TY - THES A1 - Shkumatov, Alexander V. T1 - Methods for hybrid modeling of solution scattering data and their application T1 - Methoden zur Hybriden Modellierung von SAXS Daten (Röntgenkleinwinkelstreuung) und deren Anwendung N2 - Small-angle X-ray scattering (SAXS) is a universal low-resolution method to study proteins in solution and to analyze structural changes in response to variations of conditions (pH, temperature, ionic strength etc). SAXS is hardly limited by the particle size, being applicable to the smallest proteins and to huge macromolecular machines like ribosomes and viruses. SAXS experiments are usually fast and require a moderate amount of purified material. Traditionally, SAXS is employed to study the size and shape of globular proteins, but recent developments have made it possible to quantitatively characterize the structure and structural transitions of metastable systems, e.g. partially or completely unfolded proteins. In the absence of complementary information, low-resolution macromolecular shapes can be reconstructed ab initio and overall characteristics of the systems can be extracted. If a high or low-resolution structure or a predicted model is available, it can be validated against the experimental SAXS data. If the measured sample is polydisperse, the oligomeric state and/or oligomeric composition in solution can be determined. One of the most important approaches for macromolecular complexes is a combined ab initio/rigid body modeling, when the structures (either complete or partial) of individual subunits are available and SAXS data is employed to build the entire complex. Moreover, this method can be effectively combined with information from other structural, computational and biochemical methods. All the above approaches are covered in a comprehensive program suite ATSAS for SAXS data analysis, which has been developed at the EMBL-Hamburg. In order to meet the growing demands of the structural biology community, methods for SAXS data analysis must be further developed. This thesis describes the development of two new modules, RANLOGS and EM2DAM, which became part of ATSAS suite. The former program can be employed for constructing libraries of linkers and loops de novo and became a part of a combined ab initio/rigid body modeling program CORAL. EM2DAM can be employed to convert electron microscopy maps to bead models, which can be used for modeling or structure validation. Moreover, the programs CRYSOL and CRYSON, for computing X-ray and neutron scattering patterns from atomic models, respectively, were refurbished to work faster and new options were added to them. Two programs, to be contributed to future releases of the ATSAS package, were also developed. The first program generates a large pool of possible models using rigid body modeling program SASREF, selects and refines models with lowest discrepancy to experimental SAXS data using a docking program HADDOCK. The second program refines binary protein-protein complexes using the SAXS data and the high-resolution models of unbound subunits. Some results and conclusions from this work are presented here. The developed approaches detailed in this thesis, together with existing ATSAS modules were additionally employed in a number of collaborative projects. New insights into the “structural memory” of natively unfolded tau protein were gained and supramodular structure of RhoA-specific guanidine nucleotide exchange factor was reconstructed. Moreover, high resolution structures of several hematopoietic cytokine-receptor complexes were validated and re-modeled using the SAXS data. Important information about the oligomeric state of yeast frataxin in solution was derived from the scattering patterns recorded under different conditions and its flexibility was quantitatively characterized using the Ensemble Optimization Method (EOM). N2 - Röntgenkleinwinkelstreuung (small angle X-ray scattering, SAXS) ist eine fundamentale niedrigauflösende Methode zur Untersuchung von Proteinen in Lösung und Analyse von Strukturänderungen unter verschiedenen Bedingungen (pH, Temperatur, Ionenstärke, usw.). SAXS ist nicht durch die Teilchengröße begrenzt und die Anwendbarkeit reicht von kleinsten Proteinen bis hin zu großen makromolekularen Maschinen, wie Ribosomen und Viren. SAXS-Experimente sind normalerweise schnell durchzuführen und erfordern eine relativ geringe Menge gereinigten Materials. SAXS wird hauptsächlich eingesetzt, um Größe und Form der globulärer Proteine zu studieren. Die neuesten Entwicklungen ermöglichen jedoch auch die Untersuchung und quantitative Charakterisierung metastabiler Systeme, wie teilweise oder vollständig ungefaltete Proteine. Für die SAXS-Datenanalyse existiert das umfassende Programmpaket ATSAS, welches am EMBL-Hamburg entwickelt wurde. Es ermöglicht die de novo Modellierung der Proteinform mit niedriger Auflösung, wenn keine ergänzende Information über die dreidimensionale Struktur vorhanden ist. Des weiteren können diverse Gesamteigenschaften des untersuchten Systems berechnet werden. Wenn ein hoch oder niedrig aufgelöstes strukturell bestimmtes oder vorgesagtes Modell