TY - THES A1 - Lother, Jasmin T1 - Interaktion dendritischer Zell-Subtypen mit dem human pathogenen Schimmelpilz \(Aspergillus fumigatus\) T1 - Interaction of dendritic cell subtypes with the human pathogenic mould fungus \(Aspergillus fumigatus\) N2 - Die invasive Aspergillose (IA) z¨ ahlt zu den seltenen, bei immunsupprimierten Patienten jedoch mit einer hohen Letalit¨ at verbundenen Infektionskrankheiten. Sie wird, wie alle Aspergillosen, durch den humanpathogenen Schimmelpilz Aspergillus fumigatus ausgel¨ ost. Bis heute ist die oft nicht effektive Therapie einer IA mit hohen Nebenwirkungen und Kosten verbunden. Die Entwicklung von Pathogen-spezifischen Immuntherapien soll durch die Forschung im Bereich der immunologischen Infektionsbiologie vorangetrieben werden. Fur neuen Erkenntnisse wird die Interaktion von humanen Immunzellen mit ¨ A. fumigatus analysiert. In der vorliegenden Studie wurde mit dendritischen Zellen (DCs) gearbeitet, da diese Pilzmorphologien von A. fumigatus phagozytieren k¨ onnen und uber Antigenpr ¨ ¨ asentation das adaptive Immunsystem aktivieren. Es wurden aus humanen Monozyten differenzierte DCs (moDCs) verwendet, mit welchen viele Forschergruppen aufgrund ihrer verfugbar ¨ großen Anzahl arbeiten. Allerdings dauert die Generierung von moDCs funf Tage. Aus ¨ dem peripheren Blut entstammende CD1c-positive myeloide DCs (mDCs) oder CD303- positive plasmazytoide DCs (pDCs) k¨ onnen dagegen direkt nach der Isolation verwendet werden. Die beiden DC-Populationen werden aus verschiedenen Vorl¨ auferzellen des h¨ amatopoetischen Systems im Knochenmark gebildet. Ihr Ph¨ anotyp und ihre Immunfunktionen unterscheiden sich untereinander und auch von denen der moDCs. In Interaktionsstudien konnte analysiert werden, dass die drei verwendeten DC-Subtypen (moDCs, mDCs, pDCs) unterschiedlich auf A. fumigatus reagieren. moDCs und mDCs reiften in direktem Kontakt zu Aspergillus, sie sekretierten ein relativ ¨ ahnliches Zytokinprofil und exprimierten die bekannten Aspergillus-Rezeptoren Dectin-1, TLR2 und TLR4. Im Kontrast dazu verblieben pDCs trotz Aspergillus-Kontakt unreif und sekretierten nahezu keine Zytokine. Da moDCs und mDCs eine Immunreaktion auf den Pilz zeigten, wurden sie mit verschiedenen Aspergillus-Antigenen beladen und n¨ aher untersucht. Bevor verschiedene Aspergillus-Antigene zur Beladung der DCs eingesetzt werden konnten, wurden diese analysiert und aufgereinigt. Hierfur wurde ein routinierter Arbeitsprozess ¨ etabliert. Zwei der vier verfugbaren Proteinantigene waren mit Endotoxin kontaminiert. ¨ Da schon geringe Mengen an Endotoxinen auf DCs einen stimulatorischen Effekt ausubten, ¨ wurden die Proteine mittels Affinit¨ atschromatografie von den verunreinigenden Endotoxinen befreit. In den Stimulationsexperimenten wirkten die beiden Proteinantigene CcpA und SHMT immunogen auf moDCs und mDCs. CcpA induzierte eine st¨ arkere Maturierung und Zytokinfreisetzung als SHMT. Auff¨ allig war, dass mDCs im Vergleich zu moDCs die Expression von MHC Klasse II st¨ arker erh¨ ohten und mehr IL18 freisetzten. Die mit CcpA oder SHMT beladenen moDCs und mDCs aktivierten autologe T-Zellen zur IFNg Sekretion und zur Proliferation. Zudem wurden durch die beiden Proteine Aspergillus-spezifische, CD154- positive T-Zellen induziert. Diese Aspergillus-spezifische Immunogenit¨ at von CcpA und SHMT macht die beiden Proteine zu interessanten Kandidaten fur einen Vakzinierungs- ¨ Cocktail einer DC-Immuntherapie. Aspergillus Lysat induzierte als weiteres Antigen eine T-Zell Immunantwort mit CD154-positiven T-Zellen. Zudem war die Proliferation und IFNg Sekretion von T-Zellen induziert, obwohl moDCs und mDCs nicht reiften und nur wenige Zytokine sekretierten. Die beiden Aspergillus-Proteine CpcB und fg-gap induzierten die Reifung und Zytokinsekretion von moDCs und mDCs nicht. Demzufolge sind CpcB und fg-gap fur eine DC-Immuntherapie nicht empfehlenswert. ¨ Ein Vakzinierungs-Cocktail enth¨ alt in der Regel Adjuvantien, welche die Immunreaktion verst¨ arken. Adjuvante Effekte auf moDCs konnten die getesteten Aspergillus-RezeptorLiganden Zymosan, Pam3CSK4, LPS ultrapur und R848 ausl¨ osen. Hyalurons¨ aure konnte keine Verbesserung der Reifung oder Vitalit¨ at von moDCs und mDCs bewirken. Die Antigen-bedingte Reifung der DCs fur n ¨ ¨ otige Restimulationen w¨ ahrend der Therapie konnte mittels einer tiefgekuhlten Lagerung in CryoStor Einfriermedium stabil beibehalten ¨ werden. Die beiden immunogenen Aspergillus-Proteine, die adjuvanten Rezeptor-Agonisten und die stabile Lagerung in CryoStor k¨ onnen als elementare Grundsteine fur einen Vakzinierungs- ¨ Cocktail einer anti-fungalen DC-Immuntherapie mit moDCs oder mDCs angesehen werden. N2 - Invasive aspergillosis (IA) is one of the rare infectious diseases associated with a high mortality rate that occurs in immunocompromised patients. Like all aspergillosis, it is caused by the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus. No effective therapy of IA is known to date and the current therapy is associated with high side effects and costs. More in-depth research is needed in the field of immunological infection biology, such as the interactions of human immune cells with A. fumigatus, for the development of pathogen-specific immunotherapies. In the present study dendritic cells (DCs) are investigated due to their ability to phago- cytose fungal morphologies of A. fumigatus and activate the adaptive immune system via antigen presentation. Monocytes which differentiate into DCs (moDCs) are used by many research groups due to their large numbers; however, their total generation time lasts five days. CD1c-positive myeloid DCs (mDCs) and CD303-positive plasmacytoid DCs (pDCs) found in the peripheral blood can be used directly after isolation. The two DC populations are formed from different precursor cells of the hematopoietic system in the bone marrow and therefore their phenotype and immune functions differ from each other and also from those of moDCs. ... KW - Dendritische Zellen KW - Aspergillus KW - Untertyp Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140940 ER - TY - THES A1 - Lopez Caperuchipi, Simon T1 - Charakterisierung zellulärer Veränderungen und kognitiver Verhaltensweisen in einem Model vom Schädel-Hirn Trauma in männlichen Mäusen T1 - Characterization of cellular and behavioral changes in a model of traumatic brain injury in male mice N2 - Schädel-Hirn Trauma ist die führende Ursache von Tod und Behinderung unter jungen Erwachsenen in den USA und Europa. Darüber hinaus steigert Schädel-Hirn Trauma das Risiko eine Demenzerkrankung oder andere neurodegenerative Erkrankung zu erleiden. Aus diesem Grund stellt eine bessere Erkenntnis der subakuten und chronischen pathophysiologischen Prozesse eine wichtige Grundlage für eine mögliche zukünftige neuroprotektive Therapie dar. Ziel dieser Arbeit war es daher eine Übersicht von funktionellen Einschränkungen und zellulären Veränderungen in der subakuten Phase innerhalb der ersten drei Monate darzustellen. Dazu wurden Verhaltensexperimente zu kognitiven Leistungen wie räumliches Lernen, kognitive Plastizität, episodisches Gedächtnis, Angstverhalten und allgemeine Lokomotion durchgeführt. Dabei konnten funktionale Einschränkungen der Tiere im Bereich der kognitiven Flexibilität, dem räumlichen Lernen, dem belohnungsmotivierten Verhalten, sowie Hyperaktivität beobachtet werden. Weiterführend erfolgten histologische und immunhistologische Untersuchungen an den Mäusegehirnen. So konnten in unserem Tiermodell sowohl lokale neuroinflammatorische Veränderungen nachgewiesen werden, also auch generalisierte Veränderungen, welche sich auf Isocortex und Hippocampus erstreckten und beide Hemisphären gleichermaßen betrafen. Ebenso konnten demyelinisierende Prozesse im Bereich der Läsion beobachtet werden. Im Bereich des Cortex zeigte sich außerdem eine axonale Schädigung mit begleitender Neuroinflammation, sowie eine Infiltration von B-Zellen. Anschließend wurde eruiert, ob eine Korrelation von funktionalem Outcome und histologischen Veränderungen besteht. Dabei zeigte sich eine signifikante Korrelation neuroinflammatorischer Prozesse mit Einschränkungen im räumlichen Lernen und Umlernen, sowie Auffälligkeiten im Bereich des belohnungsmotivierten Verhaltens. Damit ordnet sich diese Arbeit in die bestehenden Erkenntnisse zur Pathophysiologie des SHTs ein und ergänzt diese weiter. N2 - Traumatic brain injury is the leading cause of death and disability among young adults in the USA and Europe. Traumatic brain injury increases the risk for neurodegenerative diseases and dementia. However, the underlying pathomechanisms that contribute