TY - THES A1 - Adenugba, Akinbami Raphael T1 - Functional analysis of the gene organization of the pneumoviral attachment protein G T1 - Funktionelle Analyse der Genorganisation des pneumoviralen Attachment-Protein G N2 - The putative attachment protein G of pneumonia virus of mice (PVM), a member of the Pneumoviruses, is an important virulence factor with so far ambiguous function in a virus-cell as well as in virus-host context. The sequence of the corresponding G gene is characterized by significant heterogeneity between and even within strains, affecting the gene and possibly the protein structure. This accounts in particular for the PVM strain J3666 for which two differing G gene organizations have been described: a polymorphism in nucleotide 65 of the G gene results in the presence of an upstream open reading frame (uORF) that precedes the main ORF in frame (GJ366665A) or extension of the major G ORF for 18 codons (GJ366665U). Therefore, this study was designed to analyse the impact of the sequence variations in the respective G genes of PVM strains J3666 and the reference strain 15 on protein expression, replication and virulence. First, the controversy regarding the consensus sequence of PVM J3666 was resolved. The analysis of 45 distinct cloned fragments showed that the strain separated into two distinct virus populations defined by the sequence and structure of the G gene. This division was further supported by nucleotide polymorphisms in the neighbouring M and SH genes. Sequential passage of this mixed strain in the cell line standardly used for propagation of virus stocks resulted in selection for the GJ366665A-containing population in one of two experiments pointing towards a moderate replicative advantage. The replacement of the G gene of the recombinant PVM 15 with GJ366665A or GJ366665U, respectively, using a reverse genetic approach indicated that the presence of uORF within the GJ366665A significantly reduced the expression of the main G ORF on translational level while the potential extension of the ORF in GJ366665U increased G protein expression. In comparison, the effect of the G gene-structure on virus replication was inconsistent and dependent on cell line and type. While the presence of uORF correlated with a replication advantage in the standardly used BHK-21 cells and primary murine embryonic fibroblasts, replication in the murine macrophage cell line RAW 264.7 did not. In comparison, the GJ366665U variant was not associated with any effect on replication in cultured cells at all. Nonetheless, in-vivo analysis of the recombinant viruses associated the GJ366665U gene variant, and hence an increased G expression, with higher virulence whereas the GJ366665A gene, and therefore an impaired G expression, conferred an attenuated phenotype to the virus. To extend the study to other G gene organizations, a recombinant PVM expressing a G protein without the cytoplasmic domain and for comparison a G-deletion mutant, both known to be attenuated in vivo, were studied. Not noticed before, this structure of the G gene was associated with a 75% reduction in G protein expression and a significant attenuation of replication in macrophage-like cells. This attenuation was even more prominent for the virus lacking G. Taking into consideration the higher reduction in G protein levels compared to the GJ366665A variant indicates that a threshold amount of G is required for efficient replication in these cells. In conclusion, the results gathered indicated that the expression levels of the G protein were modulated by the sequence of the 5’ untranslated region of the gene. At the same time the G protein levels modulated the virulence of PVM. N2 - Das mutmaßliche „attachment“ Protein G des Pneumonievirus der Maus (PVM), einem Mitglied des Genus Pneumovirus, ist ein bedeutender Virulenzfaktor, mit allerdings noch nicht vollständig verstandener Funktion. Dabei zeichnet sich die Sequenz des G-Gens durch Nukleotid-Polymorphismen und damit verbundenen Variationen in der Genorganisation und möglicherweise der Proteinstruktur sowohl zwischen als auch innerhalb von PVM-Stämmen aus. Insbesondere für den PVM-Stamm J3666 wurden zwei verschiedene Organisationen des G-Gens beschrieben: ein Polymorphismus des Nukleotids 65 des G-Genes erzeugt einen neuen „upstream Open reading frame“ (uORF), der dem eigentlichen G-ORF vorausgeht (GJ366665A), oder führt zu einer Verlängerung des eigentlichen G-ORF von G um 18 Kodons (GJ366665U). Ziel dieser Studie war es deshalb, die Auswirkung dieser Sequenzvariabilitäten der für PVM J3666 beschriebenen G-Gene im Vergleich zu dem des Referenzstamms PVM 15 bezüglich Proteinexpression, der Virusreplikation und der Virulenz zu untersuchen. Als erstes wurden die beschriebenen Sequenzunterschiede bezüglich des PVM-Stamms J3666 untersucht. Die Analyse von 45 verschiedenen klonierten Fragmenten von PVM J3666 zeigte, dass es sich bei diesem Stamm eigentlich um zwei separate Viruspopulationen handelt, die sich durch die Sequenz und Struktur des G-Genes definieren lassen. Diese Unterscheidung wird durch weitere Nukleotid-Polymorphismen in den benachbarten Genen, M und SH, gestärkt. Sequenzielle Passagierung dieses gemischten Stammes in der standardmäßig zur Virusanzucht verwendeten BHK-21-Zelllinie resultierte in einem von zwei Experimenten in der Selektion der GJ366665A-Population, das ein Hinweis auf einen moderaten Replikationsvorteil darstellt. Der Austausch des G-Gens des Referenzstamms PVM 15 durch GJ366665A oder GJ366665U mithilfe der Reversen Genetik, zeigte, dass der uORF innerhalb von GJ366665A zu einer deutlich reduzierten Expression des eigentlichen G-ORF führt. Andererseits führte die potenzielle Verlängerung des ORF in GJ366665U zu einer im gleichen Maße erhöhten Expression des G-Proteins. Dagegen war der Einfluss der G-Genorganisation auf die Virusvermehrung in Zellkultur in Abhängigkeit von Zelllinie und Zelltyp inkonsistent. Während ein uORF mit einem Replikationsvorteil in BHK-21-Zellen und primären murinen embryonen Fibroblasten korrelierte, war dies in der murinen Makrophagen-Zelllinie RAW 264.7 nicht zu beobachten. Im Vergleich dazu konnte die GJ366665U-Variante nicht mit einem Einfluss auf die Virusvermehrung in Verbindung gebracht werden. Nichtsdestotrotz, konnte die GJ366665U-Variante, und damit eine erhöhte Expression von G, mit einer gesteigerten Virulenz assoziiert werden, während die GJ366665A-Variante, d. h. eine verringerte G-Expression zur Attenuierung des Virus führte. Die Untersuchungen wurden auf weitere G-Genstrukturen, d.h. ein rekombinantes PVM, rPVM-Gt, das ein N-terminal verkürztes G-Protein exprimiert, ausgeweitet. Zum Vergleich wurde eine Deletionsmutante des kompletten G-Gens, rPVM-ΔG, mit einbezogen. Von beiden Viren war bereits bekannt, dass sie in vivo attenuiert sind. Die Organisation des Gt-Gens war mit einer um 75 % verringerten Expression des entsprechenden Proteins assoziiert, was zuvor nicht beobachtet worden war. Zugleich zeigte rPVM-Gt eine deutliche Attenuierung der Replikation in RAW 264.7-Zellen und primären Mausmakrophagen, die von der G-Deletionsmutante noch übertroffen wurde. Die im Vergleich zu der GJ366665A-Variante deutlich höhere Reduktion der G-Expression dieser beiden G-Mutanten in Betracht ziehend, scheint dies darauf hinzuweisen, dass eine bestimmte Mindestexpression von G für eine effiziente Virusvermehrung in diesen Zellen benötigt wird. Zusammenfassend deuten die erhaltenen Ergebnisse darauf hin, dass die Expression des G-Proteins durch die jeweiligen 5’ nicht-translatierte Region des Gens moduliert wird, was einen neuen Mechanismus für Negativstrang-RNA-Viren darstellt. Zugleich moduliert die Expressionsrate von G die Virulenz von PVM. KW - G glycoprotein KW - protein regulation and expression KW - Pneumoviruses KW - regulation KW - expression KW - replication KW - virulence KW - 5`-UTR KW - PVM KW - RSV Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-128146 ER - TY - THES A1 - Adler, Florian Rudolf T1 - Electronic Correlations in Two-dimensional Triangular Adatom Lattices T1 - Elektronische Korrelationen in zweidimensionalen Adatom-Dreiecksgittern N2 - Two-dimensional triangular lattices of group IV adatoms on semiconductor substrates provide a rich playground for the investigation of Mott-Hubbard physics. The possibility to combine various types of adatoms and substrates makes members of this material class versatile model systems to study the influence of correlation strength, band filling and spin-orbit coupling on the electronic structure - both experimentally and with dedicated many-body calculation techniques. The latter predict exotic ground states such as chiral superconductivity or spin liquid behavior for these frustrated lattices, however, experimental confirmation is still lacking. In this work, three different systems, namely the \(\alpha\)-phases of Sn/SiC(0001), Pb/Si(111), and potassium-doped Sn/Si(111) are investigated with scanning tunneling microscopy and photoemission spectroscopy in this regard. The results are potentially relevant for spintronic applications or quantum computing. For the novel group IV triangular lattice Sn/SiC(0001), a combined experimental and theoretical study reveals that the system features surprisingly strong electronic correlations because they are boosted by the substrate through its partly ionic character and weak screening capabilities. Interestingly, the spectral function, measured for the first time via angle-resolved photoemission, does not show any additional superstructure beyond the intrinsic \(\sqrt{3} \times \sqrt{3} R30^{\circ}\) reconstruction, thereby raising curiosity regarding the ground-state spin pattern. For Pb/Si(111), preceding studies have noted a phase transition of the surface reconstruction from \(\sqrt{3} \times \sqrt{3} R30^{\circ}\) to \(3 \times 3\) at 86 K. In this thesis, investigations of the low-temperature phase with high-resolution scanning tunneling microscopy and spectroscopy unveil the formation of a charge-ordered ground state. It is disentangled from a concomitant structural rearrangement which is