vorhanden ist, kann es gegen experimentellen SAXS Daten validiert werden. Wenn die Probe polydispers ist, kann der oligomere Zustand und/oder der oligomere Zusammensetzung in Lösung bestimmt werden. Einer der wichtigsten Ansätze für SAXS Untersuchungen an makromolekularen Komplexen ist die kombinierte ab initio/Starrkörper-Modellierung, wenn entweder komplette oder partielle Strukturen der einzelnen Untereinheiten zusammen mit SAXS Daten benutzt werden, um daraus den gesamten Komplex zu konstruieren. Außerdem kann diese Methode mit Informationen von anderen strukturellen, rechnerischen und biochemischen Methoden effektiv kombiniert werden. Um den Anwendungsbereich von SAXS in der Strukturbiologie zu erweitern, müssen Methoden für die SAXS-Datenanalyse weiter entwickelt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei neue Module, RANLOGS und EM2DAM, entwickelt und zur ATSAS Programmsuite hinzugefügt. Ersteres kann eingesetzt werden, um eine Bibliothek verknüpfender Polypeptidketten (linkers) und -schleifen (loops) de novo aufzubauen und ist bereits ein Teil des Programms CORAL zur kombinierten ab initio/Starrkörper-Modellierung. EM2DAM kann eingesetzt werden, um Elektronenmikroskopie-Dichtekarten in Kugelmodelle umzuwandeln, welche für die Modellierung oder Struktur-Validierung benutzt werden können. Außerdem wurden die Programme CRYSOL und CRYSON zur Berechnung von Röntgenstrahl- beziehungsweise Neutronenstreumuster aus Atommodellen erweitert, um die Berechnung zu beschleunigen und neue Optionen einzubauen. Zwei weitere Programme, die noch nicht Teil des ATSAS Pakets sind, wurden entwickelt. Das erste ist ein Programm, das mögliche Proteinmodelle von Komplexen unter Verwendung des SAXS Starrkörper-Modellierung-Programms SASREF erstellt. Dann werden Modelle zu experimentellen SAXS-Daten angepasst, ausgewählt und verfeinert unter Verwendung des Protein-Protein-Docking-Programms HADDOCK. Das zweite Programm verfeinert binäre Protein-Protein-Komplexe unter Verwendung von SAXS-Daten sowie hochaufgelöster Modelle der ungebundenen Untereinheiten. Im Folgenden werden die einige Ergebnisse dargestellt und diskutiert. Die entwickelten Methoden wurden zusammen mit den vorhandenen ATSAS-Modulen im Rahmen von Kollaborationsprojekte eingesetzt. So war es möglich, neue Einblicke in das „strukturelle Gedächtnis“ des natürlicherweise ungefalteten Protein tau zu bekommen und die supramodulare Struktur eines RhoA-spezifischen Guanidinnukleotid-Austauschfaktors zu rekonstruieren. Außerdem wurden hoch aufgelöste Strukturen einiger blutbildender Cytokin-Empfänger-Komplexe unter Verwendung von SAXS Daten validiert und verfeinert. Wichtige Informationen über den oligomeren Zustand von Hefe-Frataxin in Lösung wurden aus den unter verschiedenen experimentelle Bedingungen gemessenen Streumustern abgeleitet, und seine Flexibilität wurde quantitativ unter Verwendung der Ensemble-Optimierungs-Methode (EOM) ermittelt. KW - Röntgen-Kleinwinkelstreuung KW - Tau-Protein KW - Datenanalyse KW - teilweise oder vollständig ungefaltete Proteine KW - Proteinstruktur KW - Alzheimer-Krankheit KW - SAXS KW - IDPs KW - protein structure KW - Alzheimer disease KW - tau protein Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65044 ER - TY - THES A1 - Bartossek, Thomas T1 - Structural and functional analysis of the trypanosomal variant surface glycoprotein using x-ray scattering techniques and fluorescence microscopy T1 - Strukturelle und funktionale Analyse des variablen Oberflächenproteins von Trypanosoma brucei mithilfe vön Röntgenstreutechniken und Fluoreszenzmikroskopie N2 - Trypanosoma brucei is an obligate parasite and causative agent of severe diseases affecting humans and livestock. The protist lives extracellularly in the bloodstream of the mammalian host, where it is prone to attacks by the host immune system. As a sophisticated means of defence against the immune response, the parasite’s surface is coated in a dense layer of the variant surface glycoprotein (VSG), that reduces identification of invariant epitopes on the cell surface by the immune system to levels that prevent host immunity. The VSG has to form a coat that is both dense and mobile, to shield invariant surface proteins from detection and to allow quick recycling of the protective coat during immune evasion. This coat effectively protects the parasite from the harsh environment that is the mammalian bloodstream and leads to a persistent parasitemia if the infection remains untreated. The available treatment against African Trypanosomiasis involves the use of drugs that are themselves severely toxic and that can lead to the death of the patient. Most of the drugs used as treatment were developed in the early-to-mid 20th century, and while developments continue, they still represent the best medical means to fight the parasite. The discovery of a fluorescent VSG gave rise to speculations about a potential interaction between the VSG coat and components of the surrounding medium, that could also lead to a new approach in the treatment of African Trypanosomiasis that involves the VSG coat. The initially observed fluorescence signal was specific for a combination of a VSG called VSG’Y’ and the triphenylmethane (TPM) dye phenol red. Exchanging this TPM to a bromo-derivative led to the observation of another fluorescence effect termed trypanicidal effect which killed the parasite independent of the expressed VSG and suggests a structurally conserved feature between VSGs that could function as a specific drug target against T. b. brucei. The work of this thesis aims to identify the mechanisms that govern the unique VSG’Y’ fluorescence and the trypanocidal effect. Fluorescence experiments and protein mutagenesis of VSG’Y’ as well as crystallographic trials with a range of different VSGs were utilized in the endeavour to identify the binding mechanisms between TPM compounds and VSGs, to find potentially conserved structural features between VSGs and to identify the working mechanisms of VSG fluorescence and the trypanocidal effect. These trials have the potential to lead to the formulation of highly specific drugs that target the parasites VSG coat. During the crystallographic trials of this thesis, the complete structure of a VSG was solved experimentally for the first time. This complete structure is a key component in furthering the understanding of the mechanisms governing VSG coat formation. X-ray scattering techniques, involving x-ray crystallography and small angle x-ray scattering were applied to elucidate the first complete VSG structures, which reveal high flexibility of the protein and supplies insight into the importance of this flexibility in the formation of a densely packed but highly mobile surface coat. N2 - Trypanosoma brucei ist ein eukaryotischer Parasit welcher bei Menschen und Nutztieren schwere Krankheiten auslöst. Der Protist lebt extrazellulär im Blutstrom seines Säugetier-Wirtes, in welchem er unter konstantem Angriff durch das Wirts-Immunsystem steht. Als ausgeklügelte Methode zur Umgehung der Immunantwort besitzt der Parasit einen dichten Oberflächenmantel des variablen Oberflächen-Glycoproteins (VSG), welcher die Identifikation invariabler Oberflächenproteine durch das Immunsystem erschwert und Wirts-Immunität gegen den Parasiten verhindert. Der gebildete VSG-Mantel muss gleichzeitig eine hohe Dichte besitzt, um invariable Oberflächenproteine vor Immundetektion zu beschützen, und eine hohe Mobilität aufweisen, um ein schnelles Recycling des Schutzmantels während Immunantworten zu gewährleisten. Dieser Mantel schützt den Parasiten effektiv vor dem Wirts-Immunsystem und führt bei fehlender Behandlung des Patienten zur persistenten Parasitemie durch Trypanosoma brucei. Die verfügbaren Behandlung gegen die Afrikanische Trypanosomiasis beinhaltet die Benutzung von Medikamenten welche ihrerseits z.T. stark toxisch sind und den Tod des Patienten verursachen können. Ein Großteil der verfügbaren Medikamente wurden zu Beginn des letzten Jahrhunderts entwickelt und stellen trotz anhaltenden Entwicklungen noch immer die beste Lösung im Kampf gegen den Parasiten dar. Die Entdeckung eines fluoreszierenden VSGs deutete auf eine Interaktionen zwischen dem VSG Mantel und Bestandteilen des umgebenden Medium hin, welche die Entwicklung von Medikamenten mit dem VSG Mantel als Drug Target ermöglichen könnte. Das ursprünglich beobachtete Fluoreszenz-Signal war spezifisch für eine Kombination eines VSG namens VSG’Y’ und dem Triphenylmethan (TPM) Phenolrot. Der Austausch von Phenolrot gegen ein Brom-Derivat führte zur Beobachtung eines weiteren Fluoreszenz-Effekts, welcher unabhängig vom exprimierten VSG auftritt und letal für den Parasiten ist. Dieser so genannten Trypanozide Effekt lässt auf konservierte Strukturen schließen, welche von allen VSGs geteilt werden und als hochspezifisches Drug Target gegen T. b. brucei fungieren könnten. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Mechanismen zu identifizieren, welche die einzigartige VSG’Y’-Fluoreszenz und den Trypanoziden Effekt auslösen. Fluoreszenz-Experimente und Protein-Mutagenese von VSG’Y’, sowie röntgenkristallographische Analysen mit mehreren unterschiedlichen VSGs wurden in dem Bestreben durchgeführt, die Bindung zwischen VSGs und TPMs zu charakterisieren, potentiell konservierte Strukturen von VSGs zu finden und die Mechanismen der einzigartigen VSG’Y’-Fluoreszenz und des Trypanoziden Effekts zu identifizieren. Diese Arbeiten haben das Potenzial die Formulierung hochspezifischer Medikamente mit VSGs als Drug Target anzutreiben. Im Rahmen der kristallographischen Analysen wurden die ersten vollständigen VSG Strukturen ermittelt, welche eine hohe Bedeutung für das Verständnis über die Bildung des VSG-Mantels haben. Die VSG Strukturen wurden u.a. per Röntgenkristallographie und Kleinwinkel-Röntgenstreuung aufgeschlüsselt und zeigten dass VSGs ein hohes Maß an Flexibilität besitzen. Diese Flexibilität ist wichtig für die Bildung eines dichten und hochmobilen VSG-Mantels. KW - Trypanosoma brucei brucei KW - Röntgenstrukturanalyse KW - Röntgen-Kleinwinkelstreuung KW - Mutagenese KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Variables Oberflächen Glycoprotein KW - VSG Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-144775 ER -