TY  - THES
A1  - Li, Kunkun
T1  - Dissecting the interconnection of Ca\(^{2+}\) and pH signaling in plants with a novel biosensor for dual imaging
T1  - Untersuchung der Verknüpfung von Ca\(^{2+}\) und pH-Signalen in Pflanzen mit einem neuartigen Biosensor für duale Bildgebung
N2  - Calcium ion (Ca2+) and protons (H+) are both regarded as second messengers, participating in plant growth and stress mechanisms. However, H+ signals in plant physiology are less well investigated compared to Ca2+ signals. If interconnections between these two second messengers exist remains to be uncovered because appropriate imaging tools to monitor Ca2+ and H+ simultaneously in the same cell as well as accurate bioinformatics analysis remain to be developed. To overcome this problem and unravel the role and possible interconnection of Ca2+ and H+ in plants, a new biosensor named CapHensor was developed and optimized to visualize intracellular Ca2+ and H+ changes simultaneously and ratiometrically in the same cell. The CapHensor consisted of an optimized green fluorescent pH sensor (PRpHluorin) and an established red fluorescent Ca2+ sensor (R-GECO1) that were combined in one construct via a P2A sequence. A P2A self-cleavage site between the two sensors allowed to express equal amounts but spatially separated sensors, which enabled artifact-free and ratiometric imaging of cellular Ca2+ and pH side-by-side. The function of the CapHensor was verified in pollen tubes, since they possess standing Ca2+ and pH gradients. We found better imaging quality and the signal-to-noise ratio to be enhanced in live-cell imaging when two R-GECO1 proteins were fused in tandem within the CapHensor construct. To guarantee exclusive subcellular localization and avoid mixed signals from different compartments, Nuclear Export Sequence (NES) and Nuclear Localization Sequence (NLS) were used to target PRpHluorin and R-GECO1 to distinct compartments. After optimization and verification its function, CapHensor was successfully expressed in different cell types to investigate the role of Ca2+ and H+ signals to control polar growth of pollen tube, stomatal movement or leaf defense signaling. Results obtained in the past indicated both Ca2+ gradients and pH gradients in pollen tubes play roles in polar growth. However, the role and temporal relationship between the growth process and changes in Ca2+ and pH have not been conclusively resolved. Using CapHensor, I found cytosolic acidification at the tip could promote and alkalization to suppress growth velocity in N. tabacum pollen tubes, indicating that cytosolic H+ concentrations ([H+]cyt) play an important role in regulation pollen tubes growth despite the accompanied changes in cytosolic Ca2+ concentrations ([Ca2+]cyt). Moreover, growth correlated much better with the tip [H+]cyt regime than with the course of the tip [Ca2+]cyt regime. However, surprisingly, tip-focused [Ca2+]cyt andII [H+]cyt oscillations both lagged behind growth oscillations approximately 33 s and 18 s, respectively, asking for a re-evaluation of the role that tip [Ca2+]cyt may play in pollen tube growth. Live-cell CapHensor imaging combined with electrophysiology uncovered that oscillatory membrane depolarization correlated better with tip [H+]cyt oscillations than with tip [Ca2+]cyt oscillations, indicative for a prominent role of [H+]cyt to also control electrogenic membrane transport. Using CapHensor, reading out cellular movement at the same time enabled to provide a precise temporal and spatial resolution of ion signaling events, pointing out a prominent role of [H+]cyt in pollen tube tip growth. For leaf cells, a special CapHensor construct design had to be developed, containing additional NES localization sequences to avoid overlapping of fluorescense signals from the nucleus and the cytosol. Once this was achieved, the role of Ca2+ and pH changes in guard cells, another typical single-cell system was investigated. Cytosolic pH changes have been described in stomatal movement, but the physiological role of pH and the interaction with changing Ca2+ signals were still unexplored. Combining CapHensor with the here developed technique to monitor stomatal movement in parallel, the role of Ca2+ and H+ in stomatal movement was studied in detail and novel aspects were identified. The phytohormone ABA and the bacterial elicitor flagellin (flg22) are typical abiotic and biotic stresses, respectively, to trigger stomatal closure. What kind of Ca2+ and H+ signals by ABA and flg22 are set-off in guard cells and what their temporal relationship and role for stomatal movement is were unknown. Similar [Ca2+]cyt increases were observed upon ABA and flg22 triggered stomatal closure, but [H+]cyt dynamics differed fundamentally. ABA triggered pronounced cytosolic alkalization preceded the [Ca2+]cyt responses significantly by 57 s while stomata started to close ca. 205 s after phytohormone application. With flg22, stomatal closure was accompanied only with a mild cytosolic alkalization but the [Ca2+]cyt response was much more pronounced compared to the ABA effects. Where the cytosolic alkalization originates from was unclear but the vacuole was speculated to contribute in the past. In this thesis, vacuolar pH changes were visualized by the dye BCECF over time, basically displaying exactly the opposite course of the concentration shift in the vacuole than observed in the cytosol. This is indicative for the vacuolar pH dynamics to be coupled strongly to the cytosolic pH changes. In stomatal closure signalling, reactive oxygen species (ROS) were proposed to play a major role, however, only very high concentration of H2O2 (> 200 µM), which resulted in the loss of membrane integrity, induced stomatal closure. Unexpectedly, physiological concentrations of ROS led to cytosolic acidificationIII which was associated