found to be 2-up/1-down, in contrast to previous predictions. Applying an extended variational cluster approach, a phase diagram of local and nonlocal Coulomb interactions is mapped out. Based on a comparison of theoretical spectral functions with scattering vectors found via quasiparticle interference, Pb/Si(111) is placed in said phase diagram and electronic correlations are found to be the driving force of the charge-ordered state. In order to realize a doped Mott insulator in a frustrated geometry, potassium was evaporated onto the well-known correlated Sn/Si(111) system. Instead of the expected insulator-to-metal transition, scanning tunneling spectroscopy data indicates that the electronic structure of Sn/Si(111) is only affected locally around potassium atoms while a metallization is suppressed. The potassium atoms were found to be adsorbed on empty \(T_4\) sites of the substrate which eventually leads to the formation of two types of K-Sn alloys with a relative potassium content of 1/3 and 1/2, respectively. Complementary measurements of the spectral function via angle-resolved photoemission reveal that the lower Hubbard band of Sn/Si(111) gradually changes its shape upon potassium deposition. Once the tin and potassium portion on the surface are equal, this evolution is complete and the system can be described as a band insulator without the need to include Coulomb interactions. N2 - Zweidimensionale Dreiecksgitter aus Adatomen der vierten Hauptgruppe auf Halbleitersubstraten bieten eine reichhaltige Spielwiese für die Untersuchung von Mott-Hubbard-Physik. Die Möglichkeit, verschiedene Adatomsorten und Substrate zu kombinieren, macht die Mitglieder dieser Materialklasse zu vielseitigen Modellsystemen, um den Einfluss von Korrelationsstärke, Bandfüllung und Spin-Bahn-Kopplung auf die elektronische Struktur zu untersuchen - sowohl im Experiment als auch mit Vielkörper-Rechnungen. Letztere prognostizieren exotische Grundzustände, wie z.B. chirale Supraleitung oder eine Spin-Flüssigkeit, wobei eine experimentelle Bestätigung jeweils noch aussteht. In dieser Dissertation werden drei derartige Systeme, nämlich die \(\alpha\)-Phasen von Sn/SiC(0001), Pb/Si(111) und kaliumdotiertem Sn/Si(111) mittels Rastertunnelmikroskopie und Photoemissionsspektroskopie diesbezüglich untersucht. Die Resultate sind potentiell relevant für Anwendungen im Bereich der Spintronik oder Quantencomputer. Für das erst kürzlich realisierte Gruppe-IV-Dreiecksgitter Sn/SiC(0001) zeigt diese Studie, bei der experimentelle und theoretische Methoden kombiniert werden, dass das System unerwartet starke Korrelationen aufweist, weil sie durch den teilweise ionischen Charakter und das geringe Abschirmungsvermögen des Substrats verstärkt werden. Die Spektralfunktion, die erstmals mit winkelaufgelöster Photoemission gemessen wird, zeigt keine überstruktur außer der intrinsischen \(\sqrt{3} \times \sqrt{3} R30^{\circ}\) Rekonstruktion des Gitters, was die Frage nach der Anordnung der Spins im Grundzustand aufwirft. Bei Pb/Si(111) haben bereits frühere Veröffentlichungen einen Phasenübergang bei der Oberflächenrekonstruktion von \(\sqrt{3}\times\sqrt{3}R30^{\circ}\) auf \(3 \times 3\) bei 86 K festgestellt. In dieser Arbeit zeigen Untersuchungen der Niedrigtemperaturphase mit hochaufgelöster Rastertunnelmikroskopie und -spektroskopie die Entstehung eines ladungsgeordneten Zustands. Dieser wird von der begleitend auftretenden strukturellen Neuordnung getrennt, welche entgegen bisheriger Voraussagen eine 2-hoch/1-tief-Anordnung aufweist. Mit Hilfe einer neu entwickelten Cluster-Rechenmethode wird ein Phasendiagramm erstellt, in dem die lokale und nichtlokale Coulomb-Wechselwirkung gegeneinander aufgetragen sind. Durch einen Vergleich zwischen theoretischen Spektralfunktionen mit Streuvektoren, die mittels Quasiteilchen-Interferenz bestimmt werden, kann Pb/Si(111) in besagtem Phasendiagramm platziert werden. Dadurch stellt sich heraus, dass elektronische Korrelationen die treibende Kraft für den ladungsgeordneten Zustand in Pb/Si(111) sind. Um einen dotierten Mott-Isolator in einem frustrierten System zu verwirklichen, wird Kalium auf das bekannte, korrelierte System Sn/Si(111) aufgebracht. Statt des erwarteten Isolator-Metall übergangs zeigen Messungen mit Rastertunnelspektroskopie, dass die elektronische Struktur von Sn/Si(111) nur lokal in der unmittelbaren Umgebung der Kaliumatome beeinflusst wird, ohne dass das System metallisch wird. Die Kaliumatome werden auf freien \(T_4\)-Plätzen des Substrats adsorbiert, was letztendlich zur Ausbildung von zwei unterschiedlichen Kalium-Zinn-Legierungen mit einem Kaliumanteil von 1/3 bzw. 1/2 führt. Komplementäre Messungen der Spektralfunktion mit winkelaufgelöster Photoemission zeigen, dass das untere Hubbardband von Sn/Si(111) durch die Kalium-Deposition allmählich seine Form verändert. Sobald Zinn und Kalium zu gleichen Teilen auf der Oberfläche vorliegen, ist diese Transformation beendet und das System kann als einfacher Bandisolator ohne die Notwendigkeit, elektronische Korrelationen zu berücksichtigen, beschrieben werden. KW - Rastertunnelmikroskopie KW - ARPES KW - Elektronenkorrelation KW - Oberflächenphysik Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-241758 ER - TY - THES A1 - Altrichter, Steffen T1 - Labeling approaches for functional analyses of adhesion G protein-coupled receptors T1 - Markierungsverfahren zur funktionellen Analyse von Adhäsions-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren N2 - The superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs) comprises more than 800 members, which are divided into five families based on phylogenetic analyses (GRAFS classification): Glutamate, Rhodopsin, Adhesion, Frizzled/Taste2 and Secretin. The adhesion G protein-coupled receptor (aGPCR) family forms with 33 homologs in Mammalia the second largest and least investigated family of GPCRs. The general architecture of an aGPCR comprises the GPCR characteristics of an extracellular region (ECR), a seven transmembrane (7TM) domain and an intracellular region (ICR). A special feature of aGPCRs is the extraordinary size of the ECR through which they interact with cellular and matricellular ligands via adhesion motif folds. In addition, the ECR contains a so-called GPCR autoproteolysis-inducing (GAIN) domain, which catalyzes autoproteolytic cleavage of the protein during maturation. This cleavage leads to the formation of an N-terminal (NTF) and a C-terminal fragment (CTF), which build a unit by means of hydrophobic interactions and therefore appear as a heterodimeric receptor at the cell surface. In the past, it has been shown that the first few amino acids of the CTF act as a tethered agonist (TA) that mediates the activation of the receptor through the interaction with the 7TM domain. However, the molecular mechanism promoting the TA-7TM domain interaction remains elusive. This work reveals a novel molecular mechanism that does not require the dissociation of the NTF-CTF complex to promote release of the TA and thus activation of the aGPCR. The introduction of bioorthogonal labels into receptorsignaling- relevant regions of the TA of various aGPCRs demonstrated that the TA is freely accessible within the intact GAIN domain. This suggests a structural flexibility of the GAIN domain, which allows a receptor activation independent of the NTF-CTF dissociation, as found in cleavage-deficient aGPCR variants. Furthermore, the present study shows that the cellular localization and the conformation of the 7TM domain depends on the activity state of the aGPCR, which in turn indicates that the TA mediates conformational changes through the interaction with the 7TM domain, which ultimately regulates the receptor activity. In addition, biochemical analyses showed that the GAIN domain-mediated autoproteolysis of the human aGPCR CD97 (ADGRE5/E5) promotes further cleavage events within the receptor. This suggests that aGPCRs undergo cleavage cascades, which are initialized by the autoproteolytic reaction of the GAIN domain. Thus, it can be assumed that aGPCRs are subject to additional proteolytic events. Finally, the constitutive internalization of the NTF and the CTF of E5 was demonstrated by various labeling methods. It was possible to label both fragments independently and to follow their subcellular location in vitro. In summary, these obtained results contribute to a better understanding about the molecular mechanisms of activity and signaling of aGPCRs. N2 - Die Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) umfasst weit mehr als 800 Mitglieder, welche aufgrund von phylogenetischen Analysen in fünf Familien unterteilt werden (GRAFS Klassifizierung): Glutamat, Rhodopsin, Adhäsion, Frizzled/Taste2 und Sekretin. Die Familie der Ädhesions-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (aGPCRs) bildet mit 33 Homologen in Säugetieren die zweitgrößte Familie innerhalb der GPCRs. Die generelle Architektur eines aGPCRs weist die GPCR typischen Merkmale einer extrazellulären Region (ECR), einer sieben Transmembrandomäne (7TM) und einer intrazellulären Region (ICR) auf. Eine Besonderheit stellt hierbei die außergewöhnliche Größe der ECR, welche über vielfältige Domänen mit zellulären und matrixgebundenen Liganden interagieren, dar. Zusätzlich umfasst die ECR eine sogenannte GPCR Autoproteolyse-induzierende (GAIN) Domäne, an welcher während der Proteinreifung eine autoproteolytische Spaltung stattfindet. Diese Spaltung führt zur Entstehung eines N-terminalen (NTF) und C-terminalen Fragmentes (CTF), welche mittels hydrophober Wechselwirkung eine Einheit an der Zelloberfläche und daher einen heterodimeren Rezeptor bilden. In der Vergangenheit zeigte sich, dass die ersten paar Aminosäuren des CTF als angebundener Agonist (TA) agieren und über die Interaktion mit der 7TM Domäne eine Aktivierung des Rezeptors vermitteln. Der molekulare Mechanismus, welcher die Wechselwirkung zwischen TA und 7TM Domänen fördert, ist jedoch weiterhin unbekannt. Diese Arbeit enthüllt einen neuartigen molekularen Mechanismus, welcher keine Dissoziation des NTF-CTF Komplexes