TY  - THES
A1  - Haßel, Sylke
T1  - Signal transduction via multiple BMP receptor complexes
T1  - Signaltransduktion über verschiedene BMP Rezeptorkomplexe
N2  - BMPs influence a variety of cellular processes. They have been shown to regulate proliferation, differentiation, migration and apoptosis and thus play central roles during developmental processes and tissue homeostasis. Ligand mediated signal transduction is transmitted via BMP type I and BMP type II receptors, both members of the serine/threonine kinase superfamily. The BMP receptor mediated signal transduction is not explored in detail. Therefore our aim was to address different aspects of BMP mediated signal transduction with main focus on BRII and its regulation. Due to the existence of two alternative splice variants, a long and a short form, the function of the two variants and the impact of the C-terminal extension are of general interest. Moreover, mutations in the BMPR2 gene were identified to be responsible for PPH, a autosomal dominant lung disease. In this thesis, BRII phosphorylation and signalling mediated by different receptor oligomers were investigated and multiple BRII associated proteins were identified. We could show that the oligomerization pattern of BMP receptors exhibits a higher degree of flexibility compared to other receptors of that superfamily. In the present work the BMP2 mediated signal transduction should be examined, depending on the receptor oligomerization pattern. Using kinase-deficient mutants, it could be demonstrated, that signalling via preformed BMP receptor complexes is mediated by the well characterized Smad1/5/8 pathway, whereas signalling initiated by BMP2 induced recruitment of the receptors activates the p38 pathway and leads to Alkaline Phosphatase production. To further study signalling events triggered directly from the BRII a proteomics-based screen for BRII associated proteins was performed. 53 associated proteins were found, the majority being signal transducing molecules, but in addition metabolic proteins, transcriptional regulators and others were identified. These proteins enable to gain a deeper insight in BMP mediated signalling. One of the interactors, the receptor tyrosine kinase c-kit, was characterized in more detail. It could be demonstrated, that BRII and c-kit form a complex in vitro and in vivo, and the interaction is enhanced upon BMP2 stimulation. 2D phosphopeptid mapping showed that BRII is phosphorylated at S757 upon activation of c-kit by SCF. Moreover, c-kit and its ligand SCF are modulating BMP2 pathways, by enhancing Smad1/5 phosphorylation, Smad-transcriptional activity, Alkaline Phosphatase production and expression of Cbfa1. All these pathways hint towards modulation of the osteoblast development via c-kit. Thus, we were able to develop a novel paradigm for the BMP2 meditated signalling. One of the initial triggers for BRII is the auto-phosphorylation of BRII. Here we analyze ligand-independent as well as ligand-dependent phosphorylation of BRII. Some phosphorylation sites in BRII were identified. The general phosphorylation occurs mostly on serines. S815, S818 and Y825 are identified targets of phosphorylation whose function is still unclear. However phosphorylation of S336 is demonstrated to be essential for BRII activation. The elucidation of BMP receptor phosphorylation and oligomerization as well as the impact of a number of BRII associated proteins (such as c-kit), demonstrated in this thesis that BMP signalling has to be regulated precisely on multiple levels. This can be useful for the development of selective signalling inhibitors for basic research and therapeutic approaches of PPH and other diseases.