to the increased risk for neurodegeneration remain unclear. The aim of this thesis is to provide an overview of behavioral and cellular changes in the subacute phase of the first three months after injury. Therefore, behavioral experiments were performed with a focus on spatial learning, cognitive plasticity, episodic memory, anxiety, and general locomotion. Deficits in spatial learning, cognitive plasticity, reward-motivated behavior as well as hyperactivity were monitored in mice after traumatic brain injury. Furthermore, histological and immunohistochemical analysis were performed on brain tissue three months after injury. Local neuroinflammatory changes were seen in the lesion area as well as global inflammation in cortex and hippocampus. Both hemispheres showed similar levels of inflammation. Demyelination colocalized with neuroinflammation around the lesion area. In the cortex axonal damage, neuroinflammatory changes, and migration of B-cells were detected. We further investigated the correlation between behavioral and cellular changes. Neuroinflammation correlated significantly with deficits in spatial learning, cognitive plasticity, and reward-motivated behavior. This thesis, therefore, provides an important overview of behavioral changes and cellular pathomechanisms and further knowledge of the subacute phase of traumatic brain injury. KW - Schädel-Hirn-Trauma KW - Neuroinflammation KW - Neurodegeneration Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-302686 ER - TY - THES A1 - Lodes, Nina Theresa T1 - Tissue Engineering für seltene Erkrankungen mit Störungen des mukoziliären Transports T1 - Tissue engineering for rare diseases with impaired mucociliary transport N2 - Bei der zystischen Fibrose (CF) sowie der primären Ziliendyskinesie (PCD) handelt es sich um zwei seltene Erkrankungen, die unter anderem den mukoziliären Transport beeinträchtigen. CF gehört hierbei zu den am häufigsten vorkommenden angeborenen Stoffwechselerkrankungen, wobei Betroffene unter einem Defekt des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductor Regulator (CFTR)-Gens leiden, der durch die Produktion von hochviskosem Sekret in muzinproduzierenden Organen, wie dem gastrointestinalen Trakt und der Lunge, gekennzeichnet ist. Patienten, die an PCD leiden, weisen Defekte in, zum jetzigen Zeitpunkt, ca. 38 bekannten und PCD-assoziierten Genen auf, die in strukturellen Defekten des ziliären Apparats und somit in dysfunktionalen Kinozilien resultieren. Da aktuell weder für die CF noch für die PCD eine Heilung möglich ist, steht bei der Therapie vor allem die Linderung der Symptome im Fokus. Grundlegendes Ziel ist der langfristige Erhalt der Lungenfunktion sowie die Prävention bakterieller Infekte. Als bisherige Modellsysteme zur Erforschung möglicher Therapeutika gelten Tiermodelle, die den humanen Phänotyp aufgrund von Speziesdiversität nicht vollständig abbilden können. Als vielversprechende Testsysteme für die zystische Fibrose gelten humane intestinale Organoidkulturen. Nachdem allerdings vorwiegend respiratorische Symptome für die Mortalität der Patienten verantwortlich sind, stellen CF-Atemwegsmodelle bessere Testsysteme für zukünftige Therapeutika dar. Atmungsorganoidkulturen wurden verwendet, um die CFTR-Funktionalität zu untersuchen, repräsentieren aber nicht vollständig die in vivo Situation. Deshalb werden zur Entwicklung neuer Therapiestrategien patientenspezifische 3D in vitro Testsysteme der humanen Atemwege benötigt, die insbesondere im Hinblick auf personalisierte Medizin ihren Einsatz finden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine für den Lehrstuhl neue Methode zur Zellgewinnung aus nasalen Schleimhautabstrichen etabliert, die eine standardisierte Versorgung mit humanem Primärmaterial garantiert. Zur Generierung einer krankheitsspezifischen Zelllinie, wie beispielsweise einer PCD-Zelllinie mit Hilfe des CRISPR/Cas9-Systems, ist eine Atemwegszelllinie erforderlich, die die in vivo Situation vollständig repräsentiert. So wurden vier verschiedene respiratorische Epithelzelllinien (HBEC3-KT, Calu-3, VA10 und Cl-huAEC) auf ihren mukoziliären Phänotyp hin untersucht, wobei lediglich die Zelllinie HBEC3-KT in zilientragende Zellen differenzierte. Diese zeigten jedoch nur auf ca. 5 % der Modelloberfläche Kinozilien, wodurch die humane respiratorische Mukosa nicht komplett abgebildet werden konnte und die HBEC3-KT-Zelllinie keine geeignete Zelllinie zur Generierung einer PCD-Zelllinie darstellte. Mit Hilfe des Tissue Engineering war es möglich, 3D in vitro Testsysteme basierend auf zwei unterschiedlichen Matrices, der biologischen SIS (small intestinal submucosa) und der synthetischen Polyethylenterephthalat (PET)-Membran, aufzubauen. Es wurden 3D Atemwegstestsysteme mit humanen primären nasalen und tracheobronchialen Epithelzellen generiert. Ergänzend zu histologischen Untersuchungen und zur Charakterisierung spezifischer Marker des respiratorischen Systems mittels Immunfluoreszenz, wurde die Ultrastruktur der Modelle, mit speziellem Fokus auf ziliäre Strukturen, analysiert. Um Rückschlüsse auf die ziliäre Funktionalität ziehen zu können und somit eine hohe in vivo Korrelation zu bestätigen, wurde im Rahmen dieser Arbeit am Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin die Methode der Hochgeschwindigkeitsvideomikroskopie etabliert, welche die Analyse der Zilienschlagfrequenz sowie des mukoziliären Transports ermöglicht. Ebenfalls wurde der Einfluss von isotoner Kochsalzlösung und des � 2-adrenergen Agonisten Salbutamol, das vor allem als Bronchodilatator bei Asthmapatienten eingesetzt wird, auf die Zilienschlagfrequenz analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass beide Substanzen den Zilienschlag im Atemwegsmodell erhöhen. Zur Generierung der Testsysteme der beiden seltenen Erkrankungen CF und PCD wurden Epithelzellen der betroffenen Patienten zunächst mittels nicht-invasiver Raman-Spektroskopie auf einen potentiellen Biomarker untersucht, welcher Einsatz in der Diagnostik der beiden Krankheiten finden könnte. Es konnte jedoch weder für die CF noch für die PCD ein Biomarker aufgedeckt werden. Jedoch zeigten PCD-Zellen eine geringe Auftrennung gegenüber nicht-PCD Zellen. Anschließend wurden 3D-Atemwegstestsysteme basierend auf Patientenzellen aufgebaut. Der Phänotyp der CF-Modelle wurde mittels immunhistologischer Färbung und der Analyse des gestörten mukoziliären Transports verifiziert. Strukturelle ziliäre Defekte konnten durch die ultrastrukturelle Analyse von Zilienquerschnitten in drei donorspezifischen PCD-Modellen identifiziert werden. Darüber hinaus konnte die ziliäre Funktionalität mit Hilfe der Hochgeschwindigkeitsvideomikroskopie nicht nachgewiesen werden. Zusammenfassend ist es in dieser Arbeit gelungen, eine neue Methode zur vollständigen Charakterisierung von 3D-Atemwegstestsystemen zu etablieren, die die Analyse der Zilienschlagfrequenz sowie des mukoziliären Transports ermöglicht. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass mit Hilfe des Tissue Engineering ein personalisiertes Krankheitsmodell für die PCD auf Segmenten eines dezellularisierten porzinen Jejunums generiert werden kann, das zukünftig ein Testsystem für potentielle Therapeutika darstellen kann. N2 - Cystic fibrosis (CF) and primary ciliary dyskinesia (PCD) are two rare diseases which,among others, impair the mucociliary transport. CF is one of the most common in-herited metabolic diseases with patients suffering from a defect in theCystic FibrosisTransmembrane Conductor Regulator(CFTR) gene, which is characterized by the pro-duction of highly viscous secretions in mucin-producing organs such as the gastrointestinaltract and lungs. Patients suffering from PCD have defects in currently approximately 38known and PCD-associated genes resulting in structural defects of the ciliary appara-tus and thus in dysfunctional cilia. Since neither CF nor PCD have any chance of beingcured so far, the main focus is on alleviating the symptoms. The basic goal is the long-term preservation of lung function and the prevention of microbial infections. Previousmodel systems for exploring possible therapeutic options have been animal models thatcan never completely represent the human phenotype due to species diversity. Humanintestinal organoid cultures are considered as a promising test system for cystic fibro-sis. However, since respiratory symptoms are mainly responsible for patient mortality,CF respiratory models provide better test systems for future therapeutics. Respiratoryorganoid cultures have been used to study CFTR functionality, but do not completelyrepresent thein vivosituation. In order to develop new therapeutic strategies, patient-specific 3Din vitrotest systems for the human respiratory tract expressing functionalkinocilia are required, which can be used in particular with regard to personalized medi-cine.In the present thesis, a new method for obtaining cells from nasal mucosal brush biop-sies was established, that guarantees a standardised supply of human primary materi-al. In order to generate a disease-specific cell line, such as a PCD cell line, using theCRISPR/Cas9 system, a respiratory cell line that fully represents thein vivosituation isrequired. Hence, four different respiratory epithelial cell lines (HBEC3-KT, Calu-3, VA10and Cl-huAEC) were investigated with regard to their mucociliary phenotype, wherebyonly the cell line HBEC3-KT differentiated into ciliated cells. However, these showed ki-nocilia only on approx. 