benötigt, um eine Freisetzung des TA und damit eine Aktivierung des aGPCR zu gewährleisten. Mittels der Einbringung von bioorthogonalen Markierungen in rezeptorsignalisierungs-relevante Bereiche des TA von diversen aGPCRs, wurde gezeigt, dass dieser innerhalb der intakten GAIN Domäne freizugänglich vorliegt. Dies lässt auf eine strukturelle Flexibilität der GAIN Domäne schließen, welche eine Rezeptoraktivierung unabhängig von der NTF-CTF Dissoziation erlaubt, wie sie auch bei spaltungsdefizienten aGPCR Varianten vorzufinden ist. Des Weiteren zeigt die vorliegende Arbeit, dass sich die zelluläre Lokalisation und die Konformation der 7TM Domäne abhängig vom Aktivitätszustand des aGPCR ist, was wiederrum daraufhin deutet, dass der TA über die Interaktion mit der 7TM Domäne eine Konformationsänderung vermittelt, welche letztendlich die Rezeptoraktivität reguliert. Zudem zeigten biochemische Analysen, dass neben der GAIN Domänen-vermittelten Autoproteolyse des humanen aGPCRs CD97 (ADGRE5/E5) weitere proteolytische Spaltungen innerhalb des Rezeptors stattfinden. Dies deutet daraufhin, dass aGPCRs Spaltungskaskaden durchlaufen, welche über die autoproteolytischen Reaktion der GAIN Domäne initialisiert werden. Dadurch kann angenommen werden, dass aGPCRs zusätzlichen proteolytischen Ereignissen unterliegen. Schlussendlich konnte mittels diverser Markierungsverfahren die konstitutive Internalisierung des NTF und des CTF von E5 nachgewiesen werden. Es war möglich beide Fragmente unabhängig voneinander zu markieren und deren subzelluläre Lokalisation in vitro zu verfolgen. Zusammenfassend tragen die gewonnen Ergebnisse zu einem besseren Verständnis der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen in Bezug auf Aktivität und Signalübertragung von aGPCRs bei. KW - G-Protein gekoppelter Rezeptor KW - Labeling KW - Functional analyses KW - Adhesion GPCR Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207068 ER - TY - THES A1 - Andreska, Thomas T1 - Effects of dopamine on BDNF / TrkB mediated signaling and plasticity on cortico-striatal synapses T1 - Effekte von Dopamin auf BDNF / TrkB vermittelte Signalwege und Plastizität an cortico-striatalen Synapsen N2 - Progressive loss of voluntary movement control is the central symptom of Parkinson's disease (PD). Even today, we are not yet able to cure PD. This is mainly due to a lack of understanding the mechanisms of movement control, network activity and plasticity in motor circuits, in particular between the cerebral cortex and the striatum. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) has emerged as one of the most important factors for the development and survival of neurons, as well as for synaptic plasticity. It is thus an important target for the development of new therapeutic strategies against neurodegenerative diseases. Together with its receptor, the Tropomyosin receptor kinase B (TrkB), it is critically involved in development and function of the striatum. Nevertheless, little is known about the localization of BDNF within presynaptic terminals in the striatum, as well as the types of neurons that produce BDNF in the cerebral cortex. Furthermore, the influence of midbrain derived dopamine on the control of BDNF / TrkB interaction in striatal medium spiny neurons (MSNs) remains elusive so far. Dopamine, however, appears to play an important role, as its absence leads to drastic changes in striatal synaptic plasticity. This suggests that dopamine could regulate synaptic activity in the striatum via modulation of BDNF / TrkB function. To answer these questions, we have developed a sensitive and reliable protocol for the immunohistochemical detection of endogenous BDNF. We find that the majority of striatal BDNF is provided by glutamatergic, cortex derived afferents and not dopaminergic inputs from the midbrain. In fact, we found BDNF in cell bodies of neurons in layers II-III and V of the primary and secondary motor cortex as well as layer V of the somatosensory cortex. These are the brain areas that send dense projections to the dorsolateral striatum for control of voluntary movement. Furthermore, we could show that these projection neurons significantly downregulate the expression of BDNF during the juvenile development of mice between 3 and 12 weeks. In parallel, we found a modulatory effect of dopamine on the translocation of TrkB to the cell surface in postsynaptic striatal Medium Spiny Neurons (MSNs). In MSNs of the direct pathway (dMSNs), which express dopamine receptor 1 (DRD1), we observed the formation of TrkB aggregates in the 6-hydroxydopamine (6-OHDA) model of PD. This suggests that DRD1 activity controls TrkB surface expression in these neurons. In contrast, we found that DRD2 activation has opposite effects in MSNs of the indirect pathway (iMSNs). Activation of DRD2 promotes a rapid decrease in TrkB surface expression which was reversible and depended on cAMP. In parallel, stimulation of DRD2 led to induction of phospho-TrkB (pTrkB). This effect was significantly slower than the effect on TrkB surface expression and indicates that TrkB is transactivated by DRD2. Together, our data provide evidence that dopamine triggers dual modes of plasticity on striatal MSNs by acting on TrkB surface expression in DRD1 and DRD2 expressing MSNs. This surface expression of the receptor is crucial for the binding of BDNF, which is released from corticostriatal afferents. This leads to the induction of TrkB-mediated downstream signal transduction cascades and long-term potentiation (LTP). Therefore, the dopamine-mediated translocation of TrkB could be a mediator that modulates the balance between dopaminergic and glutamatergic signaling to allow synaptic plasticity in a spatiotemporal manner. This information and the fact that TrkB is segregated to persistent aggregates in PD could help to improve our understanding of voluntary movement control and to develop new therapeutic strategies beyond those focusing on dopaminergic supply. N2 - Der fortschreitende Verlust der willkürlichen Bewegungskontrolle ist ein zentrales Symptom der Parkinson-Krankheit (PD). Auch heute sind wir noch nicht in der Lage, PD zu heilen. Dafür verantwortlich ist hauptsächlich ein mangelndes Verständnis von Mechanismen der Bewegungskontrolle, Netzwerkaktivität und Plastizität in motorischen Schaltkreisen, insbesondere zwischen Hirnrinde und Striatum. Der neurotrophe Faktor BDNF ist einer der wichtigsten Faktoren für die Entwicklung und das Überleben von Neuronen sowie für synaptische Plastizität im zentralen Nervensystem. BDNF ist daher ein Target für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien gegen neurodegenerative Erkrankungen. Zusammen mit seinem Rezeptor, der Tropomyosin-Rezeptorkinase B (TrkB), ist BDNF maßgeblich an der Entwicklung und Funktion des Striatums beteiligt. Dennoch ist nur wenig bekannt, wo BDNF an Synapsen im Striatum lokalisiert ist, und wo BDNF in Neuronen der Hirnrinde synthetisiert wird. Außerdem ist der Einfluss von Dopamin aus dem Mittelhirn auf die Kontrolle der BDNF / TrkB-Interaktion in striatalen Medium-Spiny-Neuronen (MSNs) bisher unklar. Dopamin scheint jedoch eine wichtige Rolle zu spielen, da dessen Abwesenheit zu drastischen Veränderungen der striatalen Plastizität führt. Dopamin könnte synaptische Plastizität im Striatum über eine Modulation der BDNF / TrkB-Interaktion regulieren. Um diese Fragen beantworten zu können, haben wir ein sensitives und zuverlässiges Protokoll für den immunhistochemischen Nachweis von endogenem BDNF entwickelt. Wir fanden heraus, dass BDNF im Striatum vor allem in glutamatergen Synapsen von Projektion aus dem Kortex lokalisiert ist und nicht in Terminalen dopaminerger Neurone aus dem Mittelhirn. Tatsächlich fanden wir BDNF in den Zellkörpern von Neuronen in den Schichten II-III und V des primären und sekundären motorischen Kortex sowie Schicht V des somatosensorischen Kortex. Es sind jene Hirnareale, welche dichte Projektionen zum dorsolateralen Striatum senden und entscheidend an der Steuerung von willkürlichen Bewegungen beteiligt sind. Weiterhin konnten wir zeigen, dass eben jene Projektionsneurone die Bildung von BDNF während der juvenilen Entwicklung von Mäusen zwischen 3 und 12 Wochen signifikant herunter regulieren. In striatalen MSN fanden wir zudem einen modulatorischen Effekt von Dopamin auf die Translokation von TrkB zur Zelloberfläche. In MSNs des direkten Signalweges (dMSNs), welche Dopaminrezeptor 1 (DRD1) exprimieren, konnten wir die Bildung von TrkB-Aggregaten im 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) - Rattenmodell der Parkinson Erkankung beobachten. Dies deutet darauf hin, dass die DRD1-Aktivität die TrkB-Oberflächenexpression in diesen Neuronen steuert. Im Gegensatz dazu fanden wir heraus, dass die DRD2-Aktivierung in MSNs des indirekten Signalweges (iMSNs) eine gegensätzliche Wirkung hat. Die Aktivierung von DRD2 führt zu einer schnellen Reduktion der TrkB-Oberflächenexpression, die reversibel und von cAMP abhängig ist. Außerdem führte die Stimulation von DRD2 zu einer Induktion von Phospho-TrkB (pTrkB). Dieser Effekt war deutlich langsamer als die Wirkung auf die TrkB-Oberflächenexpression und deutet auf eine Transaktivierung von TrkB über DRD2 hin. Insgesamt scheint Dopamin entgegengesetzte Plastizitätsmodi in striatalen MSNs auszulösen, indem es auf die TrkB-Oberflächenexpression in DRD1- und DRD2-exprimierenden MSNs einwirkt. Diese Oberflächenexpression des Rezeptors ist entscheidend für die Bindung von BDNF, welches aus kortiko-striatalen Afferenzen freigesetzt wird. Dies führt zur Induktion von TrkB-vermittelten-Signaltransduktionskaskaden und Langzeitpotenzierung (LTP). Daher könnte die dopamin-vermittelte Translokalisation von TrkB das Gleichgewicht zwischen dopaminergen und glutamatergen Signalen modulieren, um die synaptische Plastizität in einer räumlich-zeitlich abgestimmten Weise zu ermöglichen. Diese Information und die Tatsache, dass TrkB bei PD stabile Aggregate bildet, könnte dazu beitragen, unser Verständnis der willkürlichen Bewegungskontrolle zu verbessern und neue therapeutische Strategien zu entwickeln, die über jene hinausgehen, welche sich auf die dopaminerge Versorgung konzentrieren. KW - Brain-derived neurotrophic factor KW - Parkinson Krankheit KW - Plastizität KW - Motorisches Lernen KW - Basalganglien KW - Brain-derived neurotrophic factor KW - TrkB KW - Basal Ganglia KW - Motor learning KW - Parkinson's disease KW - Synaptic plasticity KW - Striatum KW - Medium spiny neurons KW - Cortico-striatal projection neurons Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174317 ER - TY - THES A1 - Anton, Selma T1 - Characterization of cAMP nanodomains surrounding the human Glucagon-like peptide 1 receptor using FRET-based reporters T1 - Charakterisierung der Rezeptor-assoziierten cAMP Nanodomänen des humanen Glucagon-like peptide 1 Rezeptors mittels FRET-basierter Sensoren N2 - Cyclic adenosine monophosphate (cAMP), the ubiquitous second messenger produced upon stimulation of GPCRs which couple to the stimulatory GS protein, orchestrates an array of physiological processes including cardiac function, neuronal plasticity, immune responses, cellular proliferation and apoptosis. By interacting with various effector proteins, among others protein kinase A (PKA) and exchange proteins directly activated by cAMP (Epac), it triggers signaling cascades for the cellular response. Although the functional outcomes of GSPCR-activation are very diverse depending on the extracellular stimulus, they are all mediated exclusively by this single second messenger. Thus, the question arises how specificity in such responses may be attained. A hypothesis to explain signaling specificity is that cellular signaling architecture, and thus precise operation of cAMP in space and time would appear to be essential to achieve signaling specificity. Compartments with elevated cAMP levels would allow specific signal relay from receptors to effectors within a micro- or nanometer range, setting the molecular basis for signaling specificity. Although the paradigm of signaling compartmentation gains continuous recognition and is thoroughly being investigated, the molecular composition of such compartments and how they are maintained remains to be elucidated. In addition, such compartments would require very restricted diffusion of cAMP, but all direct measurements have indicated that it can diffuse in cells almost freely. In this work, we present the identification and characterize of a cAMP signaling compartment at a GSPCR. We created a Förster resonance energy transfer (FRET)-based receptor-sensor conjugate, allowing us to study cAMP dynamics in direct vicinity of the human glucagone-like peptide 1 receptor (hGLP1R). Additional targeting of analogous sensors to the plasma membrane and the cytosol enables assessment of cAMP dynamics in different subcellular regions. We compare both basal and stimulated cAMP levels and study cAMP crosstalk of different receptors. With the design of novel receptor nanorulers up to 60nm in length, which allow mapping cAMP levels in nanometer distance from the hGLP1R, we identify a cAMP nanodomain surrounding it. Further, we show that phosphodiesterases (PDEs), the only enzymes known to degrade cAMP, are decisive in constraining cAMP diffusion into the cytosol thereby maintaining a cAMP gradient. Following the discovery of this nanodomain, we sought to investigate whether downstream effectors such as PKA are present and active within the domain, additionally studying the role of A-kinase anchoring proteins (AKAPs) in targeting PKA to the receptor compartment. We demonstrate that GLP1-produced cAMP signals translate into local nanodomain-restricted PKA phosphorylation and determine that AKAP-tethering is essential for nanodomain PKA. Taken together, our results provide evidence for the existence of a dynamic, receptor associated cAMP nanodomain and give prospect for which key proteins are likely to be involved in its formation. These conditions would allow cAMP to exert its function in a spatially and temporally restricted manner, setting the basis for a cell to achieve signaling specificity. Understanding the molecular mechanism of cAMP signaling would allow modulation and thus regulation of GPCR signaling, taking advantage of it for pharmacological treatment. N2 - G Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen eine große und sehr vielfältige Familie an Membranproteinen dar, deren primäre Funktion die Signalübertragung von extrazellulären Stimuli in intrazelluläre Signale ist. Dank ihrer breiten Expression im gesamten menschlichen Körper regulieren sie unterschiedliche zelluläre Prozesse und damit deren physiologische Funktion, unter anderem die Sinnesempfindung, zelluläre Kommunikation und Neurotransmission. GPCRs stehen im Zusammenhang mit unterschiedlichen Erkrankungen wie Herzinsuffizienz, Krebs, neurologischen Funktionsstörungen und diverser metabolischer Krankheiten, weswegen sie als Ziele („Targets“) zur Behandlung verschiedener Erkrankungen erforscht und genutzt werden. Aufgrund ihrer Expression auf der Zelloberfläche sind sie leicht zugänglich, und die Diversität ihrer Liganden begünstigt zusätzlich ihre Nutzung als pharmakologische Targets. Heutzutage vermitteln bereits 30% aller weltweit zugelassenen Arzneistoffe ihre Wirkung an GPCRs. GPCRs üben ihre Funktion aus, indem sie hauptsächlich an G Proteine binden, welche wiederum die Produktion sogenannter second messenger in Gang setzen. cAMP ist das Hauptsignalmolekül der Rezeptoren, welche an das stimulatorische GS Protein koppeln. cAMP überträgt hunderte ankommende Signale in einer hochspezifischen Weise, indem es an unterschiedliche Effektorproteine bindet, welche sich in bestimmten zellulären Regionen befinden. Dadurch koordiniert dieses Signalmolekül eine Vielzahl zellulärer Prozesse, angefangen bei der Regulierung von Ionenkanalaktivität über die Kontraktilität glatter- und quergestreifter Muskulatur bis hin zur Genexpression, Zellproliferation und Apoptose. Durch die pleiotropen Effekte, welche durch cAMP reguliert werden, stellt sich die Frage, wie GS-gekoppelte Rezeptoren Signalspezifität erreichen, obwohl sie ihre Funktion durch dieses eine Signalmolekül ausführen. Ursprünglich ging man von einer uneingeschränkten Diffusion und dadurch homogenen Verteilung von cAMP in der Zelle aus. Diese Vorstellung ist jedoch nicht mit der Signalisierungsspezifität von GPCRs vereinbar, da unter diesen Umständen cAMP unselektiv all seine Effektorproteine in der gesamten Zelle aktivieren könnte. Daher entstand die Hypothese der cAMP-Kompartimentierung, wobei die Zelle lokal begrenzte Bereiche mit hohen oder niedrigen cAMP Konzentrationen umfassen würde. Jedoch gab es bisher keinerlei Beweise für die Existenz und die molekulare Zusammensetzung mutmaßlicher Domänen. Folglich setzten wir uns als Ziel, hochkonzentrierte cAMP-Kompartimente in der Zelle zu lokalisieren, ihre räumliche Dimension aufzuklären und ihre Rolle zur Realisierung zellulärer Signalisierungsspezifität zu ermitteln. Im Rahmen der vorliegenden Studie setzten wir einen Förster resonance energy transfer (FRET)-basierten cAMP Sensor ein, fusionierten ihn mit dem humanen glucagone-like peptide 1 Rezeptor (hGLP1R) als Prototyp eines GS-koppelnden Rezeptors, um cAMP am Ursprung des Signals zu messen. Mittels dieser Sensoren weisen wir eine Rezeptor-umgebende begrenzte cAMP Domäne nach, welche eine erhöhte cAMP Konzenztration aufweist (Figure ‎3.10). Bei Stimulation des Rezeptors mit GLP1 Konzenztrationen beginnend bei 10 fM entsteht eine Rezeptordomäne mit lokal erhöhten cAMP Konzentrationen, welche getrennt von Plasmamembran und Cytosol ist. Wir zeigen, dass das hGLP1R-Kompartiment geschützt ist vor cAMP Signalen, welche an weiteren, unabhängigen GS-gekoppelten Rezeptoren ihren Ursprung haben (Figure ‎3.11). Um die räumliche Dimension dieser Domäne zu untersuchen, verwendeten wir Nanolinker der Länge 30- und 60 nm als Abstandhalter zwischen Rezeptor und Sensor (Figure ‎3.12) und zeigen dabei, dass sich die Domäne über eine Länge von 60 Nanometern erstreckt, wobei ein abnehmender cAMP-Gradient erkennbar ist. Weiterhin beweisen wir, dass Phosphodiesterasen (PDEs) Schlüsselfaktoren für die Bildung des cAMP-Gradienten um den Rezeptor herum sind, indem sie die Diffusion ins Cytosol beschränken (Figure ‎3.13). Darüber hinaus zeigen wir (Figure ‎3.15), dass Rezeptor-spezifische cAMP Signale PKA-Phosphorylierung in der Rezeptordomäne auslösen und, dass AKAPs elementar für nanodomänen PKA-Aktivität sind, wohingegen die cytosolische PKA-Phosphorylierung unabhängig von AKAP-Targeting der PKA ist (Figure ‎3.16). Zusammenfassend beweisen unsere Ergebnisse die Existenz einer Rezeptor-umgebenden Nanodomäne mit erhöhten cAMP Spiegeln eines GS-gekoppelten Rezeptors. Zeitgleiche Studien in unserer Gruppe zeigen, dass cAMP in der Zelle weitgehend gebunden vorliegt und diffusionslimitiert ist. Dies stellt den Nachweis für eine eingeschränkte Diffusion als molekulare Voraussetzung für die Bildung von Signalkompartimenten dar. Wir gehen davon aus, dass unsere Ergebnisse ein Ausgangspunkt für die Aufklärung von Rezeptoren als Quelle für Signalkompartimente darstellen, jedoch bedarf es weiterer Studien, um die präzise molekulare Zusammensetzung und die beteiligten Proteine dieser Signaldomäne zu untersuchen. Das Grundverständnis der Signalisierungskaskaden auf molekularer Ebene könnte es uns ermöglichen, die zellulären Reaktionen zu manipulieren, um eine Fehlfunktion der Signalisierung in erkrankten Zellen wiederherzustellen. Da der hGLP1R entscheidend für Aufrechterhaltung ausgeglichener Blutglucosespiegel ist, würde die Erfassung der molekularen Details der kompartimentalisierten Signalübertragung die Feinabstimmung der Rezeptorsignale ermöglichen, um ihn als spezifisches Target zur Behandlung von Diabetes Mellitus einzusetzen. KW - FRET KW - cAMP KW - compartments KW - GPCR Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-190695 ER - TY - THES A1 - Auer, Daniela T1 - Impact of the chlamydial deubiquitinase ChlaDUB1 on host cell defense T1 - Einfluss der chlamydiellen Deubiquitinase ChlaDUB1 auf die Wirtszellabwehr N2 - The human pathogen Chlamydia trachomatis is the main cause of sexually transmitted infections worldwide. The obligate intracellular bacteria are the causative agent of several diseases that reach from conjunctivitis causing trachoma and blindness as well as salpingitis and urethritis which can lead to infertility if left untreated. In order to gain genetically engineered Chlamydia that inducible knock down specific gene expression, the CRISPRi system was established in C. trachomatis. In a proof of principle experiment it was shown that C. trachomatis pCRISPRi:gCdu1III target ChlaDUB1 expression and reduce the protein amount up to 50 %. Knock-down of the DUB did not influence protein levels of anti-apoptotic Mcl-1 and did not make cells susceptible for apoptosis. However, reduced dCas9 protein size, bacterial growth impairment and off target effects interfering with the GFP signal, form obstacles in CRISPRi system in Chlamydia. For routinely use of the CRISPRi method in C. trachomatis further investigation is needed. Since the bacterial life cycle includes two morphological and functional distinct forms, it is essential for chlamydial spread to complete the development cycle and form infectious progeny. Therefore, Chlamydia has evolved strategies to evade the host immune system in order to stay undetected throughout the developmental cycle. The bacteria prevent host cell apoptosis via stabilization of anti-apoptotic proteins like Mcl-1, Survivin and HIF-1α and activate pro-survival pathways, inhibiting invasion of immune cells to the site of infection. The host cell itself can destroy intruders via cell specific defense systems that involve autophagy and recruitment of professional immune cells. In this thesis the role of the chlamydial deubiuqitinase ChlaDUB1 upon immune evasion was elucidated. With the mutant strain Ctr Tn-cdu1 that encodes for a truncated DUB due to transposon insertion, it was possible to identify ChlaDUB1 as a potent opponent of the autophagic system. Mutant inclusions were targeted by K48 and K63 chain ubiquitination. Subsequently the inclusion was recognized by autophagic receptors like p62, NBR1 and NDP52 that was reversed again by complementation with the active DUB. Xenophagy was promoted so far as LC3 positive phagosomes formed around the inclusion of Ctr Tn-cdu1, which did not fuse with the lysosome. The detected growth defect in human primary cells of Chlamydia missing the active DUB was not traced back to autophagy, but was due to impaired development and replication. It was possible to identify Ankib1, the E3 ligase, that ubiquitinates the chlamydial inclusion in a siRNA based screen. The activating enzyme Ube1 and the conjugating enzyme Ube2L3 are also essential in this process. Chlamydia have a reduced genome and depend on lipids and nutrients that are translocated from the host cell to the inclusion to proliferate. Recruitment of fragmented Golgi stacks to the inclusion surface was prevented when ChlaDUB1 was inactive, probably causing diminished bacterial growth. Additionally, the modification of the inclusion by Ankib1 and subsequent decoration by autophagic markers was not only present in human but also murine cells. Comparison of other Chlamydia strains and species revealed Ankib1 to be located at the proximity of the inclusion in C. trachomatis strains only but not in C. muridarum or C. pneumoniae, indicating that Ankib1 is specifically the E3 ligase of C. trachomatis. Moreover, the role of ChlaDUB1 in infected tissue was of interest, since ChlaDUB1 protein was also found in early EB stage and so might get in contact with invading immune cells after cell lysis. While bacteria spread and infect new host cells, Chlamydia can also infect immune cells. Infection of human neutrophils with Ctr Tn-cdu1 shows less bacterial survival and affirms the importance of the DUB for bacterial fitness in these cells. N2 - Chlamydia trachomatis ist weltweit der häufigste Auslöser von sexuell übertragenen Krankheiten. Das obligat intrazelluläre Bakterium manifestiert sich in diversen Krankheitsbildern, darunter Konjunktivitis, die zu einem Trachom oder sogar Erblindung führen kann und Salpingitis oder Urethritis, die unbehandelt unfruchtbar macht. Das CRISPRi System wurde in C. trachomatis etabliert, um genetisch veränderte Bakterien zu bekommen, in denen induzierbar die spezifische Genexpression herunter gefahren werden kann. Es wurde gezeigt, dass in C. trachomatis pCRISPRi:gCdu1III, einem Stamm, der mit der Genexpression von ChlaDUB1 interferiert, die Menge an ChlaDUB1 um bis zu 50 % reduziert ist. Die Sensitivität für Apoptose durch sinkende Mcl-1 Proteinmengen wurde dadurch jedoch nicht wieder hergestellt. Das verkürzte dCas9 Protein, vermindertes bakterielles Wachstum, sowie Effekte auf andere Genexpressionen, wie z.B. das GFP Signal zeigen die Problematik des CRISPRi Systems in C. trachomatis. Um CRISPRi als Routinemethode für genetische Transformation in Chlamydien zu etablieren, stehen noch weitere Untersuchungen an. Der Lebenszyklus von Chlamydien zeichnet sich durch zwei morphologisch und funktionell unterschiedliche Stadien aus, weshalb die Vollendung des Lebenszyklus und die Produktion infektiöser Partikel essenziell sind. Daher haben die Pathogene Strategien entwickelt, um dem Immunsystem des Wirts zu entgehen und sich unerkannt in der Zelle zu entwickeln. Die Bakterien verhindern Apoptose infizierter Zellen durch die Stabilisierung von anti-apoptotischen Proteinen wie Mcl-1, Survivin und HIF-1α und aktivieren Überlebens-Signalwege, die die Invasion von Immunzellen in das infizierte Gewebe unterdrücken. Die Wirtszelle selbst ist in der Lage bakterielle Eindringlinge durch die eigenen Abwehrmechanismen wie Autophagie und die Rekrutierung von professionellen Immunzellen zu zerstören. In dieser Arbeit wurde die Rolle der chlamydiellen Deubiquitinase ChlaDUB1 auf die Vermeidungsstrategien vor dem Immunsystem untersucht. Mit Hilfe der Mutante Ctr Tn-cdu1, die durch Insertion eines Transposons für eine verkürzte und inaktive Deubiquitinase codiert, konnte gezeigt werden, dass ChlaDUB1 ein Gegenspieler des Autophagiesystems ist. Die Inklusionen der Mutante wurden mit K48 und K63 Ubiquitinketten modifiziert, was die Rekrutierung von Autophagiemarkern wie p62, NBR1 und NDP52 zur Folge hatte. Die Rekomplementierung mit aktivem ChlaDUB1 Protein hob die Modifikation der Inklusion wieder auf. Jedoch wurde die Xenophagie so weit vorangetrieben, bis sich LC3 positive Phagosomen um die Inklusionen von Ctr Tn-cdu1 bildeten, die allerdings nicht mit dem Lysosom verschmolzen. Das beobachtete Wachstumsdefizit in Chlamydien, die keine funktionelle Deubiquitinase exprimieren, konnte nicht auf die Autophagie zurückgeführt werden, sondern war voraussichtlich aufgrund verlangsamter Entwicklung und Replikation entstanden. In einem siRNA basierten Experiment konnte die E3 Ligase Ankib1 für die Ubiquitinierung der Ctr Tn-cdu1 Inklusion identifiziert werden. Des Weiteren sind das Ubiquitin aktivierende Enzym Ube1 und das Ubiquitin konjugierende Enzym Ube2L3 essentiell für die Modifikation der Inklusion. Da Chlamydien ein reduziertes Genom haben und nicht für alle Enzyme selbst kodieren, sind sie auf Lipide und Metabolite der Wirtszelle für ihr Wachstum angewiesen. Die Rekrutierung der fragmentierten Glogi-Membranen zur Inklusionsoberfläche wurde durch inaktives ChlaDUB1 Protein verhindert, das wahrscheinlich die bakterielle Entwicklung negativ beeinflusst. Des Weiteren ubiquitinierte Ankib1 nicht nur Inklusionen in humanen, sondern auch in murinen Zellen, was auch hier die Bindung von Autophagiemarkern zur Folge hatte. Der Vergleich unter verschiedenen chlamydiellen Serotypen und Arten zeigte, dass Ankib1 nur an Inklusionen von C. trachomatis zu finden war, nicht aber für C. muridarum oder C. pneumoniae. Des Weitern wurde die Rolle von ChlaDUB1 in infiziertem Gewebe genauer betrachtet, da die Protease auch während frühen EB Phasen nachgewiesen wurde, in denen sie Kontakt zu immigrierenden Immunzellen haben könnte. Während der Zelllyse werden Bakterien frei gesetzt, die neue Wirtszellen, aber auch Immunzellen, infizieren können. Die Infektion von humanen Neutrophilen mit Ctr Tn-cdu1 zeigte vermindertes bakterielles Wachstum und verdeutlicht die Bedeutung von ChlaDUB1 für das Überleben in diesen Immunzellen. KW - Chlamydia KW - Golgi KW - ChlaDUB1 KW - Cdu1 Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178462 ER - TY - THES A1 - Aurbach, Katja T1 - Studies on the role of the cytoskeleton in platelet production T1 - Studien über die Rolle des Zytoskeletts in der Produktion von Thrombozyten N2 - Platelets are small anucleated cell fragments that originate from megakaryocytes (MKs), which are large cells located in the bone marrow (BM). MKs extend long cytoplasmic protrusions, a process which is called proplatelet formation, into the lumen of the sinusoidal vessels where platelets are sized by the bloodstream. During the process of platelet biogenesis, segments of the MK penetrate the endothelium and, through cytoskeletal remodeling inside the MK, proplatelet fragments are released. Rho GTPases, such as RhoA and RhoB, are critically involved in cytoskeletal rearrangements of both the actin and the tubulin cytoskeleton. The first part of this thesis concentrated on the protein RhoB and its involvement in cytoskeletal organization in MKs and platelets. Single knockout (KO) mice lacking RhoB had a minor microthrombocytopenia, which means a smaller platelet size and reduced platelet number, accompanied by defects in the microtubule cytoskeleton in both MKs and platelets. In particular, tubulin organization and stability, which is regulated by posttranslational modifications of α-tubulin, were disturbed in RhoB-/- platelets. In contrast, RhoB-/- MKs produced abnormally shaped proplatelets but had unaltered posttranslational modifications of α-tubulin. The second part focused on the influence of RhoA and RhoB on MK localization and platelet biogenesis in murine BM. Many intact RhoA-/- MKs are able to transmigrate through the endothelial layer and stay attached to the vessel wall, whereas only 1% of wildtype (wt) MKs are detectable in the intrasinusoidal space. Concomitant deficiency of RhoA and RhoB reverts this transmigration and results in macrothrombocytopenia, MK clusters around the vessel in the BM and defective MK development. The underlying mechanism that governs MKs to distinct localizations in the BM is poorly understood, thus this thesis suggests that this process may be dependent on RhoB protein levels, as RhoA deficiency is coincided with increased RhoB levels in MKs and platelets. The third part of this thesis targeted the protein PDK1, a downstream effector of Rho GTPases, in regard to MK maturation and polarization throughout thrombopoiesis. MK- and platelet-specific KO in mice led to a significant macrothrombocytopenia, impaired actin cytoskeletal reorganization during MK spreading and proplatelet formation, with defective MK maturation. This was associated with decreased PAK activity and, subsequently, phosphorylation of its substrates LIMK and Cofilin. Together, the observations of this thesis highlight the importance of Rho GTPases and their downstream effectors on the regulation of the MK and platelet cytoskeleton. N2 - Thrombozyten sind kleine Zellfragmente ohne Zellkern, die von Megakaryozyten (MKs) produziert werden. MKs sind riesige Zellen im Knochenmark, welche lange zytoplasmatische Ausläufer in die sinusoidalen Blutgefäße strecken, woraus durch den Blutstrom Thrombozyten abgeschnürt werden. Während der Thrombozyten-Biogenese penetrieren Teile des MKs das Endothel und durch zytoskeletales Umorganisieren innerhalb des MKs werden Proplättchen-Fragmente gebildet. Rho GTPasen wie die Proteine RhoA und RhoB sind maßgebliche Regulatoren des Zytoskeletts, sowohl des Aktins als auch des Tubulin Zytoskeletts. Der erste Teil dieser Thesis konzentrierte sich auf das Protein RhoB und dessen Einfluss auf die Organisation des Zytoskeletts. Mäuse mit einer Defizienz für das Protein RhoB zeigen eine Microthrombozytopenie und eine Reduktion der Thrombozytenzahl und -größe. Dies ist begleitet von Defekten des Mikrotubuli Zytoskeletts sowohl in MKs als auch in Blutplättchen. In Thrombozyten waren insbesondere Tubulin Organisation und Stabilisation betroffen, welche durch posttranslationale Modifizierungen von α-Tubulin bestimmt wurde. RhoB-negative MKs hingegen produzierten abnormal geformte Proplättchen, hatten jedoch unveränderte posttranslationale Modifizierungen von α-Tubulin. Der zweite Teil dieser Thesis fokussierte sich auf den Einfluss von RhoA und RhoB auf die Lokalisation von MKs im Knochenmarkt von Mäusen. Eine große Anzahl von RhoA-negativen MKs können durch das Endothel in die Blutgefäße wandern und bleiben dort adhärent, während nur etwa 1% wildtypischer MKs am Blutgefäß detektierbar sind. Gleichzeitige Defizienz von RhoA und RhoB revertiert die Translokation von RhoA-negativen MKs und führt in Mäusen zu Makrothrombozytopenie, die Formierung von MK Clustern um die Gefäßwand im Knochenmarkt und eine fehlerhafte MK Entwicklung. Der Mechanismus, der MKs zu bestimmten Positionen im Knochenmarkt führt, ist bisher kaum verstanden. In dieser Thesis konnte gezeigt werden, dass dieser Prozess von dem Level an RhoB Protein abhängig sein könnte, da eine Defizienz von RhoA zu einer Hochregulierung von RhoB in MKs und Thrombozyten führte. Der dritte Teil dieser Thesis zielte auf ein Signalprotein der Rho GTPasen ab, dem Protein PDK1. Es wurde die Rolle von PDK1 in der Regulation von MK Reifung und Polarisation während der Bildung von Thrombozyten untersucht. Ein MK und Thrombozyten spezifischer KO von PDK1 führte zu einer signifikanten Makrothrombozytopenie, einem gestörten Aktin Zytoskelett, während des MK Spreadings und der Proplättchen Bildung, begleitet von einer fehlerhaften MK Reifung. Dies war mit einer Reduktion in der Aktivität von PAK und folglich dem Phosphorylierungsstatus seiner Substrate LIMK und Cofilin assoziiert. Die Beobachtungen dieser Doktorarbeit arbeiteten die Relevanz von Rho GTPasen und ihren Signalproteinen für die Regulation des MK und Thrombozyten Zytoskelettes im Maus-Modell hervor. KW - Megakaryozyt KW - Thrombozyt KW - Zellskelett KW - Thrombopoiesis KW - Cytoskeleton Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-234669 ER - TY - THES A1 - Babu, Dinesh Kumar T1 - Efficient Data Fusion Approaches for Remote Sensing Time Series Generation T1 - Effiziente Datenfusionsansätze für die Generierung von Fernerkundungszeitreihen N2 - Fernerkundungszeitreihen beschreiben die Erfassung von zeitlich gleichmäßig verteilten Fernerkundungsdaten in einem festgelegten Zeitraum entweder global oder für ein vordefiniertes Gebiet. Für die Überwachung der Landwirtschaft, die Erkennung von Veränderungen der Phänologie oder für das Umwelt-Monitoring werden nahezu tägliche Daten mit hoher räumlicher Auflösung benötigt. Bei vielen verschiedenen fernerkundlichen Anwendungen hängt die Genauigkeit von der dichte und der Verlässlichkeit der fernerkundlichen Datenreihe ab. Die verschiedenen Fernerkundungssatellitenkonstellationen sind immer noch nicht in der Lage, fast täglich oder täglich Bilder mit hoher räumlicher Auflösung zu liefern, um die Bedürfnisse der oben erwähnten Fernerkundungsanwendungen zu erfüllen. Einschränkungen bei den Sensoren, hohe Entwicklungskosten, hohe Betriebskosten der Satelliten und das Vorhandensein von Wolken, die die Sicht auf das Beobachtungsgebiet blockieren, sind einige der Gründe, die es sehr schwierig machen, fast tägliche oder tägliche optische Fernerkundungsdaten mit hoher räumlicher Auflösung zu erhalten. Mit Entwicklungen bei den optischen Sensorsystemen und gut geplanten Fernerkundungssatellitenkonstellationen kann dieser Zustand verbessert werden, doch ist dies mit Kosten verbunden. Selbst dann wird das Problem nicht vollständig gelöst sein, so dass der wachsende Bedarf an zeitlich und räumlich hochauflösenden Daten nicht vollständig gedeckt werden kann. Da der Datenerfassungsprozess sich auf Satelliten stützt, die physische Systeme sind, können diese aus verschiedenen Gründen unvorhersehbar ausfallen und einen vollständigen Verlust der Beobachtung für einen bestimmten Zeitraum verursachen, wodurch eine Lücke in der Zeitreihe entsteht. Um den langfristigen Trend der phänologischen Veränderungen aufgrund der sich schnell ändernden Umweltbedingungen zu beobachten, sind die Fernerkundungsdaten aus der gegenwärtig nicht ausreichend. Hierzu werden auch Daten aus der Vergangenheit benötigt. Eine bessere Alternativlösung für dieses Problem kann die Erstellung von Fernerkundungszeitreihen durch die Fusion von Daten mehrerer Fernerkundungssatelliten mit unterschiedlichen räumlichen und zeitlichen Auflösungen sein. Dieser Ansatz soll effektiv und effizient sein. Bei dieser Methode kann ein zeitlich und räumlich hoch aufgelöstes Bild von einem Satelliten, wie Sentinel-2 mit einem zeitlich und räumlich niedrig aufgelösten Bild von einem Satelliten, wie Sentinel-3 fusioniert werden, um synthetische Daten mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zu erzeugen. Die Erzeugung von Fernerkundungszeitreihen durch Datenfusionsmethoden kann sowohl auf die gegenwärtig erfassten Satellitenbilder als auch auf die in der Vergangenheit von den Satelliten aufgenommenen Bilder angewandt werden. Dies wird die dringend benötigten zeitlich und räumlich hochauflösenden Bilder für Fernerkundungsanwendungen liefern. Dieser vereinfachte Ansatz ist kosteneffektiv und bietet den Forschern die Möglichkeit, aus der begrenzten Datenquelle, die ihnen zur Verfügung steht, die für ihre Anwendung benötigten Daten selbst zu generieren. Ein effizienter Datenfusionsansatz in Kombination mit einer gut geplanten Satellitenkonstellation kann ein Lösungsansatz sein, um eine nahezu tägliche Zeitreihen von Fernerkundungsdaten lückenlos gewährleistet. Ziel dieser Forschungsarbeit ist die Entwicklung eines effizienten Datenfusionsansatzes, um dichte Fernerkundungszeitreihen zu erhalten. N2 - Remote sensing time series is the collection or acquisition of remote sensing data in a fixed equally spaced time period over a particular area or for the whole world. Near daily high spatial resolution data is very much needed for remote sensing applications such as agriculture monitoring, phenology change detection, environmental monitoring and so on. Remote sensing applications can produce better and accurate results if they are provided with dense and accurate time series of data. The current remote sensing satellite architecture is still not capable of providing near daily or daily high spatial resolution images to fulfill the needs of the above mentioned remote sensing applications. Limitations in sensors, high development, operational costs of satellites and presence of clouds blocking the area of observation are some of the reasons that makes near daily or daily high spatial resolution optical remote sensing data highly challenging to achieve. With developments in the optical sensor systems and well planned remote sensing satellite constellations, this condition can be improved but it comes at a cost. Even then the issue will not be completely resolved and thus the growing need for high temporal and high spatial resolution data cannot be fulfilled entirely. Because the data collection process relies on satellites which are physical system, these can fail unpredictably due to various reasons and cause a complete loss of observation for a given period of time making a gap in the time series. Moreover, to observe the long term trend in phenology change due to rapidly changing environmental conditions, the remote sensing data from the present is not just sufficient, the data from the past is also important. A better alternative solution for this issue can be the generation of remote sensing time series by fusing data from multiple remote sensing satellite which has different spatial and temporal resolutions. This approach will be effective and efficient. In this method a high temporal low spatial resolution image from a satellite such as Sentinel-2 can be fused with a low temporal and high spatial resolution image from a satellite such as the Sentinel-3 to generate a