TY  - THES
A1  - Maier, Sophia Edith
T1  - Mapping membrane receptor distribution on resting platelets combining Expansion Microscopy and fluorescence confocal microscopy
T1  - Kartierung der Membranrezeptorverteilung auf nicht-aktivierten Blutplättchen mithilfe der Kombination aus Expansionsmikroskopie und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie
N2  - Stroke and myocardial infarction are the most prominent and severe consequences of pathological thrombus formation. For prevention and/or treatment of thrombotic events there is a variety of anti-coagulation and antiplatelet medication that all have one side effect in common: the increased risk of bleeding. To design drugs that only intervene in the unwanted aggregation process but do not disturb general hemostasis, it is crucial to decipher the exact clotting pathway which has not been fully understood yet. Platelet membrane receptors play a vital role in the clotting pathway and, thus, the aim of this work is to establish a method to elucidate the interactions, clustering, and reorganization of involved membrane receptors such as GPIIb/IIIa and GPIX as part of the GPIb-IX-V complex. The special challenges regarding visualizing membrane receptor interactions on blood platelets are the high abundancy of the first and the small size of the latter (1—3µm of diameter). The resolution limit of conventional fluorescence microscopy and even super-resolution approaches prevents the successful differentiation of densely packed receptors from one another. Here, this issue is approached with the combination of a recently developed technique called Expansion Microscopy (ExM). The image resolution of a conventional fluorescence microscope is enhanced by simply enlarging the sample physically and thus pulling the receptors apart from each other. This method requires a complex sample preparation and holds lots of obstacles such as variable or anisotropic expansion and low images contrast. To increase ExM accuracy and sensitivity for interrogating blood platelets, it needs optimized sample preparation as well as image analysis pipelines which are the main part of this thesis. The colocalization results show that either fourfold or tenfold expanded, resting platelets allow a clear distinction between dependent, clustered, and independent receptor organizations compared to unexpanded platelets.Combining dual-color Expansion and confocal fluorescence microscopy enables to image in the nanometer range identifying GPIIb/IIIa clustering in resting platelets – a pattern that may play a key role in the clotting pathway
N2  - Schlaganfall und Myokardinfarkt sind die wohl bekanntesten und schwerwiegendsten Folgen von pathologischer Thrombenbildung. Zur Vorbeugung und/oder Behandlung thrombotischer Ereignisse gibt es eine Vielzahl von Antiplättchen-Medikamenten wie Aspirin oder Plavix, denen allerdings eine Nebenwirkung gemein ist: das unerwünschte, erhöhte Blutungsrisiko. Um Medikamente zu entwickeln, die tatsächlich nur den Aggregationsprozess unterbinden, die generelle Blutstillung jedoch nicht unterbinden, ist es entscheidend, eine detaillierte Vorstellung der Signalkaskade der Plättchenadhesion und -aktivierung zu bekommen. Da diese bisher noch nicht vollständig verstanden wurde, soll eine Methode zur Aufklärung schneller Wechselwirkungen, Clusterbildung und Reorganisation von Plättchenrezeptoren wie GPIIb/IIIa und GPIX, als Teil des Rezeptorkomplex GPIb-IX-V, etabliert werden. Die besonderen Herausforderungen bei der Visualisierung von Wechselwirkungen von Membranrezeptoren auf Blutplättchen sind sowohl ihre hohe Dichte als auch die geringe Größe der Blutplättchen (1–3μm Durchmesser). Die Auflösungsgrenze der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie sowie der superhochauflösenden-Mikroskopie ist nicht in der Lage dicht gepackte Rezeptoren voneinander zu unterscheiden. Eine kürzlich entwickelte Technik namens Expansionsmikroskopie (ExM) bietet hierfür einen Lösungsansatz: Die Bildauflösung von einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop wird dadurch verbessert, dass Proben physikalisch vergrößert werden, sodass markierte Rezeptoren auseinanderdriften und besser voneinander unterschieden werden können. Dieses Verfahren erfordert eine komplexe Probenvorbereitung und birgt viele Unsicherheiten wie die Variabilität des Expansionsfaktors, die Isotropie des Expansionsprozesses sowie das niedrige Signal-Rausch-Verhältnis in den mikroskopischen Bildern. Um die Genauigkeit und Empfindlichkeit des Ansatzes auf seine Tauglichkeit zur Untersuchung nicht-aktivierter Blutplättchen zu überprüfen, wurde ein Arbeitsablauf für die optimale Probenvorbereitung entwickelt sowie auf wichtige Analysekriterien für die Kolokalisationsanalyse hingewiesen, welches den Hauptteil dieser Arbeit darstellt. Die Ergebnisse der Kolokalisationsanalyse zeigen, dass die vier– beziehungsweise zehnfache Expansion ruhender Blutplättchen eine eindeutige Unterscheidung zwischen abhängigen, geclusterten und unabhängigen Rezeptororganisationen im Vergleich zu nicht expandierten Blutplättchen erlaubt. Die Kombination aus ExM und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie ermöglichte die Identifizierung von Clustern der GPIIb/IIIa-Rezeptoren in ruhenden Blutplättchen – ein Vorgang, der möglicherweise eine Schlüsselrolle in der Plättchenaggregation spielt.
