated cells. Intriguingly, in oocytes Xemerin was undetectable by immunofluorescence and immunoblotting, respectively. Two-dimensional gel electrophoresis NEPHGE proved that our self-made monoclonal antibody 59/7 recognized both Xemerins highlighting two different molecular masses and isoelectric points. Interestingly, Xemerin2 exhibits an increased isoelectric point in 5-days old larvae than in adult somatic culture cells. Immunoblotting of embryonic proteins derived from different developmental stages showed that Xemerin1 and -2 are expressed in stage 43 (Nieuwkoop and Faber, 1975) during Xenopus embryogenesis for the first time. In this context, it is noteworthy that Xenopus A-type lamins – in contrast to previous reports – are already detectable in stage 28. Unexpectedly, RT-PCR analyses proved activity of the Xemerin genes during entire embryogenesis in all stages examined yet. Northern-blotting and sequence analyses of the Xemerin mRNA revealed exceeding untranslated regions with snRNP binding motives. Two independent techniques (band-quantification and quantitative real-time-PCR) bared a significantly increased activity of the Xemerin-genes upon stage 30. Outstanding interest provided the awareness, that exactly at this moment the activity of XMAN1, another inner nuclear membrane protein, was significantly down regulated. Whole mount in situ hybridizations exhibited stressed Xemerin expression in neuro-ectodermal tadpole tissues, as simultaneously reported for XMAN1 (also known as SANE) by to other groups (Osada et al., 2003; Raju et al., 2003). Congruent expression patterns of Xemerin proteins were provided by indirect immunofluorescence of embryonic thin-sections. These results corroborate the theory that XMAN1 and Xemerin could have overlapping functions. At first, recombinant fusion proteins showed an identical subcellular distribution of XMAN1 in comparison with Xemerin. Hence, in vitro binding assays proved direct interaction between Xemerins and XMAN1 as well as with Xenopus A-type lamins. Unfortunately, there is no functional XMAN1 antibody available up to now. Thus, it remains unclear if XMAN1 has overlapping functions with Xemerins during embryogenesis in vivo. Nevertheless, by characterizing Xenopus emerin this work displayed fundamental features for further studies. This opus definitely showed that the model system Xenopus laevis is competitive to the mammalian model ‘mouse’ elucidating the disease causing mechanisms of Emery-Dreifuss muscular dystrophy. KW - Glatter Krallenfrosch KW - Emerin KW - Oozyte KW - Xenopus laevis KW - Emerin KW - MAN1 KW - Oozyte KW - Embryonalentwicklung KW - Xenopus laevis KW - emerin KW - MAN1 KW - oocyte KW - early development Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19869 ER - TY - THES A1 - Großmann, Claudia T1 - Interaktion zwischen der Signaltransduktion von Aldosteron, Mineralocorticoidrezeptor und epidermalem Wachstumsfaktorrezeptor T1 - Cross-talk between Aldosterone / Mineralocorticoid Receptor and EGFR Signaling N2 - Klassischerweise ist der Aldosteron-gebundene MR an der Regulation des Blutdruckes und des Wasser-Elektrolyt-Haushaltes beteiligt. Neuere klinische Studien zeigen allerdings, dass Aldosteron auch an pathophysiologischen Remodelingprozessen im kardiovaskulären und renalen System mitwirkt. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind noch weitgehend unbekannt. Der EGFR ist ein Wachstumsfaktor und heterologer Signaltransduktor für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren von beispielsweise Angiotensin II, Phenylephrin und Endothelin-1. In der Literatur gibt es Hinweise für eine Interaktion zwischen den Signaltransduktionswegen von Aldosteron/MR und EGFR. So können Mineralocorticoide nach zerebraler Ischämie zu einem vermehrten vaskulären Remodeling und einem Anstieg der EGFR-mRNA-Konzentration führen und außerdem eine EGF-induzierte Vasokonstriktion verstärken. Daher wäre eine mögliche Erklärung für die pathophysiologische Wirkung von Aldosteron eine Induktion der EGFR-Expression mit vermehrter Wirksamkeit von vasoaktiven Peptiden. Um diese Hypothese zu überprüfen untersuchten wir in verschiedenen Modellsystemen, ob Aldosteron die EGFR-Proteinexpression erhöht. Dies war sowohl im heterologen CHO-Expressionsystem also auch in MR-exprimierenden Zelllinien und Primärkulturen der Fall. Auch in adrenalektomierten Ratten mit osmotischen Minipumpen bestätigte sich die Aldosteron-induzierte EGFR-Expression in der Aorta, im linken Herzen und der Niere. Über den eng verwandten Glucocorticoidrezeptor ließ sich keine EGFR-Expressionssteigerung auslösen, so dass es sich um einen MR-spezifischen Effekt handelt. Zur Charakterisierung des zugrundeliegenden molekularen Mechanismus, der besonders für therapeutische Interventionen von Interesse ist, wurde die Promotoraktivität des EGFR untersucht. Es zeigte sich bei Aldosteroninkubation eine gesteigerte EGFR-Promotoraktivität im Reporter-Gen-Assay. Die beteiligten Promotoranteile konnten mit Deletionskonstrukten auf zwei DNA-Fragmente eingegrenzt werden. Von Seiten des MR ist die A/B-Domäne für die Interaktion bedeutend, denn ein trunkierter MR mit den Domänen C, D, E und F genügt nicht, um den EGFR-Promoter vollständig zu aktivieren. Um Hinweise für die physiologische und pathophysiologische Bedeutung der Interaktion zwischen MR und EGFR zu erhalten, untersuchten wir sowohl den Einfluß auf die Bildung von Extrazellulärmatrix in glatten Gefäßmuskelzellen als auch auf die Natriumresorption im Sammelrohr der Niere. Als Anhaltspunkt für die vermehrte Bildung von extrazellulärer Matrix wie sie bei Remodelingprozessen vorkommt, quantifizierten wir die Fibronektinsekretion in glatten Muskelzellen der humanen Aorta (HAoSMC). Nach Aldosteroninkubation und besonders bei Koinkubation mit EGF zeigte sich eine vermehrte Fibronektinsekretion ins Medium, die sich durch Hemmer der EGFR-Kaskade normalisieren ließ. Dies unterstützt die Hypothese, dass die Aldosteron-EGFR-Interaktion an der Entstehung von Remodelingprozessen im kardiovaskulären und renalen System beteiligt ist. Neben einem Einfluss auf die Entstehung pathophysiologischer Prozesse im kardiovaskulären und renalen System kommt es über eine Aldosteron-induzierte EGFR-Expression im Sammelrohr der Niere auch zu physiologischen Effekten, nämlich einer Hemmung der Natriumresorption. Diese wirkt der klassischerweise durch Aldosteron vermittelten vermehrten Natriumresoprtion über den epithelialen Natriumkanal (ENaC) entgegen und könnte daher als negative Feedbackschleife Dauer und Ausmaß der Aldosteron-induzierten Natriumresorption limitieren. Zusätzlich zu den klassischen genomischen Wirkungen zeigen Steroide nicht-genotrope Effekte. Beim Aldosteron führen diese MR- und EGFR-vermittelt zu einer Aktivierung der ERK1/2- und JNK-1/2-Kinasen. Die nicht-genotrope Aldosteron-induzierte ERK-Aktivierung ist ferner durch c-Src-Inhibitoren hemmbar und führt zu einer Stimulation der Kerntranslokation des MR. Nicht-genotrope Effekte können folglich unter Beteiligung der EGFR-Signalkaskade die genomischen modulieren. Aldosteron führt ebenfalls zu einem Anstieg der zytosolischen Calciumkonzentration, allerdings ist dieser Effekt unabhängig vom MR. Hieraus folgt, dass die nicht-genotropen