TY - THES A1 - Anjana Vaman, Vamadevan Sujatha T1 - LASP1, a newly identified melanocytic protein with a possible role in melanin release, but not in melanoma progression T1 - LASP1, ein neu identifiziertes melanozytischen Protein mit einer möglichen Rolle bei der Freisetzung von Melanin, jedoch nicht in Melanomprogression N2 - LIM and SH3 protein 1 (LASP1) is a nucleocytoplasmic scaffolding protein. LASP1 interacts with various cytoskeletal proteins via its domain structure and is known to participate in physiological processes of cells. In the present study, a detailed investigation of the expression pattern of LASP1 protein in normal skin, melanocytic nevi and melanoma was carried out and the melanocyte–specific function of LASP1 was analyzed. LASP1 protein was identified in stratum basale of skin epidermis and a very high level was detected in nevi, the benign tumor of melanocyte. In the highly proliferative basal cells, an additional distinct nuclear localization of the protein was noted. In different tumor entities, an elevated LASP1 expression and nuclear localization, correlated positively with malignancy and tumor grade. However, LASP1 level was determined to be very low in melanoma and even reduced in metastases. Melanoma is distinguished as the first tumor tested to date – that displayed an absence of elevated LASP1 expression. In addition no significant relation was observed between LASP1 protein expression and clinicopathological parameters in melanoma. The epidermal melanin unit of skin comprises of melanocytes and keratinocytes. Melanocytes are specialized cells that synthesize the photo protective coloring pigment, melanin inside unique organelles called melanosomes. The presence of LASP1 in melanocytes is reported for the first time through this study and the existence was confirmed by immunoblotting analysis in cultured normal human epidermal melanocyte (NHEM) and in melanoma cell lines, along with the immunohistostaining imaging in normal skin and in melanocytic nevi. LASP1 depletion in MaMel2 cells revealed a moderate increase in the intracellular melanin level independently of de novo melanogenesis, pointing to a partial hindrance in melanin release. Immunofluorescence images of NHEM and MaMel2 cells visualized co-localization of LASP1 with dynamin and tyrosinase concomitant with melanosomes at the dendrite tips of the cells. Melanosome isolation experiments by sucrose density gradient centrifugation clearly demonstrated the presence of LASP1 and the melanosome specific markers tyrosinase and TRP1 in late stage melanosomes. The study identified LASP1 and dynamin as novel binding partners in melanocytes and provides first evidence for the existence of LASP1 and dynamin (a protein well–known for its involvement in vesicle formation and budding) in melanosomes. Co-localization of LASP1 and dynamin along the dendrites and at the tips of the melanocytes indicates a potential participation of the two proteins in the membrane vesicle fission at the plasma membrane. In summary, a possible involvement of LASP1 in the actin–dynamin mediated membrane fission and exocytosis of melanin laden melanosome vesicles into the extracellular matrix is suggested. N2 - LIM und SH3 protein 1 (LASP1) ist ein nukleozytoplasmatischen Gerüstprotein. LASP1 interagiert über seine Domänenstruktur mit verschiedenen Zytoskelettproteinen und ist an physiologischen Prozessen wie Migration und Zellproliferation beteiligt. In der vorliegenden Studie wurde eine detaillierte Untersuchung des Expressionsmusters von LASP1 in normale Haut, Nävi und Melanom durchgeführt und die Melanozyten-spezifische Funktion des Proteins analysiert. LASP1 konnte durch immunhistologische Färbungen im Stratum basale der Epidermis und in hoher Konzentration in Nävi (gutartige Tumore der Melanozyten) nachgewiesen werden, während die Expression in Melanom und Metastasen sehr gering ist. Auch wurde kein signifikanter Zusammenhang zwischen der LASP1 Proteinexpression in Melanomen und den klinisch-pathologischen Parametern bei 58 Patienten festgestellt. Dies steht im Gegensatz zu allen bisher getesteten Tumoren (u.a. Brust, HCC und Medulloblastom), bei der eine erhöhte LASP1 Expression in den Tumoren beobachtet wurde, die mit dem Tumorgrad korrelierte. Die hochproliferativen Basalzellen der Epidermis bestehen aus Keratinozyten und Melanozyten und weisen, im Gegensatz zu Nävi und Melanomzellen, eine deutliche Kernlokalisation des LASP1 Proteins auf. Melanozyten sind spezialisierte Zellen, die das UV-Schutzfarbpigment Melanin in einzigartigen Organellen, genannt Melanosomen, synthetisieren. Die Expression von LASP1 in diesen Melanozyten konnte zum ersten Mal in dieser Studie nachgewiesen werden. Immunfluoreszenzaufnahmen und Western Blots mit kultivierten normalen menschlichen epidermalen Melanozyten (NHEM) und Melanom-Zelllinien bestätigen die LASP1 Expression. Funktionelle Experimente mit LASP1 depletierten Zellen zeigen eine erhöhte Melaninkonzentration, die unabhängig von der de novo Melanogenese ist. Immunfluoreszenaufnahmen visualisieren eine Ko-Lokalisation von LASP1 mit Tyrosinase an den Melanosomen in den Zellausläufern von pigmentierten MaMel2 Zellen. Eine Auftrennung der einzelnen Melanosomenstadien durch Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation erlauben die Detektion von LASP1 mit Dynamin, TRP1 und Tyrosinase in späten Stadium IV Melanosomen. Die vorliegende Studie liefert den ersten Beweis für die Existenz von Dynamin (einem für die Vesikelbildung essentiellem Protein) in Melanosomen und identifiziert Dynamin als neuartigen Bindungspartner von LASP1 in Melanozyten. Die Ko-Lokalisierung LASP1 und Dynamin entlang der Dendriten und in den Spitzen der Melanozyten weist auf eine mögliche Beteiligung beider Proteine an der Melanosomen-Vesikel-Abspaltung an der Plasmamembran hin. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass LASP1 an der Actin-Dynamin vermittelten Exocytose von Melanin-beladenen Melanosomvesikeln in die Extrazellulärmatrix beteiligt ist. KW - Melanom KW - Melanin KW - LASP1 KW - melanocytic nevi KW - melanoma cancer KW - Molekularbiologie KW - Melanin release Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-116316 ER - TY - THES A1 - Braasch, Ingo T1 - Evolution by genome duplication: insights from vertebrate neural crest signaling and pigmentation pathways in teleost fishes T1 - Evolution durch Genomverdoppelung: Erkenntnisse aus Analysen der Signalwege in der Neuralleiste der Vertebraten und in den Pigmentzellen im Fisch N2 - Gene and genome duplications are major mechanisms of eukaryotic genome evolution. Three rounds of genome duplication have occurred in the vertebrate lineage, two rounds (1R, 2R) during early vertebrate evolution and a third round, the fish-specific genome duplication (FSGD), in ray-finned fishes at the base of the teleost lineage. Whole genome duplications (WGDs) are considered to facilitate speciation processes and to provide the genetic raw material for major evolutionary transitions and increases in morphological complexity. In the present study, I have used comparative genomic approaches combining molecular phylogenetic reconstructions, synteny analyses as well as gene function studies (expression analyses and knockdown experiments) to investigate the evolutionary consequences and significance of the three vertebrate WGDs. First, the evolutionary history of the endothelin signaling system consisting of endothelin ligands and receptors was reconstructed. The endothelin system is a key component for the development of a major vertebrate innovation, the neural crest. This analysis shows that the endothelin system emerged in an ancestor of the vertebrate lineage and that its members in extant vertebrate genomes are derived from the vertebrate WGDs. Each round of WGD was followed by co-evolution of the expanding endothelin ligand and receptor repertoires. This supports the importance of genome duplications for the origin and diversification of the neural crest, but also underlines a major role for the co-option of new genes into the neural crest regulatory network. Next, I have studied the impact of the FSGD on the evolution of teleost pigment cell development and differentiation. The investigation of 128 genes showed that pigmentation genes have been preferentially retained in duplicate after the FSGD so that extant teleost genomes contain around 30% more putative pigmentation genes than tetrapods. Large parts of pigment cell regulatory pathways are present in duplicate being potentially involved in teleost pigmentary innovations. There are also important differences in the retention of duplicated pigmentation genes among divergent teleost lineages. Functional studies of pigment synthesis enzymes in zebrafish and medaka, particularly of the tyrosinase family, revealed lineage-specific functional evolution of duplicated pigmentation genes in teleosts, but also pointed to anciently conserved gene functions in vertebrates. These results suggest that the FSGD has facilitated the evolution of the teleost pigmentary system, which is the most complex and diverse among vertebrates. In conclusion, the present study supports a major role of WGDs for phenotypic evolution and biodiversity in vertebrates, particularly in fish. N2 - Gen- und Genomverdopplungen sind wichtige Mechanismen der Genomevolution in Eukaryonten. Im Verlauf der Evolution der Wirbeltiere gab es drei wichtige Genomduplikationen. Zwei Genomverdopplungen (1R, 2R) fanden während der sehr frühen Vertebratenevolution statt. In der Linie der Fische kam es an der Basis der Teleostier zu einer weiteren, fischspezifischen Genomduplikation (FSGD). Man nimmt an, dass Genomduplizierungen Artbildungsprozesse begünstigen und dass sie zusätzliches genetisches Material für wichtige evolutionäre Übergänge und für die Steigerung morphologischer Komplexität erzeugen. In der vorliegenden Arbeit wurden Methoden der vergleichenden und funktionellen Genomik gewählt, um die Auswirkungen und die Bedeutung der drei Genomverdopplungen bei Vertebraten zu untersuchen. Dazu wurden molekularphylogenetische Stammbaumanalysen und Synteniedaten mit Genexpressionsstudien und Knockdown-Experimenten kombiniert. Zunächst wurde die Evolution des Endothelin-Signalsystems rekonstruiert. Dieses besteht aus Endothelin-Liganden und -Rezeptoren und hat eine Schlüsselrolle in die Entwicklung der Neuralleiste. Die Neuralleiste und die von ihr abgeleiteten Zelltypen sind wirbeltierspezifische Innovationen. Die Analyse zeigt, dass das Endothelin-System in einem gemeinsamen Vorfahren der Vertebraten entstanden ist. Die in den Genomen rezenter Vertebraten vorkommenden Komponenten des Endothelin-Systems sind durch die drei Genomverdoppelungen entstanden. Nach jeder der Duplizierungen kam es zur Ko-Evolution der Liganden- und Rezeptorenfamilien. Die Evolution des Endothelin-System unterstreicht daher die Bedeutung der Genomduplizierungen für den Ursprung und die Diversifizierung der Neuralleiste. Sie weist aber auch auf eine wichtige Rolle für die Integrierung neuer Gene in das regulatorische Netzwerk der Neuralleiste hin. Im Weiteren wurde der Einfluss der FSGD auf die Evolution der Pigmentzellentwicklung und differenzierung in Teleostiern untersucht. Die evolutionäre Analyse von 128 Genen zeigte, dass Pigmentierungsgene nach der FSGD bevorzugt in zwei Kopien erhalten geblieben sind. Daher besitzen rezente Teleostier im Vergleich zu Landwirbeltieren zusätzlich ca. 30% mehr Gene mit potentiellen Funktionen für die Pigmentierung. Große Teile der regulatorischen Signalwege in den Pigmentzellen liegen daher als zwei Kopien vor. Diese waren möglicherweise an der Evolution von Innovationen in der Körperfärbung von Teleostiern beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurden auch wichtige Unterschiede zwischen verschiedenen Fischgruppen im Erhalt duplizierter Pigmentierungsgene gefunden. Funktionelle Studien bei Zebrafish und bei Medaka an Enzymen der Pigmentsynthese, insbesondere der Tyrosinase-Familie, gaben Hinweise darauf, dass die funktionelle Evolution duplizierter Pigmentierungsgene in Fischen linienspezifisch verlaufen kann. Die Studien ergaben außerdem, dass bestimmte Funktionen der Pigmentsyntheseenzyme innerhalb der Vertebraten konserviert sind. Die Evolution des Pigmentierungssystems der Fische, welches das vielfältigste und komplexeste innerhalb der Wirbeltiere ist, wurde somit maßgeblich durch die FSGD beeinflusst. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit darauf hin, dass die Verdopplung ganzer Genome ein wichtiger Mechanismus der phänotypische Evolution bei Vertebraten ist und damit in besonderem Maße zur ihrer Biodiversität beiträgt. KW - Molekulare Evolution KW - Fische KW - Entwicklungsbiologie KW - Evolutionsbiologie KW - Genanalyse KW - Pigmentierung KW - Melanin KW - Vertebrat KW - Neuralleiste KW - Gen-/Genomverdoppelung KW - gene/genome duplication KW - fish KW - vertebrate KW - neural crest KW - pigmentation Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35702 ER -