KW  - Expansion Microscopy
KW  - platelets
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-300317
ER  - 
TY  - THES
A1  - Aigner, Max
T1  - Establishing successful protocols and imaging pipelines for Expansion Microscopy in murine blood platelets
T1  - Etablierung erfolgreicher Protokolle zur Probenpräparation und Bildgebung für die ‚Expansion Microscopy‘ in murinen Thrombozyten
N2  - Platelets play an important role in the body, since they are part of the hemostasis
system, preventing and stopping blood loss. Nevertheless, when platelet or
coagulation system function are impaired, uncontrolled bleedings but also irreversible
vessel occlusion followed by ischemic tissue damage can occur. Therefore,
understanding platelet function and activation, mechanisms which are controlled by a
variety of platelet membrane receptors and other factors is important to advance out
knowledge of hemostasis and platelet malfunction. For a complete picture of platelet
function and their modulating behavior it is desired to be able to quantify receptor
distributions and interactions of these densely packed molecular ensembles in the
membrane. This challenges scientists for several reasons. Most importantly, platelets
are microscopically small objects, challenging the spatial resolution of conventional
light microscopy. Moreover, platelet receptors are highly abundant on the membrane
so even super-resolution microscopy struggles with quantitative receptor imaging on
platelets.
With Expansion microscopy (ExM), a new super-resolution technique was introduced,
allowing resolutions to achieve super-resolution without using a super-resolution
microscope, but by combining a conventional confocal microscopy with a highly
processed sample that has been expanded physically. In this doctoral thesis, I
evaluated the potential of this technique for super-resolution platelet imaging by
optimizing the sample preparation process and establishing an imaging and image
processing pipeline for dual-color 3D images of different membrane receptors. The
analysis of receptor colocalization using ExM demonstrated a clear superiority
compared to conventional microscopy. Furthermore, I identified a library of
fluorescently labeled antibodies against different platelet receptors compatible with
ExM and showed the possibility of staining membrane receptors and parts of the
cytoskeleton at the same time.
N2  - Thrombozyten spielen eine wichtige Rolle im Körper, denn als Teil des
Gerinnungssystems, sind sie daran beteiligt Blutverlust vorzubeugen und zu stoppen.
Gleichwohl können sie bei Störungen des Gerinnungssystems zu unkontrollierbaren
Blutungen und auch durch Aggregation zu kardiovaskulären Ereignissen, wie
Herzinfarkt und Schlaganfällen führen. Für ein besseres Verständnis von Hämostase
und Gerinnungsstörungen ist es deshalb nötig die Funktion und Aktivierung von
Thrombozyten zu verstehen, welche durch eine Vielzahl von Membranrezeptoren und
anderen Faktoren gesteuert wird. Eine Methode, um weitere Einblicke in diese
Prozesse zu bekommen ist die mikroskopische Darstellung von Rezeptorverteilungen
auf der Zellmembran und deren Interaktionen. Dies zu realisieren ist aus
verschiedenen Gründen anspruchsvoll. Der mikroskopisch kleine Durchmesser der
Thrombozyten macht es konventioneller Lichtmikroskopie schwer, einzelne
Rezeptoren auf der Membran darzustellen. Außerdem befinden sich sehr viele
Rezeptoren dicht gepackt auf der Membran, sodass sogar superhochauflösende
Mikroskope Schwierigkeiten haben, die Rezeptoren quantitativ zu beurteilen.