synthetic high temporal high spatial resolution data. Remote sensing time series generation by data fusion methods can be applied to the satellite images captured currently as well as the images captured by the satellites in the past. This will provide the much needed high temporal and high spatial resolution images for remote sensing applications. This approach with its simplistic nature is cost effective and provides the researchers the means to generate the data needed for their application on their own from the limited source of data available to them. An efficient data fusion approach in combination with a well planned satellite constellation can offer a solution which will ensure near daily time series of remote sensing data with out any gap. The aim of this research work is to develop an efficient data fusion approaches to achieve dense remote sensing time series. KW - Remote sensing KW - Spatial resolution KW - Time Series KW - Data Fusion KW - Optical remote sensing data KW - Temporal Resolution KW - High resolution data KW - moderate resolution data KW - low resolution data Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251808 ER - TY - THES A1 - Bachmann, Julia T1 - Role of Adipose-Derived Stromal/Stem Cells in Cell-Assisted Lipotransfer – Characterization of their Secretory Capacity under Ischemia-Like Stress Conditions and Establishment of a 3D Adipose Tissue-ASC Co-Culture T1 - Bedeutung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe für den zellassistierten Lipotransfer – Charakterisierung der Sekretionskapazität unter Ischämie-artigen Stressbedingungen und Etablierung einer 3D Fettgewebe-ASC-Kokultur N2 - The use of human adipose-derived mesenchymal stem cells (ASCs) for cell-based therapeutic approaches, in terms of repair and regeneration of various tissues and organs, offers an alternative therapeutic tool in the field of regenerative medicine. The ability of ASCs to differentiate along mesenchymal lineages is not the only property that makes these cells particularly attractive for therapeutic purposes. Their promising functions in promoting angiogenesis, reducing inflammation as well as in functional tissue restoration are largely related to the trophic effects of a broad panel of secreted cytokines and growth factors. However, in cell-based approaches, the cell-loaded construct often is exposed to an ischemic microenvironment characterized by severe oxidative and nutritional stress after transplantation due to the initial lack of vascular connection, resulting in reduced cell viability and altered cell behaviour. Therefore, the effective use of ASCs in regenerative medicine first requires a comprehensive characterization of the cells in terms of their viability, differentiation capacity and especially their secretory capabilities under ischemia-mimicking conditions in order to better understand their beneficial role. Accordingly, in the first part of this work, ASCs were investigated under different ischemic conditions, in which cells were exposed to both glucose and oxygen deprivation, with respect to viability and secretory function. Using mRNA gene expression analysis, significantly higher expression of selected angiogenic, anti-apoptotic and immunomodulatory factors (IL-6, VEGF, STC-1) could be demonstrated under harsh ischemic conditions. These results were reflected at the protein expression level by a significantly increased secretion of these factors. For stanniocalcin-1 (STC-1), a factor not yet described in ASCs, a particularly high expression with significant secreted amounts of the protein could be demonstrated under harsh ischemic conditions. Thus, the first part of this work, in addition to the characterization of the viability, provided first insights into the secretory response of ASCs under ischemic conditions. The response of ASCs to glucose deficiency in combination with severe hypoxia has been little explored to date. Thus, the focus of the second part of this work was on a more detailed investigation of the secretory response of ASCs under glucose and oxygen deprivation. For a more comprehensive analysis of the secretion profile, a cytokine antibody array was performed, which allowed the detection of a broad panel of secreted angiogenic factors (IL-8, ANG), matrix-regulating proteins (TIMP-1, TIMP-2), chemokines (MCP-1/CCL2, IP-10/CXCL 10) and other factors under ischemic conditions. To verify these results, selected factors were examined using ELISA. The analysis revealed that the secretion of individual factors (e.g., STC-1, VEGF) was significantly upregulated by the combination of glucose and oxygen deprivation compared to oxygen deprivation alone. In order to investigate the impact of the secretome of ischemic ASCs on cell types involved in tissue regeneration, the effect of conditioned medium of ischemia-challenged ASCs on both endothelial cells and fibroblasts was investigated in subsequent experiments. Significantly increased viability and tube formation of endothelial cells as well as activated migration of fibroblasts by the secreted factors of ischemic ASCs could be demonstrated. A direct correlation of these effects to STC-1, which was significantly upregulated under ischemic conditions and has been described as a regulator of key cellular functions, could not be verified. The particular secretory capacity of ASCs provides a valuable tool for cell-based therapies, such as cell-assisted lipotransfer (CAL), where by enriching fat grafts with isolated ASCs, a significantly improved survival rate of the transplanted construct is achieved with less resorption of the fat tissue as well as a reduction in adverse implications, such as fibrosis and cyst formation. In order to better understand the function of ASCs in CAL, an autologous transwell-based lipograft-ASC co-culture was established in the last part of this work, in which first investigations showed a markedly increased secretion of VEGF compared to lipografts without added ASCs. As the stability rate of the fat tissue and thus the success of CAL is presumably also dependent on the preparation of the tissue before transplantation, the conventional preparation method of fat tissue for vocal fold augmentation in laryngoplasty was additionally evaluated in vitro in a pilot experiment. By analyzing the viability and tissue structure of the clinically prepared injection material, a large number of dead cells and a clearly damaged tissue structure with necrotic areas could be demonstrated. In comparison, the preparation method of the fat tissue established in this work as small tissue fragments was able to provide a clearly intact, vital, and vascularized tissue structure. This type of adipose tissue preparation represents a promising alternative for clinical vocal fold augmentation. In conclusion, the results of this work contribute to a comprehensive characterization of ASCs under ischemic conditions, such as those prevalent at the transplantation site or in tissue regeneration. The results obtained, especially on the secretory capacity of ASCs, provide new insights into how ASCs mediate regenerative effects in an ischemic milieu and why their use for therapeutic purposes is highly attractive and promising. N2 - Der Einsatz von humanen mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe (ASCs) für zell-basierte Therapieansätze zur Reparatur und Regeneration von verschiedenen Geweben und Organen bietet eine alternative therapeutische Lösung im Bereich der regenerativen Medizin. Die Fähigkeit der ASCs zur Differenzierung in verschiedene mesenchymale Zelltypen ist jedoch nicht die einzige Eigenschaft, die diese Zellen für therapeutische Zwecke besonders attraktiv macht. ASCs sezernieren vielmehr ein breites Spektrum an Zytokinen und Wachstumsfaktoren, die z.B. durch Förderung der Angiogenese oder der Reduktion von Entzündungsprozessen eine wichtige Rolle bei regenerativen Therapien spielen können. Allerdings ist in zellbasierten Ansätzen, das zellbeladene Konstrukt nach der Transplantation – durch den anfänglich fehlenden Gefäßanschluss und die damit einhergehende mangelnde Versorgung des implantierten Gewebes – starkem oxidativem und ernährungsbedingtem Stress, einem ischämischen Milieu, ausgesetzt, was zu einer reduzierten Zellviabilität und einem veränderten Zellverhalten führt. Der effektive Einsatz der ASCs in der regenerativen Medizin erfordert demnach zunächst eine umfassende Charakterisierung der Zellen in Bezug auf deren Lebensfähigkeit, Differenzierungsfähigkeit und insbesondere die sekretorischen Fähigkeiten unter simulierten ischämischen Bedingungen, um ihren therapeutischen Effekt besser verstehen und optimieren zu können. Dazu wurden im ersten Teil dieser Arbeit die ASCs unter verschiedenen ischämischen Bedingungen, bei denen die Zellen sowohl einem Glukose- als auch Sauerstoffmangel ausgesetzt waren, hinsichtlich der Viabilität und der sekretorischen Funktion in vitro untersucht. Durch mRNA Genexpressionsanalysen konnte für ausgewählte angiogene, anti-apoptotische und immunmodulatorische Faktoren (IL-6, VEGF, STC-1) eine signifikant höhere Expression unter stark ischämischen Bedingungen gezeigt werden. Diese Ergebnisse spiegelten sich gleichermaßen auf Proteinebene durch eine signifikant erhöhte Sekretion der Faktoren wider. Für Stanniocalcin-1 (STC-1), einen Faktor, dessen Rolle bislang im Zusammenhang mit ASCs noch nicht beschrieben ist, konnte eine besonders hohe Expression mit signifikanten sezernierten Mengen des Proteins bei hoher ischämischer Belastung der Zellen gezeigt werden. Somit konnten im ersten Abschnitt der Arbeit neben einer ersten Charakterisierung der ASCs auch erste Erkenntnisse über das sekretorische Verhalten der Zellen in einem ischämischen Milieu gewonnen werden. Die Reaktion von ASCs auf Glukosemangel in Kombination mit Hypoxie ist bislang wenig untersucht. Somit lag der Fokus im zweiten Teil dieser Arbeit auf der detaillierteren Untersuchung des Sekretionsverhaltens von ASCs unter Glucose- und Sauerstoffdeprivation. Für eine umfassende Analyse des Sekretionsprofils wurde ein Zytokin-Antikörper-Array durchgeführt, mit