with stomatal opening, but not stomatal closure. To study the role of [H+]cyt to steer stomatal movement in detail, extracellular and intracellular pH variations were evoked in N. tabacum guard cells and their behaviour was followed. The results demonstrated cytosolic acidification stimulated stomatal opening while cytosolic alkalization triggered stomatal closure accompanied by [Ca2+]cyt elevations. This demonstrated pH regulation to be an important aspect in stomatal movement and to feed-back on the Ca2+-dynamics. It was remarkable that cytosolic alkalization but not [Ca2+]cyt increase seemed to play a crucial role in stomatal closure, because more pronounced cytosolic alkalization, evoked stronger stomatal closure despite similar [Ca2+]cyt increases. Increases in [Ca2+]cyt, which are discussed as an early stomatal closure signal in the past, could not trigger stomatal closure alone in my experiments, even when extremely strong [Ca2+]cyt signals were triggered. Regarding the interaction between the two second messengers, [Ca2+]cyt and [H+]cyt were negatively correlated most of the times, which was different from pollen tubes showing positive correlation of [Ca2+]cyt and [H+]cyt regimes. [Ca2+]cyt elevations were always associated with a cytosolic alkalization and this relationship could be blocked by the presence of vanadate, a plasma membrane H+-pump blocker, indicating plasma membrane H+-ATPases to contribute to the negative correlation of [Ca2+]cyt and [H+]cyt. To compare with guard cells, cytosolic and nuclear versions of CapHensor were expressed in N. benthamiana mesophyll cells, a multicellular system I investigated. Mesophyll cell responses to the same stimuli as tested in guard cells demonstrated that ABA and H2O2 did not induce any [Ca2+]cyt and [H+]cyt changes while flg22 induced an increase in [Ca2+]cyt and [H+]cyt, which is different from the response in guard cells. I could thus unequivocally demonstrate that guard cells and mesophyll cells do respond differently with [Ca2+]cyt and [H+]cyt changes to the same stimuli, a concept that has been proposed before, but never demonstrated in such detail for plants. Spontaneous Ca2+ oscillations have been observed for a long time in guard cells, but the function or cause is still poorly understood. Two populations of oscillatory guard cells were identified according to their [Ca2+]cyt and [H+]cyt phase relationship in my study. In approximately half of the oscillatory cells, [H+]cyt oscillations preceded [Ca2+]cyt oscillations whereas [Ca2+]cyt was the leading signal in the other half of the guard cells population. Strikingly, natural [H+]cyt oscillations were dampened by ABA but not by flg22. This effect could be well explained by dampening of vacuolar H+ oscillations in the presence of ABA, but not through flg22. Vacuolar pH contributes to spontaneous [H+]cyt oscillations and ABA but not flg22 can block the interdependence of naturalIV [Ca2+]cyt and [H+]cyt signals. To study the role of [Ca2+]cyt oscillations in stomatal movement, solutions containing high and low KCl concentrations were applied aiming to trigger [Ca2+]cyt oscillations. The triggering of [Ca2+]cyt oscillations by this method was established two decades ago leading to the dogma that [Ca2+]cyt increases are the crucial signal for stomatal closure. However, I found stomatal movement by this method was mainly due to osmotic effects rather than [Ca2+]cyt increases. Fortunately, through this methodology, I found a strong correlation between cytosolic pH and the transport of potassium across the plasma membrane and vacuole existed. The plasma membrane H+-ATPases and H+-coupled K+ transporters were identified as the cause of [H+]cyt changes, both very important aspects in stomata physiology that were not visualized experimentally before. Na+ transport is also important for stomatal regulation and leaves generally since salt can be transported from the root to the shoot. Unlike well-described Ca2+- dependent mechanisms in roots, how leaves process salt stress is not at all understood. I applied salt on protoplasts from leaves, mesophyll cells and guard cells and combined live-cell imaging with Vm recordings to understand the transport and signaling for leaf cells to cope with salt stress. In both, mesophyll and guard cells, NaCl did not trigger Ca2+-signals as described for roots but rather triggered Ca2+ peaks when washing salt out. However, membrane depolarization and pronounced alkalinization were very reliably triggered by NaCl, which could presumably act as a signal for detoxification of high salt concentrations. In line with this, I found the vacuolar cation/H+ antiporter NHX1 to play a role in sodium transport, [H+]cyt homeostasis and the control of membrane potential. Overexpression of AtNHX1 enabled to diminish [H+]cyt changes and resulted in a smaller depolarization responses druing NaCl stress. My results thus demonstrated in contrast to roots, leaf cells do not use Ca2+-dependent signalling cascades to deal with salt stress. I could show Na+ and K+ induced [H+]cyt and Vm responses and Cl- transport to only have a minor impact. Summing all my results up briefly, I uncovered pH signals to play important roles to control pollen tube growth, stomatal movement and leaf detoxification upon salt. My results strongly suggested pH changes might be a more important signal than previously thought to steer diverse processes in plants. Using CapHensor in combination with electrophysiology and bioinformatics tools, I discovered distinct interconnections between [Ca2+]cyt and [H+]cyt in different cell types and distinct [Ca2+]cyt and [H+]cyt signals are initiated through diverse stimuli and environmental cues. The CapHensor will be very useful in the future to further investigate the coordinated role of Ca2+ and pH changes in controlling plant physiology.