Mit ‚Expansion microscopy‘ (ExM) wurde eine relativ junge superhochaufösende
Technik auf Thrombozyten angewendet. Diese Technik erreicht Auflösungen
vergleichbar mit sogenannten ‚super-resolution‘ Mikroskopen, ohne die Benutzung
selbiger, sondern durch die Kombination von konfokaler Mikroskopie mit einer
physikalisch expandierten Probe. In dieser Arbeit evaluierte ich das Potential dieser
Technik für superhochauflösende Bilder von Thrombozytenrezeptoren und optimierte
die Probenvorbereitung, sodass zweifarbige 3D Bilder von verschiedenen
Membranrezeptoren möglich waren. Die Ergebnisse der Kolokationsanalyse zeigten
einen deutlich vergrößerten Dynamikumfang durch ExM. Außerdem katalogisierte ich
fluoreszenzmarkierte Antikörper gegen verschiedene Thrombozyten Rezeptoren
bezüglich ihrer Tauglichkeit mit ExM und zeigte, dass es möglich ist
Membranrezeptoren und Bestandteile des Zytoskeletts gleichzeitig zu färben.
KW  - Expansion Microscopy
KW  - platelets
KW  - Mikroskopie
KW  - Microscopy
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-309003
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Goeritzer, Madeleine
A1  - Kuentzel, Katharina B.
A1  - Beck, Sarah
A1  - Korbelius, Melanie
A1  - Rainer, Silvia
A1  - Bradić, Ivan
A1  - Kolb, Dagmar
A1  - Mussbacher, Marion
A1  - Schrottmaier, Waltraud C.
A1  - Assinger, Alice
A1  - Schlagenhauf, Axel
A1  - Rost, René
A1  - Gottschalk, Benjamin
A1  - Eichmann, Thomas O.
A1  - Züllig, Thomas
A1  - Graier, Wolfgang F.
A1  - Vujić, Nemanja
A1  - Kratky, Dagmar
T1  - Monoglyceride lipase deficiency is associated with altered thrombogenesis in mice
JF  - International Journal of Molecular Sciences
N2  - Monoglyceride lipase (MGL) hydrolyzes monoacylglycerols (MG) to glycerol and one fatty acid. Among the various MG species, MGL also degrades 2-arachidonoylglycerol, the most abundant endocannabinoid and potent activator of the cannabinoid receptors 1 and 2. We investigated the consequences of MGL deficiency on platelet function using systemic (Mgl\(^{−/−}\)) and platelet-specific Mgl-deficient (platMgl\(^{−/−}\)) mice. Despite comparable platelet morphology, loss of MGL was associated with decreased platelet aggregation and reduced response to collagen activation. This was reflected by reduced thrombus formation in vitro, accompanied by a longer bleeding time and a higher blood volume loss. Occlusion time after FeCl\(_3\)-induced injury was markedly reduced in Mgl\(^{−/−}\) mice, which is consistent with contraction of large aggregates and fewer small aggregates in vitro. The absence of any functional changes in platelets from platMgl\(^{−/−}\) mice is in accordance with lipid degradation products or other molecules in the circulation, rather than platelet-specific effects, being responsible for the observed alterations in Mgl\(^{−/−}\) mice. We conclude that genetic deletion of MGL is associated with altered thrombogenesis.