Effekte teilweise MR-vermittelt und teilweise MR-unabhängig sind. Insgesamt konnte also auf verschiedenen Ebenen eine Interaktion zwischen Aldosteron/MR und der EGFR-Signalkaskade gezeigt werden, mit Hinweisen für eine Bedeutung bei sowohl physiologischen als auch pathophysiologische Vorgängen. N2 - Classically, aldosterone-bound MR regulates blood pressure as well as salt and water homeostasis. Recent clinical studies have shown that aldosterone can additionally lead to cardiovascular and renal remodeling; however, the underlying mechanisms are still unclear. The EGFR is a growth factor and heterologous signal transducer for G-protein-coupled receptors of for example angiotensin II, phenylephrine and endothelin-1. There are indications in literature that there is cross-talk between aldosterone/MR and EGFR signaling. For example, mineralocorticoids can lead to both enhanced vascular remodeling and an increase in EGFR-mRNA after cerebral injury and they can also augment EGF-induced vasoconstriction. Therefore, one attractive hypothesis to explain the pathophysiological effects of aldosterone is an aldosterone-induced EGFR expression with consequently increased signaling of vasoactive and profibrotic peptides. To evaluate this hypothesis, we tested EGFR expression after aldosterone incubation in different model systems. We found an aldosterone-induced EGFR expression in a heterologous expression system of CHO cells, in endogenously MR-expression cell lines as well as in primary culture. This was also true in the kidney, aorta and the heart of adrenalectomized rats equipped with osmotic minipumps. The closely related glucocorticoid receptor did not lead to enhanced EGFR expression, making this phenomenon MR specific. Because of its possible therapeutical relevance for remodeling processes, the underlying molecular mechanism of the MR/EGFR cross-talk is of special interest. To characterize it we looked at the promoter activity of the EGFR which was enhanced after incubation with aldosterone. Furthermore, we could narrow down the EGFR promoter regions involved in this interaction down to two DNA fragments. Concerning the MR, the n-terminal A/B-domain is necessary to elicit full activation of the promoter while the domains C, D, E and F by themselves are not enough. To gain evidence for the physiological and pathophysiological relevance of the interaction between the MR and the EGFR, we looked at formation of extracellular matrix and sodium reabsorption in the renal collecting duct. As an indicator for enhanced formation of extracellular matrix and remodeling, we measured fibronectin secretion of human aortal smooth muscle cells. After incubation with aldosterone and especially in the presence of EGF, an increase in fibronectin secretion could be measured that was antagonized by inhibitors of the EGFR cascade. This supports the hypothesis that the aldosterone-EGFR cross-talk is involved in cardiovascular and renal remodeling processes. Besides this pathophysiological effect, aldosterone-induced EGFR expression in the renal collecting duct can also lead to a reduction in sodium reabsoption. This counteracts the increase in sodium reabsorption classically induced by aldosterone and can therefore function as a negative feedback loop limiting long-term aldosterone-induced sodium reabsorption. In addition to traditional genomic effects, steroids can also elicit non-genotropic actions. Aldosterone, for example, can lead to MR- and EGFR-mediated activation of ERK1/2 and JNK1/2. The non-genotropic aldosterone-induced ERK activation is also reduced by c-Src-inhibitors and leads to an increase in the cytosolic-nuclear shuttling of the MR. Therefore, the non-genotropic effects can modulate genomic effects via the EGFR pathway. Furthermore, aldosterone can induce a rise in the concentration of cytosolic calcium which is independent on the MR. Consequently, non-genotropic actions are partially mediated by the MR and partially MR-independent. Overall, there is a cross-talk between aldosterone/MR and EGFR signaling on different levels with evidence for relevance for physiological and pathophysiological processes. KW - Aldosteron KW - Corticosteroide KW - Rezeptor KW - Signaltransduktion KW - Epidermaler Wachstumsfaktor KW - Mineralocorticoidrezeptor KW - Aldosteron KW - EGFR KW - kardiovaskuläres Remodeling KW - nicht-genotrope Steroidwirkungen KW - mineralocorticoid receptor KW - aldosterone KW - EGFR KW - cardiovascular remodeling KW - nongenotropic steroid effects Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22260 ER - TY - THES A1 - Götzke, Armin T1 - Entwicklung einer Naturschutzkonzeption in Weinbaugebieten auf der Grundlage einer vergleichenden Untersuchung faunistischer und betriebswirtschaftlicher Parameter praxisüblich und ökologisch erzeugender Weinbaubetriebe T1 - Development of a conservation strategy in winegrowing regions by comparing faunistic and microeconomic parameters of conventional and organic winegrowers N2 - 1) Wenn der Erhalt der biologischen Vielfalt gesellschaftliche Zielvorgabe ist und dafür landwirtschaftlich genutzte Flächen einbezogen werden sollen, sind Maßnahmen zu präferieren, deren Opportunitätskosten gering sind. Diese Arbeit stellt den Versuch dar, solche Maßnahmen am Beispielsystem „Weinbau“ zu entwickeln. 2) Die Anbauform „Weinbau“ ist für diese Studie aus folgenden Gründen besonders geeignet: Rebflächen sind an Standorte mit besonderen klimatischen Bedingungen gebunden, die ebenfalls für Lebensgemeinschaften von Bedeutung sind, die in Deutschland als besonders gefährdet gelten (thermophile und xerothermophile Gemeinschaften). Auch die speziellen, früher artenreichen „Weinbergsgesellschaften“ (Flora und Fauna) verdienen besondere Beachtung; zudem ist in Unterfranken eine starke räumliche Beziehung zwischen Naturschutzgebieten, die thermophile und xerothermophile Artengemeinschaften schützen sollen, und umgebenden Rebflächen gegeben. Weiterhin erscheinen Rebflächen durch die Trennung der Anbaufläche in die Bereiche „Zeile“ (die den linienförmig angepflanzten Reben entspricht) und „Gasse“ (ein etwa zwei Meter breiter Streifen zwischen den Zeilen) hervorragend geeignet, landwirtschaftliche Produktion und biodiversitäts-orientierte Maßnahmen zu verbinden. 3) In der Region „Mainfranken“ (Deutschland, Bayern) wurden drei Vergleichsflächenpaare in Ertragsrebflächen ausgewählt, die einerseits praxisüblich, andererseits nach den Vorschriften des „ökologischen Landbaus“ i.S. des BML wirtschaften. 4) In der naturschutzfachlichen Analyse wurden folgende Gesellschaften der Vergleichsflächen faunistisch untersucht: bodenaktive (epigäische) Spinnen (Araneae), Laufkäfer (Carabidae), Zikaden (Auchenorrhyncha) und Heuschrecken (Saltatoria). Im betriebswirtschaftlichen Teil wurde nach Literaturdaten und Arbeitstagebüchern die Außenwirtschaft der Weinbaubetriebe analysiert. Beide Datengruppen wurden zusammengeführt, um die Auswirkungen betrieblicher Maßnahmen der Außenwirtschaft sowohl im Hinblick auf ihre naturschutzfachliche als auch betriebswirtschaftliche Wirksamkeit zu ermitteln und hieraus Umstellungsstrategien im Weinbau abzuleiten. Zudem wurden die monetären Differenzen quantifiziert, um die Höhe etwaiger Ausgleichszahlungen bestimmen zu können. 