5 % of the model’s surface, thus the human respiratory mucosacould not be completely modelled and HBEC3-KT cell line is no suitable cell line for geneediting experiments.Tissue engineering made it possible to build 3Din vitrotest systems based on two differentmatrices, the biological SIS (small intestine submucosa) and synthetic PET (polyethyleneterephthalate) membranes. 3D airway test systems were generated using human primarynasal and tracheobronchial epithelial cells. In addition to histological investigations and the characterization of specific markers of the respiratory system by immunofluorescence,the ultrastructure of the models was analyzed with a special focus on ciliary structures.In order to gain insight into the ciliary functionality and thus to achieve a highin vivocorrelation, the method of high-speed video microscopy was established within the scopeof this work at the Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, which allowsthe analysis of ciliary beat frequency as well as mucociliary transport. The influence ofisotonic saline solution and salbutamol, aβ2-adrenergic agonist mainly used as broncho-dilator in asthma patients, on ciliary beat frequency was also analyzed. It could be shownthat both substances increased the ciliary beat of the primary respiratory mucosa models.In order to generate test systems for the two rare diseases CF and PCD, epithelial cellsof the affected patients were first examined by non-invasive Raman spectroscopy for apotential biomarker that could be used in diagnostic approaches. However, no biomarkerfor CF or PCD could be detected, with PCD cells showing a low separation to non-PCDcells. Subsequently, 3D test systems based on patient cells were developed. The phenotypeof the CF models was verified by immunohistological staining and analysis of impairedmucociliary transport. Ultrastructural ciliary defects could be identified by ultrastructuralanalysis of cilia cross sections in three donor-specific PCD models. Additionally, ciliaryfunctionality could not be detected using high speed video microscopy analysis.In summary, this work succeeded in establishing a new method for the complete characte-rization of 3D airway test systems, which allows the analysis of ciliary beating frequencyand mucociliary transport. It has been shown for the first time that tissue engineering canbe used to generate a personalized disease model for PCD using a decellularized poricinejejunum as a scaffold. Both, PCD and CF disease models could in future be regarded astest systems for potential therapeutics. KW - In-vitro-Kultur KW - Tissue Engineering KW - Gewebekultur KW - Individualisierte Medizin KW - Respiratorisches System KW - Primäre Ziliendyskinesie KW - airways KW - primary ciliary dyskinesia Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200178 ER - TY - THES A1 - Lippert, Malte T1 - Die Rolle von CD84 in der Immunzellrekrutierung der Atherosklerose T1 - The role of CD84 in the immune cell recruitment of atherosclerosis N2 - CD84 ist ein Transmembran-Glykoprotein vom Typ 1, welches ein Mitglied der Familie der SLAM 5 ist. Es ist ein homophiles Adhäsionsmolekül, das von unterschiedlichen Immunzellpopulationen exprimiert wird, einschließlich Monozyten, Makrophagen, Granulozyten, T-Zellen, dendritischen Zellen und Mastzellen, die im Zusammenhang mit der Entstehung der Atherosklerose stehen. Um die funktionelle Bedeutung von CD84 in der Pathogenese der Atherosklerose bestimmen zu können, wurden CD84-/- Mäuse mit ApoE-/- Mäusen gekreuzt, um Tiere zu erhalten, die CD84-defizient und anfällig für Atherosklerose waren. Die Bedeutung dieses Moleküls für die Atherogenese sowie für die Adhäsion, Transmigration, Immunzellrekrutierung allgemein und Integrinexpression und -aktivierung wurde im Mausmodell in vivo und in vitro untersucht. Nach acht und 16 Wochen pro-atherogener, fettreicher Western-Type Diät waren die Ausprägung der atherosklerotischen Läsionen in der Aortenwurzel, sowie deren Gehalt an Makrophagen in den ApoE-/-.CD84-/- Tieren im Vergleich zu den ApoE-/- Kontrolltieren signifikant vermindert. Weiter zeigten die Ergebnisse, dass die Viabilität von Makrophagen, denen CD84 fehlte, in vitro nicht verändert war. Der Einfluss von CD84 auf die akute Immunzellrekrutierung wurde mittels verschiedener in vivo und in vitro Experimente untersucht. Eine verminderte Rekrutierung von CD84-/- proinflammatorischer Ly6Chigh Monozyten konnte in vivo im Rahmen des Hintergliedmaßen-Ischämiemodells festgestellt werden, nicht hingegen im Air pouch-Modell. Es konnte weiterhin weder eine Veränderung der Adhäsion und chemotaktischen Transmigration von Monozyten in vitro noch der Immunzellrekrutierung in atherosklerotische Läsionen in Ldlr-/- Mäusen in vivo bei Abwesenheit von CD84 festgestellt werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass CD84 zwar keine Bedeutung für die Integri-nexpression auf Monozyten hat, jedoch für die adäquate Aktivierung von LFA-1 auf T-Zellen. Diese Arbeit trägt summa summarum zum verbesserten Verständnis des Prozesses der Atherogenese sowie der funktionellen Bedeutung von CD84 innerhalb dieses Prozesses sowie im Rahmen der Immunzellrekrutierung und Integrinaktivierung bei. Diese Erkenntnisse könnten in Zukunft dabei helfen, durch die Entwicklung neuer phar-makologischer Therapieansätze, spezifischer in von CD84 mitregulierte inflammatorische Prozesse, wie die Atherosklerose, einzugreifen. Dies könnte im Zusammenspiel mit Forschungsarbeiten gelingen, die weitere präzise Erkenntnisse zu spezifischen funktionellen Eigenschaften von CD84 hinsichtlich der Im-munzellrekrutierung und Integrinaktivierung liefern. N2 - CD84 is a type 1 transmembrane glycoprotein which is a member of the SLAM 5 family. It is a homophilic adhesion molecule expressed by different immune cell populations, including monocytes, macrophages, granulocytes, T cells, dendritic cells and mast cells, which are associated with the development of atherosclerosis. To determine the functional role of CD84 in the pathogenesis of atherosclerosis, CD84-/- mice were crossed with ApoE-/- mice to generate animals that were CD84-deficient and susceptible to atherosclerosis. The importance of this molecule for atherogenesis as well as for adhesion, transmigration, immune cell recruitment in general and integrin expression and activation was investigated in vivo and in vitro in the mouse model. After eight and 16 weeks of pro-atherogenic, high-fat western type diet, the expression of atherosclerotic lesions in the aorta and the macrophage content of the ApoE-/-.CD84-/- animals was significantly reduced compared to the ApoE-/- control animals. Furthermore, the results showed that the viability of macrophages lacking CD84 was not altered in vitro. The influence of CD84 on acute immune cell recruitment was investigated by different in vivo and in vitro experiments. A reduced recruitment of CD84-/- proinflammatory Ly6Chigh monocytes was observed in vivo in the murine model of hindlimb ischemia, but not in the air pouch model. Furthermore, neither an alteration in adhesion and chemotactic transmigration of monocytes in vitro nor in immune cell recruitment to atherosclerotic lesions could be detected in Ldlr-/- mice in vivo in the absence of CD84. Furthermore, it could be shown that although CD84 is not important for integrin expres-sion on monocytes, it is important for the adequate activation of LFA-1 on T cells. In summary, this work contributes to the further understanding of the process of atherogenesis and the functional significance of CD84 within this process as well as in the con-text of immune cell recruitment and integrin activation. These findings may help to develop new pharmacological therapeutic approaches to inter-vene more specifically in inflammatory processes co-regulated