TY - THES A1 - Lieberherr, Christina T1 - Untersuchung der Wirkung potentieller Inhibitoren der Masernvirus-Infektion T1 - Investigation of the effect of potential inhibitors of measles virus infection N2 - Die Infektion mit dem Masernvirus (MV) stellt weltweit immer noch ein großes Problem dar. Trotz des vorhandenen Lebendimpfstoffs, der eine Erkrankung sicher zu verhindern vermag, haben nicht nur die Entwicklungsländer, in denen ein flächendeckender Impfschutz schwieriger zu erreichen ist, mit der Erkrankung und ihren Komplikationen zu kämpfen. Hat sich die Erkrankung klinisch manifestiert gibt es keine kausalen Therapiemöglichkeiten und es kann nur noch symptomatisch behandelt werden. Dies ist v.a. auch in Hinblick auf die schweren Komplikationen der Maserninfektion von Bedeutung. Bei Erstkontakt mit dem Masernvirus ist die Suszeptibilität nicht geimpfter Menschen sehr hoch. Das bedeutet, dass es in 95-98 % der Fälle nach einer Infektion mit dem Masernvirus auch zum klinischen Bild der Masern kommt, unabhängig von Alter und Geschlecht. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, potentielle Hemmstoffe der Maserninfektion auf ihre Wirkung zu testen und zu verstehen, wo im Infektions- und Replikationszyklus des MV sie eingreifen. Es wurden eine Reihe Substanzen mit potentiell-inhibitorischen Eigenschaften in Infektions-Hemmtests und im Zytotoxizitätstest untersucht, von denen im Anschluss die drei besten Inhibitoren (JK80, QD6-8 und Droseron) weiter untersucht wurden. JK80 und QD6-8 waren beide mit IC50-Werten um 30 µM und SI-Werten von über 2 nur mäßig spezifisch antiviral wirksam. Während JK80 vermutlich den Eintritt des MV in die Zellen verhindert, hemmt QD6-8 die intrazelluläre Virusreplikation und wäre im Hinblick auf die Entwicklung neuartiger, spezifischer Medikamente gegen die Maserninfektion von grossem Interesse. Eine Zielmolekülanalyse der Substanz und die Testung anderer Derivate könnten Aufschluss darüber geben, wie Substanzen aussehen müssten, die eine spezifische Hemmung der intrazellulären Replikation bewirken können. Der Naturstoff Droseron könnte mit einer spezifischen Hemmung (IC50 ca. 10 µM; SIWert 6 im Fluoreszenzreader, bzw. IC50 ca. 2 µM; SI-Wert 30 in der Titration) eine mögliche Leitsubstanz für einen neuen MV-Inhibitor darstellen. Allerdings waren alle bisher getesteten Droseron-Derivate entweder weniger inhibitorisch wirksam oder deutlich zytotoxischer als Droseron selbst. Die Ergebnisse der Infektionshemmversuche mit Zugabe von Droseron vor, während oder nach der Infektion mit MV sprechen dafür, dass Droseron den Eintritt des Virus in die Zelle stört. N2 - The infection with measles virus (MV) is still a major problem worldwide.The aim of this work was therefore to test potential inhibitors of measles infection for their effect and to understand where in the infection and replication cycle of the MV they intervene.A series of substances with potential inhibitory qualities were investigated in infection inhibition tests and in the cytotoxicity test. The three best inhibitors (JK80, QD6-8 and Droseron) were further investigated.The naphthoquinone Droseron could be a possible lead compound for a new MV inhibitor. KW - Masernvirus KW - Masernvirus Inhibitoren Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176752 ER - TY - THES A1 - Berisha, Filip T1 - Molekulare Wirkmechanismen von Sulfonylharnstoffen: Direkte Epac-Aktivierung oder Hemmung der Phosphodiesterasen T1 - Mechanism of action of sulfonylurea: direct epac activation or PDE inhibition N2 - Diabetes mellitus ist die häufigste Stoffwechselerkrankung in Deutschland. Sulfonylharnstoffe (SH) stellen die älteste und eine sehr prominente Gruppe in der oralen Therapie des Diabetes mellitus Typ II dar, die eine verstärkte Insulinfreisetzung vorrangig durch die Hemmung eines ATP-sensitiven Kaliumkanals (K+ATPKanal) erreichen. Daneben konnten weitere Proteine identifiziert werden, die mit SH interagieren und zu deren Effekten beitragen. Während bereits in frühen Arbeiten gezeigt werden konnte, dass SH Vertreter der Phosphodiesterasen (PDE)Familie in ihrer Funktion behindern können, wurde kürzlich Epac2 (exchange protein directly activated by cAMP 2) als weiteres Zielprotein für SH angeführt. Insbesondere die Fähigkeit von SH, direkt an Epac2 zu binden, wird in der Literatur kontrovers diskutiert und eine indirekte Aktivierung durch eine PDE-Hemmung und einen erhöhten cAMP-Spiegel als Mechanismus vermutet. Zur