5) Die naturschutzfachliche Analyse zeigte, dass mit Ausnahme der Heuschrecken alle Gruppen eine starke Förderung durch den ökologischen Anbau erfuhren; die Förderung betraf sowohl die allgemeine Diversität wie naturschutzfachlich bedeutsame Arten. Diese Effekte konnten vor allem auf den Faktor „Einführung einer struktur- und artenreichen Dauerbegrünung“ sowie auf die Etablierung ungestörter Rückzugsbereiche zurückgeführt werden. Die Veränderungen des Pflanzenschutzes wurden als nicht wirksam eingestuft, die Kupferbehandlungen im ökologischen Weinbau werden sogar als problematisch angesehen. Weiterhin wurde die Maßnahme „Mulchen“ des ökologischen Weinbaus als problematische Maßnahme der Begrünungspflege identifiziert. 6) Die betriebswirtschaftliche Analyse zeigte, dass für die Ertragssituation der Betriebe vor allem der Pflanzenschutz bedeutsam ist. Von der Einführung einer Dauerbegrünung gehen moderate Effekte aus, die zudem oftmals auf eine „Umstellungsphase“ befristet sind. 7) In der Zusammenführung beider Analysen wird ein Anbauschema vorgeschlagen, dass ein modifiziertes Begrünungsmodell nach ökologischer Wirtschaftsweise mit einem modifizierten Pflanzenschutzsystem nach praxisüblicher Wirtschaftsweise kombiniert. Die Kalkulation eines solchen Systems zeigt, dass auf Ausgleichszahlungen verzichtet werden könnte, bzw. geleistete Zahlungen nicht als Kompensation i.e.S., sondern als Anreizzahlungen zu verstehen wären. 8) Die Notwendigkeit einer Überprüfung des entwickelten Schemas in einem Konversionsexperiment wird dargelegt. N2 - 1) Conservation goals on private land need measures that cause low opportunity costs. The aim of this study was to develop such measures using viniculture as study system. 2) Viniculture was chosen, since: (i) vineyards are located in regions where thermophilous species assemblages exist; these assemblages are among the most threatened assemblages in Germany; (ii) there is a strong spacial relationship between conservation areas and surrounding vineyards in Lower Franconia; (iii) vine is planted in rows separated by stripes of up to 3 m width; these stripes allow a broad array of management practises, and some of them may be useful in supporting species diversity. 3) Three matched pairs of vineyards in Lower Franconia (Germany, Bavaria) under conventional and organic cultivation, respectively, were chosen as study sites. 4) Two comparisons were done: The effects of differential agricultural treatment were analyzed (i) faunistically using epigaeic spiders (Araneae), ground beetles (Carabidae), plant hoppers (Auchenorrhyncha) and locusts (Saltatoria) as indicator groups; and (ii) economically using data from the literature and working-logs of the winegrowers covering all relevant expenses and earnings (including pesticide use, management of the ground cover, soil management and quantitative and qualitative yields). 5) In three taxa substantial quantitative (i.e. overall species diversity and abundance) and qualitative (i.e. diversity and abundance of endangered species) positive effects of the organic cultivation could be proven; only for grasshoppers no benefit for endangered species was detected. Effective factors were the establishment of an herbaceous ground cover and the retention of undisturbed areas within the vineyard. Plant protection seemed not to contribute to the promotion of biodiversity under organic cultivation; in the case of copper treatments, even adverse effects on biodiversity are discussed. Another critical treatment was “mulching” (the cutting and chopping of the ground cover with horizontally rotating machines, only conducted in the organically managed vineyards). 6) Analyzing expenses and earnings showed that the differences in plant protection are the main factors contributing to differences in yields (which are less in organic farming). The negative effects of herbaceous ground cover on yields due to water losses are less severe, and often restricted to a transitional period. 7) Combining the results of both analyses’ leads to the following recommendations: A modified soil and ground cover management according to organic cultivation should be combined with a modified plant protection system according to conventional standards. The calculation of the then resulting expenses and earnings shows that no compensation payments are necessary. 8) The need for an experimental verification of the recommended measures is emphasized. KW - Biodiversität KW - Naturschutz KW - Arthropoden KW - Weinbau KW - biodiversity KW - conservation KW - arthropods KW - viniculture Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21989 ER - TY - THES A1 - Krinner, Eva-Maria T1 - Generierung humaner Antikörper-Spezifitäten zur Therapie entzündlicher Erkrankungen T1 - Generation of Human Antibody Specificities for Treatment of Inflammatory Diseases N2 - Der Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) spielt eine zentrale Rolle in entzündlichen Prozessen. Die Behandlung mit Antikörpern, die murines GM-CSF neutralisieren, zeigte signifikante Behandlungseffekte in Maus-Modellen für Rheumatoide Arthritis, Autoimmune Enzephalomyelitis, entzündliche Erkrankungen der Lunge und Psoriasis. Diese Arbeit beschreibt die Generierung des ersten vollständig humanen Einzelketten (scFv)-Antikörpers, der effektiv humanes GM-CSF (hGM-CSF) neutralisiert. Dieser humane scFv-Antikörper wurde mit Hilfe der Phage-Display-Technologie, ausgehend von einem monoklonalen Ratten-Antikörper mit hGM-CSF-neutralisierender Aktivität, konstruiert. In einem ersten Schritt wurde die VH-Domäne des parentalen Ratten-Antikörpers mit einem humanen leichte Ketten V-Repertoire kombiniert. Nach Phage-Display-Selektion wurde ein dominanter Klon identifiziert, der für ein chimäres Ratte/Human scFv-Fragment kodiert. Dieser scFv-Antikörper neutralisiert hGM-CSF mit einer halbmaximalen inhibitorischen Konzentration (IC50) im nanomolaren Bereich. Die humane leichte Kette dieses Klons wurde dann mit einem humanen schwere Ketten V-Repertoire kombiniert. Um die Bindungsspezifität des Ursprungsantikörpers für den neutralisierenden Bereich auf dem Antigen zu erhalten, enthielt dieses Repertoire die Komplementaritäts-bestimmende Region 3 (CDR3) der parentalen VH-Domäne. Nach Phage-Display-Selektion wurden mehrere scFv-Antikörper identifiziert, die hGM-CSF im niedrig nanomolaren Konzentrationsbereich neutralisierten. Das scFv-Fragment mit der höchsten hGM-CSF-neutralisierenden Aktivität (3077) wurde in verschiedene therapeutisch relevante Antikörperformate überführt. Zum einen wurde das scFv-Fragment über einen zusätzlichen C-terminalen Cystein-Rest an ein verzweigtes, 40 kD-grosses Polyethylenglycol (PEG) –Polymer konjugiert. Zum anderen wurde das scFv-Fragment durch Fusion mit humanen konstanten Immunglobulin-Domänen zu einem ganzen IgG1/kappa-Antikörper vervollständigt. Die so generierten Konstrukte mit identischer Spezifität wurden dann in vitro im Hinblick auf Bindungsaffinität, Neutralisierungsaktivität und Stabilität untersucht. Die Konjugation des PEG-Polymers hatte einen vernachlässigbaren Effekt auf das Neutralisierungspotential des scFv-Fragments in vitro, obwohl sie aufgrund einer verlangsamten Assoziationsrate eine reduzierte