N2  - Kalziumionen (Ca2+) und Protonen (H+) werden beide als Botenstoffe angesehen, die am Pflanzenwachstum und an Mechanismen zur Stressbewältigung beteiligt sind. In der Pflanzenphysiologie sind H+-Signale jedoch im Vergleich zu Ca2+-Signalen weniger gut untersucht. Die Frage, ob zwischen diesen beiden Botenstoffen Zusammenhänge bestehen, muss noch geklärt werden, da geeignete bildgebende Verfahren zur gleichzeitigen Aufzeichnung von Ca2+ und H+ Signalen sowie eine genaue bioinformatische Analyse noch entwickelt werden müssen. Um dieses Problem zu überwinden und die Rolle und möglichen Zusammenhang von Ca2+ und H+ Signalen in Pflanzen zu entschlüsseln, wurde ein neuer Biosensor namens CapHensor entwickelt und optimiert, um intrazelluläre Ca2+- und H+-Veränderungen gleichzeitig und ratiometrisch zu untersuchen. Der CapHensor bestand aus einem optimierten grün fluoreszierenden pH-Sensor (PRpHluorin) und einem etablierten rot fluoreszierenden Ca2+-Sensor (R-GECO1), die über eine P2A-Sequenz in einem Konstrukt kombiniert wurden. Eine sogenannte P2A-„self-cleavage site“ zwischen den beiden Sensoren ermöglichte die Expression gleicher Mengen, aber räumlich getrennter Sensoren, was eine artefaktfreie und ratiometrische Darstellung von zellulärem Ca2+ und pH nebeneinander ermöglichte. Die Funktion des CapHensors wurde in Pollenschläuchen verifiziert, da diese einen ständigen Ca2+- und pH-Gradienten aufweisen. Wir stellten fest, dass die Qualität der Bildaufnahmen und das Signal-Rausch-Verhältnis bei der Bildgebung in lebenden Zellen verbessert wurden, wenn zwei R-GECO1-Proteine innerhalb des CapHensor-Konstrukts translational fusioniert wurden. Um eine ausschließliche zytosolische Lokalisierung zu gewährleisten und gemischte Signale aus verschiedenen Kompartimenten zu vermeiden, wurden sogenannte „Nuclear Export Sequence“ (NES) und die „Nuclear Localization Sequence“ (NLS) verwendet, um PRpHluorin und R-GECO1 in unterschiedlichen Kompartimente zu lokalisieren. Nach der Optimierung und Überprüfung seiner Funktionsweise wurde CapHensor erfolgreich in verschiedenen Zelltypen exprimiert, um die Rolle von Ca2+- und H+-Signalen bei der Kontrolle des polaren Wachstums von Pollenschläuchen, die Stomabewegung oder Abwehrmechanismen der Blätter zu untersuchen. Die in der Vergangenheit erzielten Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl der Ca2+-Gradient als auch der pH-Gradient in Pollenschläuchen eine Rolle beim polaren Wachstum spielen, wobei dem Ca2+-Gradient zum Teil die Hauptrolle zugesprochen wird. Die Rolle und die zeitlicheVI Beziehung zwischen dem Wachstumsprozess und den Veränderungen von Ca2+ und pH sind jedoch noch nicht abschließend geklärt. Mit Hilfe von CapHensor fand ich heraus, dass eine zytosolische Ansäuerung an der Spitze die Wachstumsgeschwindigkeit in N. tabacumPollenschläuchen fördern und eine Alkalisierung die Wachstumsgeschwindigkeit unterdrücken kann, was darauf hindeutet, dass die zytosolische H+-Konzentration ([H+]cyt) trotz der damit einhergehenden Veränderungen der zytosolischen Ca2+-Konzentration ([Ca2+]cyt) eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Wachstums von Pollenschläuchen spielt. Außerdem korrelierte das Wachstum viel besser mit dem [H+]cyt-Verlauf an der Spitze als mit dem Verlauf des [Ca2+]cytSignals. Überraschenderweise hinkten jedoch sowohl die [Ca2+]cyt- als auch die [H+]cytOszillationen an der Spitze den Wachstumsoszillationen um etwa 33 s bzw. 18 s hinterher, so dass die Rolle von [Ca2+]cyt an der Spitze für das Wachstum des Pollenschlauchs neu bewertet werden muss. Die CapHensor-Bildgebung an lebenden Zellen in Kombination mit Elektrophysiologie ergab, dass die oszillierende Membrandepolarisation besser mit den [H+]cyt-Oszillationen an der Spitze korrelierte als mit den [Ca2+]cyt-Oszillationen, was darauf hindeutet, dass [H+]cyt auch eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des elektrogenen Membrantransports spielt. Mit Hilfe des CapHensors und dem gleichzeitigen Auslesen der Zellbewegungen konnte eine präzise zeitliche und räumliche Auflösung der Ereignisse erzielt werden, was auf eine herausragende Rolle von [H+]cyt beim Wachstum der Pollenschlauchspitze hinweist. Für den Einsatz des CapHensors in Blattzellen musste ein spezielles CapHensor-Konstrukt entwickelt werden, das zusätzliche NES-Lokalisierungssequenzen enthielt, um eine Überlappung der Fluoreszenzsignale aus dem Zellkern und dem Zytosol zu vermeiden. Nachdem dies erreicht war, wurde die Rolle von Ca2+- und pH-Änderungen in Schließzellen, einem gut beschriebenen Einzelzellsystem, untersucht. Veränderungen des zytosolischen pH-Werts wurden bei der Bewegung von Stomata in früheren Studien beschrieben, aber die physiologische Rolle dieser Veränderungen und die Interaktion mit sich verändernden Ca2+-Signalen waren noch unerforscht. Der Einsatz von CapHensor zusammen mit der von mir entwickelten Technik zur parallelen Erfassung der Stomatabewegung hat unser Verständnis der Rolle von Ca2+ und H+ bei der Stomatabewegung erheblich verbessert. Das Phytohormon ABA und der bakterielle Elicitor Flagellin (flg22) sind typische abiotische bzw. biotische Stressfaktoren, die das Schließen der Stomata auslösen. Welche Art von Ca2+- und H+-Signalen in den Schließzellen durch ABA und flg22 ausgelöst werden und in welchem zeitlichen Zusammenhang sie stehen und welche Rolle sieVII für die