by CD84, such as atherosclerosis. Research that address the specific functional characteristics of CD84 with respect to immune cell recruitment and integrin activation could help to further resolve the contribution of CD84 to atherosclerosis. KW - Arteriosklerose KW - Immunozyt KW - Monozyt KW - Atherosklerose KW - CD84 KW - Immunzellrekrutierung Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-229249 ER - TY - THES A1 - Lichter, Katharina T1 - Die Ultrastruktur von Aktiven Zonen in hippocampalen Moosfaserboutons T1 - The ultrastructure of active zones in hippocampal mossy fiber boutons N2 - In nervous systems, synapses precisely orchestrate information transfer and memory formation. Active zones (AZ) are specialized subcellular compartments at the presynaptic mesoscale which process synaptic transmission on an ultrastructural level. The AZ cytomatrix including the essential scaffold protein Rab3 interacting molecule (RIM) enables exocytosis of synaptic vesicles. A deficiency of the locally most abundant protein isoform RIM1α diminishes long-term potentiation in a complex central mammalian synapse – the connection of hippocampal mossy fiber boutons (MFB) to cornu ammonis (CA)3 pyramidal neurons. Behaviourally, these mice present with learning impairment. The present MD thesis addresses the so far unknown three-dimensional (3D) AZ ultrastructure of MFBs in acute hippocampal slices of wild-type and RIM1α-/- mice. In a first set of experiments, a standardized protocol for near-to-native synaptic tissue preparation at MFBs using high-pressure freezing and freeze substitution and 3D modelling using electron tomography was developed and established. Based on the excellent preservation of synaptic tissue using this protocol, the AZ ultrastructure in both genotypes was quantified in detail up to an individual docked synaptic vesicle using custom-written programming scripts. The experiments demonstrate that deficiency of RIM1α leads to multidimensional alter-ation of AZ 3D ultrastructure and synaptic vesicle pools in MFBs. (Tightly) docked synaptic vesicles – ultrastructural correlates of the readily releasable pool – are reduced, decentralized, and structurally modified, whereas the more distant vesicle pool clusters more densely above larger and more heterogenous AZ surfaces with higher synaptic clefts. The present thesis contributes to a more comprehensive understanding regarding the role of RIM1α for (tight) vesicle docking and organization at MFBs. Furthermore, the precise 3D ultrastructural analysis of MFB AZs in this thesis provides the necessary mor-phological basis for further studies to correlate synaptic ultrastructure with presynaptic plasticity and memory dysfunction in RIM1α-/- mice using advanced electrophysiological and behavioral techniques. N2 - In Nervensystemen bedürfen Informationsweitergabe und Gedächtnisformation eines präzisen Zusammenspiels von Synapsen in Zeit und Raum. Synaptische Transmission basiert strukturell auf mesoskopischen cytosolischen Kompartimenten an der präsynaptischen Membran, sogenannten Aktiven Zonen (AZ). Ihre Cytomatrix, bestehend aus zentralen Gerüstproteinen wie Rab3 interacting molecule (RIM), ermöglicht eine schnelle Freisetzung synaptischer Vesikel. Die Defizienz der lokal häufigsten Isoform RIM1α resultiert an einer komplexen zentralen Säugersynapse, die des hippocampalen Moosfaserboutons (MFB) zu im Cornu ammonis (CA)3 befindlichen Pyramidalzellen, in einer dezimierten Langzeitplastizität. Auf Verhaltensebene zeigen diese Mäuse eine reduzierte Lernfähigkeit. Die vorliegende Dissertation widmet sich grundlegend der bisher unbekannten dreidimensionalen (3D) AZ-Ultrastruktur des MFB in akuten Hippocampusschnitten der adulten Wildtyp- und RIM1α-Knock-Out-Maus (RIM1α\(^{-/-}\)). In einer methodischen Entwicklungsphase wurde ein neuartiges, anspruchsvolles Protokoll der nahezu artefaktfreien (near to native) Synapsenpräparation am MFB mittels Hochdruckgefrierung und Gefriersubstitution sowie der 3D-Modellierung mittels Elektronentomographie etabliert. In einer zweiten Experimentier- und Analysephase ermöglichte die hochwertige synaptische Gewebeerhaltung in beiden Genotypen eine standardisierte, auf Programmierskripten basierte Quantifizierung der AZ-Ultrastruktur bis auf die Ebene eines individuell gedockten synaptischen Vesikels. Dieser Dissertation gelingt der Nachweis, dass eine Defizienz von RIM1α zu einer multidimensionalen ultrastrukturellen Veränderung der AZ und ihres Vesikelpools am MFB führt. Neben einer Reduktion, Dezentralisierung und strukturellen Veränderung (eng) gedockter Vesikel – der ultrastrukturellen Messgrößen von unmittelbar freisetzungsfähigen Vesikeln – verdichtet sich der distaler lokalisierte Vesikelpool auf zugleich größeren, heterogenen AZ-Flächen mit erweitertem synaptischem Spalt. Vorliegende Untersuchungen tragen zum Verständnisgewinn über eine zentrale Rolle von RIM1α für das Docking und die Organisation von Vesikeln der AZ im MFB bei. Darüber hinaus stellen die präzisen ultrastrukturellen Analysen eine morphologische Grundlage für weiterführende Studien mit Hilfe modernster Techniken dar, beispielsweise über die Auswirkungen der geänderten RIM1α\(^{-/-}\) AZ-Ultrastruktur auf die präsynaptische Plastizität sowie in Korrelation zum Gedächtnis und Lernen der Tiere. KW - Hippocampus KW - Neurowissenschaften KW - Exzitatorische Synapse KW - Synaptische Transmission KW - Synaptische Vesikel KW - active zone KW - presynaptic KW - mossy fiber synapse KW - RIM1α KW - CA3 KW - high-pressure freezing/freeze substitution KW - electron tomography KW - acute brain slices Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-303126 ER - TY - THES A1 - Lennartz, Simon T1 - Tissue Engineering der menschlichen Speicheldrüse unter Verwendung von Epithel- und mikrovaskulären Endothelzellen auf einer Matrix aus dezellularisiertem Schweinedarm T1 - Tissue engineering of human salivary gland using epithelial and microvascular endothelial cells on a decellularized porcine matrix N2 - Eine ausgeprägte Mundtrockenheit, Xerostomie, entsteht häufig durch eine irreversible Funktionseinschränkung der Speicheldrüsen. Diese ist unter anderem durch die Einnahme bestimmter Medikamente, Autoimmunerkrankungen, fortgeschrittenes Alter oder die Bestrahlungstherapie von Tumoren der Kopf-Hals-Region bedingt, wobei letztere eine der häufigsten Ursachen darstellt. Konsequenzen der eingeschränkten Drüsenfunktion sind herabgesetzte Speichelflussraten, eine Reduktion des Mund-pH-Werts, eine veränderte Elektrolyt- und Immunglobulin-Zusammensetzung des Speichels und somit eine Verringerung des Infektionsschutzes. Die resultierenden Komplikationen erstrecken sich von Karies und rezidivierenden Infektionen bis hin zu Pilzbesiedelungen der Mundschleimhaut. Diese schränken die Lebensqualität der Patienten stark ein und führen häufig zu Therapieunterbrechungen. Fast die Hälfte der Patienten leidet unter Depressionen oder psychischen Belastungszuständen. Es gibt wenige Therapieansätze zur Behandlung der postradiogenen Xerostomie: Pilocarpin erhöht zwar die Speichelflussraten, hat jedoch keinen signifikanten Effekt auf die Lebensqualität. Die operative Translokation der Glandula submandibularis hat den Weg in die klinische Routine noch nicht gefunden, während die intensitätsmodulierte Bestrahlung (IMRT) nicht für jeden Patienten geeignet ist; beide zeigen jedoch einen positiven Effekt auf die Lebensqualität. Gentechnische und stammzellbasierte Ansätze zur Regeneration des Drüsengewebes befinden sich im Experimentalstadium. Somit ergibt sich ein dringender Bedarf an innovativen Optionen zur Behandlung der postradiogenen Xerostomie. Das Tissue Engineering, die Erstellung einer künstlichen Speicheldrüse aus körpereigenen Zellen, böte hier ein potentielles Behandlungskonzept. Diese Studie soll deshalb untersuchen, ob humane Speicheldrüsenepithelzellen (hSEZ) auf einer Matrix aus dezellularisiertem, porzinem Jejunum, der sogenannten Small intestinal submucosa + mucosa (SIS-muc), kultiviert werden können. Können die Zellen innerhalb der Wachstumsperiode wichtige physiologische Differenzierungsmarker beibehalten? Kann die Produktion von α-Amylase, einem der wichtigsten Enzyme des menschlichen Speichels, erhalten werden? Welchen Einfluss hat die Kokultur mit mikrovaskulären Endothelzellen (mvEZ)? Und zuletzt: Ist dezellularisierter Schweinedarm eine potentiell geeignete Matrix für das Tissue Engineering der menschlichen Speicheldrüse? Zunächst erfolgte die Entnahme von humanem Speicheldrüsengewebe, woraus hSEZ isoliert wurden. Diese wurden dann sowohl in Mono- als auch in Kokultur mit mvEZ auf die SIS-muc aufgebracht und auf dieser kultiviert. Die SIS-muc wurde aus kurzen Schweinedarm-Segmenten gewonnen, die in einem mehrstufigen Verfahren dezellularisiert wurden. Die besiedelte SIS-muc wurde mittels konventioneller sowie Immunfluoreszenzfärbungen, Raster- und Transmissionsektronenmikroskopie (REM/TEM) sowie quantitativer Polymerasekettenreaktion (qPCR) untersucht, darüber hinaus erfolgte die Messung der α-Amylase-Enzymaktivität. Histologisch sowie in der REM zeigte sich sowohl in der Mono- als auch in der Kokultur eine konfluente Besiedelung der SIS-muc mit hSEZ. In der Kokultur formten mvEZ einen Monolayer auf der serosalen Matrixseite. Bei der Charakterisierung der hSEZ zeigte sich in den Immunfluoreszenzaufnahmen eine starke Ausprägung von Zytokeratin, α-Amylase und Aquaporin-5 und eine moderate Ausprägung von Claudin-1. Bei der Untersuchung der Funktion der α-Amylase konnte in der Kokultur von hSEZ mit mvEZ eine im Gegensatz zur Mono- und 2D-Kultur signifikant erhöhte Enzymaktivität der α-Amylase nachgewiesen werden. In der qPCR-Analyse der α-Amylase-Genexpression war die 3D-Kultur der 2D-Kultur überlegen. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Kultur von hSEZ auf der SIS-muc möglich ist. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Zellen in 3D-Kultur spezifische Differenzierungsmerkmale beibehalten, die in der 2D-Kultur teils verloren gehen und dass hSEZ in Kokultur mit mvEZ eine gegenüber der Monokultur signifikant erhöhte Produktion von α-Amylase aufweisen. Diese Arbeit liefert die Datengrundlage für zukünftige Studien im dynamischen Bioreaktor-Modell (BioVaSc), die auf dem Weg zur klinischen Translation notwendig sind. Somit stellt sie einen wichtigen Schritt in Richtung einer auf Tissue Engineering basierten Therapie der belastenden Xerostomie dar. N2 - Xerostomia or dryness of the mouth often results from irreversible loss of function of the salivary glands. This medical condition can either be induced by certain drugs, autoimmune diseases, high age or radiotherapy of head and neck cancer with the latter being one of the most common causes. Impaired glands lead to a decrease in saliva flow rate as well as pH level inside the mouth and cause an alteration in the composition of saliva (e.g. electrolytes, immunoglobulins) lowering its anti-inflammatory capacity. Complications imply caries and recurring infections as well as mycosis of the oral cavity which negatively impact the patients’ quality of life, often leading to therapy interruptions. Moreover, almost half of the patients suffer from depression or other mental disorders. The treatment of radiogenic xerostomia is based on only a few therapeutic approaches currently available: Pilocarpin increases saliva flow rate yet does not significantly improve the patiens’ quality of life or reduce mucositis. Although indicating positive effects on quality of life, operative translocation of the submandibular gland has not yet been established in the clinical routine, while intensity modulated radiotherapy (IMRT) is not suitable for every patient. On the other hand, genetic or stem-cell-based approaches for regeneration of salivary gland tissue are still at an experimental stage. Thus, there is a strong demand for innovative options for the treatment of radiation-induced xerostomia which could potentially be supplied by an approach based on the tissue engineering of the salivary gland using autologous cells. The aim of this study is to investigate, whether human salivary gland epithelial cells (hSGEs) can be cultured on a scaffold made from decellularized porcine jejunum, the so-called small intestinal submucosa (SIS-muc). Do the cells maintain the expression of certain cellular markers over the given cell culture time? Can the production of α-amylase, a key enzyme of human saliva, be perpetuated? And lastly: Is the SIS-muc an appropriate scaffold for the tissue engineering (TE) of the human salivary gland? To examine this, human salivary gland tissue was obtained and salivary gland epithelial cells were isolated. The cells were cultured both in mono- and co-culture with microvascular endothelial cells (mvECs) on the SIS-muc. Colonized SIS-muc was analyzed in H&E and immunofluorescence stainings, scanning- and transmission electron microscopy as well as quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Furthermore, enzyme activity of α-amylase was quantified. H&E stainings as well as scanning electron microscopy (SEM) revealed a confluent cell layer of hSGECs on the scaffold both in mono-and co-culture. Immunofluorescence stainings indicated a strong expression of cytoceratin, α-amylase and aquaporin-5 and a moderate expression of claudin-1. Enzyme assay revealed that SGECs co-cultured with mvECs yielded a significantly increased activity of α-amylase compared to the monocultured cells. Quantitative PCR (qPCR) indicated an increase in α-amylase gene expression in 3D-culture compared to 2D-culture. This study shows that hSGECs can successfully be cultured on the SIS-muc and maintain important cellular markers which partly vanish in 2D-culture. Moreover, co-culture with mvECs increased α-amylase enzyme activity of hGECs compared to monoculture. Those results significantly contribute to the base of evidence needed for following studies focusing on dynamic cell culture using the BioVaSc which are necessary to evaluate the possibilities for clinical translation. Thus, this study takes an important step towards a tissue engineering-based therapy of the burdensome xerostomia. KW - Tissue Engineering KW - Xerostomie KW - Speicheldrüse KW - postradiogene Xerostomie KW - SIS-muc KW - 3D-Kultur KW - BioVaSc Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164116 ER - TY - THES A1 - Leinweber, Jonas T1 - Untersuchung zur pathophysiologischen Rolle und therapeutischen Relevanz der neuen Inhibitoren der plasmatischen Blutgerinnung Agaphelin und Ixolaris im experimentellen Schlaganfallmodell der Maus T1 - Characterization of the pathophysiological role and therapeutic relevance of the new inhibitors of plasmatic blood coagulation Agaphelin and Ixolaris in the model of ischemic stroke in mice N2 - Beim ischämischen Schlaganfall führt ein thrombotischer Verschluss von gehirnversorgenden Arterien zu einer akuten Durchblutungsstörung, mit der Folge von neurologischen Defiziten. Primäres Therapieziel ist es, diese Blutgerinnsel aufzulösen, um die Sauerstoffversorgung des Gehirns wiederherzustellen und den ischämischen Hirnschaden zu begrenzen. Dazu stehen die intravenösen Thrombolyse mit rt-PA (rekombinanter Gewebe-Plasminogen-Aktivator) sowie die endovaskuläre mechanische Thrombektomie zur Verfügung. Häufig kann ein Schlaganfall, trotz erfolgreicher Rekanalisation der Gefäße, zu einer weiteren Größenzunahme des Infarktes und neurologischen Defiziten bei den Patienten führen. Diese Größenzunahme beruht zum einen auf einem sich entwickelnden Hirnödem und zum anderen auf entzündlichen Prozessen. Zahlreiche Hinweise deuten darauf hin, dass der Schlaganfall ein Zusammenspiel aus thrombotischen und entzündlichen Ereignissen ist, ein Phänomen, das als Thromboinflammation bezeichnet wird. Aufgrund der begrenzten Behandlungsmöglichkeiten ist die Entwicklung neuer Therapieansätze für den ischämischen Schlaganfall besonders wichtig. Agaphelin und Ixolaris sind Proteine aus den Speicheldrüsen von Hämatophagen, für welche in früheren Studien eine starke antithrombotische Wirkung bei gleichzeitig geringem Blutungsrisiko nachgewiesen wurde. Diese möglichen antithrombotischen Effekte wurden in dieser Studie im Hinblick auf ihre Wirksamkeit und Sicherheit im Mausmodell der zerebralen Ischämie untersucht. Die Behandlung der Mäuse mit Agaphelin 1 Stunde nach transienter Okklusion der Arteria cerebri media (tMCAO) führte zu kleineren Schlaganfallvolumina und geringeren neurologischen Defiziten an Tag 1 nach dem Schlaganfall. Die Mortalität der Mäuse war bis Tag 7 deutlich gesunken. Aus klinischer Sicht ist ebenfalls relevant, dass der starke antithrombotische Effekt von Agaphelin im Mausmodell nicht mit einem erhöhten Risiko für intrazerebrale Blutungen einherging. Diesem protektiven Effekt von Agaphelin lagen eine verminderte intrazerebrale Thrombusbildung, eine abgeschwächte Entzündungsantwort und eine Stabilisierung der Blut-Hirn-Schranke sowie eine Reduzierung der Apoptose zugrunde. Nach der Gabe von Ixolaris 1 Stunde nach tMCAO waren zwar signifikant geringere Infarktgrößen messbar, diese führten allerdings nicht zu einer Verbesserung der neurologischen Defizite. Zudem verursachte die Gabe von Ixolaris schon 24 Stunden nach tMCAO erhebliche intrazerebrale Blutungen und auch