Bindungsaffinität verursachte. Der humane IgG1-Antikörper zeigte sowohl eine verbesserte Bindungsaffinität als auch eine erhöhte Neutralisierungsaktivität im Vergleich zum nicht-PEGylierten wie auch zum PEGylierten scFv-Fragment. Wir konnten außerdem zeigen, dass die PEGylierung in der thermischen Stabilität des scFv-Antikörpers einen deutlichen Anstieg um 10°C vermittelte. Aufgrund der hohen Neutralisierungsaktivität und Stabilität des IgG1-Antikörpers 3077 wie auch des PEGylierten scFv-Fragments 3077 sind beide Moleküle - in unterschiedlichen klinischen Anwendungsbereichen - potentielle Kandidaten für eine Behandlung humaner entzündlicher Erkrankungen. N2 - Granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) plays a central role in inflammatory processes. Treatment with antibodies neutralizing murine GM-CSF showed significant effects in mouse models of rheumatoid arthritis, lung inflammation, autoimmune encephalomyelitis and psoriasis. This work describes the generation of the first human single-chain antibody (scFv) potently neutralizing human GM-CSF (hGM-CSF). This human scFv fragment was constructed by phage display technology starting from a rat monoclonal antibody with hGM-CSF neutralizing activity. In a first step the VH domain of the parental rat antibody was combined with a human light chain variable (V) repertoire. After phage display selection one dominant clone was identified which encoded a chimeric rat/human scFv antibody neutralizing hGM CSF with a low nanomolar half-maximal inhibitory concentration (IC50). The human light chain of this clone was then combined with a human heavy chain V repertoire. The latter preserved the complementary determining region (CDR) 3 of the parental rat VH domain to retain binding specificity to the neutralizing binding area on the antigen. After phage display selection, several human single-chain antibody fragments were identified that efficiently neutralized human GM-CSF at low nanomolar concentrations. The most potent GM-CSF neutralizing human scFv fragment (3077) was further engineered to different antibody formats with relevance for therapeutic application. On the one hand, the scFv fragment was conjugated to a branched 40 kDa polyethylene glycol (PEG) polymer via an additional C-terminal cysteine residue. On the other hand, the scFv fragment was converted to a human IgG1/kappa-antibody by fusion with human constant immunoglobulin domains. The naked scFv, the PEGylated scFv and the IgG antibody of identical specificity were then compared to each other in terms of binding affinity, neutralizing activity and stability in vitro. PEG conjugation had a neglegible effect on the in vitro neutralizing potential of the scFv fragment although it caused a significant drop in binding affinity due to a reduced on-rate. The human IgG1 antibody variant showed an improved equilibrium dissociation constant as well as neutralizing activity superior to the non-PEGylated and the PEGylated scFv fragment. We also demonstrated that PEGylation mediates a significant increase in thermal stability of about 10°C as compared to the naked scFv fragment. Because of the high neutralizing activity and stability the IgG1 3077 antibody as well as the PEGylated scFv fragment 3077 both are - in different clinical settings - potential candidates to treat pro-inflammatory human diseases. KW - GM-CSF KW - Antikörper KW - Entzündung KW - Therapie KW - Antikörper KW - GM-CSF KW - Phage-Display KW - antibody KW - GM-CSF KW - phage display Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20295 ER - TY - THES A1 - Kusnezow, Wlad T1 - Entwicklung von Antikörper-Mikroarray : von Biophysik der Mikrospot-Reaktion bis zur Hochdurchsatzanalyse der Proteine T1 - Development of antibody microarray: from biophysics of microspot reaction to high throughput analysis of proteins N2 - Obwohl Protein-Mikroarrays ursprünglich aus dem gut entwickelten und fest etablierten DNA-Pendant entstanden sind, repräsentierte jedoch die Umstellung der Mikroarray-Technik von der DNA- auf die Proteinanalyse aufgrund der enormen physikalisch-chemischen Variabilität der Proteine, deren relativ niedrigen Stabilität und der komplexen Mikrospot-Kinetik eine große technologische Herausforderung. Deshalb setzt das Vorhaben, die Technik der Antikörper–Mikroarrays von ihrem konzeptuellen Zustand ausgehend zu einem robusten, real funktionierenden Werkzeug zu etablieren, nicht nur eine Vielzahl an technologischen Lösungen, sondern auch eine systematische und physikalisch begründete Herangehensweise in dieser technologischen Entwicklung voraus. Das waren im Wesentlichen die zwei wichtigsten, der eigentlichen Entwicklung der Antikörper-Mikroarrays untergeordneten Ziele der Arbeit. Mit dem Ziel, Antikörper-Mikroarrays prinzipiell zu etablieren und eine optimale Immobilisierungschemie für deren Herstellung zu finden, wurden im ersten Teil dieser Arbeit mehrere chemische Beschichtungen von Glasslides optimiert, unterschiedliche Spotting-Bedingungen von Antikörpern für verschiedene Oberflächen getestet und verschiedene Blockierungsverfahren und Strategien zur Aufbewahrung von Slides analysiert. Anschließend wurde eine Reihe von kommerziellen und selbst hergestellten chemisch beschichteten Slides unter den optimierten Bedingungen miteinander verglichen. Als Hauptergebnis dieser Untersuchung wurde die Herstellung der Antikörper-Microarrays etabliert. Unter anderem konnte im Zuge dieser systematischen Analyse gezeigt werden, dass Epoxysilan-modifizierte Oberflächen am besten geeignet sind. Diese Oberfläche ist heutzutage auf dem Gebiet der Protein-Microarrays am weitesten verbreitet und wurde für alle weiteren Studien innerhalb dieser Dissertation verwendet. Die Entwicklung der Antikörper-Mikroarrays in den letzten Jahren demonstrierte erhebliche Schwierigkeiten im Erreichen der nötigen Sensitivität und Reproduzierbarkeit. Um dieser Problematik auf den Grund zu gehen, und die Mikrospot-Kinetik experimentell untersuchen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine modifizierte und für den Fall der Mikrorrays angepasste Variante des Two-Compartment Modells (TCM) entwickelt. TCM ermöglicht auf eine phänomenologische Weise, d.h., dass Diffusionskoeffizienten, Mischintensität oder Dichte der Bindungsstellen nicht bekannt sein müssen, eine quantitative experimentelle Analyse der Mikrospot-Kinetik unter Berücksichtigung von Effekten des Massentransports. Um die phänomenologischen TCM-Werte interpretieren zu können und um den Mechanismus der Mikrospot-Reaktion zu untersuchen, wurden auch andere, für die Mikrospot-Kinetik relevante, klassische Theorien an die Bedingungen der Mikrospot-Reaktion angepasst und mit dem modifizierten TCM mathematisch verbunden. Als das erste in der Mikroarray-Technologie mathematisch-physikalische Werkzeug dieser Art hat die hier entwickelte Theorie ein großes Potential, auch in den anderen verwandten Techniken wie DNA- oder Peptid-Mikroarrays Verwendung zu finden. Außerdem wurde innerhalb dieser Arbeit ein anderes einheitliches theoretisches Modell entwickelt, das eine kinetische Simulation von verschiedenen Reaktionsphasen sowohl für konventionelle als auch für Mikrospot-Immunoassays ermöglicht. Im Rahmen dieser Arbeit konnte für einen typischen