KW  - platelets
KW  - MGL
KW  - in vitro and in vivo thrombus formation
KW  - platelet activation
KW  - platelet aggregation
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-304052
SN  - 1422-0067
VL  - 24
IS  - 4
ER  - 
TY  - THES
A1  - Göb [née Klaus], Vanessa Aline Domenica
T1  - Pathomechanisms underlying ischemic stroke
T1  - Pathomechanismen des ischämischen Schlaganfalles
N2  - Every year, stroke affects over 100 million people worldwide and the number of cases continues to grow. Ischemic stroke is the most prevalent form of stroke and rapid restoration of blood flow is the primary therapeutic aim. However, recanalization might fail or reperfusion itself induces detrimental processes leading to infarct progression. Previous studies identified platelets and immune cells as drivers of this so-called ischemia/reperfusion (I/R) injury, establishing the concept of ischemic stroke as thrombo-inflammatory disease. Reduced cerebral blood flow despite recanalization promoted the hypothesis that thrombus formation within the cerebral microcirculation induces further tissue damage. The results presented in this thesis refute this: using complementary methodologies, it was shown that infarct growth precedes the occurrence of thrombi excluding them as I/R injury-underlying cause. Blood brain barrier disruption is one of the hallmarks of ischemic stroke pathology and was confirmed as early event during reperfusion injury in the second part of this study. Abolished platelet α-granule release protects mice from vascular leakage in the early reperfusion phase resulting in smaller infarcts. Using in vitro assays, platelet α-granule-derived PDGF-AB was identified as one factor contributing to blood-brain barrier disruption.
In vivo visualization of platelet activation would provide important insights in the spatio-temporal context of platelet activation in stroke pathology. As platelet signaling results in elevated intracellular Ca2+ levels, this is an ideal readout. To overcome the limitations of chemical calcium indicators, a mouse line expressing an endogenous calcium reporter specifically in platelets and megakaryocytes was generated. Presence of the reporter did not interfere with platelet function, consequently these mice were characterized in in vivo and ex vivo models. 
Upon ischemic stroke, neutrophils are among the first cells that are recruited to the brain. Since for neutrophils both, beneficial and detrimental effects are described, their role was investigated within this thesis. Neither neutrophil depletion nor absence of NADPH-dependent ROS production (Ncf-/- mice) affected stroke outcome. In contrast, abolished NET-formation in Pad4-/- mice resulted in reduced infarct sizes, revealing detrimental effects of NETosis in the context of ischemic stroke, which might become a potential therapeutic target. 
Cerebral venous (sinus) thrombosis, CV(S)T is a rare type of stroke with mainly idiopathic onset. Whereas for arterial thrombosis a critical contribution of platelets is known and widely accepted, for venous thrombosis this is less clear but considered more and more. In the last part of this thesis, it was shown that fab-fragments of the anti-CLEC-2 antibody INU1 trigger pathological platelet activation in vivo, resulting in foudroyant CVT accompanied by heavy neurological symptoms. Using this novel animal model for CVT, cooperative signaling of the two platelet receptors CLEC-2 and GPIIb/IIIa was revealed as major trigger of CVT and potential target for treatment.
N2  - Jährlich sind weltweit über 100 Millionen Menschen von einem Schlaganfall betroffen, wobei die Zahl der Fälle weiter zunimmt. Der ischämische Schlaganfall ist die häufigste Form des Schlaganfalls, und die sofortige Wiederherstellung des Blutflusses ist das oberste Therapie¬ziel. Allerdings kommt es vor, dass die Rekanalisierung des betroffenen Gefäßes fehlschlägt oder die Reperfusion selbst zu schädlichen Prozessen führt, die das Fortschreiten des Infarkts begünstigen. In vorangegangen Studien wurden Thrombozyten und Immunzellen als treibende Kräfte dieser so genannten Ischämie/Reperfusion (I/R)-Schädigung identifiziert und der ischämische Schlaganfall als thrombo-inflammatorische Erkrankung definiert. Eine verminderte zerebrale Durchblutung trotz Rekanalisation führte zu der Hypothese, dass die Bildung von Thromben in der zerebralen Mikrozirkulation zu weiteren Gewebeschäden führt. Die hier vorgestellten Ergebnisse widerlegen dies: Mit Hilfe komplementärer Methoden konnte gezeigt werden, dass das Infarktwachstum dem Auftreten von Thromben vorausgeht, was diese als Ursache für die I/R-Verletzung ausschließt.
