TY  - THES
A1  - Fichtner, Alina Suzann
T1  - Alpaca, armadillo and cotton rat as new animal models for nonconventional T cells: Identification of cell populations and analysis of antigen receptors and ligands
T1  - Alpaka, Gürteltier und Baumwollratte als neue Tiermodelle für nichtkonventionelle T-Zellen: Identifikation von Zellpopulationen und Analyse von Antigenrezeptoren und Liganden
N2  - In this thesis, three species were investigated for the conservation of two non-conventional T cell systems, the CD1d/ iNKT cell system and the BTN3/ Vγ9Vδ2 T cell system. Non-conventional T cells are αβ or γδ T cells that do not fit into the classical mode of antigen recognition and adaptive responses. These T cells recognize antigens different from classical peptide antigens and are not restricted to the polymorphic MHC molecules but rather to non-polymorphic antigen-presenting molecules. The iNKT cell subset is restricted by the lipid antigen-presenting molecule CD1d and carries out immunomodulatory functions by rapid cytokine secretion. The molecular basis of this system, the semi-invariant iNKT TCR chains and CD1d were proven to be expressed and compared to homologs in human and rodents. Cotton rats possess multiple members of the AV14 and BV8 family and only one isoform of CD1d which is comparable to findings in the rat.
Moreover, the reactivity of primary cells to glycolipid antigens could be shown, and an iNKT
cell-like population was detected in primary cells using newly developed cotton rat CD1d oligomers. These were also applied to test the capacity of CD1d to present typical glycolipid
antigens to iNKT TCR transductants. In addition, expression of cotton rat iNKT TCR α and β chains in TCR-negative cell lines was used to show successful pairing and detection of glycolipids in the context of CD1d. In summary, the conservation of a functional CD1d/iNKT cell system in the cotton rat could be shown, and tools were developed to study this cell subset in the course of infectious diseases. The Vγ9Vδ2 T cell subset is the major γδ T cell subset in human peripheral blood and has the unique ability to contribute to immune surveillance by detecting pyrophosphorylated metabolites of isoprenoid synthesis that indicate cell stress, transformation or infection. Up to this date, phosphoantigen-reactive γδ T cells have only been shown in primate species. However, evidence for the existence and functional conservation of the genes implied in the BTN3/Vγ9Vδ2 T cell system was found in several placental mammal species,
and two candidate species were chosen for further investigation. The nine-banded armadillo, a valuable model for leprosy research, was shown to possess homologous genes to TRGV9, TRDV2 and BTN3. In this study, the expression of productive rearrangements of TRDV2 gene segments could be shown in peripheral blood samples, but no evidence was found for the expression of a functional TRGV9 rearrangement or BTN3 molecules. Moreover, determinants of phosphoantigen-reactive Vγ9Vδ2 T cells and functional BTN3 molecules were found to still be prevalent in armadillo genes. This makes the armadillo an interesting model to study the structural determinants that allow phosphoantigen recognition by a functional Vγ9Vδ2 T cell subset although this species is merely a witness for a functional system in a placental mammal ancestor. In contrast, alpacas were shown to express functional Vγ9Vδ2 T cells which conserved many features of the human counterpart. Expression of Vγ9Vδ2 pairings could be shown by single-cell PCR and functional phosphoantigenreactive pairings were observed. This phosphoantigen reactivity was also shown in PBMC cultures with a newly developed antibody specific for alpaca Vδ2Jδ4 chains. Moreover, a more detailed study of the alpaca TCR repertoire showed similarities to “γδ high” species like
camelids and cattle which possess an extended family of TRDV genes. The γ and δ loci of alpaca
TCR genes were drafted based on genomic information and cDNA studies and provide an overview for more detailed studies. Conservation of phosphoantigen recognition by the single BTN3 molecule of alpacas was shown in 293T knock out cell lines, and BTN3 detection on PBMCs was investigated with a newly developed alpaca BTN3-specific antibody. These findings prove the existence of a functional BTN3-dependent phosphoantigen-reactive Vγ9Vδ2 T cell subset and provide a basis for the future study of this cell system in a non-primate species. Moreover, as the first non-primate candidate species with the BTN3/Vγ9Vδ2 T cell system the alpaca is an important outgroup for research in this field. The use of a single BTN3 variant in contrast to three human isoforms that work together renders the alpaca a unique and to this date indispensable model for Vγ9Vδ2 T cells. 
In conclusion, this study provides an overview of the applicability of new animal models in the
study of the non-conventional T cell subsets iNKT cells and Vγ9Vδ2 T cells and leads the way for a better understanding of structural and functional relationships.