weiteren Untersuchung wurden in dieser Arbeit FRET-basierte Biosensoren verwendet, um die Wirkung von SH auf Epac und PDEs näher zu untersuchen. Dabei konnte sowohl in einem photometrischen Ansatz als auch in lebenden Zellen, die einen Epac2-basierten Sensor enthalten, gezeigt werden, dass eine Aktivierung durch SH stattfindet. Da sowohl Epac2-camps, der von allen hier verwendeten Sensoren mit der höchsten Sensitivität für cAMP, als auch CFP-Epac1δDEPYFP nicht auf SH reagieren, ist diese Aktivierung selektiv für die Isoform Epac2 und wird vorrangig nicht durch eine PDE-Hemmung verursacht. Die Verwendung weiterer Sensoren mit verschiedenen Varianten von Epac2 (verlängerte Version von Epac2-camps) zeigen mit zunehmender Länge über die cAMP-Bindedomäne hinaus eine beginnende Reaktion im Sinne einer instabilen FRET-Kurve (Epac2camps long) bzw. eine deutliche Aktivierung durch den SH (Epac2-camps superlong), wodurch eine direkte Aktivierung bestätigt wird, und suggerieren eine Bindestelle für SH, die sich von denen von cAMP unterschiedet und weiter eingeengt werden konnte (im näheren Bereich von Q454 bzw. E460). Obwohl hierdurch eine direkte Aktivierung gezeigt werden konnte, ist die grundsätzliche Fähigkeit der SH, PDE zu beeinflussen, keineswegs geklärt. Daher wurden weitere Sensoren konstruiert bzw. verwendet, die basierend auf Epac1-camps und Epac2-camps verschiedene PDEs enthalten. Dabei konnte durch die Zugabe von SH eine deutliche Aktivierung des jeweiligen Sensors und somit eine PDEHemmung nachgewiesen werden. Dies konnte sowohl für PDE4A als auch für die in Inselzellen überwiegend vorkommende PDE3B gezeigt werden. Dadurch ergeben sich einige (klinisch relevante) Implikationen. Zum einen stellt neben der direkten Epac-Aktivierung auch die direkte Hemmung der PDE einen wichtigen Mechanismus für die Sekretion von Insulin dar. Außerdem sind bei PDEHemmung und direkter Epac-Aktivierung außerhalb der Inselzellen auch Nebenwirkungen in anderen Organen zu erwarten wie z.B. die Entstehung lebensgefährlicher Rhythmusstörungen in Herzmuskelzellen. N2 - Diabetes is the most common metabolic disease in the developed world. Sulfonylurea (SU) are one of the oldest and prominent group of oral antidiabetic drugs that act by inhibiting an ATP-sensitive potassium channel and increasing insulin release. Furthermore, additional targets have been identified that interact with SU. Whereas early works could show that SU can inhibit the function of different phosphodiesterases (PDEs), Epac2 (exchange protein directly activated by cyclic AMP) has been identified as yet another target protein for CU. Especially the ability to activate Epac2 by direct binding has been subject of controversial debate. In this study we used FRET-based biosensor to investigate the effects of SU on Epac and different PDEs. We could show that SU can activate Epac by direct binding that is selective top the isoform Epac2. The use of different sensors that contain different parts of Epac2 even revealed the approximate location of the binding site that is different to that of cAMP. Moreover, the use of other biosensor containing isoforms of PDE showed the ability of SU to strongly inhibit PDE3 and PDE4. This leads to several (clinically relevant) implications. Firstly, the direct activation of Epac2 present an important mechanism of insulin release. On the other hand, the activation of Epac2 and inhibition of different PDEs in all cells and tissues might lead to numerous side effects in other organs, e.g. the formation of life threatening cardiac arrythmias. KW - Sulfonylharnstoffe KW - FRET KW - Epac KW - Phosphodiesterasen KW - PDE-Hemmung KW - sulfonylurea KW - biosensor KW - cAMP KW - CFP KW - YFP Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176535 ER - TY - THES A1 - Aue, Annemarie T1 - Lokalisation und Bedeutung der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase bei der Lungenfibrose in der Maus T1 - Localization and importance of NO-sensitive guanylyl cyclase in a murine model of lung fibrosis N2 - Die im Rahmen dieser Arbeit behandelten Fragestellungen vermitteln neue Kenntnisse über die Pathogenese der Lungenfibrose auf zellulärer Ebene. Bei der Lungenfibrose handelt es sich um eine chronische Erkrankung, die durch eine initiale Inflammation und das Auftreten von Myofibroblasten gekennzeichnet ist. Die Myofibroblasten führen zu einer vermehrten Produktion von EZM, was in einer Zerstörung der Lungenarchitektur, Narbenbildung