die Mortalität der Mäuse war zu diesem Zeitpunkt bereits erhöht. Aufgrund dieser massiven Nebenwirkungen scheint Ixolaris kein geeigneter Kandidat für eine humane Anwendung zu sein. Bei Agaphelin hingegen könnte es sich um einen vielversprechenden Kandidaten für die Behandlung des ischämischen Schlaganfalls handeln. Vor einer möglichen Testung von Agaphelin in klinischen Studien, sind weitere translationale Untersuchungen notwendig, um ein noch präziseres Verständnis für die Wirksamkeit und Sicherheit von Agaphelin zu gewinnen. Insgesamt stellt die Hemmung thromboinflammatorischer Prozesse, ohne eine Erhöhung der Blutungskomplikationen, eine vielversprechende Option zur Behandlung des ischämischen Schlaganfalls dar. N2 - Thrombotic occlusion of cerebral vessels is an important process in pathogenesis of ischemic stroke resulting in lack of blood supply of the brain and neurological deficits. In order to restore the oxygenation of the brain and to limit brain injury, recanalization of the occluded vessels is the therapeutic main goal of stroke treatment. So far, the only proven pharmacological intervention for thrombolysis is the recombinant tissue-type plasminogen activator. For recanalization of larger arteries endovascular thrombectomy was established as a mechanic intervention. Nevertheless, despite successful recanalization ischemic brain damage and neurological deficits evolve. Increased size of infarct lesions develop due to brain edema and inflammatory processes. Moreover, there is evidence that inflammation and thrombosis are linked, which has led to the concept of thromboinflammation. Due to the limited treatment strategies in stroke management, the development of new therapeutic approaches for ischemic stroke is particularly important. Recent studies have shown that the hematophagous salivary gland proteins Agaphelin and Ixolaris exhibit multiple antithrombotic effects without promoting a risk of bleeding. To investigate the potentially safe antithrombotic effects, Agaphelin and Ixolaris were tested in a mouse model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO). Treatment of mice with Agaphelin 1 hour after tMCAO resulted in smaller infarct volumes and an improved neurological function on day one after stroke. Up to seven days after stroke the mortality rate was significantly reduced. This protective effect was due to reduced local thrombus formation, a reduced inflammatory response and less severe blood-brain-barrier damage as well as reduced apoptosis. Moreover, it is important to mention, that the strong protective effect of Agaphelin was not linked to an increased risk of intracerebral bleeding. Treatment of mice with Ixolaris one hour after tMCAO leads to significantly smaller infarct sizes. However, neurologic deficits did not improve after treatment with Ixolaris. Furthermore, risk of intracerebral bleeding and mortality rates were significantly increased 24 hours after treatment with Ixolaris. Due to these severe side effects, Ixolaris does not seem to be an appropriate candidate for human therapy. Nevertheless, Agaphelin appears to be a promising component for ischemic stroke treatment, but further translational studies should be performed before testing Agaphelin in clinical stroke trials. Overall, the inhibition of thromboinflammatory effects without increased bleeding reflects a promising option for successful ischemic stroke treatment. KW - Schlaganfall KW - antithrombotic KW - inflammation KW - stroke KW - Agaphelin KW - Ixolaris KW - Thromboinflammation KW - Experimenteller Schlaganfall Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-252921 ER - TY - THES A1 - Lauruschkat, Chris David T1 - Entwicklung funktioneller Immunassays zur Detektion der humanen Immunantwort auf das opportunistische Pathogen \(Aspergillus\) \(fumigatus\) T1 - Development of functional immunoassays to study human host responses to the opportunistic pathogen \(Aspergillus\) \(fumigatus\) N2 - Aspergillus fumigatus ist ein opportunistisches fungales Humanpathogen, das ein breites Erkrankungsspektrum von der invasiven Aspergillose (IA) in immunkompromittierten Patienten bis zu einer Reihe von Hypersensitivitätserkrankungen in immunkompetenten Individuen hervorrufen kann. Die Diagnostik für A. fumigatus assoziierte Krankheitsbilder beruht auf mehreren diagnostischen Tests, die auch in ihrer Kombination oft zu späten und unzuverlässigen Diagnosen führen, was wiederum zu einer suboptimalen Patientenversorgung, erhöhter Mortalität und gesteigerten Kosten für das Gesundheitssystem führt. Es besteht daher die unbedingte Notwendigkeit, neue und bessere diagnostische Tests zur Detektion von A. fumigatus zu entwickeln. T Zell Assays sind vielversprechende, innovative diagnostische Tests, die bereits für andere Infektionskrankheiten in der Routinediagnostik eingesetzt werden. Erste Versuche wurden bereits unternommen, diese Assays auch für A. fumigatus assoziierte Erkrankungen einzusetzen. Die gängigsten, auf mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC)-basierten T Zell Assays sind der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), Enzyme-linked Immuno Spot Assay (ELISPOT) und die Durchflusszytometrie. Das Ziel dieser Dissertation war die Entwicklung eines klinisch einsetzbaren T-Zell-Assays für A. fumigatus assoziierte Erkrankungen. Die in der Literatur beschriebenen Assays zeigten in unseren Experimenten bei der Anwendung für mykologische Fragestellungen eine hohe Suszeptibilität gegenüber bereits kurzen präanalytischen Lagerzeiten und Krykonservierung, was einen klinischen Einsatz erschwerte. Wir entwickelten deshalb einen Vollblut basierten ELISA (VB-ELISA) mit dualer Kostimulation (α-CD28 und α-CD49d), hoher Reproduzierbarkeit und verbesserter Robustheit gegenüber präanalytischen Einflussfaktoren. Der VB ELISA konnte hohe Differenzen zwischen Typ 1 T Helferzellen (Th1) , Th2 und Th17 Zytokinkonzentrationen bei Patienten mit Aspergillus assoziierten Hypersensitivitätskrankheitsbildern und Kontrollpatienten feststellen. Um zu testen, ob dieser Anstieg auf die Erkrankung zurückzuführen ist oder auch bei hoher Aspergillus-Umweltexposition vorzufinden ist, wurde der Assay in Aspergillus exponierten gesunden ökologischen Landwirten getestet. In dieser Gruppe fanden wir ebenfalls eine erhöhte Th1 und Th2 Expansion und Zytokinsekretion gegenüber gesunden Kontrollspendern, jedoch wurde nur ein geringer Anstieg des Th17 Signalzytokines IL-17 detektiert. Die Detektion von IL-17 im VB-ELISA in Kombination mit anderen Zytokinmarkern ist daher ein vielversprechender Biomarker für die Diagnose von A. fumigatus assoziierten Hypersensitivitätserkrankungen. Neben diesen Hypersensitivitätserkrankungen haben wir den VB-ELISA auch in immunkompromittierten Patienten nach allogener Stammzelltransplantation (alloSZT), einer Hochrisikogruppe für die IA und die durch das humane Cytomegalovirus (HCMV) ausgelöste Zytomegalie, evaluiert. Während in unserer monozentrischen Pilotstudie aufgrund der geringen Inzidenz keine Evaluation an IA-Patienten erfolgen konnte, wurde mittels VB-ELISA eine hohe Konkordanz der HCMV-spezifischen T Zell Antwort mit der HCMV Serologie sowie eine vergleichbare Leistung zum ELISPOT, dem am häufigsten eingestetzen Assay für diese Fragestellung, festgestellt. Zusammenfassend haben wir mit dem VB ELISA einen vielversprechenden und breitflächig im Spektrum A. fumigatus assoziierter Erkrankungen einsetzbaren T Zell Assay entwickelt, der in der Zukunft in großen Studien mit klar definierten Patientenkohorten getestet werden sollte. Auf Grund von Daten aus Folgestudien, die auf dieser Arbeit basieren, ist des Weiteren davon auszugehen, dass der VB-ELISA auf Grund seiner Stärken potenziell in einer Vielzahl von Anwendungsgebieten und Pathogenen (eine Folgestudie mit SARS-CoV-2 wurde vor kurzem veröffentlicht) universell eingesetzt werden kann. Neben der Immundiagnostik für diverse Infektionserkrankungen könnte der Assay außerdem für T Zell Antworten auf Vakzinierungen und Immuntherapien, in vivo Experimente und in vitro Toxizitätstests verwendet werden. N2 - Aspergillus fumigatus is an opportunistic human pathogen, which is the cause of a wide disease spectrum. The spectrum ranges from invasive Aspergillosis (IA) in immunocompromised patients to diverse hypersensitivity diseases in immunocompetent individuals. Diagnostic assays of A. fumigatus have to be combined for efficient detection and still lead to unreliable and late diagnosis, resulting in suboptimal patient care, increased mortality and public health costs. There is, therefore, a great need to develop novel diagnostics for the detection of