N2  - In dieser Arbeit wurden drei Spezies hinsichtlich ihrer Konservierung von unkonventionellen T-Zellen und ihren Interaktionspartnern, dem CD1d/iNKT-Zellsystem und dem BTN3/Vγ9Vδ2 T-Zellsystem, untersucht. Nicht-konventionelle T-Zellen sind αβ oder γδ T-Zellen, die nicht in das klassische Schema der adaptiven Immunantwort und Peptidantigenerkennung via MHC passen. Diese speziellen T-Zellen erkennen andere Antigene und unterliegen nicht der MHC-Restriktion, sondern interagieren mit meist nicht-polymorphen antigenpräsentierenden Molekülen. 
iNKT-Zellen erkennen Lipide, die von CD1d präsentiert werden, und führen immunmodulatorische Funktionen durch schnelle Zytokinproduktion aus. Charakteristisch ist die Expression einer semi-invarianten TCR α-Kette mit einer AV14/AJ18-Umlagerung in Mäusen und Ratten und der homologen Umlagerung AV24/AJ18 im Menschen. Diese α-Kette liegt gepaart mit bestimmten β-Ketten vor, die Diversität in der CDR3 Region aufweisen. Die Erforschung von iNKT-Zellen in der Baumwollratte, einem Modellorganismus für Infektionen mit humanen Viren, war bislang durch das Fehlen von genomischen Daten und Methoden eingeschränkt. Daher wurde die Konservierung von iNKT-Zellen und ihrem antigenpräsentierenden Molekül CD1d in der Baumwollratte untersucht. Die Expression der molekularen Bestandteile dieses Systems, die iNKT α-Kette, typische β-Ketten und CD1d, konnte bestätigt werden und mit den homologen Molekülen in Menschen und Nagern verglichen werden.
Baumwollratten besitzen, vergleichbar mit Ratten, mehrere Mitglieder der AV14- und BV8-Familie und nur eine CD1d Variante. Zudem konnte die Reaktivität von primären Baumwollrattenzellen gegenüber typischen iNKT-Zell-Antigenen gezeigt werden und iNKT-Zellpopulationen in primären Zellen wurden mithilfe von CD1d-Multimeren gefärbt. Diese wurden auch zum Test der Funktionalität von CD1d herangezogen. Zusätzlich wurden iNKT TCR-Ketten in TCR-negativen Zelllinien exprimiert und so Paarung und Glykolipiderkennung gezeigt. Zusammenfassend konnte die Konservierung des CD1d/iNKT-Zellsystems in der Baumwollratte bewiesen werden Methoden entwickelt werden, die eine Erforschung der Bedeutung von iNKT-Zellen in Virusinfektionen in diesem Modellorganismus ermöglichen.
Vγ9Vδ2 T-Zellen sind die Hauptpopulation von γδ T-Zellen im Blut des Menschen und haben die einzigartige Fähigkeit Metabolite des Isoprenoidstoffwechsels zu erkennen und dadurch zur Immunüberwachung beizutragen. Diese Moleküle sind ein Indiz für Zellstress, Transformation oder Infektionen. Bis jetzt wurden funktionelle Vγ9Vδ2 T-Zellen nur in Vertretern der Primaten gezeigt, die Gene dieses Systems sind allerdings in mehreren höheren Säugetieren konserviert. Zwei Kandidaten für ein funktionelles BTN3/Vγ9Vδ2 T-Zellsystem wurden in dieser Arbeit näher betrachtet. Das Neunbinden-Gürteltier ist ein Modellorganismus der Lepraforschung und die Konservierung von TRGV9, TRDV2 und BTN3 Homologen wurde in dieser Spezies gezeigt. Die Expression von produktiven TRDV2-Umlagerungen konnte im Blut dieser Tiere nachgewiesen werden, es wurde jedoch kein Hinweis auf die Expression von γ-Ketten mit TRGV9 Gensegmenten oder
BTN3 Transkripten gefunden. Zusätzlich konnten charakteristische Merkmale von Phosphoantigen-reaktiven menschlichen Vγ9Vδ2 T-Zellen und BTN3 gefunden werden, die immer noch im Gürteltier