Standard-Antikörper-Mikroarray theoretisch und experimentell eine lang andauernde, stark massentransportabhängige Mikrospot-Kinetik beschrieben werden. Es konnte gezeigt werden, dass das Erreichen eines thermodynamischen Gleichgewichts in Mikroarrays wegen eines relativ langsamen Ligandentransports zum Spot eine lange Zeit dauert, je nach Bindungskonstante, Diffusionsgeschwindigkeit und Ligandenkonzentration mehrere Stunden bis hin zu Wochen. In dieser Arbeit wurde ein neues physikalisches Konzept, das dem heutzutage dominierenden Blickwinkel, der sogenannten ambient analyte Theorie, opponierend gegenübersteht, formuliert. Auch konnten viele Konsequenzen fürs Design und die zukünftige Entwicklung dieser relativ neuen Technologie gezogen werden. Als eine logische Folge der massentransportlimitierten Reaktionen ist das Design eines Antikörper-Mikroarray ein kritischer Punkt für die Leistung des Verfahrens. Im Laufe der experimentellen und/oder theoretischen Betrachtungen konnte gezeigt werden, dass eine Reihe allgemeiner Parameter wie Größe eines Spots, Spotting-Muster, Inkubationsgeometrie, Volumen und Konzentration einer Probe, Viskosität des Inkubationspuffers und Mischintensität die Reaktionsraten auf den Spots insgesamt um mehrere Größenordnungen beeinflusst. Ist die maximale Rate des Massentransports in einem Mikroarray-Verfahren gewährleistet, kann dann auch die maximale Bindungsleistung der Spots, die durch die Dichte der Bindungsstellen, Bindungsaffinität, Inkubationszeit und andere relevante Parameter eingestellt wird, erreicht werden. Aber nicht nur in der Inkubationsphase, sondern auch bei den Wasch- und Detektionsschritten sollte die gleiche Liste der Parameter berücksichtigt werden. Durch die Optimierung all dieser Parametern konnte eine deutliche Verbesserung der Sensitivität von Antikörper-Mikroarrays in der Protein-Expressionsanalyse von klinischen Blutproben erzielt werden In einer weiteren Studie zur Analyse von unterschiedlichen Detektionsverfahren konnte die Sensitivität und Reproduzierbarkeit der etablierten Antikörper-Mikroarrays weiter verbessert werden. Eine Reihe unterschiedlicher Markierungssubstanzen mit NHS (N-hydroxysuccinimide) und ULS (universal linkage system) reaktiven Gruppen wurden innerhalb drei Detektionsverfahren untersucht: 1) eine direkte Probenmarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, 2) Markierung der Probe mit Biotin-Substanzen und nachfolgender Detektion mittels fluoreszenzmarkierten Extravidin und 3) Markierung der Probe mit Fluorescein-Substanzen mit Anti-Fluorescein-Detektion. Aus den Erfahrungen der vorherigen kinetischen Untersuchungen wurde hier vorerst das kinetische Verhalten des Testsystems analysiert und optimale Inkubationsbedingungen festgelegt. Anschließend wurden optimale Konzentrationen all dieser Substanzen für die Markierung von Blutplasma bestimmt. Im Vergleich zur direkten Fluoreszenzmarkierung resultierten sich die indirekten Detektionsverfahren mit Biotin- und Fluorescein-Substanzen in wesentlich besseren Signal-zu-Hintergrund-Verhältnissen. In einer anschließenden Vergleichsanalyse zeigten sich einige Substanzen wie Biotin-ULS oder Fluoresceine-NHS als am besten geeignet für eine Protein-Expressionsanalyse von Blutplasma. Sensitivitäten im femtomolaren Bereich konnten mittels der etablierten Antikörper-Mikroarrays sowohl für eine markierte Antigenmischung als auch für komplexe klinische Proben innerhalb dieser Dissertation erzielt werden. Viele niedrig konzentrierte Proteine wie beispielsweise Zytokine, die normalerweise in einer piko-oder femtomolaren Konzentration im Blut vorliegen, wurden in dieser Arbeit mit sehr hohen Signal-zu-Hintergrund-Verhältnissen detektiert. Das hier beschriebene Verfahren öffnet zusätzliche Möglichkeiten für schnelle, kostengünstige und unbeschränkt erweiterungsfähige Mikrospot-Immunoassays. N2 - Although protein microarrays are superficially similar to DNA microarrays, the conversion of microarray technology to the protein world still represents a big technological challenge because of the enormous physicochemical variability and relatively low stability of proteins as well as complex microspot kinetics. Therefore, the intention of developing the concept of antibody microarray into a really functioning tool requires a multiplicity of technological solutions as well as a systematic and physically justified approach in this technological development. These were essentially the two most important goals while developing antibody microarrays. Aiming to establish antibody microarrays in principle und to find optimal antibody immobilization chemistry, several chemical coatings of glass slides, antibody spotting conditions for different surfaces, different blocking procedures and strategies for slides storage were analysed and optimised in the first part of this dissertation. Subsequently, a set of commercial and home-made chemically coated slides was compared under these optimized conditions. As a main result, manufacturing of antibody microarrays was established. Among other things, the epoxysilan surface was found to be best suitable for fabrication of antibody microarrays in course of this systematic analysis. This kind of chemical coating is nowadays one of the most popular in the protein microarray field and it was also used in all other studies presented here. The development of antibody microarray technology in the last years demonstrated substantial difficulties trying to achieve the required sensitivity and reproducibility. In order to get the bottom of this issue and to be able to examine microspot kinetics experimentally, the so-called two-compartment model (TCM) was modified and adapted for the case of microrrays in this work. TCM enables a quantitative experimental analysis of microspot kinetics with regard to effects of mass transport. It is a phenomenological model, so that one does not need to know density of binding sites or any parameters of mass transport such as diffusion coefficient or mixing intensity. To be able to interpret the phenomenological reaction descriptors of TCM and to investigate reaction mechanism, some relevant theoretical models were also adapted for the case of microspot reaction as well as were mathematically joined with the modified TCM. Our theory is the first mathematical tool of this sort in the microarray technology and it has therefore a lot of potential to be applied also in the other related techniques such as DNA or peptide microarrays. Additionally, another uniform theoretical model was developed in this work. It enables a kinetic simulation of different reaction regimes for the case of conventional as well as microspot immunoassays. Long-lasting and strongly mass transport dependent microspot kinetics was described in this work, both theoretically and experimentally. The attainment of the thermodynamic equilibrium in microarrays may require many hours, days or even weeks due to a relatively slow ligand transport to spots. A new physical concept, which represents the opposite view to the today’s most widespread concept, so called ambient analyte theory, could be formulated in consequence of this investigation. Also, we could draw many consequences for design and future development of this