Bewegung der Stomata spielen, war bisher unbekannt. Bei der durch ABA und flg22 ausgelösten Schließung der Stomata wurde ein Anstieg von [Ca2+]cyt beobachtet, aber die Dynamik von [H+]cyt unterschied sich grundlegend und zeigte eine andere Dynamik. ABA löste eine ausgeprägte zytosolische Alkalisierung aus, die der [Ca2+]cyt-Antwort um 57 s deutlich vorausging, während die Spaltöffnungen erst ca. 205 s danach anfingen zu schliessen. Bei Flg22 ging das Schließen der Spaltöffnungen nur mit einer leichten zytosolischen Alkalisierung einher, aber die Ca2+-Reaktion war im Vergleich zur ABA-Reaktion viel ausgeprägter. Woher die zytosolische Alkalisierung stammt, war unklar, aber in der Vergangenheit wurde spekuliert, dass die Vakuole dazu beiträgt. In dieser Arbeit wurden vakuoläre pH-Änderungen mit Hilfe des Farbstoffs BCECF über die Zeit verfolgt, wobei die Konzentrationsverschiebung in der Vakuole im Grunde genommen genau den umgekehrten Verlauf aufwies als im Zytosol beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass die Dynamik des vakuolären pH-Wertes stark an die Änderungen des zytosolischen pHWertes gekoppelt ist. Aus der Literatur ist bekannt, dass reaktive Sauerstoffspezies (ROS) bei der Signalgebung für das Schließen der Stomata eine wichtige Rolle spielen. Als ich jedoch definierte H2O2-Mengen auf die Zellen applizierte, führten nur unphysiologosch hohe H2O2-Konzentrationen (> 200 µM), die zu einem Verlust der Membranintegrität führten, zum Schließen der Stomata. Unerwarteterweise führten physiologische Konzentrationen von ROS zu einer Ansäuerung des Zytosols, die mit der Öffnung der Stomata, aber nicht mit der Schließung der Stomata in Verbindung gebracht wurde. Um die Rolle von [H+]cyt bei der Steuerung der stomatären Bewegung im Detail zu untersuchen, wurden extrazelluläre und intrazelluläre pH-Änderungen in N. tabacumSchließzellen hervorgerufen um deren Verhalten bei pH-Änderungen zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine zytosolische Ansäuerung die Öffnung der Stomata stimuliert, während eine zytosolische Alkalisierung die Schließung der Stomata auslöst, begleitet von einem Anstieg von [Ca2+]cyt. Dies beweist, dass die pH-Regulierung ein wichtiger Aspekt der stomatären Bewegung darstellt und auf die Ca2+-Dynamik einwirkt. Bemerkenswert war, dass die zytosolische Alkalisierung und nicht der Ca2+-Anstieg eine entscheidende Rolle bei der Schließung der Stomata zu spielen schien, da eine stärkere zytosolische Alkalisierung trotz eines ähnlichen [Ca2+]cyt - Anstiegs eine stärkere Schließung der Stomata hervorrief. Erhöhungen von [Ca2+]cyt, die in der Vergangenheit als frühes Stomataschließungssignal diskutiert wurden, konnten in meinen Experimenten den Stomataschluß nicht allein auslösen, selbst wenn extrem starke Ca2+-Signale ausgelöst wurden. Was die Interaktion zwischen den beiden Botenstoffen anbelangt, so warenVIII [Ca2+]cyt und [H+]cyt meist negativ miteinander korreliert, was sich von den Pollenschläuchen unterschied, die eine positive Korrelation zwischen [Ca2+]cyt und [H+]cyt aufwiesen. Ca2+- Erhöhungen waren immer mit einer Alkalisierung des Zytosols verbunden, und diese Beziehung konnte durch die Anwesenheit von Vanadat, ein H+-Pumpen Blocker blockiert werden, was darauf hindeutet, dass die H+-ATPasen der Plasmamembran zu der negativen Korrelation von [Ca2+]cyt und [H+]cyt beitragen. Im Vergleich zu den CapHensor-Reaktionen bei Schließzellen wurden zytosolische und Zellkern-lokalisierende Versionen von CapHensor in Mesophyllzellen von N. benthamiana, einem von uns untersuchten multizellulären System, exprimiert. Die Reaktionen der Mesophyllzellen auf die gleichen Stimuli wie bei den Schließzellen zeigten, dass ABA und H2O2 keine Veränderungen von [Ca2+]cyt und [H+]cyt hervorrufen, während flg22 einen Anstieg von [Ca2+]cyt und [H+]cyt bewirkt, der sich von der Reaktion in Schließzellen unterscheidet. Damit konnte ich eindeutig nachweisen, dass Schließ- und Mesophyllzellen in Bezug auf [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Änderungen sehr unterschiedlich auf dieselben Stimuli reagieren, ein Konzept, das zwar schon früher vorgeschlagen, aber noch nie so detailliert für Pflanzen nachgewiesen wurde. Ein Phänomen, das seit langem in Schließzellen beobachtet wird, dessen Funktion oder Ursache aber noch nicht verstanden ist, sind regelmäßige Ca2+-Oszillationen, die spontan auftreten. Interessanterweise wurden zwei Populationen von oszillierenden Schließzellen anhand ihrer [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Phasenbeziehung identifiziert. Bei etwa der Hälfte der oszillierenden Zellen gingen die [H+]cyt-Oszillationen den [Ca2+]cyt-Oszillationen voraus, während in der anderen Hälfte der Schließzellenpopulation [Ca2+]cyt das vorangehende Signal war. Auffallend ist, dass die natürlichen [H+]cyt-Oszillationen durch ABA gedämpft wurden, nicht aber durch flg22. Dieser Effekt lässt sich gut durch die Dämpfung der vakuolären H+-Oszillationen in Gegenwart von ABA erklären, aber nicht durch flg22, das ich mit BCECF sichtbar gemacht habe. Es zeigte sich, dass sowohl der vakuoläre pH-Wert zu spontanen [H+]cyt-Oszillationen beiträgt als auch, dass ABA, nicht aber flg22, den Zusammenhang der natürlichen [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Signale blockieren kann. Um die Rolle der [Ca2+]cyt-Oszillationen bei der Bewegung der Stomata zu untersuchen, wurden Lösungen mit hohen und niedrigen KCl-Konzentrationen verwendet, um [Ca2+]cyt-Oszillationen auszulösen. Das Auslösen von Ca2+-Oszillationen nach dieser Methode wurde in Studien vor zwei Jahrzehnten etabliert, und die Ergebniss daraus haben zu dem Dogma geführt, dass der Anstieg von [Ca2+]cyt das entscheidende Signal für die Schließung von Stomata ist. Ich habe jedoch herausgefunden, dass die Bewegung der Stomata mit dieser Methode hauptsächlich auf osmotischeIX Effekte und nicht auf die Auswirkungen der [Ca2+]cyt-Erhöhungen zurückzuführen waren. Glücklicherweise fand ich mit dieser Methode heraus, dass es eine starke Korrelation zwischen dem zytosolischen pH-Wert und dem Kaliumtransport über die Plasmamembran und die Vakuole gibt. Die H+-ATPasen der Plasmamembran und die H+-gekoppelten K+-Transporter wurden als Ursache für die pH-Änderungen identifiziert, beides sehr wichtige Aspekte in der Stomaphysiologie, die zuvor nicht experimentell sichtbar gemacht werden konnten. Der Transport von Natriumionen (Na+) ist für die Regulierung der Stomata und der Adaption von Blättern bei Salzstress wichtig, da Salz von der Wurzel zum Spross transportiert werden kann. Im Gegensatz zu den gut beschriebenen Ca2+-abhängigen Na+-Transportmechanismen in den Wurzeln ist überhaupt nicht bekannt, wie Blätter Salzstress verarbeiten. Ich habe Salz auf Protoplasten von Blättern, Mesophyllzellen und Schießzellen appliziert und „Live-Cell-Imaging“ mit Aufzeichnungen der Membranspannung kombiniert, um den Transport und die Signalreizweiterleitung bei Salzstress in Blättern zu verstehen. Sowohl in Mesophyll- als auch in Schließzellen löste NaCl keine Ca2+-Signale aus, wie sie für Wurzeln beschrieben wurden, sondern führte beim Auswaschen von Salz zu [Ca2+]cyt-Transienten. Eine Membrandepolarisation und eine ausgeprägte Alkalisierung wurden jedoch sehr zuverlässig durch NaCl ausgelöst, was vermutlich als Signal für die Entgiftung von hohen Salzkonzentrationen dienen könnte. Im Einklang damit konnte ich zeigen, dass der vakuoläre Kationen/H+-Antiporter NHX1 eine Rolle beim Natriumtransport, der zytosolischen pH-Homöostase und der Kontrolle des Membranpotenzials spielt. Die Überexpression von AtNHX1 ermöglichte es, [H+]cyt-Veränderungen zu vermindern und führte zu einer geringeren Depolarisationsreaktion unter NaCl-Stress. Meine Ergebnisse zeigen somit, dass Blattzellen im Gegensatz zu Wurzeln keine Ca2+-abhängigen Signalkaskaden nutzen, um mit Salzstress umzugehen, und ich konnte zeigen, dass Na+ und K+ die [H+]cyt- und Membranspannungs-Reaktionen auslöst und der Cl--Transport nur einen geringen Einfluss hat. Zusammenfassend habe ich festgestellt, dass pH-Signale eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des Wachstums von Pollenschläuchen spielen, sowie bei der Bewegung der Stomata und der Entgiftung der Blätter durch Salz beteiligt sind. Meine Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass pH-Änderungen ein wichtigeres Signal für die Steuerung verschiedener Prozesse in Pflanzen sein könnten als bisher angenommen. Durch den Einsatz des CapHensors in Kombination mit elektrophysiologischen und bioinformatischen Methoden konnte ich feststellen, dass in verschiedenen Zelltypen unterschiedliche Zusammenhänge zwischen [Ca2+]cyt und [H+]cyt bestehenX und dass unterschiedliche [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Signale durch verschiedene Stimuli und Umweltreize ausgelöst werden. Der CapHensor wird in Zukunft sehr nützlich sein, um die koordinierte Rolle von Ca2+- und pH-Änderungen bei der Steuerung der Pflanzenphysiologie weiter zu untersuchen.
KW  - Calcium
KW  - pH
KW  - live-cell imaging
KW  - pollen tubes
KW  - guard cells
KW  - mesophyll cells
KW  - Pflanzen
KW  - Biosensor
KW  - Bilderzeugung
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249736
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hertlein, Tobias
T1  - Visualization of Staphylococcus aureus infections and antibiotic therapy by bioluminescence and 19F magnetic resonance imaging with perfluorocarbon emulsions
T1  - Darstellung von Staphylococcus aureus Infektionen und Antibiotikatherapie durch Biolumineszenzbildgebung und 19F-Kernspintomografie mit Perfluorcarbon-Emulsionen
N2  - Staphylococcus aureus is a major threat to public health systems all over the globe. This second most cause of nosocomial infections is able to provoke a wide variety of different types of infection in humans and animals, ranging from superficial skin and skin structure infections to invasive disease like sepsis or pneumonia. But not enough, this pathogen is also notorious in acquiring and/or developing resistance to antimicrobial compounds, thus limiting available treatment options severely. Therefore, development of new compounds and strategies to fight S. aureus is of paramount importance. But since only 1 out of 5 compounds, which entered clinical trials, becomes a drug, the preclinical evaluation of promising compounds has to be reconsidered, too. The aim of this thesis was to address both sides of this problem: first, to improve preclinical testing by incorporating in vivo imaging technologies to the preclinical testing procedure in order to acquire additional and clearer data about efficacy of promising compounds and second, by evaluating lysostaphin, which is a promising, new option to fight S. aureus infections.