angelegt sind. Dadurch bietet sich das Neunbinden-Gürteltier als Modell für die Erforschung von strukturellen Faktoren an, die Phosphoantigen-Erkennung durch funktionelle Vγ9Vδ2 T Zellen ermöglichen. Generell ist dieser Modellorganismus aber eher ein Zeuge für ein funktionelles BTN3/VγVδ2 T-Zellsystem in einem gemeinsamen Vorfahren. Im Gegensatz dazu wurden in Alpakas funktionelle Vγ9Vδ2 T-Zellen nachgewiesen, die viele Charakteristiken menschlicher phosphoantigen-reaktiver Vγ9Vδ2 T-Zellen, z.B. TRGJP Verwendung und CDR3 Längenrestriktion, aufweisen. Die Expression von Vγ9Vδ2 Paarungen im Alpaka konnte durch Einzelzell-PCR gezeigt werden und einige Paarungen waren in der Lage Phosphoantigene zu erkennen. Diese Reaktivität wurde, mithilfe von neu entwickelten Vδ2Jδ4-spezifischen Antikörpern, auch in PBMC Kulturen nachgewiesen. Weiterhin wurden Ähnlichkeiten des Alpakas mit „γδ high“ Spezies, z. B. Kamele und Rinder, durch eine erweiterte Untersuchung des TCR-Repertoires aufgezeigt. Schematische Darstellungen der TCR-γ und -δ Loci wurden basierend auf genomischen Daten und cDNA Analysen angefertigt und ermöglichen eine Übersicht für genauere Untersuchungen. Die Konservierung der Phosphoantigen-Bindung zu Alpaka BTN3 konnte durch Gen Knock-out Zelllinien bestätigt werden und die BTN3 Expression wurde mit neuen Alpaka BTN3-spezifischen Antikörpern untersucht. Diese
Ergebnisse beweisen die Existenz einer BTN3-abhängigen Phosphoantigen-reaktiven Vγ9Vδ2 T-Zellpopulation im Alpaka und liefern eine Basis für zukünftige Studien dieses Systems. Weiterhin ist das Alpaka als erste nicht-Primaten Spezies eine wichtige Außengruppe für die Forschung in diesem Feld und ein bis jetzt einzigartiges und unersetzliches Modell für die Verwendung nur einer BTN3 Isoform in einem funktionellen BTN3/Vγ9Vδ2 T-Zellsystem. Abschließend lässt sich sagen, dass in dieser Arbeit eine Übersicht der Eignung von neuen Tiermodellen für die Untersuchung zweier nicht-konventioneller T-Zellpopulationen, der iNKT und Vγ9Vδ2 T-Zellen, geschaffen wurde. Dies ermöglicht weitere Untersuchungen zum besseren Verständnis von strukturellen und funktionellen Interaktionen.
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Immunologie
KW  - Immunmodulation
KW  - Evolution
KW  - Non-conventional T cell
KW  - Vgamma9Vdelta2 T cell
KW  - Butyrophilin
KW  - Phosphoantigen
KW  - iNKT cell
KW  - CD1d
KW  - Glycolipid
KW  - T cell activation
KW  - Antigen recognition
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-169108
ER  - 
TY  - THES
A1  - Jarick [née Ottmüller], Katja Julika
T1  - Migration of allogenic T cells in intestinal lymphoid structures during acute Graft-versus-Host Disease
T1  - Migration allogener T-Zellen in intestinalen lymphoiden Strukturen während der akuten Graft-versus-Host Reaktion
N2  - T cell infiltration into the intestine occurs after priming and activation in the mesenteric lymph nodes and Peyer’s patches and subsequent trafficking via the blood circulation. We hypothesized that additionally to the vascular trafficking route, a fraction of T cells in the Peyer’s patches directly migrate into the adjacent lamina propria of the small intestine. To test this hypothesis, we employed a mouse model of acute Graft-versus-Host Disease to study the direct T cell migration from the Peyer’s patches to the adjacent lamina propria. 
First, we analyzed the border of Peyer’s patches on histological sections and found that the Peyer’s patch is not enclosed by a capsule or basement membrane. Thus, the tissue architecture allows for direct access to the surrounding tissue. With whole-mount light sheet fluorescence microscopy we quantified a three-dimensional gradient of T cells around Peyer’s patches on day 2.5 and day 3 after transplantation. This gradient evened out at day 4 and day 6 when high numbers of T cells started to evenly infiltrate the intestine from the blood circulation. We confirmed that gradient-forming T cells around Peyer’s patches resided within the tissue parenchyma of the lamina propria and not inside lymphatic vessels. 