relatively new techique. As a logical consequence of the mass transport limited reactions, proper assay design is cruicial for performance of antibody microarrays. In the course of our experimental and/or theoretical considerations, it was shown that a number of general parameters such as size of a spot, spotting pattern, incubation geometry, volume and concentration of a sample, viscosity of incubation buffer and mixing intensity could altogether affect signal velocity by many orders of magnitude. If the maximum rate of mass transport in a microarray procedure is ensured, then also the maximum binding capacity of spots could be achieved by adjusting such parameters as density of binding sites, binding affinity, incubation time etc. The same factors should be also considered for washing and detection steps in a kinetically relevant design of microarray procedure. Optimizing these parameters, the performance of antibody microarrays as applied for protein profiling of clinical specimens could be strongly improved. A significant improvement of the antibody microarray performance as applied for protein profiling of clinical blood samples could be also achieved in a further study aiming to analyze different detection approaches. A number of labeling substances containing either NHS (N-hydroxysuccinimide) or ULS (universal linkage system) reactive groups was examined within three general detection procedures: 1) direct sample labeling with fluorescence dyes, 2) sample labelling with biotin- containing substances with subsequent detection using fluorescently labeled extravidin and 3) sample labelling with fluorescein-substances with detzection by anti-fluorescein. Based on the experience of the previous kinetic investigations, kinetic behavior of the applied test system was first analyzed in this study to find optimal incubation conditions. Also, optimal blood plasma labelling concentration for every analyzed substance was determined in this study. The indirect detection approaches (biotin/extravidin and fluorescein/anti-fluorescein) resulted in substantially better signal-to-noise ratios as compared to direct fluorescent labeling. Some substances such as biotin-ULS or fluorescein-NHS were found to be best suitable for microarray-based protein profiling of blood plasma. Using the established antibody microarrays, sensitivities in the fM range could be attained in this dissertation both for a labeled mix of antigens as well as for complex clinical samples. Many low abundant proteins as for example cytokines, which are normally present in a pM-fM concentration in the blood, was detected in this work with very high signal-to-noise ratios. The approach described here opens additional possibilities for fast, economical and unrestricted multiplexing microspot immunoassays. KW - Microarray KW - Antikörper KW - Antikörper-Mikroarray KW - Oberflächenchemie KW - Kinetik KW - Fluoreszenz KW - Blutserum KW - antibody microarray KW - surface chemistry KW - kinetics KW - fluorescence KW - serum Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22534 ER - TY - THES A1 - Löffler, Daniela Inge Martina T1 - Untersuchungen virulenzattenuierter Listeria monocytogenes Stämme als Impfstoffträger im Mausmodell T1 - Virulence-attenuated Listeria monocytogenes strains as vaccine carrier in vivo N2 - Virulenzattenuierte Stämme des Gram-positiven Pathogens Listeria monocytogenes (Lm) stellen optimale Kandidaten als Träger für heterologe Proteinantigene in die Maus dar. Lm repliziert nach Befreiung aus dem primären phagosomalen Kompartiment sehr effizient und schnell im Zytosol sehr vieler nicht-phagozytischer Wirtszellen als auch in professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APC). Diese Fähigkeit in relevante immunologische APCs einzudringen und zu replizieren, erlaubt die zielgerichtete Übertragung heterologer Antigene in die MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Präsentationswege, um so eine effektive zelluläre Immunität zu etablieren. In der vorliegenden Arbeit wurden die in vivo Effizienzen der Aktivierung von antigen-spezifischen CD8+ and CD4+ T-Zellen miteinander verglichen, sobald das plasmidkodierte Proteinantigen Ovalbumin (OVA) in Form von bakteriell exprimierten und exportierten Proteinen, von cDNA oder mRNA durch die jeweiligen virulenzattenuierten Lm trpS Stämme in das Zytosol von antigenpräsentierenden Zellen freigesetzt wurde. Die Freisetzung wurde durch ein Listeria-spezifisches Phagenlysin, welches von den Bakterien vorwiegend im Zytosol der Wirtszelle exprimiert wird, unterstützt. Die Übertragung dieser unterschiedlichen biologisch-aktiven Moleküle durch die autolysierenden Listerien führte im Falle des Proteins und der mRNA erfolgreich zu einer MHC-Klasse-I-Präsentation eines Ovalbumin-Peptides (SIINFEKL), welche letztendlich eine adaptive zelluläre Immunität unter Beteiligung von T-Gedächtniszellen induzierte. Dabei stellte sich die Übertragung des Proteins durch Lm als die effizienteste Strategie im Induzieren einer zellulären adaptiven Immunantwort mit gegen Ovalbumin gerichteten CD8 und CD4 T-Gedächtniszellen heraus. Autolysierende Listerien, welche die plasmidkodierende OVA-DNA übertrugen, lösten dagegen keine OVA-spezifische T-Zellantwort aus. Da sich der Trägerstamm Lm trpS aufgrund der Autolysiskassette zwar als virulenzattenuiert herausgestellt hatte, jedoch bei höher Applikationsdosis dieses Stammes es nur zu einer unvollständigen Lysis kam, wurden die jeweiligen Effizienzen weiterer noch stärker attenuierter autolysierender Lm Stämme als Überträger des Ovalbumins (Lm Mutanten trpS hlyW491A und (trpS aroA aroB)) bestimmt. Beide ermöglichten die OVA-Präsentation über MHC-Klasse-I-Moleküle mit nachfolgender klonaler Expansion spezifischer CD8+ T-Zellen in vergleichbaren signifikanten Werten zum WT Stamm trpS. Ferner wurde zum ersten Mal eine signifikante Präsentation des OVAs über MHC-Klasse-I-Moleküle durch die autolysierende Mutante trpS hlyW491A, welche die plasmidkodierende DNA freisetzte, nachgewiesen. Die autolysierende Lm (trpS aroA aroB) Mutante in hoher CFU (5107) stellte sich dabei als ein sehr vielversprechender Träger des heterologen Proteinantigens heraus, da sie im Gegensatz zum autolysierenden Stamm Lm trpS eine sehr geringe Leberschädigung hervorrief. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, das durch Freisetzung von OVA Antigenen in das Zytosol oder ins Phagosom von APCs, welche von den jeweiligen Lm (trpS aroA aroB) Stämmen als exportiertes, zellwandverankertes oder intrazellulär verbleibendes Protein exprimiert wurden, vergleichbare Häufigkeiten an proliferierten OVA-spezifischen CD8+ T-Zellen induzierten werden konnten. Es zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede in der Aktivierung antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen durch diese Lm (trpS aroA aroB) OVA-Trägerstämme. Die Strategie der Übertragung exportierter Proteine ins Phagosom oder ins Zytosol antigenpräsentierender Zellen war die wirkungsvollste, um gleichzeitig effiziente MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-restringierte Antigenpräsentationen in vivo zu induzieren. Es wurden alternative plasmidkodierende Lysiskassetten für die Freisetzung von DNA-Vakzinen (Baktofektion) aus den Bakterien konstruiert, die alle aus Lyseproteinen eines Listeria-spezifischen Phagens und einem vorangestellten zytosolischen listeriellen Promotor bestehen. Diese wurden in ihrer Effizienz mit der ursprünglich eingesetzten Lysiskassette PactA-ply118 verglichen. Dabei wurde beobachtet, dass zwei von den vier neukonstruierten Lysiskassetten in einige Zellinien vergleichbare Baktofektionsraten erzielten. Jedoch ist die ursprüngliche Phagenlysin-Kassette PactA-ply118 für die Übertragung von Plasmid-DNA in das Zytosol von Wirtszellen die wirksamste, da diese in vivo zu einer besonders hohen Attenuation der Bakterien führte. N2 - Virulence-attenuated strains of the Gram positive pathogen Listeria monocytogenes (Lm) are optimal candidates for the delivery of heterologous antigens into mammalian hosts. Lm escapes the phagosome, replicates efficiently within the cytosol of many host cells including appropriate cells of the immune system like macrophages and dendritic cells (antigen presenting cells, APCs). These natural biological properties of Lm to enter and replicate in relevant immunological APCs allow the targeted delivery of heterologous antigens into the antigen-processing pathway of MHC class I and MHC class II molecules leading to a strong cellular immunity. In this work, the in vivo efficiences of activation of antigen-specific CD8 and CD4 T cells were compared when the plasmid-encoded protein antigen ovalbumin was secreted by the bacteria as a protein or delivered as cDNA or as mRNA. Delivery was supported also by a specific endolysin produced by the bacteria. Listeriae harbouring this transcriptional unit undergo lysis when they reach the cytosol. In the case of OVA as protein or as mRNA, delivery of these different biological active molecules by autolysing Listeria resulted in significant OVA peptide (SIINFEKL) presentation in the context of MHC class I molecules, which also induced an adaptive cellular immunity with memory T cells. Secretion of OVA by the carrier bacteria yielded the strongest immune response involving OVA-specific memory CD8 and CD4 T cells. In contrast, infection with autolysing Listeria delivering OVA-encoded DNA failed to generate OVA-specific T cells. Due to its harbouring of the autolysing cassette, carrier strain Lm trpS was virulence-attenuated, but infection with 5107 bacteria of this strain resulted in a partial lysis. Therefore investigation of other attenuated and also autolysing strains (Lm mutants trpS hlyW491A and (trpS aroA aroB)) was necessary. Both these strains facilitated OVA presentation via MHC-class-I molecules resulting in clonal expansion of specific CD8+ T cells in comparable frequencies as the wild-type strain. Furthermore, autolysing Lm trpS hlyW491A delivering OVA-encoded DNA led to specific presentation of OVA in the context of MHC class I molecules. Additionally, autolysing Lm (trpS aroA aroB) strain with high infection dose (5107) is a promising carrier for heterologous protein antigens because this mutant exhibited only marginal liver toxicity in contrast to the strain Lm trpS. In this regard, comparable frequencies of proliferated OVA-specific CD8+ T cells were induced through the delivery of OVA antigens into phagosome or cytosol of APCs that were expressed as secreted proteins, as anchored-proteins or as intracellular proteins by the respective carrier Lm strains (trpS aroA aroB). Activation of antigen-specific CD4+ T cells by these OVA-carrier Lm (trpS aroA aroB) was different compared to activation of antigen-specific CD8+ T cells. Secretion of OVA by the carrier bacteria yielded the strongest activation of both MHC-class I and II restricted antigen presentation in vivo. Different lysis cassettes were tested consisting of Listeria-specific phage lysis proteins and an intracellular promoter of Listeria for the delivery of DNA vaccines (bactofection). The efficiency of these cassettes was compared to the original cassette (PactA-ply118). Two of the four new cassettes achieved comparable bactofection rates in some cell lines as the originally used cassette. However, the Lm strain containing the cassette PactA-ply118 was found to be the most effective due to high attenuation in mice. KW - Listeria monocytogenes KW - Attenuierung KW - Impfstoff KW - Maus KW - Listeria monocytogenes KW - Impfstoffe KW - Mausmodell KW - Listeria monocytogenes KW - vaccines KW - in vivo Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18728 ER - TY - THES A1 - Mauder, Norman T1 - Vergleichende Untersuchung der Internaline und PrfA-abhängigen Transkription in Listeria monocytogenes, L. ivanovii und L. seeligeri T1 - comparative study of internalins and PrfA-dependent transcription in Listeria monocytogenes, L. ivanovii and L. seeligeri N2 - Die Gattung Listeria umfasst sechs bekannte Arten ubiquitär vorkommender Gram-positiver, nicht sporulierender Stäbchenbakterien. Von diesen Spezies sind Listeria monocytogenes und L. ivanovii in der Lage bei Mensch und Tier das Krankheitsbild der Listeriose zu verursachen (Rocourt & Seeliger, 1985; Vázquez-Boland et al., 2001b; Weis & Seeliger, 1975), wobei L. ivanovii vorwiegend bei Tieren als Krankheitserreger vorkommt (Cummins et al., 1994; Hof & Hefner, 1988). L. monocytogenes gilt als wichtiges Modell für ein intrazelluläres Pathogen, das mit Hilfe seiner Internaline auch in nicht-professionelle Phagozyten invadieren (Gaillard et al., 1991; Lingnau et al., 1995) und sich dank einer Reihe weiterer Virulenzfaktoren im Zytoplasma vermehren, fortbewegen und Nachbarzellen infizieren kann (Tilney & Portnoy, 1989). Die beiden pathogenen Arten und das apathogene L. seeligeri besitzen eine als LIPI-1 bezeichnete Pathogenitätsinsel (Gouin et al., 1994; Kreft et al., 2002). Internalingene sind bei L. monocytogenes teilweise geclustert und bei L. ivanovii zu einem großen Teil in einer LIPI-2 genannten Pathogenitätsinsel organisiert (Domínguez-Bernal et al., 2006; Dramsi et al., 1997; Gaillard et al., 1991; Raffelsbauer et al., 1998). Die Expression vieler dieser Virulenzgene wird durch das zentrale Regulatorprotein PrfA gesteuert, dessen Gen prfA selbst Teil der LIPI-1 ist (Domínguez-Bernal et al., 2006; Leimeister-Wächter et al., 1990; Lingnau et al., 1995; Mengaud et al., 1991a). Im Rahmen dieser Arbeit sollten die Internaline InlC, InlE, InlG und InlH von L. monocytogenes näher untersucht werden. Dazu wurden rekombinante His6-markierte Internaline aufgereinigt und polyklonale Antiseren gegen die Internaline A, B, E, G und H hergestellt. Darüber hinaus gelang die Herstellung zweier monoklonaler Antikörper gegen InlG. Obwohl die Antikörper gegen InlG und InlE ihre rekombinanten Antigene gut dekorieren, konnten mit ihnen keine Proteine in Zellwand- oder Überstandspräparaten von L. monocytogenes EGD und EGDe detektiert werden. Das Antiserum gegen InlH kreuzreagierte mit InlA und auch schwach mit anderen Internalinen. In Zellwandpräparaten von L. monocytogenes dekorierte es ein ~50 kDa schweres Protein, welches mit InlH identisch sein könnte. Es fehlt in inlG/H/E Deletionsmutanten und wird in einer inlA/B Deletionsmutante stärker exprimiert. Im Kulturüberstand ist es etwas schwerer, wie man es von einem Protein mit LPXTG Motiv erwartet, das nicht von Sortase (Bierne et al., 