und folglich einem verminderten Gasaustausch resultiert. Eine modulatorische Rolle von Stickstoffmonoxid (NO) bei der Entwicklung der Lungenfibrose wird vermutet, dennoch sind die Effektorzellen in der Lunge noch nicht bekannt. Daher wurde im ersten Teil dieser Arbeit die Lokalisation des NO-Rezeptors, der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase (NO-GC), in der Lunge untersucht. Dazu wurden Knockout-Mäuse generiert, bei denen die NO-GC global (GCKO) oder Perizyten-spezifisch (PDGFRβ-GCKO, SMMHC-GCKO, NG2-GCKO und SMMHC/NG2-GCKO) deletiert ist. Zudem wurden tdTomato-Reportermäuse verwendet, die das Fluoreszenzprotein unter Kontrolle eines spezifischen Reporters exprimieren (PDGFRβ/tomato, SMMHC/tomato, NG2/tomato, FoxD1/tomato und Tie2/tomato). In der Lunge sind Perizyten der NO-GC-exprimierende Zelltyp. Durch Immunhistochemie konnten zudem zwei verschiedene Subpopulationen von NO-GC-exprimierenden Perizyten identifiziert werden: Eine große Population an SMMHC/PDGFRβ-positiven Perizyten und eine kleine Population an NG2/PDGFRβ-positiven Perizyten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Funktion der NO-GC während der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose untersucht. Bleomycin führt zu einer fibrotischen Antwort in allen Genotypen, was durch ein erhöhtes Lungengewicht und einen erhöhten Kollagengehalt deutlich wird. Der Schweregrad der Lungenverletzung ist in NO-GC-defizienten Mäusen größer als in Anwesenheit der NO-GC. Dies deutet auf eine Rolle der NO-GC bei der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose hin. Während der Entstehung der Lungenfibrose kommt es zur Bildung von Myofibroblasten, die als die Schlüsselzellen der Wundheilung und fibrotischer Prozesse bezeichnet werden. Diese Zellen kommen unter physiologischen Bedingungen kaum vor und ihre Herkunft ist nach wie vor nicht eindeutig geklärt. Da Perizyten als mögliche Vorläuferzellen betrachtet werden, wurde Lineage Tracing von Perizyten durchgeführt. Erstmals wurden zwei verschiedene Myofibroblasten-Subtypen durch die Expression von NO-GC unterschieden: (1) NO-GC-positive Myofibroblasten, die in der Alveolarwand lokalisiert sind und von Perizyten abstammen und (2) NO-GC-negative Myofibroblasten, die sich innerhalb der Alveolen befinden, deren Ursprung jedoch nicht Perizyten sind. Diese Myofibroblasten zeigen jedoch eine de novo-Synthese von PDGFRβ. Durch Lineage Tracing-Versuche sowie immunhistochemische Analysen können Perizyten, Endothelzellen und Fibrozyten als Vorläuferzellen ausgeschlossen werden. Die Ursprungszelle der intra-alveolären Myofibroblasten ist somit bislang nicht identifiziert. Im letzten Teil der Arbeit wurde die Rolle der an der Lungenfibrose beteiligten Zelltypen näher untersucht. Dazu wurde die Auflösung der reversiblen Bleomycin-induzierten Lungenschäden betrachtet. Der Verlust der beiden Myofibroblasten-Subtypen weist darauf hin, dass sie zwar die Effektorzellen der Wundheilungsreaktion, jedoch nicht an der Entstehung der chronisch manifesten Fibrose beteiligt sind. Perizyten proliferieren in Folge der Gabe von Bleomycin und sind vermehrt im Lungenparenchym auch nach Auflösung der Bleomycin-induzierten Lungenverletzung vorzufinden. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass es sich hierbei um die Effektorzellen der chronisch manifesten Lungenfibrose handelt, die durch eine Verdickung der Alveolarwand gekennzeichnet ist. Um die zellulären Mechanismen der Lungenfibrose umfassend aufzuklären, müssen weitere Untersuchungen an irreversiblen Fibrosemodellen folgen, die auch die chronischen Charakteristiken der Erkrankung berücksichtigen. N2 - This project provides new insights into the pathogenesis of pulmonary fibrosis on the cellular level. Pulmonary fibrosis is a chronic disease characterized by signs of inflammation and the appearance of myofibroblasts that are responsible for excessive production of extracellular matrix (ECM). This leads to destroyed lung architecture, scar formation and reduced gas exchange. A modulatory role of nitric oxide (NO) in the development of pulmonary fibrosis has been proposed. However, the effector cells in the lung are remain elusive. The first part of the thesis focused on the localization of NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) in lung. Pericytes are the major NO-GC-expressing cell type in lung. Knock-out mice were generated lacking NO-GC globally (GCKO) as well as pericyte-specific GCKO mice (PDGFRβ-GCKO, SMMHC-GCKO, NG2-GCKO und SMMHC/NG2-GCKO). In addition, reporter mice were used that express tdTomato following cre-mediated recombination (PDGFRβ/tomato, SMMHC/tomato, NG2/tomato, FoxD1/tomato und Tie2/tomato). Immunohistochemical analysis shows the existence of two subpopulations of pericytes expressing NO-GC in lung: SMMHC/PDGFRβ-positive pericytes and a smaller subpopulation of NG2/PDGFRβ-positive pericytes. In the second part of the thesis, the role of NO-GC during bleomycin-induced lung injury was investigated. Bleomycin led to a fibrotic response in all genotypes as seen by an increase of lung weight and collagen content. Severity of lung injury in NO-GC-deficient mice was greater compared to wild type (WT) mice following instillation of bleomycin. These results indicate a possible role of NO-GC during bleomycin-induced lung injury. The development of pulmonary fibrosis is characterized by the formation of myofibroblasts that are known to be key players of wound healing and fibrotic processes. These cells do not occur under physiological conditions and their origin is still under debate. Lineage tracing of pericytes showed that NO-GC-expression allows to differentiate interstitial from intra-alveolar myofibroblasts: (1) NO-GC-positive, pericyte-derived myofibroblasts located in the alveolar wall and (2) NO-GC-negative, intra-alveolar myofibroblasts that are not derived from pericytes but, surprisingly, show de novo-expression of PDGFRβ after injury. The precursor cell type of intra-alveolar myofibroblasts is not identified yet. Pericytes, endothelial cells and fibrocytes do not transdifferentiate into myofibroblasts. Investigation of different cell types during resolution of lung fibrosis showed the disappearance of both types of myofibroblast. NO-GC-expressing pericytes that proliferate following administration of bleomycin are still present in an increased number. These results implicate a major role of myofibroblasts during wound healing responses but pericytes could be the effectors of chronic and manifest pulmonary fibrosis that is characterized by thickening of the alveolar wall. For a further understanding of the cellular mechanisms during pulmonary fibrosis investigations on irreversible models of fibrosis need to be performed. KW - Lungenfibrose KW - Guanylatcyclase KW - Myofibroblast KW - Perizyt KW - NO-sensitive Guanylyl-Cyclase KW - Bleomycin KW - Pulmonary fibrosis KW - NO-sensitive guanylyl cyclase KW - myofibroblast KW - pericyte KW - bleomycin Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176710 ER - TY - JOUR T1 - einBlick - Ausgabe 06 - 12. Februar 2019 N2 - Nachrichten aus der Julius-Maximilians-Universität Würzburg KW - Universität KW - Würzburg KW - University KW - Wuerzburg KW - Wurzburg Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176442 UR - https://www.uni-wuerzburg.de/aktuelles/einblick/ VL - 06/2019 ER - TY - THES A1 - Kettler, Julia T1 - Der antiproliferative Effekt des epigenetischen BRD4- Inhibitors JQ1 auf den proliferativen Phänotyp humaner kolorektaler Karzinomzellen T1 - The antiproliferative effect of epigenetic BRD4 inhibitor JQ1 on the proliferative phenotype of human colorectal cancer cells N2 - Der niedermolekulare Inhibitor JQ1 bindet an der Bromodomäne von BRD4, ein auf epigenetischer Ebene agierendes Protein. Der antiproliferative Effekt von JQ1 wurde bisher bei verschiedenen Tumorentitäten vor allem des lymphatischen und blutbildenden Systems gezeigt. In dieser Arbeit wurde der antiproliferative Effekt von JQ1 an fünf humanen kolorektalen Karzinomzelllinien im Vergleich zu nicht transformierten Kontrollzellen (Fibroblasten) in Normoxie, Hypoxie und in der Langzeitkultur nachgewiesen. Außerdem verringerte JQ1 die Expression von MYC auf Protein- und mRNA-Ebene und steigerte die Transkription des durch MYC negativ regulierten Zielegens p21. Diese Steigerung korrelierte mit einem Zellzyklusarrest in der G0/G1-Phase in vier von fünf kolorektalen Karzinomzelllinien. N2 - The small molecule inhibitor JQ1 binds to the bromodomain of BRD4, a protein acting on the epigenetic level. The antiproliferative effect of JQ1 has been shown in various tumor entities, especially in lymphatic and hematopoietic systems. In this study, the antiproliferative effect of JQ1 was demonstrated in five human colorectal carcinoma cell lines compared to non-transformed control cells (fibroblasts) in normoxia, hypoxia and long-term culture. In addition, JQ1 reduced expression of MYC at the protein and mRNA levels and increased transcription of MYC-negatively regulated target p21. This increase correlated with a cell cycle arrest in the G0/G1 phase in four of five colorectal carcinoma cell lines. KW - MYC KW - JQ1 Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176418 ER - TY - THES A1 - Wötzel, Dagmar T1 - Wirksame Umsetzung strategischer Entscheidungen in profitorientierten Unternehmen T1 - Adaptive Organizations N2 - Die Logik der bisher erforschten und beschriebenen Management- und Führungstheorien müssen sich im Zeitalter der Digitalisierung weiterentwickeln. Die ursprüngliche Forschungsfrage nach einer wirksamen Implementierung von strategischen Entscheidungen passt nicht mehr zur Realität von disruptiven Veränderungen in der sogenannten VUCA Welt (Volatile, uncertain, complex, ambiguous). Die Arbeit ist mutig und wertvoll, weil sie die Lücke zwischen neuen Entwicklungen in der Praxis und fehlenden umfassenden Theoriekonzepten in den Management-, Führungs- und Organisationswissenschaften offenlegt und zu schließen hilft. Der erste Teil der Arbeit fasst die aktuellen Erkenntnisse rund um strategische Entscheidungsfindung in Unternehmen, globale Megatrends als Rahmenbedingung und Change-Management als Umsetzungshilfe zusammen. Die Schlussfolgerung aus dieser holistischen Betrachtung ist, dass die Forschungsfrage rückwärts gerichtet die Realität des 20. Jahrhunderts adressiert und für das Zeitalter der Digitalisierung keine hilfreiche Antwort bietet. Vielmehr geht es um die weiter entwickelte Forschungsfrage, wie anpassungsfähige Organisationen entwickelt und gepflegt werden können. Solche Organisationen überleben disruptive Veränderungen nicht nur irgendwie, sondern sind so gestaltet, dass sie diese nutzen, um immer wieder neue Antworten auf sich entwickelnde Kundenbedürfnisse und in der internen Organisation zu finden. Diese anpassungsfähige oder adaptive Organisation hat fünf wesentliche Dimensionen, die im zentralen Teil der Arbeit beleuchtet werden. Alle Themen entwickeln sich derzeit laufend weiter, so dass es noch keine letztgültige Antwort gibt welche Methoden sich durchsetzen werden. Im Sinne eines holistischen Transformationsmanagements gibt das letzte Kapitel Hinweise auf die Herangehensweise, um die eigene Organisation in ihrer Anpassungsfähigkeit weiter zu entwickeln. Die gründliche Diskussion einer Fülle von konzeptionellen Ansätzen in Verbindung mit einer bemerkenswerten Erfahrung der Autorin erlaubt es, die auftretende Problemstellung profunder anzugehen als bei einer rein akademischen Herangehensweise. N2 - The logic of researched and described management and leadership theories must evolve in the age of digitalization. The original research question of “implementing strategic decisions in for profit companies efficiently” does not fit the reality of disruptive changes in the VUCA world (volatile, uncertain, complex, ambiguous). The thesis is brave and precious as it helps to reveal and close the gap between new developments in the business world and missing theoretical concepts in the management, leadership and organizational sciences. The first part of the thesis summarizes state of the art insights concerning strategic decision making in companies, global megatrends as framework conditions and change management as implementation support. This holistic view allows the conclusion that the research question at the start is solving a 20th century challenge, which does not provide helpful answers for the age of digitalization. This results in a development of the research question to “How can an adaptive Organization be created and nurtured?” This type of organization is designed to not only survive, but indeed benefit from the disruptive changes. These use the disruption to find new answers to continuously developing customer needs and for the internal organization. Adaptive organizations need to be reflected in 5 core dimensions, which are analyzed and developed in the main part of the thesis. All of those are in a continuous development and it is not yet clear, which methods will sustain. The last chapter provides guidance in the spirit of a holistic transformation management, how to start developing the adaptability of an organization. The thorough discussion of a wealth of concepts and approaches combined with the extensive practical experience of the author allows a more profound approach to the research question than a strictly academic research. KW - Anpassungsfähige Organisation KW - adaptive organisation KW - VUCA world KW - Strategische Entscheidungsfindung KW - Digitalisierung KW - Digitalization KW - Strategisches Management KW - Strategic Management KW - Selbstorganisation KW - Führungsentscheidung KW - Organisation KW - Strategie Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176243 ER - TY - THES A1 - Zaum, Ann-Kathrin T1 - Erweiterte Diagnostik bei neuromuskulären Erkrankungen: vom Genpanel zum Whole Genome Sequencing T1 - Extended diagnostics in neuromuscular disease: from gene panel to whole genome sequencing N2 - Muskeln und Nerven bilden eine essentielle funktionelle Einheit für den Bewegungsapparat. Neuromuskuläre Erkrankungen lassen sich unterteilen in Krankheiten, denen ein muskuläres Problem zu Grunde liegt, wie zum Beispiel Muskeldystrophien (Muskeldystrophie Duchenne, DMD) und Myopathien (Myofibrilläre Myopathie, MFM), und in Erkrankungen aufgrund von Nervenschädigungen, wie zum Beispiel Neuropathien und spastische Paraplegien (SPG). In den vier Teilen der vorliegenden Arbeit konnte sowohl das genetische wie auch das phänotypische Spektrum von neuromuskulären Krankheiten erweitert werden. Die dafür verwendeten Methoden reichen von der Sanger-Sequenzierung einzelner Gene über Next-Generation Sequencing (NGS)-Panel-Diagnostik, zu Whole Exome Sequencing (WES) und schließlich zu Whole Genome Sequencing (WGS). Zusätzlich wurde cDNA zur Detektion von Veränderungen im Transkriptom sequenziert. Im ersten Teil wurde der klinische Phänotyp der Seipinopathien erweitert, der jetzt auch amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und multifokale motorische Neuropathie (MMN) beinhaltet. Dafür wurde eine Panel-Analyse durchgeführt, die eine bekannte Mutation in BSCL2 aufdeckte. Aufgrund des hiermit erweiterten Phänotyps der Seipinopathien sollten Mutationen in BSCL2 auch bei anderen Verdachtsdiagnosen, wie ALS oder MMN, berücksichtigt werden. Außerdem wurde gezeigt, dass in der Diagnostik SPGs und Charcot-Marie-Tooth Erkrankungen (CMTs) eine Überlappung zeigen und bei der Diagnose von Verdachtsfällen Gene aus beiden Krankheitsbereichen berücksichtigt werden sollten. Die Suche mit Hilfe eines Phänotyp-Filters hat sich dabei als erfolgreich erwiesen. Ungelöste Fälle sollten aber in regelmäßigen Abständen neu analysiert werden, da immer neue Gene mit den Phänotypen assoziiert werden. Der zweite Teil befasst sich mit der Untersuchung von DMD-Patienten mit bisher ungeklärtem Genotyp. Durch eine RNA-Analyse des gesamten DMD-Transkripts wurden tief-intronische Mutationen aufgedeckt, die Einfluss auf das Spleißen haben. Durch diese Mutationen wurden intronische Sequenzen als Pseudoexons in die mRNA eingefügt. Diese Mutationsart scheint häufig unter ungeklärten DMD-Fällen zu sein, in unserer Kohorte von 5 DMD-Patienten wurden in zwei Fällen Pseudoexons entdeckt. Eine Besonderheit besteht darin, dass in der RNA-Analyse immer noch ein Rest Wildtyp-Transkript vorhanden war, wodurch die Patienten vermutlich einen milderen Becker-Phänotyp aufweisen. Ein weiterer ungeklärter DMD-Fall konnte durch die Sequenzierung der gesamten genomischen Sequenz aufgeklärt werden. Es wurde eine perizentrische Inversion entdeckt (46,Y,inv(X)(p21.1q13.3). Dies zeigt, dass WGS auch zur Detektion von großen Strukturvariationen geeignet ist. Im dritten Teil wurden Spleißmutationen untersucht. Spleißmutationen wurden bisher nicht in TMEM5-assoziierter alpha-Dystroglykanopathie beschrieben und somit als neue Mutationsart für diese Erkrankung nachgewiesen. Dabei wurde auch die funktionelle Exostosin-Domäne in TMEM5 bestätigt. Eine RNA-Untersuchung verschiedener Spleißmutationen zeigte, dass Spleißmutationen häufig zu einem veränderten Transkript führen, auch wenn diese Mutationen weiter von der Konsensussequenz entfernt sind. Spleißmutation sollten daher häufiger in der Diagnostik berücksichtig und überprüft werden. Im letzten Teil wurde eine strukturierte Diagnostik von MFM-Patienten beschrieben und neue Kandidaten-Gene für MFM vorgestellt. Es ist zu vermuten, dass auch Mutationen in Genen, die bisher für Kardiomyopathien, Kollagen Typ VI-Myopathien und Neuropathien beschrieben sind, einen MFM-Phänotyp verursachen können. Diese Ergebnisse erweitern das genetische Spektrum der MFM, was sich auf die Diagnostik dieser Erkrankungen auswirken sollte. Im Laufe dieser Arbeit konnten damit die neuromuskulären Erkrankungen vieler Patienten genetisch geklärt werden. Neue Phänotypen und genetische Ursachen wurden beschrieben und es wurde gezeigt, dass sich WGS technisch für die Diagnostik, auch zur Detektion von großen Strukturvarianten, eignet. N2 - Muscles and nerves form an essential functional unit for the locomotor system. Neuromuscular disorders are divided in diseases that have a muscular origin, such as muscular dystrophies (Duchenne muscular dystrophy, DMD) and myopathies (myofibrillar myopathies, MFM) and diseases based on neuron denervation, for instance neuropathies and spastic paraplegias (SPG). The four parts of the present work expand the genetic and phenotypic spectrum of neuromuscular disorders. The used methods range from Sanger sequencing of single genes to panel next-generation sequencing (NGS) diagnostics, whole exome sequencing (WES) and finally to whole genome sequencing (WGS). Additionally, cDNA was sequenced to detect transcriptome changes. In the first part, the clinical phenotype of seipinopathies has been expanded to include amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and multifocal motor neuropathy (MMN). An NGS panel was sequenced in three patients suffering from ALS, MMN and neuropathy. A known mutation in BSCL2 was detected which expands the phenotype of seipinopathies. Therefore, mutations in BSCL2 should be considered in patients with diagnosis such as ALS and MMN. Moreover, it was demonstrated that SPGs and Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) show a genetic overlap and genes of both diseases should be considered in genetic analysis. The use of a phenotype filter for variant analysis was successful. However, unsolved cases should be re-analysed in intervals, as new genes are frequently connected to phenotypes. The second part concerns DMD patients with unresolved genotype. RNA-analysis of the whole DMD transcripts revealed deep-intronic variants that influence splicing and insert intronic sequences as pseudoexons in the mRNA. This kind of mutation appears to be common, as two of our five analysed patients had pseudoexons. What is particular about these cases is the fact that a rest of wild type DMD transcript remained, which possibly contributes to a milder Becker phenotype in the patients. In another unsolved DMD case WGS was performed and a pericentric inversion including DMD was discovered (46,Y,inv(X)(p21.1q13.3), which demonstrates that WGS is capable of detecting large structural anomalies. In the third part splice mutations were analysed. Splice mutations were unknown for TMEM5-related alpha-dystroglycanopathy and are now a new kind of mutation in this disease. At the same time the functional exostosin domain in TMEM5 was confirmed. RNA analysis of further splice mutations showed a frequent influence on splicing even if the mutation was far from the canonical splice site. Therefore, splice mutations should be verified and considered in diagnostics more often. The last part describes a structured approach when diagnosing MFM patients and introduces new candidate genes for MFM. It appears that mutations in genes formerly associated with cardiomyopathies, collagen type VI-related myopathies and neuropathies can cause an MFM phenotype. These results expand the genetic spectrum of MFM which should be considered in diagnostics. In the course of this dissertation the neuromuscular diseases of many patients could be solved genetically. New phenotypes and genotypes were described and it was proven that WGS is technically suitable for genetic diagnostic, even for the detection of large structural variants. KW - Neuromuskuläre Krankheit KW - Mensch KW - Next-Generation Sequencing KW - Neuromuskuläre Erkrankungen KW - Molekulargenetik KW - Humangenetik KW - Human genetics Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176314 ER - TY - JOUR T1 - einBlick - Ausgabe 05 - 05. Februar 2019 N2 - Nachrichten aus der Julius-Maximilians-Universität Würzburg KW - Universität KW - Würzburg KW - University KW - Wuerzburg KW - Wurzburg Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175994 UR - https://www.uni-wuerzburg.de/aktuelles/einblick/ VL - 05/2019 ER - TY - THES A1 - Wunsch, Marie T1 - Das enterische Nervensystem als mögliche Zielstruktur der Autoimmunreaktion in der Multiplen Sklerose T1 - The enteric nervous system is a potential autoimmune target in multiple sclerosis N2 - Bei der Multiplen Sklerose (MS) handelt es sich um eine Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS). Abhängig von der betroffenen ZNS-Region kann es zu vielfältigen Symptomen kommen. Neben neurologischen Symptomen verursacht durch ZNS-Läsionen leidet ein Großteil der MS-Patienten auch unter gastrointestinalen Funktionsstörungen. Diese gastrointestinalen Symptome wurden bisher eher auf Läsionen im Rückenmark zurückgeführt und nicht direkt in Verbindung mit der autoimmunen Ätiologie der Erkrankung gebracht. In dieser Studie wurde das enterische Nervensystem (ENS) in einem B-Zell- und Antikörper-abhängigen Mausmodell der MS untersucht. Dafür wurde der Autoimmunprozess durch Immunisierung mit MP4, einem Fusionsprotein aus dem Myelin-Basischen-Protein (MBP) und dem Proteolipid-Protein (PLP), ausgelöst. Das ZNS und ENS wurden in den unterschiedlichen Erkrankungsstadien immunhistochemisch und elektronenmikroskopisch analysiert. Neben der Immunpathologie des ZNS konnte dabei eine Degeneration des ENS schon vor dem Einsetzen der ersten neurologischen Defizite nachgewiesen werden. Die ENS-Pathologie war antikörper-mediiert und ging einher mit einer verringerten gastrointestinalen Motilität sowie mit einer Gliose und Neurodegeneration des ENS. Mithilfe von Immunpräzipitation und Massenspektrometrie konnten im ENS vier mögliche Zielstrukturen des Autoimmunprozesses identifiziert werden, was auf sog. epitope spreading hindeutet. Auch im Plasma von MS-Patienten konnten Antikörper gegen drei dieser Antigene nachgewiesen werden. Des Weiteren zeigten sich in Kolon-Resektaten von MS-Patienten erste Ansätze einer Neurodegeneration und Gliose des ENS. In dieser Studie wurde zum ersten Mal ein direkter Zusammenhang zwischen der Autoimmunreaktion gegen das ZNS und einer simultanen Reaktion gegen das ENS gezeigt. Dies kann einen Paradigmenwechsel im Verständnis der Immunpathogenese der MS anstoßen und neue therapeutische und diagnostische Ansätze initiieren. N2 - Multiple sclerosis (MS) is a chronic autoimmune disease, in which the immune system attacks the central nervous system (CNS). Clinical symptoms and the course of the disease can vary among patients, depending on the region of the brain primarily affected. Besides the neurological symptoms caused by CNS lesions, a great amount of MS patients display functional gastrointestinal impairments. Gastrointestinal symptoms were previously explained by the presence of spinal cord lesions rather than being linked to the autoimmune pathomechanisms of the disease. Here, the enteric nervous system (ENS) was studied in a B cell- and antibody-dependent mouse model of MS, in which the myelin basic protein (MBP) - proteolipid protein (PLP) fusion protein MP4 was used to initiate the autoimmune attack. Immunohistochemistry and electron microscopy were performed at different stages of the disease. We noted that in addition to the immune pathology in the CNS itself, the ENS also showed signs of degeneration. ENS degeneration was evident prior to the manifestation of CNS lesions and to the onset of neurological deficits in mice. ENS pathology was antibody-mediated and accompanied by impaired gastrointestinal motility, ENS gliosis and neurodegeneration. Using immunoprecipitation and mass spectrometry, four autoimmune targets expressed by enteric glia and/or neurons could be identified suggesting that epitope spreading to antigens of the ENS had occurred. MS patients displayed plasma antibodies against three of the ENS autoantigens. Studying human colon resectates provided preliminary evidence for gliosis and neurodegeneration of the ENS in MS patients, which was absent in non-MS controls. Overall, this study establishes a pathomechanistic link between the well-established autoimmune attack on the CNS and a simultaneous attack on the ENS that has not been described so far. These findings can initiate a paradigm shift in the current understanding of the pathomechanism of MS with diagnostic and therapeutic implications. KW - Multiple Sklerose KW - Autoantikörper KW - Enterisches Nervensystem KW - Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis KW - Darmwandnervensystem KW - Autoimmunität Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175888 ER - TY - JOUR T1 - einBlick - Ausgabe 04 - 29. Januar 2019 N2 - Nachrichten aus der Julius-Maximilians-Universität Würzburg KW - Universität KW - Würzburg KW - University KW - Wuerzburg KW - Wurzburg Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175672 UR - https://www.uni-wuerzburg.de/aktuelles/einblick/ VL - 04/2019 ER -