N2  - BMPs regulieren eine Vielzahl zellulärer Prozesse, unter anderem Zellwachstum, Zelldifferenzierung, Bewegung und Zelltod. Dies macht sie zu einem bedeutenden Faktor während zahlreicher Entwicklungsvorgänge und im adulten Organismus. BMP-Signale werden über BMP Typ I und Typ II Rezeptoren weitergeleitet, die beide Serin/Threonin Kinase Rezeptoren sind. Während der Typ I Rezeptor Signale zu den Smad-Proteinen weiterleitet, fungiert der Typ II Rezeptor seinerseits als Aktivator des Typ I Rezeptors und ist somit für die Signalweiterleitung essentiell. Alternative Signalwege sind nicht sehr gut untersucht. Deswegen war es unser Ziel verschiedene Aspekte der BMP vermittelten Signaltransduktion, mit Schwerpunkt BRII, zu untersuchen. Der BRII ist interessant, da er in zwei alternativen Spleißvarianten vorliegt, einer langen und einer kurzen Form, die sich intrazellulär um mehr als 500 Aminosäuren unterscheiden und deren Unterschiede hinsichtlich Signalweiterleitung noch nicht erforscht sind. Darüber hinaus führen Mutationen im BMPR2 Gen zu einen Gefäßerkrankung der Lunge, PPH. In dieser Arbeit wurden die BRII Phosphorylierung und Signalweiterleitung, initiiert von unterschiedlichen BMP Rezeptorkomplexen, untersucht. Hierbei wurde eine Vielzahl von BRII assoziierten Proteine identifiziert und hinsichtlich ihres Einflusses auf BMP Signalweiterleitung charakterisiert.. Unser Labor konnte zeigen, daß das Oligomerisierungsmuster der BMP Rezeptoren weitaus flexibler als das der verwandten TGF-β Rezeptoren ist. Aus diesem Grund wurde die Siganltransduktion der BMP Rezeptoren im Hinblick auf die Komplexbildung untersucht. Mit Hilfe Kinase-defekter Mutanten konnte gezeigt werden, dass präformierte Rezeptorkomplexe den Smad-Signalweg benutzen, wohingegen liganden-induzierte Komplexe ihre Signale über den p38-Weg weiterleiten, welcher die Produktion von Alkalischer Phosphatase steuert. Um darüber hinaus Signalwege ausgehend vom BRII zu untersuchen und mehr über Smad-unabhängige Signalwege zu erfahren, wurde ein Proteomics-basierter Screen nach BMP Typ II Rezeptor interagierenden Proteinen durchgeführt. Unter den 53 Rezeptor-assoziierten Proteinen befanden sich viele Signaltransduktionsmoleküle, aber auch metabolische Proteine, Proteine, die an der Regulation der Transkription beteiligt sind und andere. Mit Hilfe dieser Proteine kann ein Einblick in die Vielfalt der BMP Rezeptor vermittelten Signaltransduktion gewonnen werden. Der Tyrosinkinase Rezeptor c-kit ist eines der assoziierten Proteine. Es konnte gezeigt werden, dass die Interaktion durch BMP2 Zugabe in vivo verstärkt wurde. Phosphorylierung an Serin 757 des BRII, vermittelt von aktiviertem c-kit und SCF, konnte mittels 2-dimensionalem Phosphopeptidmapping gezeigt werden. Außerdem beeinflusst der SCF/c-kit Signalweg auch bereits beschriebene BMP Signalwege. So konnten synergistische Effekte beider Liganden auf dem Smad1/5 Weg, bei der Produktion der Alkalischen Phosphatase und bei der Transkription von Cbfa1 beobachtet werden, alles Wege, die die Entwicklung von Osteoblasten steuern. So konnte mit dem Einfluß von c-kit auf BMP2 vermittelte Osteoblastenetwicklung ein neuer Faktor bei BMP gesteuerter Entwicklung aufgedeckt werden. Einer der initialen Trigger bei der BMP Signaltransuktion ist die Aktivierung des BMP Typ II Rezeptors durch Phosphorylierung. Es wurde Liganden-unabhängige wie Liganden-abhängige Phosphorylierung des BRII untersucht und die jeweiligen Phosphorylierungssites identifiziert. Hauptsächlich findet die Phosphorylierung an Serinen statt. So wurden S815 und S818, aber auch Y825 als Target-sites identifiziert. Im Gegensatz zu der Phosphorylierung von S815, S818 und Y825, deren Funktion noch unklar ist, konnte gezeigt werden, daß Phosphorylierung von S336 essentiell für die Rezeptoraktivierung ist. Die Erforschung der BMP-Rezeptor Phosphorylierung, Oligomerisierung und Rezeptor-assoziierter Proteine (wie c-kit), wie in dieser Arbeit vorgestellt, zeigt, dass BMP vermittelte Signaltransduktion präzise auf mehreren Ebenen reguliert werden muß. Die hier erstmalig beschriebenen Wege der Regulation der BMP Signaltransduktion tragen sowohl zu einem besseren Verständnis molekularer Zusammenhänge bei, als auch zu der Entwicklung selektiver Inhibitoren und therapeutischer Ansätze zur Behandlung der PPH und anderer Krankheiten.