2002; Garandeau et al., 2002) prozessiert wurde. In L. monocytogenes EGDe wird dieses ~50 kDa Protein um ein bis zwei dekadische Größenordungen stärker exprimiert als in L. monocytogenes EGD. Die Expression des Proteins war bei 30 und 37 °C gleich stark und wurde nicht durch PrfA reguliert. In Zellwandpräparaten von L. ivanovii ATCC 19119 dekorierten die Seren gegen InlA und InlH ein Protein das in seiner Größe dem InlA von L. monocytogenes entspricht. Mit Hexosaminidase Assays zur Untersuchung von Zelladhärenz (nach Landegren, 1984) an rekombinante His6-markierte Internaline konnte keine Interaktion der Internaline InlE, InlG oder InlH mit Oberflächenfaktoren von Caco-2, HeLa oder HepG2 Zellen nachgewiesen werden, während Positivkontrollen mit InlA und InlB weitestgehend erwartungsgemäß ausfielen. InlC besitzt jedoch offenbar einen bisher noch nicht genauer identifizierten Rezeptor auf der Zelloberfläche. An InlC und EGF adhärierten Caco-2 Zellen stark wachstumsphasenabhängig und etwa tausendfach schwächer als an InlA. Die beste Bindung erfolgte bei semikonfluent gewachsenen Zellen, die am Vortag ausgesät wurden. Unter diesen Bedingungen war auch die von Bergmann et al. beobachtete unterstützende Wirkung von InlC auf die InlA-abhängige Invasion am größten (Bergmann et al., 2002). In dieser Arbeit wurden außerdem die Promotoren von Internalingenen aus L. ivanovii, sowie weitere Virulenzgene (plcA, hly, actA) der Spezies L. monocytogenes, L. ivanovii und L. seeligeri mit Hilfe eines zellfreien in vitro Transkriptionssystems (Lalic-Mülthaler et al., 2001) untersucht, um deren PrfA-Abhängigkeit und Aktivität unabhängig von physiologischen Faktoren analysieren zu können, da die PrfA-Aktivität in vivo pleiotrop reguliert wird (Dickneite et al., 1998; Ermolaeva et al., 2004; Milenbachs et al., 1997; Milenbachs Lukowiak et al., 2004; Renzoni et al., 1997; Ripio et al., 1996). Dafür wurde in dieser Arbeit RNA-Polymerase aus L. monocytogenes ΔprfA ΔsigB (Stritzker et al., 2005) isoliert. Gleichzeitig wurde die Aktivität von rekombinanten His6-markierten PrfA Proteinen untersucht. Dazu wurden die PrfA Proteine von L. monocytogenes (m-PrfA und hyperaktives m-PrfA* (Ripio et al., 1997b)), L. ivanovii (i-PrfA) und L. seeligeri (s-PrfA), so wie ein Hybridprotein (sm-PrfA) aufgereinigt. Das Hybridprotein sm-PrfA entspricht s-PrfA bis auf die letzten 38 Aminosäurereste, die durch jene von m-PrfA ersetzt wurden. ... N2 - The genus Listeria comprises six known species of ubiquitous Gram-positive, non-sporulating, rod-shaped bacteria. Of these species Listeria monocytogenes and L. ivanovii are able to cause the clinical picture of listeriosis in humans and animals (Rocourt & Seeliger, 1985; Vázquez-Boland et al., 2001b; Weis & Seeliger, 1975) with L. ivanovii predominantly occurring in animals (Cummins et al., 1994; Hof & Hefner, 1988). L. monocytogenes is considered as important model of an intracellular pathogen that can also invade non-professional phagocytes with the aid of internalins (Gaillard et al., 1991; Lingnau et al., 1995) and can multiply and spread due to a set of virulence factors (Tilney & Portnoy, 1989). The two pathogenic species and the apathogenic L. seeligeri possess a pathogenicity island termed LIPI-1 (Gouin et al., 1994; Kreft et al., 2002). In L. monocytogenes internalin genes are partially clustered and mainly form a pathogenicity island termed LIPI-2 in L. ivanovii (Domínguez-Bernal et al., 2006; Dramsi et al., 1997; Gaillard et al., 1991; Raffelsbauer et al., 1998). The expression of many virulence genes is controlled by the central regulatory protein PrfA which gene prfA is part of LIPI-1 (Domínguez-Bernal et al., 2006; Leimeister-Wächter et al., 1990; Lingnau et al., 1995; Mengaud et al., 1991a). In the context of this work the internalins InlC, InlE, InlG and InlH of L. monocytogenes should be further investigated. Therefore recombinant His6-tagged internalins were purified and polyclonal antisera against the internalins A, B, E, G and H were raised. In addition the creation of two monoclonal antibodies against InlG succeeded. While the antibodies against InlG and InlE decorated well their recombinant antigens, they could not detect proteins in cell wall preparations or culture supernatant of L. monocytogenes EGD and EGDe. The antiserum against InlH cross-reacted with InlA and weakly also with other internalins. In cell wall preparations of L. monocytogenes it decorated a ~50 kDa protein which could be identical with InlH. This protein is missing in inlG/H/E deletion mutants and is stronger expressed in inlA/B deletion mutants. It is slightly bigger in the supernatant as expected for a protein with LPXTG motif that was not processed by sortase (Bierne et al., 2002; Garandeau et al., 2002). In L. monocytogenes EGDe the ~50 kDa protein was expressed stronger than in L. monocytogenes EGD by two orders of magnitude. The expression of this protein was equal at 30 and 37 °C and was not regulated by PrfA. In cell wall preparations of L. ivanovii ATCC 19119 the antisera against InlA and InlH decorated a protein matching the size of InlA of L. monocytogenes. Hexosaminidase assays for analysis of cell adherence (after Landegren, 1984) with recombinant His6-tagged internalins showed no interaction of the internalins InlE, InlG or InlH with surface factors of Caco-2, HeLa or HepG2 cells while positive controls with InlA and InlB mainly resulted as expected. However InlC has a not yet identified receptor on the eukaryotic cell surface. Caco-2 cells adhered to InlC and EGF in a strongly growth phase dependent manner and roughly thousand fold weaklier then to InlA. Best binding was observed with semi confluent grown cells which were prepared one day before the assay. Under these conditions the supportive effect of InlC in InlA-dependent invasion reported by Bergmann et al. was also maximal (Bergmann et al., 2002). Furthermore in this work the promoters of internalin genes from L. ivanovii and other virulence genes (plcA, hly, actA) from the species L. monocytogenes, L. ivanovii and L. seeligeri were investigated with the aid of the cell free in vitro transcription assay (Lalic-Mülthaler et al., 2001) to analyze their PrfA-dependency and activity independent of metabolic factors because PrfA activity is pleiotropicly regulated in vivo (Dickneite et al., 1998; Ermolaeva et al., 2004; Milenbachs et al., 1997; Milenbachs Lukowiak et al., 2004; Renzoni et al., 1997; Ripio et al., 1996). Therefore RNA polymerase from L. monocytogenes ΔprfA ΔsigB (Stritzker et al., 2005) was isolated in this work. Simultaneously the activity of recombinant His6-tagged PrfA proteins was investigated. For this purpose PrfA proteins of L. monocytogenes (m-PrfA and hyperactive m-PrfA* (Ripio et al., 1997b)), L. ivanovii (i-PrfA), L. seeligeri (s-PrfA) and the hybrid protein (sm-PrfA) were purified. The hybrid protein sm-PrfA corresponds to s-PrfA except for the last 38 amino acid residues which were substituted by those of m-PrfA. ... KW - Listeria KW - Virulenz KW - Internaline KW - Transkription KW - Listeria KW - Internaline KW - PrfA KW - Transkription KW - Listeria KW - internalins KW - PrfA KW - transcription Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21659 ER -