A. fumigatus. T-cell assays are promising, innovative diagnostic assays, which are used in routine diagnostics for certain infectious diseases. First affords have been made to adapt T-cell assays for the diagnosis of A. fumigatus-associated diseases. The most common T-cell assays are based on the isolation and stimulation of peripheral blood mononuclear cell (PBMC) and relay on Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), Enzyme-Linked Immuno Spot Assay (ELISPOT) and flow cytometry as their read-out platforms. The aim of this dissertation was to develop a clinically feasible T-cell assay for A. fumigatus-associated diseases. We were able to demonstrate that all of these assays have high susceptibility towards pre-analytic factors like cryopreservation and shortly extended pre-analytic blood storage periods, hampering clinical feasibility. Thus, we developed a whole blood based ELISA (WB-ELISA) with dual co-stimulation (α-CD28 and α-CD49d), which showed high reproducibility, increased robustness towards pre-analytic factors and increased cytokine read-outs. The WB-ELISA was able to quantify large differences of T helper cell 1 (Th1), Th2 and Th17 cytokine concentrations in patients suffering from Aspergillus-associated hypersensitivity diseases compared to healthy controls. To analyze, whether these increased cytokine concentrations were the result of the pathology or could also be found in heavily Aspergillus-exposed individuals, we examined cytokine concentration in heavily Aspergillus-exposed organic farmers. We quantified increased Th1 and Th2 cytokine concentrations, however, we only found a minimal increase in the Th17 signal cytokine IL-17. Interleukin (IL)-17 (most likely in combination with other cytokines) is therefore a promising potential biomarker for the diagnosis of Aspergillus-associated hypersensitivity diseases. In addition to Aspergillus-associated hypersensitivity diseases, we tested the feasibility of the WB ELISA in immunocompromised patients after allogeneic stem cell transplantation (alloSCT). These patients are at high-risk for infections like IA as well as cytomegalovirus (CMV) disease, which is caused by CMV. Although, IA-specific evaluation could not be conducted, due to the low IA-incidence in these patients, the WB-ELISA showed high concordance of HCMV-specific T-cell responses with HCMV-serology as well as comparable performance to the ELISPOT, a commonly used T-cell assay for HCMV, in alloSCT patients. In conclusion, the successful development of the WB-ELISA has led to a promising and widely applicable T-cell assay for Aspergillus-associated diseases. In the future, the WB-ELISA should be evaluated in larger, multi-centric studies in well-defined patient cohorts suffering from Aspergillus-associated diseases. Furthermore, the WB-ELISA might be useful for a wide range of areas and pathogens (a follow-up study in COVID-19 patients was recently published). Besides the use in the immune diagnostics of infectious diseases, the WB-ELISA might also be applicable in the quantification of T-cell responses in vaccination- and immune therapy studies, in-vivo experiments and in-vitro toxicity testing. KW - Immunzellassays KW - Immunology KW - Infectious diseases KW - Immune cell assays KW - Immunologie KW - Infektiologie KW - Aspergillus fumigatus Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-319835 ER - TY - THES A1 - Langlhofer, Georg T1 - Über die Bedeutung intrazellulärer Subdomänen des Glycinrezeptors für die Kanalfunktion T1 - Investigations into the relevance of glycine receptor intracellular subdomains to receptor channel function N2 - Der zur Familie der pentameren ligandengesteuerten Ionenkanäle zugehörige Glycinrezeptor (GlyR) ist ein wichtiger Vermittler synaptischer Inhibition im Zentralnervensystem von Säugetieren. GlyR-Mutationen führen zur neurologischen Bewegungsstörung Hyperekplexie. Aufgrund fehlender struktureller Daten ist die intrazelluläre Loop-Struktur zwischen den Transmembransegmenten 3 und 4 (TM3-4 Loop) eine weitgehend unerforschte Domäne des GlyR. Innerhalb dieser Domäne wurden Rezeptortrunkierungen sowie Punktmutationen identifiziert. Rezeptortrunkierung geht mit Funktionslosigkeit einher, welche jedoch durch Koexpression des fehlenden Sequenzabschnitts zum Teil wiederhergestellt werden kann. Innerhalb dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen trunkierten, funktionslosen GlyR und sukzessiv verkürzten Komplementationskonstrukten untersucht. Dabei wurden als Minimaldomänen für die Interaktion das C-terminalen basische Motive des TM3-4 Loops, die TM4 sowie der extrazelluläre C-Terminus identifiziert. Die Rückkreuzung transgener Mäuse, die das Komplementationskonstrukt iD-TM4 unter Kontrolle des GlyR-Promotors exprimierten, mit der oscillator-Maus spdot, die einen trunkierten GlyR exprimiert und 3 Wochen nach der Geburt verstirbt, hatte aufgrund fehlender Proteinexpression keinen Effekt auf die Letalität der Mutation. Des Weiteren wurde die Bedeutsamkeit der Integrität beider basischer Motive 316RFRRKRR322 und 385KKIDKISR392 im TM3-4 Loop in Kombination mit der Loop-Länge für die Funktionalität und das Desensitisierungsverhalten des humanen GlyRα1 anhand von chimären Rezeptoren identifiziert. Eine bisher unbekannte Patientenmutation P366L innerhalb des TM3-4 Loops wurde mit molekularbiologischen, biochemischen und elektrophysiologischen Methoden charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass die mutierten Rezeptorkomplexe in vitro deutlich reduzierte Glycin-induzierte Maximalströme sowie eine beschleunigte Schließkinetik aufweisen. P366L hat im Gegensatz zu bereits charakterisierten Hyperekplexiemutationen innerhalb des TM3-4 Loops keinen Einfluss auf die Biogenese des Rezeptors. P366 ist Teil einer möglichen Poly-Prolin-Helix, die eine Erkennungssequenz für SH3-Domänen darstellt. Ein potenzieller Interaktionspartner des TM3-4 Loops des GlyRα1 ist Collybistin, welches eine wichtige Rolle bei der synaptischen Rezeptorintegration spielt und die Verbindung zum Zytoskelett vermittelt. An der inhibitorischen Synapse verursacht P366L durch die Reduzierung postsynaptischer Chloridströme, das beschleunigte Desensitisierungsverhalten des GlyRα1 sowie ein verändertes Interaktionsmotiv Störungen der glycinergen Transmission, die zur Ausprägung phänotypischer Symptome der Hyperekplexie führen. N2 - The glycine receptor (GlyR) belongs to the superfamily of pentameric ligand-gated ion channels and mediates synaptic inhibition in the central nervous system of mammals. GlyR mutations lead to the neuromotor disorder hyperekplexia. Due to the lack of structural data, the intracellular loop between transmembrane segments 3 and 4 (TM3-4 Loop) is considered as the most unexplored domain of the GlyR. Within this domain receptor truncations as well as point mutations have been identified. Receptor truncation correlates with non-functionality that can be partially restored by coexpression of the missing sequence. In this work, the interaction between a truncated non-functional GlyR and successively truncated complementation constructs was investigated. The C-terminal basic motif of the TM3-4 loop, the TM4 and the C-Terminus were identified as the minimal domain required for interaction. Backcrossing of a transgenic mouse line expressing the complementation construct iD-TM4 under the control of the GlyR promotor, with the oscillator mouse spdot expressing a truncated GlyR leading to death 3 weeks after birth, was unsuccessful and did not influence the lethality of the mutation, most probably due to the lack of transgene protein expression. In addition the importance of the integrity of both basic motifs 316RFRRKRR322 and 385KKIDKISR392 within the TM3-4 loop in combination with loop length were shown to be essential for functionality and desensitization behavior of the human GlyRα1 using chimeric receptors. An unknown TM3-4 loop mutation P366L was characterized using biomolecular, biochemical and electrophysiological approaches. It was demonstrated that mutated receptor complexes display remarkably reduced glycine-induced maximal currents in addition to accelerated channel closing kinetics in vitro. In contrast to previously analyzed hyperekplexia mutations within the TM3-4 loop, P366L exhibits no influence on receptor biogenesis. P366 is located in a sequence probably forming a poly-proline helix, which serves as a recognition sequence for SH3 domains. One prospective interaction partner is collybistin, which plays a major role in the process of synaptic receptor integration and connects the receptor complex to the cytoskeleton. At the site of the inhibitory