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - Signaltransduktion
KW  - BMP
KW  - Signaltransduktion
KW  - Smad
KW  - p38
KW  - proteomics
KW  - BMP
KW  - signalling
KW  - Smad
KW  - p38
KW  - proteomics
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13353
ER  - 
TY  - THES
A1  - Keller, Sascha
T1  - Struktur- und Funktionsanalysen an BMP Ligand-Rezeptor-Komplexen
T1  - Structural and Functional Analysis of BMP Ligand-Receptor Complexes
N2  - Für BMPs wie auch die anderen Mitglieder der TGF-beta-Superfamilie beginnt der Signalweg mit der Bindung des Liganden an zwei Typen transmembranärer Rezeptoren. Die Ligand-Rezeptor Interaktionen sind dabei durch unterschiedliche Affinität und Spezifität gekennzeichnet und bilden wahrscheinlich die Grundlage für das breite Spektrum biologischer Funktionen. In dieser Arbeit wurde mittels einer Struktur- und Funktionsanalyse von BMP Ligand-Rezeptor Komplexen die molekulare Basis für die Affinität und Spezifität dieser Wechselwirkungen untersucht. Hierfür wurde die Kristallstruktur des BMP-2 : BR-IAec Ligand-Rezeptor Komplexes bei einer Auflösung von 1,9Å ermittelt. Mit der höheren Auflösung war die Charakterisierung der geometrischen Parameter eines Netzwerks von zehn Wasserstoff-Brückenbindungen in der Interaktionsfläche zwischen BMP-2 und BR-IAec möglich. Deren zentrale Bedeutung für dieWechselwirkung konnte auch durch funktionelle Analyse bestätigt werden. So stellen die im Zentrum der Bindungsfläche liegenden Wasserstoff-Brückenbindungen BMP-2 Leu51 (N) : BR-IAec Gln86 (OE1) und BMP-2 Leu51 (O) : BR-IAec Gln86 (NE1), sowie die BMP-2 Asp53 (N) : BR-IAec Cys77 (O) H-Brücke die Hauptdeterminanten der Ligand-Rezeptor Bindung dar. Darüber hinaus ließ sich aus der strukturellen Analyse des "wrist"-Epitops von BMP-2 eine besondere Bedeutung der Prä-Helix Schleife L2, sowie der im Kontakt eingeschlossenen Wassermoleküle für die Anpassung der Bindungsfläche an unterschiedliche Interaktionspartner ableiten. Diese Ergebnisse bilden die Grundlage für ein neues Modell zur Beschreibung von Affinität und Spezifität der hochaffinen BMP-Typ I Rezeptor Interaktion. Dabei stellen die Wasserstoff-Brückenbindungen den Hauptanteil zur Bindungsenergie, während die hydrophobe Umgebung in der Interaktionsfläche die Bildung von Wasserstoff-Brückenbindungen energetisch begünstigen und hydrophobe Wechselwirkungen nur geringfügigen Einfluss auf die Affinität nehmen. Die vorliegenden Arbeit beschreibt zudem die Präparation und Kristallisation von binären Ligand-Typ I Rezeptor Komplexen für BMP-2, BMP-6 und GDF-5, sowie die der ternären Komplexe von BMP-2, BR-IAec und ActR-IIec bzw. BR-IIec. Die extrazellulären Domänen der hierfür verwendeten Rezeptoren wurden durch Expression in E.coli oder Sf-9 Insektenzellen erhalten. Ihre funktionelle Charakterisierung erfolgte durch BIAcore Interaktionsanalyse an immobilisierten Liganden, wobei in Abhängigkeit vom Ligand-Rezeptor Komplex unterschiedliche Affinitäten ermittelt werden konnten. In Übereinstimmung mit den hierbei erhaltenen Daten wurden die Ligand-BMP Typ IB Rezeptor Komplexe für BMP-2, BMP-6 und GDF-5, sowie der GDF-5 : BR-IAec Ligand-Rezeptor Komplex präpariert. Des Weiteren konnte die Bildung des ternären BMP-2 : BR-IAec : ActR-IIec Ligand-Rezeptor Komplexes in Lösung nachgewiesen werden. Für all diese Komplexe konnten Kristallisationsbedingungen ermittelt werden. Trotz Optimierung dieser Bedingungen reichte die Qualität der erhaltenen Kristalle nicht für eine Aufklärung der Struktur aus. Für eine detailliertes Verständnis der Mechanismen der Rezeptoraktivierung muss die strukturelle und funktionelle Charakterisierung von BMP Ligand-Rezeptor Komplexen fortgeführt werden. Die präsentierten Ergebnisse deuten darauf hin, dass über die Kenntnis der einzelnen Affinitäten und die gezielte Modifikation der Interaktionspartner eine erfolgreiche Strukturanalyse dieser Ligand-Rezeptor Komplexe möglich ist.