The first aim of this thesis focused on the establishment of a dual modality in vivo imaging platform, consisting of Bioluminescence Imaging (BLI) and Magnetic Resonance Imaging (MRI), to offer detailed insights into the course and gravity of S. aureus infection in the murine thigh infection model. Since luciferase-expressing S. aureus strains were generated in former studies and enabled thus bioluminescence imaging of bacterial infection, this technology should be implemented into the compound evaluation platform in order to non-invasively track the bacterial burden over time. MRI, in contrast, was only rarely used in earlier studies to visualize and measure the course of infection or efficacy of anti-bacterial therapy. Thus, the first set of experiments was performed to identify benefits and drawbacks of visualizing S. aureus infections in the mouse model by different MR methods. Native, proton-based MR imaging showed in this regard increased T2 relaxation times in the infected thigh muscles, but it was not possible to define a clear border between infected and uninfected tissue. Iron oxide nanoparticles and perfluorocarbon emulsions, two MR contrast agents or tracer, in contrast, offered this distinction. Iron oxide particles were detected in this regard by their distortion of 1H signal in proton-based MRI, while perfluorocarbon emulsion was identified by 19F MRI. Mammals do not harbor sufficient intrinsic amounts of 19F to deliver specific signal and therefore, 19F MR imaging visualizes only the signal of administered perfluorocarbon emulsion. The in vivo accumulation of perfluorocarbon emulsion can be imaged by 19F MRI and overlayed on a simultaneously acquired 1H MR image, which shows the anatomical context in clear detail. Since this is advantageous compared to contrast agent based MR methods like iron oxide particle-based MRI, further experiments were performed with perfluorocarbon emulsions and 19F MRI.
Experimental studies to elucidate the accumulation of perfluorocarbon emulsion at the site of infection showed robust 19F MR signals after administration between day 2 and at least day 8 p.i.. Perfluorocarbon emulsion accumulated in all investigated mice in the shape of a ‘hollow sphere’ at the rim of the abscess area and the signal remained stable as long as the infection prevailed. In order to identify the mechanism of accumulation, flow cytometry, cell sorting and histology studies were performed. Flow cytometry and cell sorting analysis of immune cells at the site of infection showed that neutrophils, monocytes, macrophages and dendritic cells carried contrast media at the site of infection with neutrophils accounting for the overwhelming portion of perfluorocarbon signal. In general, most of the signal was associated with immune cells, thus indicating specific immune cell dependent accumulation. Histology supported this observation since perfluorocarbon emulsion related fluorescence could only be visualized in close proximity to immune cell nuclei.
After establishing and testing of 19F MRI with perfluorocarbon emulsions as infection imaging modality, the effects of antibiotic therapy upon MR signal was investigated in order to evaluate the capability of this modality for preclinical testing procedure. Thus, the efficacy of vancomycin and linezolid, two clinically highly relevant anti - S. aureus compounds, were tested in the murine thigh infection model. Both of them showed reduction of the colony forming units and bioluminescence signal, but also of perfluorocarbon emulsion accumulation strength and volume at the site of infection, which was visualized and quantified by 19F MRI. The efficacy pattern with linezolid being more efficient in clearing bacterial infection was shown similarly by all three methods. In consequence, 19F MRI with perfluorocarbon emulsion as MR tracer proved to be capable to visualize antibacterial therapy in preclinical testing models.
The next step was consequently to evaluate a promising new compound against S. aureus infections. Thus, lysostaphin, an endo-peptidase that cleaves the cell wall of S. aureus, was tested in different concentrations alone or in combination with oxacillin for efficacy in murine thigh and catheter associated infection models. Lysostaphin only in the concentration of 5 mg/kg body weight or combined with oxacillin in the concentration of 2 mg/kg showed strong reduction of bacterial burden by colony forming unit determination and bioluminescence imaging in both models. The perfluorocarbon accumulation was investigated in the thigh infection model by 19F MRI and was strongly reduced in terms of volume and signal strength in both above-mentioned groups. In general, lysostaphin showed comparable or superior efficacy than vancomycin or oxacillin alone. Therefore, further development of lysostaphin for the treatment of S. aureus infections is recommended by these experiments. Overall, the antibiotic efficacy pattern of all applied antibiotic regimens was similar with all three applied methods, demonstrating the usefulness of MRI for antibiotic efficacy testing. Importantly, treatment with oxacillin either alone or in combination with lysostaphin resulted in stronger perfluorocarbon emulsion accumulation at the site of infection than expected compared to the results from bioluminescence imaging and colony forming unit determination. This might be an indication for immunomodulatory properties of oxacillin.
Further murine infection experiments demonstrated in this context a differential release of cytokine and chemokines in the infected thigh muscle in dependence of the applied antibacterial therapy. Especially treatment with oxacillin, but to a less degree with minocycline or linezolid, too, exhibited high levels of various cytokines and chemokines, although they reduced the bacterial burden efficiently. In consequence, possible immunomodulatory effects of antibacterial compounds have to be taken into account for future applications of imaging platforms relying on the visualization of the immune response. However, this observation opens a new field for these imaging modalities since it might be extraordinary interesting to study the immunomodulatory effects of compounds or even bacterial factors in vivo. And finally, a two modality imaging platform which combines methods to visualize on the one hand the bacterial burden and on the other hand the immune response offers an innovative, new platform to study host-pathogen interaction in vivo in a non-invasive fashion.
In summary, it could be shown that perfluorocarbon emulsions accumulate in immune cells at the site of infection in the murine S. aureus thigh infection model. The accumulation pattern shapes a ‘hollow sphere’ at the rim of the abscess area and its size and perfluorocarbon content is dependent on the severity of disease and/or efficacy of antibiotic therapy. Thus, 19F MRI with perfluorocarbon emulsions is a useful imaging modality to visualize sites and course of infection as well as to evaluate promising antibacterial drug candidates. Furthermore, since the accumulation of tracer depends on immune cells, it might be additionally interesting for studies regarding the immune response to infections, auto-immune diseases or cancer, but also to investigate the efficacy of immunomodulatory compounds and immunization.
N2  - Staphylococcus aureus ist als zweithäufigste Ursache nosokomialer Infektionen eine ernste Bedrohung für Gesundheitssysteme weltweit. Dieses Pathogen ist in der Lage eine Vielzahl verschiedener Krankheitsformen, von oberflächlichen Wund- und Gewebsinfektionen bis hin zu invasiven Erkrankungen wie Bakteriämie oder Pneumonie, in Mensch und Tier zu verursachen. Zudem erwies sich dieser Krankheitserreger in der Vergangenheit als höchst anpassungsfähig durch den Erwerb oder die Entwicklung von Resistenzen gegenüber antibakterieller Substanzen, wodurch die Verfügbarkeit wirksamer Therapiemöglichkeiten drastisch eingeschränkt wurde. Aus diesem Grund ist die Entwicklung neuer Antibiotika und Behandlungsstrategien gegen S. aureus Infektionen von enormem gesellschaftlichem Interesse. Da aber lediglich eine von fünf Substanzen, die in klinische Studien eintreten, später als Medikament zugelassen wird, sollte die präklinische Evaluierung neuer, vielversprechender Therapeutika ebenso verbessert und überdacht werden. Diese Doktorarbeit addressiert in diesem Zusammenhang beide Facetten: zum einen wurde durch Einbeziehung von in vivo Bildgebungstechnologien ein deutlicheres Bild von der Effizienz neuer Substanzen während der präklinischen Evaluierung ermöglicht, zum anderen wurde mit Lysostaphin eine neuartige Substanzklasse zur Behandlung von S. aureus Infektionen getestet.
Primärziel dieser Arbeit war deshalb die Entwicklung und Etablierung einer dualen Bildgebungsplattform bestehend aus Biolumineszenz- (BLI) und Kernspintomografischer (MRI) Bildgebung, um detaillierte Einblicke in Verlauf und Schwere von S. aureus Infektionen im Muskelinfektionsmodell der Maus zu ermöglichen. Die Biolumineszenzbildgebung bakterieller Infektionen wurde durch die Entwicklung von Luziferase-exprimierenden S. aureus Stämmen bereits in früheren Arbeiten ermöglicht und wurde in die Bildgebungsplatform integriert, um die Entwicklung der Bakterienlast nicht-invasiv verfolgen zu können. Kernspintomografie wurde in früheren Arbeiten hingegen kaum zur Darstellung der Effizienz anti-bakterieller Therapien während der Präklinik verwendet. Aus diesem Grund dienten die ersten Experimente zur Erkennung von Vor- und Nachteilen der Darstellung von S. aureus Infektionen im Tiermodell durch verschiedene Kernspintomografische Bildgebungsmethoden. Native, Protonen-basierte Kernspintomografie wies verlängerte T2 Relaxationszeiten im infizierten Muskelgewebe nach, doch eine klare Eingrenzung des infizierten Bereiches war nicht möglich. Die Anwendung von Eisenoxid und Perfluorcarbon Nanopartikeln, zwei Kontrastmittel zur Kernspintomografie, ermöglichte ebendiese. Eisenoxid Nanopartikel wurden durch ihren Signalstöreffekt auf das MR Protonensignal detektiert, während Perfluorcarbon Emulsionen durch 19F basierte Kernspintomografie nachgewiesen wurden. Säugetiere verfügen nicht über ausreichende Mengen von 19F Atomen, um ein spezifisches Signal zu liefern, weshalb 19F Kernspintomografie lediglich applizierte Perfluorcarbon Emulsion in vivo abbilden kann. Dieses Bild kann dann über ein zugleich aufgenommenes Protonen MR Bild gelegt werden, wodurch die Akkumulation des Kontrastmittels im Detail in anatomischer Umgebung dargestellt werden kann. Da es sich hierbei um einen Vorteil gegenüber anderen Kontrastmittel-basierten MR Bildgebungsmethoden wie Eisenoxid Nanopartikel gestützter Kernspintomografie handelt, wurden nachfolgende Experimente mit Perfluorcarbon Emulsionen durchgeführt. Studien zur Bildgebung der Perfluorcarbon Akkumulation am Infektionsherd des Muskelabszessmodels von S. aureus in der Maus zeigten deutliches 19F MR Signal nach Gabe zwischen Tag 2 und Tag 8 p.i.. In allen untersuchten Tieren zeigte sich eine Ansammlung des Kontrastmittels in Form einer Hohlkugel um den Abszessbereich, wobei das Signal während der gesamten Infektion stabil war. Um den Akkumulationsmechanismus zu identifizieren, wurden Durchflusszytometrie-, Zellseparations- und histologische Experimente durchgeführt. In diesem Zusammenhang erwiesen sich Neutrophile, Makrophagen, Monozyten und Dendritische Zellen als Perfluorcarbon-tragende Immunzelltypen, wobei das Gros an Kontrastmittel in Neutrophilen nachgewiesen werden konnte. Im Allgemeinen war der Großteil des Perfluorcarbonsignals mit Immunzellen assoziert, weshalb eine spezifische Immunzell-abhängige Akkumulation wahrscheinlich erscheint. Die histologischen Untersuchungen stützten diese Beobachtung, da die Kontrastmittel assoziierten Fluoreszenzmarker nur in der Nähe von Immunzellnuclei gefunden werden konnten.