Die Störung der Blut-Hirn-Schranke ist eines der charakteristischen Kennzeichen der Pathologie des ischämischen Schlaganfalls und wurde im zweiten Teil dieser Studie als frühes Ereignis während des Reperfusionsschadens bestätigt. Mit Hilfe transgener Mäuse konnte gezeigt werden, dass die Ausschüttung von α-Granula aus Thrombozyten in der frühen Reperfusionsphase an Störungen der Blut-Hirn-Schranke beteiligt ist und somit zum Infarktwachstum beiträgt. In in-vitro-Versuchen konnte gezeigt werden, dass PDGF-AB, ein Bestandteil der α-Granula, an Prozessen, die für die Beeinträchtigung der Blut-Hirn-Schranke verantwortlich sind, beteiligt ist.
Die Sichtbarmachung von aktivierten Thrombozyten in vivo, würde wichtige Erkenntnisse über den räumlichen und zeitlichen Kontext der Aktivierung von Thrombozyten im Verlauf des Schlaganfalls liefern. Da alle aktivierenden Signalwege zum Anstieg des intrazellulären Kalziumspiegels führen, ist Kalzium ein idealer Indikator der Thrombozytenaktivierung. Um die Grenzen chemischer Kalziumindikatoren zu überwinden, wurde eine transgene Mauslinie erzeugt, welche einen endogenen Kalziumreporter speziell in Thrombozyten und Megakaryozyten exprimiert. Die Anwesenheit des Reporters hatte keine Auswirkung auf die Funktionalität der Thrombozyten und die Mäuse wurden in vivo sowie ex vivo in verschiedenen Experimenten charakterisiert. 
In der Folge eines ischämischen Schlaganfalles gehören Neutrophile zu den am frühesten ins Gehirn einwandernden Zellen. Dabei werden Neutrophilen sowohl günstige als auch schädliche Wirkungen auf den Verlauf des ischämischen Schlaganfalls zugeschrieben. Aus diesem Grund wurde ihre Rolle in dieser Arbeit näher untersucht. Weder die Abwesenheit von Neutrophilen noch das Fehlen der NADPH-abhängigen Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (Ncf1-/- Mäuse) beeinflussen den Ausgang eines Schlaganfalls. Im Gegensatz dazu, führte die Verhinderung der NET-Bildung (NET = neutrophil extracellular traps) in Pad4-/- Mäusen zu verringerten Infarktgrößen, was auf eine schädliche Wirkung der NETose im Zusammenhang des Schlaganfalls hinweist und somit ein therapeutisches Angriffsziel darstellen könnte. 
Sinusvenenthrombosen sind eine seltene Form des Schlaganfalls, die meist ohne bekannte Ursache auftreten. Während für die arterielle Thrombose ein kritischer Beitrag der Thrombozyten bekannt und weithin akzeptiert ist, ist dies für venöse Thrombosen weniger klar, wird aber immer mehr in Betracht gezogen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Fab-Fragmente des anti-CLEC-2-Antikörpers INU1 in vivo eine pathologische Aktivierung von Thrombozyten auslösen, die zu einer fulminanten Sinusvenenthrombose mit schweren neurologischen Symptomen führt. Mit Hilfe dieses neuartigen Tiermodells wurde die zusammenwirkende Signalübertragung der beiden Thrombozytenrezeptoren CLEC-2 und GPIIb/IIIa als Hauptauslöser der Sinusvenenthrombose und damit potenzielles Ziel für eine Behandlung identifiziert.
KW  - Schlaganfall
KW  - Thrombozyt
KW  - Maus
KW  - Blut-Hirn-Schranke
KW  - Sinusthrombose
KW  - thrombo-inflammation
KW  - ischemic stroke
KW  - blood brain barrier
KW  - CVT
KW  - platelets
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-286727
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gross, Carina
T1  - The role of platelets in hepatic ischemia reperfusion injury in mice
T1  - Die Rolle von Thrombozyten im hepatischen ischämischen Reperfusionsschaden in Mäusen
N2  - