TY - THES A1 - Menzel, Nicolas T1 - Molekulare Analyse der zellulären Funktionen der p21-aktivierten Kinase Mushroom bodies tiny von Drosophila melanogaster T1 - Molecular analysis and cellular functions of the p21 activated kinase Mushroom bodies tiny from Drosophila melanogaster N2 - In Drosophila melanogaster wurde der p21-aktivierten Proteinkinase Mushroom bodies tiny (Mbt) eine wichtige Rolle als Regulator während der Differenzierung von Photorezeptorzellen zugeschrieben. Da morphologische Umgestaltungsprozesse der Photorezeptorzellen von dynamischen Zellbewegungen begleitet und die molekularen Details größtenteils noch ungeklärt sind, wurden in dieser Arbeit die Funktionen von Mbt in Bezug auf veränderte Zelladhäsionseigenschaften, Reorganisation des Aktincytoskeletts und die Beteiligung an weiteren Signalwegen analysiert. Im ersten Projekt wurde ein genetischer Interaktionsscreen mit Hilfe eines hypomorphen mbt- Allels (mbtP3) durchgeführt, um zu untersuchen, in welche zellulären Signalwege Mbt einzuordnen ist. Die Identifizierung des Aktin-Depolymerisationsfaktor Cofilin (Drosophila: Twinstar) und der Phosphatase Slingshot bestätigte, daß Mbt in Prozesse involviert ist, die die Aktindynamik kontrollieren. In Vertebraten phosphoryliert und inaktiviert die Proteinkinase Pak4 (Drosophila Homolog zu Mbt) die Lim-Kinase (Limk), die wiederum Cofilin durch Phosphorylierung hemmt. Dieser Effekt kann nach Dephosphorylierung des Cofilin durch die Phosphatase Slingshot wieder aufgehoben werden. In Drosophila konnte gezeigt werden, daß aktiviertes Mbt mit Twinstar und Drosophila Limk (D-Limk) assoziiert ist und die Phosphorylierungen beider Moleküle induzieren kann. Zusammen mit genetischen Experimenten stellen die Ergebnisse entgegen der Situation in Vertebraten die Funktion von D-Limk als Vermittler zwischen Mbt und Twinstar in Frage und lassen vielmehr auf einen Verlauf des Signals von Mbt direkt an Twinstar, über Slingshot oder unbekannte Kinasen schließen. Ein zweites Projekt beschäftigte sich mit dem Einfluß von Mbt auf die DE-Cadherin-beta- Catenin/Armadillo vermittelte Zelladhäsion. Dazu wurde ein Zellkultursystem in Drosophila Schneiderzellen etabliert, welches es erlaubte, den DE-Cadherin-beta-Catenin/Armadillo-alpha- Catenin Komplex vollständig zu rekonstituieren. Die Resultate zeigten, daß Mbt mit dem Komplex interagiert und beta-Catenin/Armadillo an den Aminosäuren S561 und S688 phosphoryliert. Die Phosphorylierung bewirkt eine Destabilisierung der Bindung zwischen DE-Cadherin und beta- Catenin/Armadillo und vermindert die Adhäsion der Zellkontakte zwischen Zellen. Im dritten Projekt ging es um die Suche nach unbekannten Phosphorylierungspartnern und der Integration von Mbt in weitere Signalwege. Dazu wurde eine stringente, radioaktive in vitro Phosphorylierungsreaktion entwickelt, die die Detektion von Mbt-spezifischen Phosphorylierungssubstraten aus einem Extrakt von Drosophila Schneiderzellen ermöglichte. In einer Vorstufe wurde dieses Extrakt mit dem ATP-Analogon 5’-Fluorosulfonylbenzoyladenosin (5’FSBA) vorbehandelt, um sämtliche endogenen Kinasen irreversibel zu inhibieren und die nachfolgende Phosphorylierungsreaktion mit aufgereinigtem Mbt spezifisch für Mbt zu machen. Nach Auftrennung und Identifizierung der potentiellen Phosphoproteine durch Massenspektrometrie wurde das Drosophila Dynamitin als neuer Interaktions- und Phosphorylierungspartner von Mbt gefunden. N2 - In Drosophila melanogaster, the p21 activated kinase Mushroom bodies tiny (Mbt) fulfils a critical role in the differentiation of photoreceptor cells during development. Differentiation of photoreceptor cells is accompanied by morphogenetic rearrangement, however, the underlying molecular mechanisms are not completely understood. Therefore in this work the function of Mbt was analysed with respect to the modulation of cell-cell adhesion, reorganization of the actin cytoskeleton and the integration of Mbt in different signalling pathways. In the first project a genetic screen with a hypomorphic mbt allele (mbtP3) was performed to identify components of Mbt signalling pathways. The identification of the actin depolymerization factor Cofilin (Drosophila: Twinstar) and the phosphatase Slingshot confirmed that Mbt is involved in actin regulating processes. In vertebrates, the p21 activated kinase Pak4 (Drosophila homolog of Mbt) acts as an upstream activator of the Lim-Kinase (Limk) which in turn inactivates the actin depolymerization factor Cofilin by phosphorylation. This effect can be reversed by the phosphatase Slingshot. In Drosophila activated Mbt is not only associated with Twinstar and Drosophila Limk (D-Limk) but also induces phosphorylation of both molecules. Together with genetic experiments these results are in contrast to the situation of Pak4 in vertebrates and question the role of D-Limk as a major mediator in signalling between Mbt and Twinstar. Instead we propose that Mbt can either directly act on Twinstar or regulates Twinstar phosphorylation through Slingshot or other unknown kinases. In the second project, the influence of Mbt on DE-cadherin mediated cell adhesion was investigated. Therefore a Drosophila Schneider cell line was established which allowed the reconstitution of a functional DE-cadherin-beta-catenin/Armadillo-alpha-catenin complex. The results revealed an interaction between Mbt and this complex and further showed that Mbt specifically phosphorylates beta-catenin/Armadillo on amino acids S561 and S688. As a consequence the binding between beta-catenin/Armadillo and DE-cadherin is destabilized leading to a reduced adhesion between cells. The third project was to devise a strategy that allows with high selectivity the identification of phosphorylation substrates of Mbt from total lysates of Drosophila Schneider cells. The general idea was to irreversibly block endogenous kinase activities by the ATP-analog 5’-fluorosulfonylbenzoyladenosine and then to perform a radioactive in vitro kinase assay in the presence of exogenously provided Mbt. The potential phosphoproteins were purified and identified by mass spectrometry. The Drosophila Dynamitin was found as a novel interaction and phosphorylation partner of Mbt. KW - Drosophila KW - Kinase KW - Zellkontakte KW - Photorezeptorzellen KW - Aktincytoskelett KW - Drosophila KW - kinase KW - cell contacts KW - photoreceptor cells KW - actin cytoskeleton Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23727 ER - TY - THES A1 - Pick, Simon T1 - Kinematik und visuelle Steuerung des Kletterverhaltens und der Beinplatzierung der Fliege Drosophila melanogaster und Übertragung auf die Robotik T1 - Kinematics and visual control of climbing behaviour and leg placement in the fly Drosophila melanogaster and applications to robotics N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden visuelle Einflüsse auf die Beinplatzierung beim Laufen und auf das Kletterverhalten der Fliege Drosophila melanogaster analysiert. Während sich die Beinplatzierung als vorwiegend taktil gesteuert herausstellte, ist das Klettern sowohl bezüglich der Entscheidung zur Durchführung (Motivationssteuerung) als auch bezüglich der Ausführung selbst unter präziser visueller Kontrolle. Für die Untersuchungen wurde ein Lücken-Überwindungsparadigma entwickelt und die Kinematik des Kletterns über verschieden breite Lücken mit einer eigens entwickelten 3D-Hochgeschwindigkeits-Videoanlage erstmals quantitativ beschrieben. Drei wesentliche Verhaltensanpassungen sorgen dafür, dass die Fliegen die maximal mögliche Spannbreite ihrer Beine voll ausnützen und Lücken von bis zu 170% der eigenen Körperlänge überqueren können. Das Kletterverhalten wird abhängig von der Lückenbreite initiiert und sinnlose Versuche an unüberwindbar breiten Lücken vermieden. Die visuelle Lückenbreitenmessung wurde analysiert; sie beruht auf der Auswertung von Bewegungsparallaxe beim Anlauf. Einige Erkenntnisse aus der Laufforschung an Fliegen wurden auf einem im Rahmen dieser Arbeit modifizierten hexapoden Laufroboter umgesetzt und die Verbesserungen quantifiziert. N2 - This work started out to analyze visual influences on leg placement and on the climbing behavior of the fly Drosophila melanogaster. Whereas leg placement turned out to be predominantly under tactile control, climbing is indeed under tight visual control both with regard to the decision to initiate the behavior (motivational control) as well as with regard to the execution of climbing. A gap-crossing paradigm has been developed to facilitate a detailed study and the kinematics of climbing over gaps of various widths has been quantified using a 3D high-speed video analysis system developed for this purpose. Three major behavioral adaptations help the fly to exploit fully the limits of its leg span in order to overcome gaps of up to 170% of its own body length. Climbing is initiated dependent on gap width. Vain attempts to overcome insurmountably broad gaps are avoided. Analysis showed that the fly uses parallax motion generated during the approach to estimate the width of a gap. Some of the results of the research on the fly’s walking behavior have been implemented in a modified hexapod walking robot, and the improvements have been quantified. KW - Taufliege KW - Kinematik KW - Klettern KW - Verhaltensanpassung KW - Drosophila KW - Verhalten KW - Klettern KW - Laufen KW - Robotik KW - Drosophila KW - behaviour KW - climbing KW - walking KW - robotics Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12737 ER - TY - THES A1 - Spall, Thomas T1 - Optische Visualisierung neuronaler Aktivität : Etablierung des in-vivo Calcium-Imaging mit dem genetisch codierten Sensor Yellow Cameleon 2.1 und Untersuchung der olfaktorischen Codierung im Gehirn von Drosophila melanogaster T1 - Optical visualization of neuronal activity: Establishment of Calcium Imaging using the genetically expressed Sensor Yellow Cameleon 2.1 and Examination of olfactory Coding in the brain of Drosophila melanogaster N2 - Die Messung der räumlich aufgelösten Aktivität von neuronalen Zellverbänden ist ein wichtiges Werkzeug, um die Funktionsweise von Gehirnen zu verstehen. Für diese Arbeit diente die Fruchtfliege Drosophila melanogaster mit ihrer gut beschriebenen Genetik und Neurobiologie als Untersuchungsobjekt. Bei der vorgelegten Arbeit lag eine zweigeteilte Aufgabenstellung vor: Zum einen wurde die Technik des in – vivo Calcium – Imagings mit Hilfe des genetisch codierten Sensors Yellow Cameleon 2.1 am Lehrstuhl komplett neu etabliert, zum anderen wurde mit der neuen Technik das Zusammenspiel der funktionellen Elemente neuronaler Systeme anhand der Fliegenolfaktorik untersucht. Sowohl die Experimente zur Depolarisation durch KCl, als auch die Experimente zur olfaktorischen Codierung, wurden mit dem Calciumsensor Yellow Cameleon 2.1 durchgeführt. Es wurde ausgehend von der Vorgängerversion Yellow Cameleon 2.0 durch gezielte Mutagenese von Sören Diegelmann erstellt. Eine Photomultiplier – basierte in – vitro Funktionsanalyse des rekombinanten Sensorproteins ergab eine Zunahme der Ratio EYFP / ECFP mit steigender Calciumkonzentration. Dabei konnte auch der ratiometrische FRET – Effekt des Cameleons verdeutlicht werden: Mit steigender Calciumkonzentration verschiebt sich das Verhältnis von EYFP – Fluoreszenz zu ECFP – Fluoreszenz zu höheren Ratiowerten. Durch Zugabe des Calciumchelators EGTA konnte außerdem die reversible Arbeitsweise des Sensors nachgewiesen werden. Das in die Fliege eingebrachte Yellow Cameleon 2.1 – Konstrukt wurde mittels der GAL4 – UAS – Technik in verschiedenen olfaktorischen Gehirnzentren exprimiert. Von besonderer Relevanz für die Experimente zur olfaktorischen Codierung war dabei die GAL4 – Treiberlinie GH146. Mit ihrer Hilfe konnte das Fusionsprotein in den olfaktorischen Projektionsneuronen des Fliegengehirns exprimiert, und so die Duftrepräsentation im postsynaptischen Neuropil der Antennalloben bzw. in den präsynaptischen Neuropilen der Calyces und des lateralen Protocerbrums untersucht werden: Die Stimulation von 3 individuellen Fliegen mit den Düften Benzaldehyd, Isoamylacetat und Octanol liefert duftspezifische neuronale Aktivitätsmuster im Antenallobus. Die auf die Duftstimuli mit Calciumsignalen reagierenden Areale haben eine Größe von 10 – 30 µm, liegen also in der Größenordnung von individuellen Glomeruli. Die Duftrepräsentation in den Antennalloben zeigt außerdem einen kombinatorischen Aspekt: Jeder Duft evoziert ein charakteristisches Aktivitätsmuster bestehend aus einem oder mehreren Glomeruli. Die Aktivitätsmuster verschiedener Düfte können sich überlagern, d.h. individuelle Glomeruli können durch verschiedene Düfte aktiviert werden, das gesamte Aktivitätsmuster, d.h. die Summe der aktivierten Glomeruli eines bestimmten Duftes, ist jedoch charakteristisch. Die Duftrepräsentation in den Antennalloben von Drososophila geschieht also in Form eines glomerulären Codes, ein Prinzip der Duftverarbeitung, das auch in anderen Insekten und Vertebraten nachgewiesen werden konnte. Für den Calyx des Pilzkörpers ergaben sich innerhalb eines Individuums, bei wiederholter Stimulation mit demselben Duft, ebenfalls duftspezifische Aktivitätsmuster. Dabei waren die auf den Duftstimulus hin antwortenden neuronalen Areale diskret über den Calyx hinweg verteilt. Insgesamt zeigt das hohe Maß an Reproduzierbarkeit der Aktivitätsmuster für einen gegebenen Duft, dass im Calyx, wie in den Antennalloben, eine duftspezifische räumliche Repräsentation vorliegt. Der kombinatorische Aspekt der Codierung konnte auch hier beobachtet werden. Die einzelnen Spots der im Calyx gemessenen Aktivitätsmuster liegen in der Größenordnung von 5 +/- 2 µm und entsprechen somit in ihrer Größe den elektronenmikroskopisch beschriebenen Microglomeruli. Durch die Calcium – Imaging Experimente am lateralen Protocerebrum konnte nachgewiesen werden, dass die Erhöhung der Duftkonzentration eine räumliche Ausdehnung des aktivierten Neuropils zur Folge hat. Die EYFP –, ECFP – und Ratio – Intensitäten, die aus einer “Region of Interest“ im anterioren Bereich des lateralen Protocerebrums berechnet wurden, zeigen weiterhin, dass mit steigender Duftkonzentration auch die Stärke des Calciumsignals zunimmt. Dabei gibt es zwischen den 4 getesteten Düften statistisch signifikante Unterschiede: Methylcyclohexanol evoziert über den gesamten Verdünnungsbereich hinweg die schwächste neuronale Aktivität, Isoamylacetat evoziert in den Verdünnungsstufen 10-3 und 10-1 die stärkste neuronale Aktivität. D.h. neben der räumlichen Ausdehnung des Signals, führt die Konzentrationserhöhung auch zu einer gesteigerten Intensität des Calciumsignals, wobei sich die Signalintensitäten für verschiedene Düfte und Verdünnungsstufen unterscheiden können. Mit der verwendeten Versuchsanordnung und Datenauswertung, war es jedoch bislang nicht möglich eine räumliche Repräsentation der Düfte im lateralen Protocerebrum nachzuweisen. N2 - Measuring the spatiotemporal activity of neuronal cell populations is an important tool towards a further understanding of brain functions. This thesis investigates the brain activity of the model system Drosophila melanogaster with its well described genetics and neurobiology, thereby consisting of two major parts: On the one hand the in – vivo Calcium – Imaging technique by means of the genetically encoded sensor Yellow Cameleon 2.1, had to be newly established in our laboratory, on the other hand the interaction of functional elements within the neuronal olfactory pathway of the fruitfly was to be examined using this new technique. Both the experiments on KCl – induced depolarization and the experiments on olfactory coding were accomplished with the Yellow Cameleon 2.1 sensor. This molecular probe was generated by Sören Diegelmann by targeted in – vitro mutagenesis of the previous version Yellow Cameleon 2.0. A photomultiplier based in – vitro functional analysis of the recombinant sensor protein resulted in an increase of Calcium signals with rising Calcium ion concentrations, thereby revealing the ratiometric FRET effect of the Cameleons: With rising Calcium concentration the relationship between EYFP – fluorescence and ECFP – fluorescence shifts towards higher ratio values EYFP / ECFP. By application of the Calcium chelator EGTA the reversible function of the sensor could be demonstrated as well. By means of the GAL4 – UAS – technique, the Yellow Cameleon 2.1 construct transformed into the fly`s germline could be expressed in different olfactory brain centers. In the present work the GAL4 – strain GH146 was of special relevance for the experiments on olfactory coding. The GH146 – driven Cameleon 2.1 line expresses the sensor protein in olfactory projection neurons of the fly`s brain and therefore permits the examination of odorant coding within the postsynaptic neuropile of the antennal lobes, the presynaptic neuropiles of the calyces and the lateral protocerebrum, respectively: The stimulation of 3 individual flies with the odorants benzaldehyde, isoamylacetate and octanol revealed odorant – specific spatial activity patterns within the antennal lobes. The areas activated by the odorant stimulation were of similar size as individual glomeruli (~10 – 30 µm). The glomerular – like odor representation in the antennal lobes shows a combinatorial aspect: Each odorant induces a characteristic acitivity pattern consisiting of one or more glomeruli. Activity patterns evoked by different odorants can overlap, i.e. individual glomeruli can be activated by different odorants. In spite of from this combinatorial aspect, the activity pattern for a given odorant remains specific. Odorants are therefore represented in a glomerular code within the antennal lobes of Drosophila. The glomerular code represents an olfactory processing principle which could be demonstrated for other insects and vertebrates as well. Repeated stimulation of an individual fly with the same odorant revealed that intraindividual optical recordings from the mushroom body calyx were reproducible and generated odorant – specific activity patterns as well. The response patterns to different odorants were clearly spatially organized, with discrete areas of activity distributed over the calyx area. The reproducibility of the different patterns strongly suggest that odorant representations within the calyx are spatially specific, i. e. the spatial glomerular code of the antennal lobes could be somehow transformed into a spatial odorant – specific acitvity pattern in the calyx. Interestingly, the combinatorial aspect of olfactory encoding could be seen in the calyces as well. The spots of activity observed in the calyx are within the range of 5 +/- 2 µm and thus correspond in size to the boutons forming the presynaptic part of the so called microglomeruli described by electron microscopy. The Calcium – Imaging experiments at the level of the lateral protocerebrum showed a spatial expansion of the activated neuropiles with increasing odorant concentrations. The EYFP – , ECFP – intensities and their ratio values, which were computed from a region of interest within the anterior range of the lateral protocerbrum, reveal an increase in signal intensity with rising odorant concentrations. Within this reference the 4 odorants examined show satistically significant differences: methlycyclohexanol evoked the weakest Calcium signals over the entire dilution range, isoamylacetate evoked the strongest Calcium signals at the dilutions 10-3 and 10-1. This means that apart from the spatial expansion of the signal, the concentration increase leads to an increase in signal intensity, while the signal intensities for different odorants at a given dilution can differ. However, using the described experimental assembly and data evaluation, it was not possible to prove a spatial odorant representation within the lateral protocerebrum. KW - Terpyridinderivate <2 KW - 2':6' KW - 2"-> KW - Polymerkomplexe KW - Fluoreszenz KW - Drosophila KW - optisches Imaging KW - Yellow Cameleon 2.1 KW - olfaktorische Codierung KW - Drosophila KW - optical Imaging KW - Yellow Cameleon 2.1 KW - olfactory coding Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11575 ER - TY - THES A1 - Bolt-Ulschmid, Julia Katharina T1 - Charakterisierung von Adenylatkinasen aus Plasmodium falciparum und Thioredoxinreduktase-assoziierten Proteinen aus Dipteren T1 - Charakterisierung von Adenylatkinasen aus Plasmodium falciparum and Thioredoxin reductase-associiated Proteins of insects N2 - In Säugetieren existieren im wesentlichen zwei Abwehrsysteme gegen oxidativen Streß, in welchen die Glutathionreduktase (GR) und Thioredoxinreduktase (TrxR) Schlüsselenzyme sind. Ein einzelnes Gen der Taufliege, genannt dmtrxr-1, kodiert sowohl für die durch alternatives Splicing entstehende cytoplasmatische und mitochondriale Form der DmTrxR-1. Zum Teil innerhalb des dmtrxr-1-Gens findet sich auf dem Komplementärstrang ein weiteres Gen, welches sniffer genannt wurde. In Kooperation wurde nachgewiesen, daß dieses Gen essentiell zur Verhinderung alterungsbedingter Neurodegeneration ist. Durch biochemische Charakterisierung konnte das rekombinant hergestellte Produkt dieses Gens in der vorliegenden Arbeit als Carbonylreduktase, ein zu den Kurzketten-Dehydrogenasen (short-chain dehydrogenases) gehörendes Enzym, identifiziert werden. Sniffer weist das für Carbonylreduktasen typische Substratspektrum mit Phenanthrenequinone als bestem Substrat auf und wird von Flavonoiden wie Quercetin und Rutin sowie Hydroxymercuribenzoat gehemmt. In verschiedenen Ansätzen konnten Kristalle des rekombinanten Proteins gewonnen werden, die inzwischen in Kooperation vermessen wurden und so zu einer Kristallstruktur mit einer Auflösung von 1,7 Angström führten. Durch diese Arbeiten konnte zum ersten Mal eine Verbindung zwischen einem charakterisierten Gen (snifffer), oxidativem Streß und neurodegenerativen Effekten auf molekularer Ebene nachgewiesen werden. Parasiten haben während ihres Lebenszyklus einen hohen Bedarf an Energie und sind abhängig von einer starken Syntheseleistung. Zur Bewältigung dieses Stresses benötigen sie hohe Aktivitäten an Adenylatkinase (AK; ATP + AMP  2 ADP) und GTP-AMP-Phosphotransferase (GAK; GTP + AMP  GDP + ADP). Beide Enzyme wurden in Blutstadien des Malariaparasiten Plasmodium falciparum identifiziert und die entsprechenden Gene der PfAK und PfGAK auf den Chromosomen 10 und 4 respektive lokalisiert. Klonierung und heterologe Expression in E. coli ergab enzymatisch aktive Proteine mit einer Größe von 28,9 (PfAK), bzw. 28,0 kDa (PfGAK). Das rekombinante Protein der PfAK entspricht in seinen biochemischen Charakteristika denen der authentischen PfAK. Dies gilt auch für eine mögliche Assoziation mit einem stabilisierenden Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 70 kDa und der hohen Substratspezifität für das Monophosphat-Nukleotid AMP. Die Spezifität für das Triphosphat-Substrat ist weniger stringent. Das beste Triphosphat-Substrat ist ATP mit einem Vmax-Wert von 75 U/mg und einem kcat von 2800 min-1. Die Sequenz der PfAK enthält eine amphiphatische Helix, welche als notwendig für die Translokation zytosolischer Adenylatkinasen in den Intermembranraum der Mitochondrien beschrieben wurde. Die PfGAK bevorzugt GTP und AMP als Substrat (100 U/mg; kcat = 2800 min-1 bei 25°C) und zeigt als Besonderheit keine messbare Aktivität mit ATP. Im Gegensatz zu ihrem Ortholog im Menschen (AK3) enthält die Sequenz der PfGAK ein Zinkfinger-Motiv und bindet Eisenionen. Erste Immunfluoreszenz-Analysen lokalisieren die PfGAK in den Mitochondrien. PfAK und PfGAK werden von den Dinukleosid-Pentaphosphat-Verbindungen AP5A beziehungsweise GP5A gehemmt. Die Ki-Werte liegen mit ca. 0.2 µM ungefähr 250-fach niedriger als die KM-Werte der entsprechenden Nukleotidsubstrate. Zur Lösung der vor allem im Rahmen einer rationalen Medikamentenentwicklung notwendigen Kristallstruktur des Zielmoleküls konnten bereits Kristalle der PfGAK erhalten werden. N2 - In mammalia, two major systems with glutathione reductase (GR) and thioredoxin reductase (TrxR) as key enzymes defend the organism against oxidative stress. The single copy gene dmtrxr-1 codes for both the cytoplasmic and mitochondrial form of DmTrxR-1, generated by alternative splicing. Another gene, located on the complementary strand partially within the dmtrxr-1 gene, could be identified and was named sniffer. This gene is essential for prevention of age-related neuro-degeneration, as could be shown in a cooperation with the group of Prof. Schneuwly. In this thesis, biochemical characterization of the recombinant protein identified sniffer as a carbonyl reductase, an enzyme belonging to the short-chain-dehydrogenases. Sniffer shows the typical substrate spectrum of carbonyl reductases with phenthrenequinone as best substrate and is inhibited by the flavonoids quercetin and rutin and also by hydroxymercurybenzoate (HMB). Protein crystals could be obtained under different conditions. In a cooperation with the group of Prof. Klebe, these already lead to a crystal structure with a resolution of 1.7 angstrom. The work on sniffer is the first that directly links a characterized gene (sniffer), oxidative stress and neurodegeneration on the molecular level. For coping with energetic and synthetic challenges, parasites require high activities of adenylate kinase (AK; ATP + AMP  2 ADP) and GTP:AMP phosphotransferase (GAK; GTP + AMP  2 ADP). These enzymes were identified in bloodstream stages of Plasmodium falciparum. The genes encoding PfAK and PfGAK are located on chromosomes 10 and 4, respectively. Molecular cloning and heterologous expression in E. coli yielded enzymatically active proteins of 28.9 (PfAK) and 28.0 kDa (PfGAK). Recombinant PfAK resembles authentic PfAK in its biochemical characteristics including the possible association with a stabilizing protein and the high specificity for AMP as the mononucleotide substrate. Specificity is less stringent for the triphosphate, with ATP as the best substrate (75 U/mg; kcat = 2160 min-1). PfAK contains the sequence of the amphiphatic helix that is known to mediate translocation of the cytosolic protein into the mitochondrial intermembrane space. PfGAK exhibits substrate preference for GTP and AMP (100 U/mg; kcat = 2800 min-1); notably, there is no detectable activity with ATP. In contrast to its human orthologue (AK3), PfGAK contains a zinc finger motif and binds ionic iron. The dinucleoside pentaphosphate compounds AP5A and GP5A inhibited PfAK and PfGAK, respectively, with Ki values of appr. 0.2 µM which is more than 250-fold lower than the KM values determined for the nucleotide substrates. The disubstrate inhibitors are useful for studying the enzymatic mechanism of PfAK and PfGAK as well as their function in adenine nucleotide homeostasis; in addition, the chimeric inhibitors represent interesting lead compounds for developing nucleosides to be used as antiparasitic agents. To elucidate the structure which is necessary for the use as a drug target, crystallization studies have been performed and the first crystals could be obtained. KW - Taufliege KW - Plasmodium falciparum KW - Adenylatkinase KW - Carbonyl-Reductase KW - Malaria KW - Plasmodium KW - Adenylatkinase KW - Carbonylreduktase KW - Drosophila KW - Malaria KW - Plasmodium KW - adenylate kinase KW - carbonyl reductase KW - drosophila Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10752 ER - TY - THES A1 - Diegelmann, Sören T1 - Molekulare und phänotypische Charakterisierung von Drosophila melanogaster Synapsin Mutanten und In-vivo Calcium Imaging T1 - Molecular and phenotypical characterization of Drosophila melanogaster Synapsin mutants and In-vivo Calcium Imaging N2 - Durch genaue Kartierung der Defizienzen in den Mutanten konnten bislang unbekannte regulatorische Elemente des Synapsin Gens identifiziert werden. Mit dieser Information sollte es möglich sein, einen Synapsin-„Rescue“ Vektor zu konstruieren, der nach Transformation in die Nullmutante den wildtypischen Phänotyp wiederherstellt. Beim Vergleich der im Rahmen des Berkeley Drosophila Genom Projekt veröffentlichten Sequenz des Synapsin Gens mit vor sieben Jahren publizierten Sequenzdaten fielen Diskrepanzen sowohl in der genomischen Sequenz als auch in der cDNA auf. Um zu klären, ob es sich hier um Artefakte, Polymorphismen oder systematische Modifikationen handelt, wurde der entsprechende Bereich von neun an verschiedenen Orten gefangenen Wildtypen genomisch und auf der cDNA Ebene amplifiziert und sequenziert. In allen Fällen wurde die genomische Sequenz des Genomprojekts verifiziert, so dass von einem Sequenzierfehler in der früheren Sequenz auszugehen ist. Als Folge ergibt sich eine Exon-Intron Struktur, bei der die Spleiß-Konsensussequenz (GT-AG Regel) im Intron 4 des Synapsins gewahrt bleibt. Dagegen bestätigten die RT-PCR Sequenzen die früheren cDNA-Daten, so dass ein A zu G Austausch zwischen der genomischen Sequenz und der cDNA des Proteins aufgedeckt wird. Dieser Austausch führt zu einer Veränderung der in allen bisher bekannten Synapsinen konservierten Zielsequenz der Proteinkinase CaMK I/ IV und PKA, was interessante Fragen zu seiner funktionellen Bedeutung aufwirft. Die Basensubstitution spricht für ein A-zu-I RNA-Editing auf der Ebene der Ribonukleinsäure. Dieser Vorgang wird durch das Enzym dADAR katalysiert und wurde bereits für verschiedene neuronale Proteine nachgewiesen. Die für die Reaktion benötigte doppelsträngige Sekundärstruktur der RNA kann durch die Sequenz der prä-mRNA des Synapsins gebildet werden. Die potentielle „Editing site Complementary Sequence“ (ECS) konnte im Intron 4 in einem Abstand von ca. 90 Basen stromabwärts der Editing-Stelle durch ein Computerprogramm ermittelt werden. Der A zu G Austausch wird in allen Laborwildtypen und allen neu etablierten Stämmen, sowie in verschiedenen Entwicklungsstadien beobachtet. Lediglich in einem cDNA-Gemisch aus Eiern, Embryonen und 1. Larven findet man neben der editierten auch die nicht-editierte Sequenz. Um in späteren Experimenten die Funktion der Phosphorylierung und die Auswirkung der mRNA Editierung ermitteln zu können wurden in einem weiteren Versuch die beiden Erkennungsstellen der PKA in der cDNA durch Mutationen modifiziert, so dass Phosphorylierungstests an den Konstrukten durchgeführt werden können. Zur phänotypischen Charakterisierung der Nullmutante wurde die Defizienz-Linie Syn97 durch extensive Rückkreuzung in den genetischen Hintergrund des Wildtyps CantonS eingebracht, der als Standard-Kontrollstamm für Verhaltensexperimente und insbesondere Lernversuche dient. Die Linie Syn97CS wurde im Rahmen einer Kooperation von Mitarbeitern des Lehrstuhls in verschiedenen Verhaltenstests und Lernparadigmen auf phänotypische Veränderungen überprüft. Dabei fanden sich mehrere Verhaltensunterschiede zum Wildtyp, die vermutlich auf geringfügigen Modifikationen in komplexen neuronalen Netzwerken beruhen. In operanten Lernparadigmen konnte ein Einfluss der Synapsin-Elimination auf den Lernerfolg detektiert werden. Dabei trat die Reduktion des Lernindex bereits im dritten Larvenstadien auf und setzte sich in der adulten Fliege fort. Der Einfluss des Fehlens des Synapsins auf Lernprozesse in Drosophila steht im Einklang mit Befunden aus Knock-out Mäusen für SynI + II. Im reduzierten Courtship Index der Syn97CS Männchen offenbart sich ein konkreter Hinweis auf eine verringerte Darwin’sche Fitness der Synapsin-Nullmutante. Die Gesamtheit der in der Synapsin-Nullmutante entdeckten Phänotypen könnte den hohen Konservierungsgrad des Proteins zwischen Vertebraten und Invertebraten erklären. In einem weiteren Teil-Projekt konnten Mutationen in die cDNA des Calciumsensor Cameleon 2.0 Proteins eingebracht werden, um so die verbesserte Version Cam 2.1 zu erhalten. Daraufhin wurden mehrere transgene UAS-Cam 2.1 Linien hergestellt, die bei der Kreuzung mit verfügbaren Gal4 Linien den Calciumsensor für eine Expression in definierten Neuronenpopulationen von Drosophila zugänglich machen. In weiterführenden Arbeiten konnte die Funktionalität des Fusionsproteins überprüft werden und somit die ersten Schritte hin zur Anwendung der in-vivo Calcium Imaging Methode am Lehrstuhl durchgeführt werden. N2 - Synapsins are abundant synaptic vesicle-associated phosphoproteins which are highly conserved between species. They are involved in anchoring the synaptic vesicle to the cytoskeleton and in the neurotransmitter release. Previously the synapsin gene (syn) in Drosophila melanogaster was cloned and characterized. Several deletions in the locus were generated by jump-out mutagenesis. In this thesis I present further details on the molecular characterization of the synapsin gene as well as data on the phenotypical relevance of the protein. Previously unknown regulatory elements for the synapsin gene were identified by mapping the breakpoints of several mutants. By using this information it should be possible to generate a rescue constuct for syn mutants apsin to create a transgenic line with a wild-type-like expression. By comparing the synapsin sequence published seven years ago with the sequence from the Berkeley Drosophila Genome Project a discrepancy was detected regarding both the genomic and the cDNA sequence. In order to clarify if this discrepancy is based on an artefact, a polymorphism or a systematic modification, the region was amplified and sequenced at the genomic and cDNA level in nine different wild-type lines. In all cases the genomic sequence was identical to the data of the genome project, giving rise to the suspicion that the previously published sequence contained a sequencing artefact. This result eliminates the need to postulate an unconventional exon-intron structure that would violate the GT-AG splice consensus for in intron 4 of the synapsin gene. However the data from RT-PCR confirmed the cDNA sequence, proving an A to G exchange between genomic DNA and cDNA. This exchange leads to a modification of the aminoacid sequence at the highly conserved target site of the protein kinases CaMK I/ IV and PKA, raising interesting questions about the functional significance of the modification. The substitution is typical for an A-to-I editing event at the RNA level. The modification is catalysed by the dADAR enzyme and was already identified in several neuronal proteins. The necessary double-stranded secondary structure of the RNA can be formed by the synapsin pre-mRNA. The possible editing site complementary sequence (ECS) was detected 90 base downstream of the editing site within intron 4 by computer analysis. The A-to-G exchange was observed in all laboratory and new established wild-type strains as well as during most development stages. Only in a mixed cDNA fraction from eggs, embryos and first larvae a non-edited version coexists with the edited form. For further experiments on the function of phosphorylation at this site and on the relevance of the RNA-editing mutations were introduced into the cDNA in order to generate informative constructs for phosphorylation assays. For the phenotypical characterization of the flies lacking synapsin the null-mutant Syn97 was intensively crossed into the genetic background of the wild-type control strain CantonS, which normally serves as a control in behavioral and especially learning paradigms. The newly established Syn97CS line was tested in collaboration with colleagues at the department for significant differences in behavior or learning compared to the wild-type. Several behavioral abnormalities were found which probably are due to minor modifications in complex neuronal networks. In operant learning tasks we found influences of the protein deficiency. A reduction in the learning index already exists at the 3rd larval stage and persists in the adult fly. The influence of the elimination of synapsin on learning processes in Drosophila is in aggreement with results from synI+II knock-out mice. A link to a reduction of the Darwinian fitness of Syn97CS mutants came from experiments using the courtship suppression paradigm, where mutant males showed a reduced courtship index. In combination these phenotypes may well explain the high conservation of the protein between vertebrates and invertebrates. In another project a mutation was introduced in the cDNA of the calcium sensor cameleon 2.0 in order to create the improved version cameleon 2.1. Several UAS-Cam 2.1 transgenic lines could be established. By crossing these lines with Gal4 flies the calcium sensor could be expressed in a subset of defined neurons. In subsequent experiments the function of the modified protein could be demonstrated establishing the first steps towards in-vivo calcium imaging at the department. KW - Synapsin KW - Mutanten KW - Drosophila KW - Calcium Imaging KW - Synapsin KW - mutants KW - Drosophila KW - Calcium Imaging Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8513 ER - TY - THES A1 - Huber, Saskia T1 - Charakterisierung von SAP47 in Drosophila melanogaster und der dazugehörigen Proteinfamilie T1 - Characterization of SAP47 in Drosophila melanogaster and its protein familiy N2 - In der Arbeit wird ein synapsenassoziiertes Protein, das SAP47 und seine zugehörige Proteinfamilie charakterisiert. N2 - A synapse associated protein, SAP47, and its protein family is characterized. KW - Taufliege KW - Synapse KW - Proteine KW - Molekularbiologie KW - Drosophila KW - Synapse KW - SAP47 KW - BSD KW - Drosophila KW - synapse KW - SAP47 KW - BSD Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7777 ER - TY - THES A1 - Fischer, Matthias T1 - Lokalisierung eines Gedächtnisses bei Drosophila melanogaster T1 - Localization of a Memory in Drosophila N2 - Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, daß das olfaktorische Kurzzeitgedächtnis von Drosophila melanogaster in den Pilzkörpern lokalisiert ist. Zu Beginn dieser Doktorarbeit war bekannt, daß die Pilzkörper notwendig für das Geruchsgedächtnis sind. Drei unabhängige Methoden der Ablation bzw. Veränderung der biochemischen Eigenschaften der Pilzkörper hatten zu dem selben Ergebnis geführt, daß funktionierende Pilzkörper unentbehrlich für den Aufbau eines Geruchsgedächtnisses sind. Noch informativer als ein Experiment, in dem durch Zerstörung einer Struktur eine Leistung unmöglich gemacht wird ist der umgekehrte Weg, der durch einen gewebespezifischen „rescue“ die Leistung wiederherstellt. Dazu wurde in dieser Arbeit das wildtypische Allel des Gens rutabaga in rut-mutanten Fliegen mit Hilfe des Gal4/UAS-Systems ausschließlich in den Pilzkörpern, bzw., im Gegenexperiment, nur außerhalb der Pilzkörper zur Expression gebracht. rut kodiert für die Adenylatcyclase I, die mit synaptischer Plastizität bei Drosophila, Aplysia und Mäusen in Verbindung gebracht wird. Man geht davon aus, daß synaptische Plastizität die molekulare Grundlage für Lernen und Gedächtnis ist. Die AC I stellt cAMP her, dessen Menge und präzise Regulation die Übertragungsstärke an Neuronen beeinflußt. Eine Störung dieses Signalweges z. B. durch die rut-Mutation führt zu einer Beeinträchtigung des Gedächtnisses bei Drosophila. rut wurde mit Hilfe des in Drosophila etablierten Gal4/UAS-Systems exprimiert: Der gewebespezifisch aktive Hefe-Transkriptionsfaktor Gal4 führt dazu, daß das hinter einen Gal4-spezifischen UAS-Promotor klonierte wildtypische rut-Gen in denjenigen Zellen transkribiert wird, in denen der Transkriptionsfaktor vorhanden ist. Dies wurde in einer rut-Mutante durchgeführt, so daß in allen anderen Zellen keine funktionierende AC I vorhanden war. Die rut-abhängige synaptische Plastizität wurde damit ausschließlich auf die gewünschten Regionen beschränkt. Das Expressionsmuster der Gal4-Linien wurde durch Immuncytochemie (Anti-Tau) sichtbar gemacht. Diese Fliegen wurden in einem klassischen Konditionierungsexperiment auf ihr Geruchs-Gedächtnis untersucht. Dazu wurden einer Gruppe von Fliegen nacheinander 2 Gerüche präsentiert, von denen einer mit Elektroschocks gepaart war. Nach ca. 2 min konnten diese Fliegen sich für einen der beiden Gerüche entscheiden, die nun gleichzeitig aus 2 unterschiedlichen Richtungen dargeboten wurden. Je nach Lernleistung entschieden sich mehr oder weniger Fliegen für den vorher unbestraften Geruch. Es ergab sich, daß der Ort im Gehirn, an dem die wildtypische AC I exprimiert wurde, über die Höhe des Gedächtniswertes entschied: Die AC I ausschließlich in den Pilzkörpern gewährte ein völlig normales Gedächtnis, wogegen die AC I außerhalb der Pilzkörper das Gedächtnis nicht gegenüber der rut-Mutante verbessern konnte. Die Analyse der Expressionsverteilung von insgesamt 9 getesteten Fliegenlinien mißt überdies dem -Lobus des Pilzkörpers eine besondere Bedeutung bei und läßt den Schluß zu, daß das hier untersuchte Gedächtnis ausschließlich in den -Loben lokalisiert ist. Dieses erfolgreiche rut-„rescue“ - Experiment zeigt, daß rut-abhängige synaptische Plastizität ausschließlich in den Pilzkörpern ausreichend für ein wildtypisches Gedächtnis ist. Dieses Ergebnis vervollständigt die Erkenntnisse von den Pilzkörper-Ablationsexperimenten insofern, als nun die Aussage zutrifft, daß die Pilzkörper notwendig und hinreichend für das olfaktorische Kurzzeitgedächtnis sind. N2 - Memories are thought to be due to lasting synaptic modifications in the brain. The search for memory traces has relied predominantly on determining regions that are necessary for the process. However, a more informative approach is to define the smallest sufficient set of brain structures. The rutabaga adenylyl cyclase, an enzyme that is ubiquitously expressed in the Drosophila brain and that mediates synaptic plasticity, is needed exclusively in the Kenyon cells of the mushroom bodies for a component of olfactory short-term memory. This demonstrates that synaptic plasticity in a small brain region can be sufficient for memory formation. KW - Gedächtnis KW - Drosophila KW - Pilzkörper KW - rutabaga KW - memory KW - Drosophila KW - mushroom-body KW - rutabaga Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8050 ER - TY - THES A1 - Leibold, Christian T1 - Das Cystein String Protein von Drosophila melanogaster - Invivo-Funktionsanalyse verschiedener Proteindomänen am Modellsystem der larvalen neuromuskulären Synapse T1 - The Cysteine string protein of Drosophila melanogaster - Invivo-functional analysis of different protein domains using the larval neuromuscular junction as a model system N2 - Cystein String Proteine (CSPs) wurden als synaptische Vesikelproteine entdeckt. In Drosophila werden sie in den funktionellen Synapsen und sekretorischen Organellen aller Entwicklungsstufen exprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass CSPs an der regulierten Neurotransmitterausschüttung beteiligt sind und mehrere, von Insekten bis zum Menschen konservierte Domänen besitzen: eine N-terminale Phosphorylierungsstelle der Protein Kinase A (PKA), eine J-Domäne mit 50%iger Homologie zum bakteriellen Chaperone-Protein DnaJ, eine Linker-Domäne, einen Cystein String aus elf aufeinander folgenden Cysteinen, die durch zwei Cystein-Paare flankiert werden und einen variableren C-Terminus. Es wurden Interaktionen mit den Proteinen HSC70, SGT, Syntaxin, Synaptobrevin/VAMP, verschiedenen Untereinheiten von G-Proteinen, Synaptotagmin, sowie spannungsabhängigen Ca2+-Kanälen beschrieben. csp-Nullmutanten CspU1 von Drosophila melanogaster zeigen einen temperatursensitiven Phänotyp, in dem adulte Fliegen von CspU1 reversibel bei 37°C innerhalb von drei Minuten paralysieren. An der neuromuskulären Synapse dritter Larven von CspU1 kann bei nicht-permissiver Temperatur von 32°C eine reversible Blockade der synaptischen Transmission beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit sollten mit Hilfe des larvalen Nerv-Muskel-Präparats dritter Larven elektrophysiologische Untersuchungen an verschiedenen csp-Mutanten durchgeführt werden. Hierdurch sollte die Bedeutung der einzelnen Domänen für die Funktion von csp weiter aufgeklärt werden. Am larvalen Nerv-Muskel-Präparat von Drosophila ist eine Arbeit auf Einzel-Zell-Niveau möglich. Die Segmentierung, die wiederkehrende Anordnung von Muskeln und innervierenden Motoneuronen, sowie das Vorkommen vieler auch im Gehirn von Drosophila lokalisierter synaptischer Proteine machen die larvale neuromuskuläre Synapse für die vorliegenden Fragestellungen. Wie in vielen anderen Arbeiten, wurden elektrophysiologische Messungen an dem Longitudinalmuskel 6 durchgeführt. Alle Messungen evozierter Muskelpotentiale (EJP) wurden, wenn nicht anders erwähnt, mit 0,2Hz Stimulusfrequenz durchgeführt. Die Reiz-Intensität wurde an jedes Präparat individuell angepasst und betrug das 2 ½ -fache des Initial-Schwellenwertes, bei dem ein vollständiges EJP ausgelöst wurde. Zunächst konnte der in der Literatur beschriebene larvale Block der synaptischen Transmitterausschüttung bei erhöhter Temperatur nicht reproduziert, jedoch durch Rückkreuzungen der Nullmutante CspU1 gegen den Wildtyp w1118 wiederhergestellt werden. Das „Rescue“-Konstrukt scDNA1, welches die Grundlage für alle weiteren mutierten Formen von csp darstellt, rettete den larvalen temperatursensitiven Phänotyp im csp-Nullmutantenhintergrund von CspU1 vollständig. Larvale Mutanten der Linie SSP, bei denen der Cystein String durch einen Serin String ausgetauscht worden war (Serine-string protein), zeigten in Übereinstimmung mit den adulten Fliegen den bekannten temperatursensitiven Phänotyp. Larvale Mutanten der Linie CLP (Cysteine-less protein) zeigten im Gegensatz zu adulten Tieren dieser Linie keinen temperatursensitiven Phänotyp, sondern ein wildtypisches Verhalten. Für die Mutante L∆8, die im Nullmutantenhintergrund von CspU1 roc ein in der Linker-Domäne um acht Aminosäuren verkürztes CSP-Protein exprimiert, wurden verschiedene elektrophysiologische Phänotypen beobachtet: Larven der X-chromosomalen Linie zeigten den bekannten temperaturabhängigen Block der synaptischen Transmission. Larven der Insertionslinie für das 3. Chromosom zeigten keine Temperatursensitivität, sondern wildtypisches Verhalten. In immunhistochemischen Untersuchungen konnte für die X-chromosomale Linie eine deutlich schwächere Expression des L∆8-Proteins beobachtet werden. Larven der Linie C∆27, die ein im C-terminalen Bereich von CSP um 27 Aminosäuren verkürztes CSP-Protein exprimieren, im Nullmutantenhintergrund CspU1 roc konnten anhand des Phänotyps in zwei Gruppen unterteilt werden. Unabhängig vom Insertionsort zeigte eine Gruppe den bekannten larvalen temperatursensitiven Phänotyp. Die zweite Gruppe zeigte auch bei erhöhter Temperatur wildtypisches Verhalten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde versucht, eine neue Deletionsmutante für csp durch Remobilisierung einer P-Insertion (P#1617, flybase, Bloomington) im ersten Exon zu erzeugen, da in der Nullmutante CspU1 möglicherweise auch benachbarte Gene betroffen sind. Nach Überprüfung der erzeugten Mutanten durch Western und Southern Blot, immunhistochemische Experimente und elektrophysiologische Untersuchungen am Nerv-Muskel-Präparat 3. Larven konnte keine Deletionsmutante mit temperaturabhängigem Phänotyp isoliert werden, die ausschließlich csp betraf. N2 - Cysteine string proteins (CSPs) were detected as synaptic vesicle proteins. In Drosophila they are expressed in functional synapses and secretory organelles of all developmental stages. CSPs were shown to be involved in regulated neurotransmitter release and contain several domains, which are conserved from insects to man: N-terminal phosphorylation site for protein kinase A (PKA), “J”-domain with 50% homology to a bacterial chaperone-protein DnaJ, “linker”-domain, cysteine string consisting of eleven following cysteines, flanked by two pairs of cysteines and the more variable C-terminus. Interactions with the following proteins have been described: HSC70, SGT, Syntaxin, Synaptobrevin/VAMP, several subunits of G-proteins, Synaptotagmin, and voltage-dependent Ca2+-channels. Csp-null mutants (CspU1) of Drosophila melanogaster exhibit a temperature sensitive phenotype. Adult flies of CspU1 paralyse reversibly at 37°C within three minutes. At the neuromuscular junction of 3rd instar larvae of CspU1 a reversible blockade of synaptic transmission can be observed at non-permissive temperature of 32°C. Electrophysiological studies at the larval nerve-muscle-preparation of 3rd instar larvae of different csp-mutants were performed in this Ph.D. thesis in order to investigate the relevance of the different CSP domains for the function of csp. Using the larval nerve-muscle-preparation of Drosophila studies at single-cell-levels are possible. The clear segmentation, iterated position of the body wall muscles and localization of many proteins, which are also present in the brain, account for the larval neuromuscular junction as an ideal model-system for the study of synaptic transmission. As described in previous work, electrophysiological studies have been performed at longitudinal muscle 6. All recordings of evoked junction potentials (EJP) were performed with 0.2Hz stimulus frequency (if not described in a different way). Stimulus intensity was adjusted 2 ½ times to initial threshold for a complete EJP, individually for each preparation. In the beginning larval blockade of synaptic transmitter release as described in literature could not be reproduced. Backcrossing for 12 generations of CspU1 with w1118 could restore the temperature-dependent blockade of synaptic transmission in 3rd instar larvae. “Rescue”-construct scDNA1, which was further used as template for all mutated forms of CSP used in this study, completely rescued the larval temperature-sensitive phenotype in csp-null mutant background. Larval mutants of SSP (serine-string protein, serine-string replaces cysteine-string) showed the temperature-sensitive phenotype, as known from their adult flies. In contrast to their adult flies larval mutants of CLP (cysteine-less protein) showed no temperature-sensitive phenotype, but wild type-like behaviour. For the mutant L∆8 (deletion of eight conserved amino acids of linker domain) in null mutant background of CspU1 roc two different phenotypes could be observed: The X-chromosomal strain showed the known temperature-dependent blockade of synaptic transmission. In contrast, 3rd instar larvae of the strain with insertion on the 3rd chromosome showed no temperature sensitivity, but wild type-like behaviour. In immunhistochemical staining a weaker L∆8-protein expression could be observed for the X-chromosomal line. Due to their different phenotype and independent of insertion locus, larval C∆27-mutants could be divided into two groups. One group revealed the known larval temperature-sensitive phenotype. The second group showed also at elevated temperature wild type-like behaviour. In the second part of the current work a new mutant for csp should be created because of the possibility that additional genes are influenced in the null-mutant CspU1. Therefore a deletion in the csp-Locus should be created in a jump-out mutagenesis. In the strain P1617 (flybaase, Bloomington) the PZ-element, which is located in the non-translated region of the 1st exon of csp, was remobilized. Characterization of the jump-out mutants by western and southern blot analysis, immunhistochemical experiments and electrophysiological studies at nerve-muscle-preparations of 3rd instar larvae failed to isolate a jump-out mutant with described temperature-dependent phenotype and affection only of csp. KW - Taufliege KW - Cysteinderivate KW - Temperaturabhängigkeit KW - Drosophila KW - CSP KW - Synapse KW - temperatursensitiv KW - Drosophila KW - CSP KW - Synapse KW - temperature sensitive Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7481 ER - TY - THES A1 - Kibler, Eike Mathias U. T1 - Casein-Kinase-2-Beta und neuronale Entwicklungsprozesse T1 - Casein kinase 2ß and neural development - examinations employing the neurogenetic model organism Drosophila melanogaster N2 - Die Pilzkörper von Drosophila melanogaster stellen eine für die Lebensfähigkeit dieses Organismus entbehrliche Gehirnstruktur dar. Die Entwicklungsprozesse, die der Bildung dieser zentralnervösen Struktur zugrunde liegen, sind gut erforscht. Die neuronalen Stammzellen, die für die Bildung dieser Gehirnstruktur verantwortlich sind, sind identifiziert und experimentell gut zugänglich. Daher bietet sich die Drosophila-Pilzkörperentwicklung als neurogenetisches Modellsystem an, grundlegende Mechanismen der Gehirnentwicklung durch die Untersuchung von Pilzkörperstrukturmutanten zu erforschen. In dieser Arbeit wurde mushroom bodies undersized P1 (mbuP1) als eine durch Transposon- Insertion in den Casein-Kinase-2ß-Genlokus verursachte, hypomorphe Mutation identifiziert, die zu einer starken Verringerung der Anzahl der die Pilzkörper bildenden intrinsischen Neurone führt. Eine Reversion des mbuP1-Pilzkörperphänotyps konnte unter anderem durch die Expression von Casein-Kinase-2ß-(CK2ß)-Transgenen im mbuP1-Hintergrund erzielt werden. Durch Rekombination wurde ein fertiler mbuP1-Stamm etabliert, der nun die Untersuchung der zellulären mbuP1-Defekte ermöglicht. Eine partielle, letale Deletion der CK2ß-Transkriptionseinheit wurde erzeugt. Die Letalität dieser Deletion konnte sowohl durch ein genomisches CK2ß-Transgen als auch durch die ubiquitäre Expression einer CK2ß-cDNA gerettet, und hierdurch die essentielle Funktion der CK2ß-Transkriptionseinheit in Drosophila belegt werden. Durch die ubiquitäre Expression von in vitro-mutagenisierten CK2ß-cDNAs im CK2ß-Letalhintergrund wurde gezeigt, daß die Phosphorylierung der regulatorischen CK2ß-Untereinheit durch die katalytisch aktive CK2α-Untereinheit kein lebensnotwendiger Prozess ist. Gleichartige Experimente wurden zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung eines CK2ß-Zinkfingermotivs und eines CK2ß-Destruction-Box-Motivs durchgeführt. Diese legen nahe, daß das Zinkfingermotiv im Gegensatz zum Destruction-Box-Motiv für die in vivo-Funktion der CK2ß-Untereinheit essentiell ist. Expression der in vitro-mutagenisierten CK2ß-cDNAs im mbuP1-Hintergrund werden die funktionelle Bedeutung der ausgetauschten Aminosäuren für die Pilzkörperentwicklung zeigen. Eine letale genetische Interaktion von mbuP1 mit einer Mutation des Drosophila-MAP-Kinase-Gens rolled (rlSem) und eine lebensfähige Interaktion von mbuP1 mit einer Mutation des Drosophila-S6-Kinase-p90rsk-Gens ignorant (ignP1), bei der Flügel- und Augenent-wicklungsdefekte zu beobachten sind, wurden gefunden. Es wurde zudem gezeigt, daß rlSem als Suppressor des Pilzkörperphänotyps eines schwächeren mbu-Allels wirkt. Hierdurch konnte eine Beteiligung der Casein-Kinase-2 an MAP-Kinase-Signalübertragungswegen wahrscheinlich gemacht werden. N2 - Mushroom bodies are dispensable for the developing and adult Drosophila fly. The developmental processes underlying mushroom body formation are well studied, the neural stem cells responsable for their development are identified and experimentally well accessable. Therefore Drosophila mushroom body development can be used as a powerful neurogenetic model system to find out about fundamental mechanisms underlying brain development by studying mutant flies showing aberrant mushroom body development. In the course of this work, mushroom bodies undersized P1 (mbuP1) was identified as a hypomorphic casein kinase 2ß-allele (CK2ß) caused by the insertion of transposable elements in the casein kinase 2ß gene locus. The mbuP1-mutation leads to a drastic reduction of the number of intrinsic neurons forming the adult mushroom body. Expression of transgenic CK2ß in a mbuP1-mutant background led to a reversion of the mbuP1-associated mushroom body phenotype. Fertility of mbuP1-flies could be partially restored by recombining the original mbuP1{P3843/2}-chromosome with a w1118-chromosome. This will allow future studies to identify the cellular defects caused by mbuP1. A partial deletion of the CK2ß gene causes lethality which could be rescued by either a genomic CK2ß-transgene or by ubiquitous expression of a CK2ß-cDNA. Therefore, CK2ß has been shown to be an essential gene in Drosophila. By ubiquitous expression of in vitro mutagenized CK2ß-cDNAs in a CK2ß-lethal background, a non-essential role of phosphorylation of the regulatory CK2ß-subunit by the catalytically active CK2α-subunit could be shown. Similar experiments were performed to examine the role of a CK2ß-zincfinger motif and a CK2ß-destruction-box motif. The obtained results suggest a non-essential in vivo function for the destruction-box motif and an essential in vivo function for the zincfinger-motif. Expression of the in vitro mutagenized CK2ß-cDNAs in a mbuP1-background will reveal the functional significance of the substituted amino acids for mushroom body development. Performed genetic interaction studies showed a lethal interaction of mbuP1 with a mutation in the Drosophila-MAP-kinase gene rolled (rlSem) and a viable genetic interaction with a mutation in the Drosophila-S6-kinase-p90rsk gene ignorant (ignP1) which revealed defects in wing formation and eye development. It also could be shown that rlSem acts as a suppressor of the mushroom body phenotype associated with a weaker mbu-allele. These observations point towards a role of casein kinase 2 in MAP-kinase signalling. KW - Taufliege KW - Pilzkörper KW - Ontogenie KW - Embryonalentwicklung KW - Proteinkinase CK2 KW - Drosophila KW - CK2 KW - Pilzkörper KW - CK2ß KW - Entwicklung KW - Drosophila KW - CK2 KW - mushroom body KW - CK2ß KW - development Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4202 ER - TY - THES A1 - Tschäpe, Jakob-Andreas T1 - Molekulare und funktionelle Analyse der Drosophila-Mutante löchrig T1 - Molecular and Functional Analysis of the Drosophila mutant löchrig N2 - Neurodegenerative Erkrankungen des Menschen sind eines der Hauptfelder molekularer neurobiologischer Grundlagenforschung. Um generell molekulare, komplizierte Vorgänge in vivo untersuchen zu können, nutzt man seit geraumer Zeit Modellorganismen wie Caenorhabditis elegans oder Drosophila melanogaster. In der vorliegenden Arbeit wird die Drosophila-Neurodegenerationsmutante loe (löchrig) beschrieben, die als Modell für die Rolle des Cholesterinhaushalts im Bezug auf Neurodegeneration herangezogen werden kann. Die Fliegen dieser Mutante zeigen stark progressive, altersabhängige Degeneration von Neuronen, dabei unterlaufen diese Nervenzellen einen nekrotischenZelltod. Verantwortlich für diese Mutation ist die Insertion eines P-Elementes in einem Intron des Drosophila-g-5'-AMP-aktivierten Proteinkinase- (AMPK)-Gens. Die verschiedenen Spleißprodukte des loe Gens kodieren für die regulatorische g-Untereinheit des AMPK-Komplexes, der , aktiviert durch 5'AMP, energieintensive Prozesse negativ reguliert. Die Spleißform loeI ist durch die P-Element-Insertion betroffen, Anteile des P-Elementes werden in das loeI-Transkript hineingespleißt. Eine neuronale Expression von loeI im loe-Hintergrund führt zur Revertierung des loe-Phänotypes. Mit der Expression anderer Spleißformen kann dieser Effekt nicht erzielt werden. Das LOE I-Protein birgt in seinem N-Terminus eine Reihe möglicher Interaktionstellen mit anderen Proteinen, die den AMPK-Komplex in einen Kontext mit den Proteinen der APP (Amyloid Precursor Proteins) ?Familie stellen oder z. B. Interaktionen mit dem Cytoskelett herstellen können. Eine molekulare Interaktion mit NiPSNAP, einem Protein, dass vermutlich eine Rolle im Vesikelverkehr spielt, konnte nachgewiesen werden. Ein direktes humanes Homolog von LOE I ist nicht bekannt, wohlgleich es im Menschen drei AMPK-g-Untereinheiten gibt, von denen zwei ähnliche Funktionen übernehmen könnten wie LOE I. Die loe-Mutante interagiert genetisch mit der Mutante clb ? columbus, die einen Defekt im Gen der HMG-CoA-Reduktase trägt. Dieses Emzym ist das Schlüsselenzym der Cholesterinbiosynthese. Die Art der Interaktion belegt eine negative Regulierung der HMG-CoA-Reduktase durch die AMPK. So schwächt die clb-Mutation den neurodegenerativen loe-Phänotyp ab, eine Überexpression von clb verstärkt diesen. Eine Verminderung der Neurodegeneration kann auch mit Medikamenten erreicht werden: Statine, potente Hemmer der HMG-COA-Reduktase, reprimieren deutlich den loe-Phänotyp. In loe ist der Cholesterinester-Spiegel auf 40% abgesenkt. Eine weitere genetische Interaktion von loe konnte nachgewiesen werden: Die Mutante für das Drosophila-Homolog von APP (Appl) verstärkt den neurodegenerativen Phänotyp in loe stark, wogegen die Appl-Mutante selbst keine neurodegenerativen Defekte aufweist. Darüberhinaus zeigt die Doppelmutante Defekte, die keine der Einzelmutanten aufweist: Sterilität oder eine extrem kurze Lebensdauer von nur 3-4 Tagen. Diese Interaktion ließ sich auf molekularer Ebene charakterisieren. Die proteolytische Prozessierung von APPL durch Sekretasen ist in loe alteriert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch die loe-Mutation die b-Sekretase aus Vertebraten (BACE) und eine bisher noch nicht beschriebene endogene Sekretase aus Drosophila negativ beeiflusst werden. Ein AMPK-Komplex mit LOE I als g-Untereinheit scheint über den Cholesterinester-Spiegel die Aktivität einer speziellen Untergruppe der Sekretasen zu beeinflussen. Die Missfunktion dieser Sekretasen ist ein kritischer Punkt in der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit. Die loe-Mutation wirft neues Licht auf die bekannten Verbindungen zwischen Cholesterin-Stoffwechsel, Vesikelverkehr und Prozessierung von APP(L). Mit den großen Möglichkeiten, die die Drosophila-Genetik bietet, stellt diese neue Mutante ein weiteres Werkzeug zur Charakterisierung von Therapie-Ansätzen für die Alzheimer-Kankheit dar. Die vorliegende Arbeit belegt um ein weiteres Mal, dass Drosophila ein potentes Modellsystem zur Untersuchung humaner, neurodegenerativer Erkrankungen wie Chorea Huntington, Parkinson oder der Alzheimer Krankheit ist. N2 - Human neurodegenerative diseases are the main topic of molecular neurobiological basic research. To investigate detailed mechanisms in vivo one uses the tool of genetic model organisms like Caenorhabditis elegans or Drosophila melanogaster for quite a long while. This thesis describes the Drosophila neurodegenration mutant löchrig (loe), which can be used as a model for cholesterol metabolism in respect to neurodegeneration. Mutant loe flies show strong and progressive age-dependent degenration of neurons undergoing necrotic cell death. The P-element inserted in an intron of the gene coding for the Drosophila 5'-AMP activated protein kinase (AMPK) complex gamma subunit is responsible for the mutation in loe. The various splice forms of the loe gene code for different regulatory gamma subunits of this complex consisiting of three subunits. The splice form loeI is affected by the P-element insertion, parts of the P-element are spliced into the loeI transkript in the loe mutant. The neuronal expression of one copy of loeI in the mutant background revertes the neurodegenerative phenotype which can not be achieved by expression of one of the other splice forms. The LOE I protein contains in its N-terminus several putative interaction motifs and domaines. These could get a LOE I-containing AMPK complex in context with the APP (amyloid precursor protein) or the cytoskeletton. An interaction with NiPSNAP ? a protein with a putative function in the vesicular transport ? has been proved molecularly. A human homolog of LOE I is not yet known, although there are three different isoforms of a AMPK gamma subunit described in humans. The loe mutant interacts genetically with the columbus (clb) mutant, wich is affected in the gene of the HMG-CoA reductase, the key enzyme in cholesterol biosynthesis. This shown interaction verifies a negative regulation of the HMG-CoA reductase by the AMPK complex in Drosophila. Thus the clb mutation supresses the loe phenotype, an overexpression of clb enhances the neurodegeneration. A supression of the neurodegenerative phenotype can be also achieved by a statin treatment of loe flies. Statins are potent inhibitors of the HMG-CoA reductase. Another genetic interaction exists between loe and the Appl mutant. Appl d, the null mutant of the Drosophila APP homolog, enhances strongly the neurogenerative phenotype of loe, whereas the Appl mutant itself shows no neuronal defects. In addition the double mutant shows defects which none of the single mutants show: sterility of females and a dramatic shortened lifespan of only 3-4 days. This interaction could be characterized on the molecular level: The proteelytic processing of APPL by sectretases is altered in the loe mutant. Both the BACE sectretase from vertebrates and an so far uncharakterized endogenous sectretase in Drosophila are negatively influenced by the loe mutation. An AMPK complex containing LOE I as the gamma subunit seems to regulate the activity of a subgroup of the sectretases via the cholesterolester level. The misfunction of secretases is a crutial point in the pathogenesis of Alzheimer's disease. The loe mutation gives new insights in the already known links between cholesterol homeostasis, vesicular transport, and processing of APP(L). Together with the exstensive tools of Drosophila genetics this new mutant will supply new possibilities to characterize putative therapies to cure Alzheimer's disease. This thesis at another time presents Drosophila as an potent model system for the research on human neurodegenerative diseases like Huntington's disease, Parkinson or Alzheimer's disease. KW - Taufliege KW - Mutante KW - Cholesterin KW - Nervenzelle KW - Degeneration KW - Alzheimer-Krankheit KW - Neurodegeneration KW - Drosophila KW - APP KW - Cholesterin KW - Alzheimer Krankheit KW - AMPK KW - Neurodegeneration KW - Drosophila KW - APP KW - Cholesterol KW - Alzheimer's Disease KW - AMPK Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2963 ER -