Die Etablierung von 19F Kernspintomografie mit Perfluorcarbon Emulsionen als Infektionsbildgebungsmethode ermöglichte im nächsten Schritt die Untersuchung von antibakterieller Therapie auf das MR Signal, um die Eignung dieser Methode für die Präklinik zu evaluieren. Deshalb wurden die Wirksamkeit von Vancomycin und Linezolid, zweier klinisch höchst relevanter Antibiotika zur Behandlung von S. aureus Infektionen, im Muskelabszessmodel der Maus untersucht. Beide erwiesen sich als effizient in der Verringerung der bakteriellen Last im infizierten Muskel und des Bakterien-Biolumineszenzsignals, aber auch bei der Reduktion der Stärke und des Volumens der Perfluorcarbon Akkumulation am Infektionsherd, die durch 19F Kernspintomografie dargestellt und vermessen wurde. Alle drei Methoden zeigten dabei das gleiche Effizienzmuster nach dem Linezolid wirksamer bei der Bekämpfung der Infektion war. Folglich erwies sich 19F Kernspintomografie mit Perfluorcarbon Emulsionen als effektiv um den antibakteriellen Effekt von Antibiotika in präklinischen Modellen zu untersuchen.
Konsequenterweise wurde im nächsten Schritt eine neuartige Substanz zur Behandlung von S. aureus Infektionen mit Hilfe der Bildgebungsplattform untersucht: Lyostaphin. Diese Endopeptidase schneidet spezifisch die Zellwand von S. aureus und wurde in verschiedenen Konzentrationen oder in Kombination mit Oxacillin im Muskelabszess- oder Katheterinfektionsmodell der Maus gestestet. Lysostaphin in der Konzentration von 5 mg/kg Körpergewicht (Maus) oder Lysostaphin in der Konzentration von 2 mg/kg in Kombination mit Oxacillin führten zu einer starken Verringerung der Bakterienlast und des Biolumineszenzsignals in beiden Modellen. Die Ansammlung von Perfluorcarbon Kontrastmittel war zudem in diesen beiden Gruppen stark reduziert im Vergleich zur Negativkontrolle und den mit Vancomycin und Oxacillin behandelten Tieren. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass Lysostaphin eine vergleichbare oder bessere Wirksamkeit als Vancomycin oder Oxacillin alleine lieferte. Aus diesem Grund scheint eine Weiterentwicklung dieser Substanz zur Behandlung von S. aureus empfohlen. Der Nutzen der Bildgebungsplattform wurde in diesen Experimenten zudem dadurch deutlich, dass alle drei Methoden zur Bestimmung der Schwere der Erkrankung ähnliche Wirksamkeiten der Antibiotika anzeigten. Dennoch muss festgestellt werden, dass die Gruppen, die Oxacillin entweder alleine oder in Kombination mit Lysostaphin erhielten, stärkere Perfluorocarbon Akkumulation am Infektionsherd aufwiesen als von den Bakterienlast- oder Biolumineszenz-Ergebnissen zu erwarten gewesen wäre. Ein Grund hierfür könnten mögliche immunomodulatorischen Effekte von Oxacillin sein. Tatsächlich zeigten weitere Experimente Variationen in den Konzentrationen von Cytokinen und Chemokinen im infizierten Muskel in Abhängigkeit der verwendeten Antibiotikatherapie. Besonders die Behandlung mit Oxacillin, in geringerem Maße aber auch mit Minocyclin oder Linezolid, führte zu erhöhten Konzentrationen, wenngleich die Bakterienlast deutlich reduziert werden konnte. Folglich sollten mögliche immuno-modulatorischen Effekte antibakterieller Substanzen bei zukünftiger Anwendung von Bildgebungsplattform, die auf dem Markieren von Immunzellen basieren, mit ins Kalkül gezogen werden. Auf der anderen Seite eröffnet diese Beobachtung ein neues Anwendungsfeld für diese Bildgebungsmethoden, da es außerordentlich interessant erscheint, damit immuno-modulatorische Substanzen oder bakterielle Faktoren in vivo zu untersuchen. Zu guter Letzt, ermöglicht diese Bildgebungsplattform, die Methoden zur Darstellung der bakteriellen Last auf der einen und des Immunsystems auf der anderen Seite verknüpft, eine innovative, neue Möglichkeit Wirt-Pathogen Interaktionen nicht-invasiv und in vivo studieren zu können.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass Perfluorcarbon Emulsionen in Immunzellen am Infektionsherd des S. aureus Muskelabszessmodells der Maus akkumulieren. Die Ansammlung formt eine Hohlkugel am Rand des Abszessbereiches, deren Größe und Fluorgehalt von der Schwere der Erkrankung und/oder der Wirksamkeit der angewandten Antibiotikatherapie abhängt. Aus diesem Grund erwies sich 19F Kernspintomografie mit Perfluorcarbon Emulsionen als Kontrastmittel als nützliche Platform zur präklinischen Evaluierung antibakterieller Substanzen. Weiterhin erscheint diese Methode wegen der Akkumulation des Kontrastmittels in Immunzellen, als interessant zum Studium der Immunantwort gegenüber Infektionen, aber auch Krebs oder Autoimmunerkrankungen sowie zur Erforschung von immuno-modulatorischen Substanzen und Impfansätzen.
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Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-105349
ER  -