N2  - BMPs, like other members of the TGF-beta superfamily initiate their signaling pathways through binding to two types of transmembrane receptors. These ligand-receptor interactions are characterized by different affinities and specificities that may in turn account for the variety of cellular responses. The aim of this work was to examine the molecular basis for the affinities and specificities of these interactions using structural and functional analysis of BMP ligand-receptor complexes. Therefore, the crystal structure of the BMP-2 : BR-IAec ligand-receptor complex was determined at 1,9Å resolution. At this high resolution it was possible to characterize the geometrical parameters of a network of ten hydrogen bonds within the interface. Their particular importance for the interaction could be confirmed by functional analysis. The hydrogen bonds BMP-2 Leu51 (N) : BR-IAec Gln86 (OE1) and BMP-2 Leu51 (O) : BR-IAec Gln86 (NE1) which are located in the center of the interface, as well as the BMP-2 Asp53 (N) : BR-IAec Cys77 (O) H-bond are the main binding determinants of the ligand-receptor interaction. Furthermore, the structural analysis of the ’wrist’ epitope of BMP-2 revealed the importance of the pre-helix loop L2 and of the water molecules in the interface that are required for adaptation of the contact surface to different binding partners. These results form the basis of a new model describing the affinity and specificity of the BMP-type I receptor interaction: hydrogen bonds contribute most of the binding energy, while the hydrophobic environment increases the strength of the hydrogen bonds. The hydrophobic interactions themselves have only a minor effect on the affinity. Furthermore, this work presents the preparation and crystallization of the binary ligand-type I receptor complexes for BMP-2, BMP-6 and GDF-5, as well as the ternary complex of BMP-2 and BR-IAec with either ActR-IIec or BR-IIec. The extracellular receptor domains have been expressed in E.coli or Sf-9 insect cells. Their functional characterization has been carried out using BIAcore measurements with immobilized ligands that confirmed the differences in affinities depending on the particular ligand receptor complex under study. In accordance with these data, the ligand-type IB receptor complexes of BMP-2, BMP-6 and GDF-5, as well as the GDF-5 : BR-IAec ligand-receptor complex have been prepared. Additionally, the formation of the ternary BMP-2 : BR-IAec : ActR-IIec ligand-receptor complex could be shown. Crystallization conditions have been obtained for all complexes. However, the quality of the crystals was not sufficient for structure determination, despite intensive optimization of these conditions. For a detailed understanding in the mechanisms of receptor activation the structural and functional characterization of BMP ligand-receptor complexes should be continued. Therefore, the presented results suggest that, with knowledge of the individual affinities and the selective modification of the binding partners, a successful structure determination of these ligand-receptor complexes might be possible.
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - Wirkstoff-Rezeptor-Bindung
KW  - Kristallstruktur
KW  - Bone Morphogenetic Protein
KW  - Ligand-Rezeptor Komplex
KW  - Kristallstrukturanalyse
KW  - Wasserstoffbrückenbindung
KW  - Hauptbindungsdeterminante
KW  - bone morphogenetic protein
KW  - ligand-receptor complex
KW  - crystal structure analysis
KW  - hydrogen bonds
KW  - main binding determinant
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12467
ER  -