synapse, P366L causes reduced chloride currents, accelerated desensitization behavior of the GlyRα1 and an altered interaction motif leading to disturbed glycinergic neurotransmission that result in formation of phenotypic symptoms of hyperekplexia. KW - Glycinrezeptor KW - intrazelluläre Domäne KW - Hyperekplexie KW - intracellular domain KW - hyperekplexia KW - Bewegungsstörung KW - Synapse KW - Ionenkanal Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140249 ER - TY - THES A1 - Langenhorst, Daniela T1 - Induktion und Aktivierung regulatorischer T-Zellen durch superagonistische Stimulation des CD28 Moleküls T1 - Induction and activation of regulatory T-cells by superagonistic Stimulation of the CD28 molecule N2 - Regulatorische T-Zellen (Tregs) spielen eine ntscheidende Rolle beim Erhalt der Immunhomöostase und bei der Kontrolle überschießender Immunantworten. Sie können anhand ihres Entstehungsortes in im Thymus generierte natürliche Tregs (nTregs) und in der Peripherie generierte induzierte Tregs (iTregs) unterteilt werden. Ihr Phänotyp wie auch ihre Funktion werden zu einem großen Teil durch den transkriptionellen Masterregulator Foxp3 kontrolliert. Das kostimulatorische Molekül CD28 wird von nTregs für die Differenzierung benötigt und von Tregs und konventionellen T-Zellen (Tkons) für ihre Aktivierung. Superagonistische CD28 spezifische monoklonale Antikörper (CD28SA) aktivieren T-Zellen im Gegensatz zu konventionellen anti-CD28 Antikörpern ohne zusätzliche Ligation des T-Zellrezeptors. Die in vivo Applikation des CD28SA bewirkt eine starke Aktivierung der Tregs und eine präferentielle Expansion der Tregs gegenüber Tkons. Dies erklärt die präventive und therapeutische Wirkung der CD28SA Behandlung in verschiedenen Krankheitsmodellen bei Nagern. Die erste Anwendung des humanisierten CD28SA TGN1412 führte in den Testpersonen jedoch zu einem unerwarteten „Cytokine-Release Syndrom“. Daher wurde hier am Mausmodell der Zusammenhang zwischen Treg Aktivierung und systemischer Zytokinausschüttung näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die CD28SA vermittelte Proliferation der T-Zellen abhängig vom CD28 Signal und von parakrinem Interleukin (IL)-2 ist. Durch die in vivo Depletion der Tregs vor der CD28SA Injektion wurde deutlich, dass es auch in Mäusen nach CD28SA Stimulation zu einer systemischen Ausschüttung pro-inflammatorischer Zytokine kommt, die jedoch, im Gegensatz zum humanen System, von Tregs effektiv kontrolliert werden kann. Um die usschüttung pro-inflammatorischer Zytokine zu verhindern, wäre eine zusätzliche prophylaktische Behandlung mit Corticosteroiden möglich, da diese auch in hohen Dosen die CD28SA vermittelte Aktivierung und Expansion der Tregs nicht beeinflussen. Neben der Expansion wird durch die Stimulation mit CD28SA auch die Produktion des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10 in Tregs induziert und so eine genauere Untersuchung des Ursprungs und des Schicksals IL-10 produzierender Tregs ermöglicht. Diese Tregs exprimieren im Vergleich zu IL-10 negativen Tregs ein höheres Niveau an Molekülen, die mit einer supprimierenden Aktivität verbunden sind. Zudem werden IL-10 Produzenten aufgrund der Veränderung im Expressionsmuster der Migrationsrezeptoren nach der Stimulation von einem lymphknotensuchenden CCR7+CCR5-CCR6- zu einem entzündungssuchenden CCR7-CCR5+CCR6+ Phänotyp verstärkt in Bereiche mit stattfindender Immunantwort rekrutiert. Schließlich sind IL-10 produzierende Tregs von CD28SA stimu2 lierten Mäusen in vitro stärker apoptoseanfällig als die IL-10 negativen Tregs. Die Aktivierung der Tregs scheint somit die terminale Differenzierung zu einem IL-10 produzierenden Effektorphänotyp mit begrenzter Lebensdauer zu induzieren. Dies führt auch zur Beendigung der Immunsuppression. Die Kombination aus schwachem TZR und starkem CD28 Signal, die die CD28SA Stimulation in naiven T-Zellen auslöst, induziert zumindest in vitro abhängig von IL-2 und TGFβ effizient die Expression von Foxp3. Die so generierten iTregs haben, ähnlich wie konventionell in vitro erzeugte iTregs, in Bezug auf die Expression von Oberflächenmolekülen und den Methylierungsstatus bestimmter Regionen des Foxp3 Gens einen Phänotyp, der zwischen dem von Tkons und Tregs liegt. Da auch die supprimierende Aktivität der iTregs geringer ist als die der ex vivo Tregs bedarf es einer weiteren Optimierung des Stimulationsprotokolls, um diese Zellen für therapeutische Zwecke verwenden zu können. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die superagonistische Stimulation des CD28 Moleküls ein vielseitig einsetzbares Instrument ist. Einerseits können durch die CD28SA Stimulation Tregs polyklonal aktiviert und für therapeutische Zwecke mobilisiert werden und andererseits kann die besondere Art der T-Zellstimulation auch dazu genutzt werden, neue Aspekte von nTregs und iTregs zu untersuchen. N2 - Regulatory T-cells (Tregs) are important to maintain immune homeostasis and to control overshooting immune responses. Depending on the place where they are generated Tregs can be divided into thymus-derived natural Tregs (nTregs) and peripheral-derived induced Tregs (iTregs). Their phenotype and function is controlled by the transcriptional masterregulator Foxp3. The costimulatory molecule CD28 is required for nTreg differentiation and for the activation of Tregs and conventional T-cells (Tcons). Superagonistic CD28 specific monoclonal antibodies (CD28SA) activate T-cells without additional T-cell receptor ligation in contrast to conventional anti-CD28 antibodies. In vivo CD28SA treatment induces strong Treg activation and preferential expansion of Tregs over Tcons. This explains the preventive and therapeutic effects of CD28SA in various rodent disease models. In contrast, a first-in-man trail of the human CD28SA TGN1412 resulted in an unexpected cytokine release syndrome. Thus, using the mouse system the relationship between Treg activation and systemic cytokine release was reinvestigated. It could be shown that CD28SA induced T-cell proliferation is dependent on the CD28 signal and on paracrine interleukin (IL)-2. In vivo depletion of Tregs prior CD28SA injection showed that in mice, too, CD28SA stimulation induces a systemic release of pro-inflammatory cytokines, but in contrast to humans, this can be effectively controlled by Tregs. To prevent the pro-inflammatory cytokine release an additional prophylactic treatment with corticosteroids might be feasible since even high doses of corticosteroids have no effect on CD28SA driven Treg activation and expansion. Beside expansion, CD28SA stimulation also induces the production of anti-inflammatory IL-10 in Tregs. This allows for examination of the origin and fate of IL-10 producing Tregs. In comparison to IL-10 negative Tregs, these cells express higher levels of molecules associated with suppressive activity. In addition IL-10 producers are preferentially recruited to sites of ongoing immune responses, as they shift their expression pattern of migration receptors after stimulation from a CCR7+CCR5-CCR6- lymph node-seeking to a CCR7-CCR5+CCR6+ inflammation-seeking phenotype. Finally, IL-10 producing Tregs of CD28SA stimulated mice are more apoptosis-prone in vitro than their IL-10 negative counterparts. Thus, activation of Tregs induces terminal differentiation towards an IL-10 producing effector phenotype with a limited life span. This also terminates the immune suppression. The special combination of weak TCR and strong CD28 signals following CD28SA stimulation of naïve T-cells can, at least in vitro and dependent on IL-2 and TGFβ, efficiently induce Foxp3 expression. The phenotype regarding expression of certain surface molecules and the methylation level of particular regulatory regions of the Foxp3 gene is similar in CD28SA and anti-CD3/ anti-CD28 (+ IL-2/TGFβ) induced iTregs, and shows properties of both Tcons and Tregs. Since the suppressive activity of these iTregs is also lower than that of ex vivo Tregs, further improvement of the stimulation protocol is needed before these cells could be used for therapeutic purposes. In conclusion, this study shows that superagonistic stimulation of CD28 molecules is a versatile tool. On the one hand CD28SA stimulation polyclonally activates Tregs and can be used as a therapeutic, on the other hand the special way of T-cell stimulation can also be utilized to investigate new aspects of nTregs and iTregs. KW - Antigen CD28 KW - regulatorische T-Zellen KW - CD28 Molekül KW - T-Zellaktivierung KW - CD28 Superagonist KW - T-Lymphozyt KW - Immunreaktion KW - Immunologie Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-96700 ER -