To positively prove that the recently activated donor T cells around Peyer’s patches have egressed directly from that patch, we established a protocol for intravital photoconversion of T cells inside Peyer’s patches. 12 h after photoconversion inside a single Peyer’s patch, photoconverted T cells resided only around this particular Peyer’s patch and not elsewhere in the small intestine. This indicated that the T cells did not infiltrate via the blood but migrated to the adjacent lamina propria of the small intestine. Dynamic intravital two-photon microscopy revealed that these T cells next to the Peyer’s patch migrated in a random pattern. This suggested that these cells did not follow a positive chemoattractive gradient once they had reached the lamina propria. Laser-capture microdissection combined with RNA sequencing of the mucosa near the Peyer’s patch identified a wide range of migration-promoting factors. These included chemokines, co-stimulatory receptors and migration-associated intracellular molecules, which are candidates to promote this direct migration from Peyer’s patches.
Altogether, we demonstrate for the first time that additionally to the vascular trafficking route, a fraction of T cells migrates directly from the Peyer’s patch to the surrounding mucosa. This mechanism implies so far unrecognized regional specification of Peyer’s-patch-primed T cells. Our findings may impact treatment strategies to avoid intestinal inflammation or foster immunity after oral vaccination.
N2  - T-Zell Infiltration in den Darm erfolgt nach Primen und Aktivierung in den mesenterialen Lymphknoten und Peyerschen Plaques durch Rezirkulation über die Blutbahn. Wir stellten die Hypothese auf, dass zusätzlich zur vaskulären Route ein Teil der T-Zellen im Peyerschen Plaque direkt in die angrenzende Lamina propria des Dünndarms wandert. Um diese Hypothese zu testen, setzten wir ein Mausmodell für eine akute Graft-versus-Host Reaktion ein, um die direkte Migration von T Zellen aus den Peyerschen Plaques in die angrenzende Lamina propria zu untersuchen. 
Zuerst analysierten wir die Randzonen um die Peyerschen Plaques mit histologischen Schnitten und konnten bestätigen, dass der Peyersche Plaque von keiner Kapsel oder Basalmembran umschlossen ist, sodass die Gewebearchitektur den direkten Zugang des umliegenden Gewebes zulässt. Mithilfe der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie von Dünndarm-Komplettpräparaten quantifizierten wir einen dreidimensionalen T-Zell Gradienten um Peyersche Plaques an den Tagen 2,5 und 3 nach allogener Stammzelltransplantation. Dieser Gradient verschwand zwischen an Tag 4 und Tag 6, als eine hohe Anzahl an T-Zellen begann, den Darm gleichmäßig über die Blutbahn zu infiltrieren. Wir bestätigten, dass die Gradienten-bildenden T-Zellen im Gewebe der Lamina propria und nicht in lymphatischen Gefäßen saßen, um zirkulierende Zellen von der Gradientenbildung auszuschließen.
Um direkt zu beweisen, dass die T-Zellen um dem Peyerschen Plaque unmittelbar aus diesem Plaque ausgewandert sind, haben wir ein Protokoll für intravitale Photokonversion von T-Zellen im Peyerschen Plaque etabliert. 12 h nach der Photokonversion in einem einzelnen Peyerschen Plaque befanden sich die T-Zellen nur um diesen bestimmten Plaque herum. Dies zeigt, dass die T-Zellen das Gewebe nicht über die Blutbahn infiltrierten, sondern direkt in die angrenzende Lamina propria des Dünndarms gewandert waren. Dynamische intravitale Zweiphotonenmikrokopie offenbarte, dass diese T-Zellen um den Peyerschen Plaque nach zufälligem Schema wanderten. Dies legte nahe, dass diese T-Zellen keinem positiven Chemokingradienten folgten, sobald sie die Lamina propria erreicht hatten. Laser-Mikrodissektion kombiniert mit RNA-Sequenzierung der Mukosa nahe des Peyerschen Plaques identifizierte eine große Auswahl an migrationsfördernden Faktoren. Hierunter waren Chemokine, kostimulatorische Rezeptoren und intrazelluläre migrationsassoziierte Moleküle, welche Kandidaten sind, diese direkte Migration aus den Peyerschen Plaques zu fördern. 
In dieser Arbeit zeigen wir erstmalig, dass zusätzlich zur vaskulären Route ein Teil der T Zellen direkt vom Peyerschen Plaque in die umliegende Mukosa wandert. Dieser Mechanismus impliziert bislang unerkannte regionale Spezialisierung von T Zellen, welche in Peyerschen Plaques aktiviert wurden. Diese neuen Befunde können zukünftige Behandlungsstrategien gegen intestinale Entzündungserkrankungen oder für Immunreaktionen nach oraler Impfung beeinflussen.
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Graft-versus-host-disease
KW  - Darm
KW  - Zellmigration
KW  - Peyer's patch
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178758
ER  -