TY - THES A1 - Cheng, Cheng T1 - Metabolomics and dereplication-based isolation of novel bioactive natural products from marine sponge-associated actinomycetes T1 - Metabolomik und Dereplikations-basierte Isolierung von neuen bioaktiven Naturstoffen aus marinen, Schwamm-assoziierten Actinomyceten N2 - Marine sponge-associated actinomycetes are considered as promising source for the discovery of novel biologically active compounds. Metabolomics coupled multivariate analysis can efficiently reduce the chemical redundancy of re-isolating known compounds at the very early stage of natural product discovery. This Ph.D. project aimed to isolate biologically active secondary metabolites from actinomycetes associated with different Mediterranean sponges with the assistance of metabolomics tools to implement a rapid dereplication and chemically distinct candidate targeting for further up-scaling compounds isolation. This study first focused on the recovery of actinomycetes from marine sponges by various cultivation efforts. Twelve different media and two separate pre-treatments of each bacterial extract were designed and applied to facilitate actinomycete diversity and richness. A total of 64 actinomycetes were isolated from 12 different marine sponge species. The isolates were affiliated to 23 genera representing 8 different suborders based on nearly full-length 16S rRNA gene sequencing. Four putatively novel species belonging to the genera Geodermatophilus, Microlunatus, Rhodococcus, and Actinomycetospora were identified based on a sequence similarity <98.5% to validly described 16S rRNA gene sequences. 20% of the isolated actinomycetes was shown to exhibit diverse biological properties, including antioxidant, anti-Bacillus sp., anti-Aspergillus sp., and antitrypanosomal activities. The metabolomics approaches combined with the bioassay results identified two candidate strains Streptomyces sp. SBT348 and Streptomyces sp. SBT345 for further up-scaling cultivation and compounds isolation. Four compounds were isolated from Streptomyces sp. SBT348. Three of these compounds including the new cyclic dipeptide petrocidin A were previously highlighted in the metabolomics analyses, corroborating the feasibility of metabolomics approaches in novel compounds discovery. These four compounds were also tested against two pathogen microorganisms since the same activities were shown in their crude extract in the preliminary bioassay screening, however none of them displayed the expected activities, which may ascribe to the insufficient amount obtained. Streptomyces sp. SBT345 yielded 5 secondary metabolites, three of which were identified as new natural products, namely strepthonium A, ageloline A and strepoxazine A. Strepthonium A inhibited the production of Shiga toxin produced by enterohemorrhagic Escherichia coli at a concentration of 80 μM, without interfering with the bacterial growth. Ageloline A exhibited antioxidant activity and inhibited the inclusion of Chlamydia trachomatis with an IC50 value of 9.54 ± 0.36 μM. Strepoxazine A displayed antiproliferative property towards human promyelocytic HL-60 cells with an IC50 value of 16 μg/ml. 11 These results highlighted marine sponges as a rich source for novel actinomycetes and further exhibited the significance of marine sponge-associated actinomycetes as promising producers of novel biologically active compounds. The chemometrics coupled metabolomics approach also demonstrated its feasibility and efficacy in natural product discovery. N2 - Schwamm-assoziierte Actinomyceten stellen eine vielversprechende Quelle für die Entdeckung neuer, biologisch aktiver Verbindungen dar. Metabolomik gekoppelte multivariate Datenalyse kann die erneute Isolation bekannter chemischer Verbindungen in einem frühen Stadium drastisch reduzieren und der Entdeckung neuer Naturstoffe dadurch effizienter machen. Das Ziel dieser Arbeit war es, biologisch aktive Sekundärmetabolite aus Actinomyceten, welche mit Mittelmeerschwämmen assoziiert sind, zu isolieren. Mithilfe von Werkzeugen aus der Metabolomik soll eine schnelle Dereplikation sowie gezielte Auswahl an chemischen Verbindungen implementiert werden um diese nachfolgend und in hohem Durchsatz isolieren zu können. Diese Promotions-Arbeit konzentriert sich zunächst auf die Isolation von Actinomyceten aus marinen Schwämmen mittels verschiedener Kultivierungsmethoden. Zwölf verschiedene Medien sowie zwei unterschiedliche Vorbehandlungen der bakteriellen Extrakte wurden angewendet, um die Kultivierung diverser Actinomyceten zu ermöglichen. Insgesamt konnten damit 64 Actinomyceten aus 12 unterschiedlichen Schwämmen isoliert worden. Mithilfe der Sequenzierung von 16S rRNA Sequenzen konnten diese bakteriellen Isolate 23 Gattungen und 8 Unterordnungen zugewiesen werden. Aufgrund von Sequenzähnlichkeiten <98.5% wurden 4 neue Arten identifiziert, welche zu den folgenden Gattungen gehören: Geodermatophilus, Microlunatus, Rhodococcus and Actinomycetospora. 20% der isolierten Actinomyceten wurde gezeigt, die verschiedene biologische Eigenschaften aufweisen, einschließlich antixocidativer, antibakterieller, Fungiziden Eigenschaften sowie ihrer anti- Trypanosomen -Aktivitäten. Mithilfe metabolomischer Methoden und Bioassays konnten zwei bakterielle Stämme, Streptomyces sp. SBT348 und Streptomyces sp. SBT345, für deren Kultivierung und Isolierung chemischer Verbindung identifiziert werden. Aus dem Stamm Streptomyces sp. SBT348 konnten vier neue Verbindungen isoliert werden, darunter ein neues, zyklisches Dipeptid Petrocidin A. Drei dieser Verbindungen, einschließlich Petrocidin A, wurden bei der Datenanalyse der Metabolomik hervorgehoben. Das bestätigte die Durchführbarkeit metabolomischer Methoden für die Entdeckung neuer Verbindungen. Allerdings zeigte keine Verbindung die erwarteten Aktivitäten. Das könnte darauf zurückgeführt werden, dass die erhaltenen Mengen unzureichend waren. In Streptomyces sp. SBT345 konnten fünf Sekundärmetabolite identifiziert werden, von welchen drei - Strepthonium A, Ageloline A und Strepoxazine A - als neue Naturstoffe identifiziert werden konnten. Durch Strepthonium A in einer Konzentration von 80 µM konnte die Produktion des Shiga-Toxins in Escherichia coli gehemmt werden, ohne dessen bakterielles Wachstum zu beeinflussen. Ageloline A wirkte antioxidativ und hemmte Chlamydia trachomatis mit einem IC50 Wert von 9.54 ± 0.36 µM. Strepoxazine A zeigte eine wachstumshemmende Wirkung gegenüber HL-60 Zellen (humane Promyelozytenleukämie-Zellen) bei einem IC50 Wert von 16 µg/ml. Die Ergebnisse zeigen auf, dass marine Schwämme viele bisher unbekannte Actinomyceten beherbergen. Diesen Actinomyceten ist eine hohe Bedeutung beizumessen, da sie eine vielversprechende Quelle für neue, biologisch aktive Verbindungen darstellen. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass der methodische Ansatz via chemometrischer und metabolomischer Methoden gut durchführbar und effizient ist und daher für die Entdeckung von Naturstoffen sehr gut geeignet ist. KW - Actinomyces KW - Schwämme KW - Sekundärmetabolit KW - Metabolomik KW - Marine natural products KW - Actinomycetes KW - Metabolomics KW - Marine sponges KW - Natural products KW - Dereplicaiton Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-136587 ER - TY - THES A1 - Faber, Johan Henrik T1 - Naphthylisoquinoline Alkaloids : Structural Elucidation, Metabolism and Functional Analysis of their Bioactivities T1 - Naphthylisochinolinalkaloide: Strukturaufklärung, Metabolismus und Untersuchungen zu Wirkmechanismen N2 - This thesis deals with the isolation and structural elucidation of bioactive naphthylisoquinoline alkaloids and related analogs. The mode of action of the antiplasmodial activity exhibited by the naphthylisoquinoline alkaloids was explored and compared to that of the antimalarial drug chloroquine. Furthermore, the phase 1 and 2 metabolism of dioncophyllines A and C and dioncopeltine A were investigated. In detail the following results have been obtained: • From the leaves of the recently discovered East African liana A. tanzaniensis six naphthylisoquinoline alkaloids were isolated. • The leaves of a botanical yet undescribed Ancistrocladus species, collected by Prof. Dr. V. Mudogo in the Democratic Republic of Congo in the habitat Yeteto near the town Ikela, were analyzed for naphthylisoquinoline alkaloids for the first time. The isolation work led to the first identification of an N,C-coupled naphthyldihydroisoquinoline alkaloid; ancistrocladinium B. Phytochemical investigation of the roots of the Congolese Ancistrocladus species (habitat Yeteto), , afforded five new derivatives of known naphthylisoquinoline alkaloids, namely 5'-O-demethylhamatine, 5'-O-demethylhamatinine, 6-O-demethylancistroealaine A, 6,5'-O,O-didemethylancistroealaine A, and 5-epi-6-O-methylancistrobertsonine A, along with six known naphthylisoquinoline alkaloids. • The antiplasmodial activity guided purification of 60Co irradiated samples containing commercially available naphthylisoquinoline related substances, afforded the isolation of the irradiation products 3,4-dihydro-1-isoquinolinone, 3,4-dihydro-1-isoquinolineamine, and 1,2,3,4-tetrahydro-1,2-diazirino-isoquinoline. The compounds were found to be more active than the starting material, although only exhibiting weak antiplasmodial activity against P. falciparum. • The effect on the absorption spectrum of FPIX due to complex formation with the naphthylisoquinoline alkaloids dioncophyllines A and C, dioncopeltine A korupensamine A, and ancistrocladine was examined by a titration study. Job's plot analyses by UV-spectroscopy determined the stoichiometry for the complex formation of FPIX and naphthylisoquinoline alkaloids to be 2:1. Furthermore, the dissociation constants for the complexation with FPIX were determined for each of the naphthylisoquinoline alkaloids investigated. Dioncophylline C and dioncopeltine A were found to possess dissociation constants, which are comparable to the one reported for the antimalarial drug chloroquine. The ability of ESI to transfer noncovalent solution-phase assemblies intact into the gas phase, was conducted on solution mixtures of naphthylisoquinoline alkaloid and FPIX, as well as on mixtures of chloroquine and FPIX. The mass spectrometry analyses revealed several peaks, which corresponded to the complex formation of FPIX to the respective ligands investigated. The most interesting results obtained were the detection of peaks corresponding to the complex formation between a chelated dimer of FPIX and dioncophylline Cand of peaks corresponding to a double protonated tetramer of FPIX – consisting of two chelated -oxo dimers of FPIX – in complex formation with two molecules of chloroquine. • Two phase 1 metabolism products of dioncophylline A were identified. Coelution in combination with HPLC-MS/MS, NMR, and CD investigations assigned the major metabolic product as 5'-O-demethyldioncophylline A. The minor metabolic product was only present in small amounts, which disabled an unambiguous structural characterization of the compound. However, as deduced from the mass spectrometry analyses and exclusion of a possible metabolic oxidation product by coelution with authentic reference material, the metabolite should possess a 4-hydroxylated isoquinoline portion and is assumed to be represented by structure. Dioncophylline C and dioncopeltine A were found to be stable to phase 1 metabolism reactions caused by rat liver microsomes. N2 - • Aus Blättern der ostafrikanischen Lianenart Ancistrocladus tanzaniensis wurden sechs Naphthylischinolin-Alkaloide isoliert, darunter Ancistrotectorilin die bereits aus A. tectorius isoliert wurde. Von einer botanisch bisher unbeschriebenen Ancistrocladus Art, gesammelt von Prof. Dr. V. Mudogo in der Demokratischen Republik Kongo bei Yeteto, in der Nähe der Stadt Ikela, wurden die Blätter i auf ihren Inhalt an Naphthylischinolin-Alkloiden phytochemisch untersucht. Dabei konnte das erste N,C gekuppelte Naphthyldihydroisochinolin-Alkaloid, Ancistrocladinium B. • Die phytochemische Untersuchung der Wurzeln der Kongolesischen Ancistrocladus Art (Fundort Yeteto) wurde ausgeführt und ergab die Isolierung von fünf unbekannten Derivaten bereits bekannter Naphthylisochinolin-Alkaloide: 5'-O-Demethylhamatin , 5'-O-Demethylhamatinin, 6-O-Demethylancistroealain A, 6,5'-O,O-Didemethylancistroealain A und 5-epi-6-O-Methylancistrobertsonine A. Parallel dazu wurden sechs bereits bekannte Naphthylisochinolin-Alkaloide identifiziert. Die bioaktivitätsgeleitete Reinigung antiplasmodialer 60Co bestrahlter Proben –kommerziel verfügbarer Naphthylisochinolin abgeleiteter Substanzen – führte zur Isolierung verschiedener Bestrahlungs-Produkte, nämlich 3,4-Dihydro-1-Isochinolinon, 3,4-Dihydro-1-isochinolineamin, und 1,2,3,4-Tetrahydro-1,2-Diazirino-Isochinolin. Die isolierten Substanzen waren jeweils aktiver als die Edukte, zeigten aber trotzdem nur antiplasmodiale Wirksamkeit im mittleren Berreich. • Die Auswirkung der Komplexbildung unterschiedlicher Naphthylisochinolin-Alkloide – Dioncophylline A und C, Dioncopeltin A, Korupensamin A, und Ancistrocladin – auf das Absorptions-Spektrum von FPIX wurde mittels eines Titrationsexperimentes, unter Anwendung von UV Spektroskopie, untersucht. Durch Job's Plot Analysen konnte so die Stöchiometrie der Komplex-Bildung zwischen FPIX und Naphthylisochinolin-Alkaloide zu 2:1 bestimmt werden. Weiterhin konnten die einzelnen Dissoziationskonstanten für die Komplexierung von FPIX mit den untersuchten Naphthylisochinolin-Alkaloiden errechnet werden. Die für Dioncophyllin C und Dioncopeltin A bestimmten Dissoziationskonstanten sind mit der in der Literatur für das antimalariale Arzneitmittel Chloroquine vergleichbar. Die Möglichkeit durch ESI nicht kovalent gelöste Komponenten intakt in die Gas-Phase zu transferieren, wurden auf Lösungs-Gemische von Naphthylischinolin-Alkaloiden und FPIX sowie auf Lösungs-Gemische von Chloroquine und FPIX angewandt. Die massenspektroskopischen Analysen ergaben mehrere Peaks, die der Komplex-Bildung von FPIX mit den einzeln untersuchten Liganden entsprachen. Die interessantesten Ergebnisse waren dabei die Entdeckung von Peaks, die die Komplex-Bildung zwischen einem chelatisierten Dimer von FPIX mit Dioncophyllin C, sowie zwischen einem doppelt protonierten Tetramer von FPIX – bestehend aus zwei chelatisierten -oxo Dimeren von FPIX – mit zwei Molkülen Chloroquine entsprachen. Zwei Phase 1 Metabolite von Dioncophyllin A konnten in Kooperation mit M. Sieber identifiziert werden. Die Struktur des Haupt-Metabolismus-Produktes konnte durch Koelution, HPLC-MS/MS, NMR und CD Untersuchungen als 5'-O-demethyldioncophyllin A bestätigt werden. KW - Naphthylisochinolinalkaloide KW - Strukturaufklärung KW - Naturstoffe KW - Naphthylisochinoline KW - Metabolismus KW - Strukturaufklärung KW - Wirkmechanismus KW - Natural products KW - naphthylisoquinoline alkaloids KW - metabolism KW - structural elucidation KW - mode of action Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22789 ER -