welchem die Sekretion eines breiten Panels von angiogenen Faktoren (IL-8, ANG), matrixregulierenden Proteinen (TIMP-1, TIMP-2), Chemokinen (MCP-1/CCL2, IP-10/CXCL 10) sowie weiterer Faktoren unter ischämischen Bedingungen nachgewiesen werden konnte. Zur Verifizierung dieser Ergebnisse wurden ausgewählte Faktoren mittels ELISA untersucht. Durch diese Analyse konnte gezeigt werden, dass die Sekretion einzelner Faktoren (z.B. STC-1, VEGF) durch die Kombination von Glukose- und Sauerstoffentzug deutlich hochreguliert wird, z.B. gegenüber nur dem Entzug von Sauerstoff. Um die Wirkung des Sekretoms von ischämischen ASCs auf Zelltypen, die in der Regeneration von Geweben eine Rolle spielen, zu untersuchen, wurde in nachfolgenden Experimenten die Wirkung von konditioniertem Medium ischämischer ASCs sowohl auf Endothelzellen als auch auf Fibroblasten untersucht. Dabei konnte sowohl eine deutlich gesteigerte Röhrenbildung („tube formation“) von Endothelzellen als auch eine aktivierte Migration von Fibroblasten durch die sezernierten Faktoren der ischämischen ASCs nachgewiesen werden. Ein direkter Zusammenhang dieser Effekte mit dem unter ischämischen Bedingungen signifikant hochregulierten Faktor STC-1, welcher als Regulator zellulärer Schlüsselfunktionen beschrieben wird, konnte hingegen nicht nachgewiesen werden. Die besondere Sekretionsfähigkeit von ASCs stellt ein wertvolles Werkzeug für zellbasierte Therapien dar, wie z.B. den zellassistierten Lipotransfer (CAL), bei dem durch die Anreicherung von Fetttransplantaten mit isolierten ASCs eine deutliche Verbesserung der Überlebensrate des transplantierten Konstrukts mit einer geringeren Resorption des Fettgewebes sowie einer Verringerung von unerwünschten Folgen, wie Fibrosen und Zystenbildung, erzielt wird. Um die Funktion der ASCs im CAL besser charakterisieren zu können, wurde im letzten Teil dieser Arbeit eine autologe Transwell-basierte Lipograft-ASC-Kokultur etabliert, in welcher durch erste Untersuchungen eine signifikant erhöhte Sekretion von VEGF im Vergleich zu den Lipografts ohne Zusatz von isolierten ASCs gezeigt werden konnte. Da die Stabilitätsrate des Fettgewebes und damit der Erfolg des CAL mutmaßlich auch von der Aufbereitung des Gewebes vor der Transplantation abhängig ist, wurde in einem Pilot-Experiment die konventionelle Präparationsmethode von Fettgewebe für die Stimmlippenaugmentation in der Laryngoplastik in vitro evaluiert. Durch Analysen zur Viabilität und Gewebestruktur konnte bei dem klinisch aufbereiteten Injektionsmaterial eine große Anzahl abgestorbener Zellen sowie eine deutlich geschädigte Gewebestruktur mit nekrotischen Arealen nachgewiesen werden. Im Vergleich dazu konnte mit der in dieser Arbeit etablierten Präparationsmethode des Fettgewebes als kleine Gewebsfragmente eine deutlich intakte, vitale und vaskularisierte Gewebestruktur erhalten werden. Damit bietet diese Art der Aufbereitung von Fettgewebe eine vielversprechende Alternative für die klinische Stimmlippenaugmentation.  Zusammengefasst tragen die Ergebnisse dieser Arbeit zu einer umfassenden Charakterisierung von ASCs unter ischämischen Bedingungen bei, wie sie beispielsweise am Transplantationsort oder in der Geweberegeneration vorliegen können. Die gewonnenen Ergebnisse, insbesondere zu den sekretorischen Fähigkeiten der ASCs, liefern neue Erkenntnisse darüber, wie ASCs regenerative Effekte in einem ischämischen Milieu vermitteln und weshalb deren Verwendung für therapeutische Zwecke besonders attraktiv und vielversprechend ist. KW - Adipose KW - Secretion KW - Regenerative Medicine KW - Ischemia KW - Hypoxia KW - Adipose-Derived Stromal/Stem Cells KW - Trophic Factors KW - Glucose Starvation KW - Cell-Assisted Lipotransfer Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251786 ER - TY - THES A1 - Balakrishnan, Ashwin T1 - Fast molecular mobility of β\(_2\)-adrenergic receptor revealed by time-resolved fluorescence spectroscopy T1 - Schnelle molekulare Beweglichkeit des β\(_2\)-adrenergen Rezeptors durch zeitaufgelöste Fluoreszenzspektroskopie N2 - G-protein- coupled receptors (GPCRs) are the largest family of membrane confined receptors and they transduce ligand binding to downstream effects. Almost 40% of the drugs in the world target GPCRs due to their function, albeit knowing less about their activation. Understanding their dynamic behaviour in basal and activated state could prove key to drug development in the future. GPCRs are known to exhibit complex molecular mobility patterns. A plethora of studies have been and are being conducted to understand the mobility of GPCRs. Due to limitations of imaging and spectroscopic techniques commonly used, the relevant timescales are hard to access. The most commonly used techniques are electron paramagnetic resonance or double electronelectron resonance, nuclear magnetic resonance, time-resolved fluorescence, single particle tracking and fluorescence recovery after photobleaching. Among these techniques only fluorescence has the potential to probe live cells. In this thesis, I use different time-resolved fluorescence spectroscopic techniques to quantify diffusion dynamics / molecular mobility of β2-adrenergic receptor (β2-AR) in live cells. The thesis shows that β2-AR exhibits mobility over an exceptionally broad temporal range (nanosecond to second) that can be linked to its respective physiological scenario. I explain how β2-AR possesses surprisingly fast lateral mobility (~10 μm²/s) associated with vesicular transport in contrast to the prior reports of it originating from fluorophore photophysics and free fluorophores in the cytosol. In addition, β2-AR has rotational mobility (~100 μs) that makes it conform to the Saffman-Delbrück model of membrane diffusion unlike earlier studies. These contrasts are due to the limitations of the methodologies used. The limitations are overcome in this thesis by using different time-resolved fluorescence techniques of fluorescence correlation spectroscopy (FCS), time-resolved anisotropy (TRA) and polarisation resolved fullFCS (fullFCS). FCS is limited to microsecond to the second range and TRA is limited to the nanosecond range. fullFCS complements the two techniques by covering the blind spot of FCS and TRA in the microsecond range. Finally, I show how ligand stimulation causes a decrease in lateral mobility which could be a hint at cluster formation due to internalisation and how β2-AR possesses a basal oligomerisation that does not change on activation. Thus, through this thesis, I show how different complementary fluorescence techniques are necessary to overcome limitations of each technique and to thereby elucidate functional dynamics of GPCR activation and how it orchestrates downstream signalling. N2 - G¬Protein¬gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind die größte Familie der Membran¬Rezeptoren und durch Bindung von Liganden leiten sie extrazlluläre Signal in das Innere der Zelle weiter. Fast 40% der Medikamente auf der Welt zielen aufgrund ihrer Funktion auf GPCRs ab, obwohl man relative wenig über ihre Aktivierung weiß. Das Verständnis ihres dynamischen Verhaltens im basalen und aktivierten Zustand könnte sich in Zukunft als Schlüssel zur Medikamentenentwicklung erweisen. GPCRs sind dafür bekannt, dass sie komplexe molekulare Bewegungsmuster aufweisen. Eine Fülle von Studien wurden und werden durchgeführt, um die Beweglichkeit von GPCRs zu verstehen. Aufgrund der Einschränkungen der gängigen bildgebenden und spektroskopischen Techniken sind die relevanten Zeitskalen nur schwer messbar. Die am häufigsten verwendeten Techniken sind die paramagnetische Elektronenresonanz oder die Doppel¬Elektron¬Elektron¬Resonanz, die magnetische Kernresonanz, die zeitaufgelöste Fluoreszenz, die Einzelpartikelverfolgung und die Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleichung. Unter diesen Techniken haben nur die Fluoreszenz¬basierten Techniken das Potential, lebende Zellen zu untersuchen. In dieser Arbeit werden verschiedene zeitaufgelöste fluoreszenzspektroskopische Techniken zur Quantifizierung der Diffusionsdynamik oder molekularen Mobilität des β2¬adrenergen Rezeptors (β2¬AR) in lebenden Zellen verwendet. Diese Arbeit zeigt, dass β2-AR eine Beweglichkeit über einen außergewöhnlich breiten, zeitlichen Bereich (Nanosekunde bis Sekunde) aufweist, der mit dem jeweiligen physiologischen Szenario verknüpft werden kann. Es wird gezeigt, wie β2¬AR eine überraschend schnelle, laterale Bewegung (~10 μm²/s) besitzt, welche mit vesikulärem Transport in Verbindung gebracht werden kann. Im Gegensatz zu früheren Berichten, wonach die beobachtete Komponente von der Photophysik der Fluorophore und freien Fluorophoren im Zytosol abstammt. Zusätzlich weist β2¬AR eine Rotationsbeweglichkeit (~100 μs) auf, welche es ¬ im Gegensatz zu früheren Studien ¬ dem Saffman¬Delbrück¬Modell der Membrandiffusion zuordnen lässt. Dieser Unterschied ist auf die Beschränkungen der verwendeten Techniken zurückzuführen. Die Einschränkungen werden in dieser Arbeit durch die Verwendung verschiedener zeitaufgelöster Fluoreszenztechniken überwunden, z. B. der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) im Bereich von mehreren hundert Nanosekunden bis Sekunden, der zeitaufgelösten Anisotropie (TRA) im Nanosekundenbereich und der polarisationsaufgelösten FullFCS (FullFCS), die die zeitlich Lücke zwischen FCS und TRA schließt. Zuletzt wird eine Abnahme der lateralen Beweglichkeit durch Ligandenstimulation gezeigt, was ein Hinweis auf Clusterbildung aufgrund von Internalisierung sein könnte, und dass β2¬AR eine basale Oligomerisierung aufweist, die sich bei Aktivierung nicht ändert. Zusammenfassend kann man sagen, dass verschiedene komplementäre Fluoreszenztechniken notwendig sind, um die Einschränkungen der einzelnen Techniken zu überwinden und dadurch die funktionelle Dynamik der GPCR¬Aktivierung und deren Bedeutung für die nachgeschaltete Signalübertragung aufzuklären. KW - Fluorescence correlation spectroscopy KW - GPCR KW - time-resolved anisotropy KW - adrenergic receptor KW - homoFRET Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-250856 ER -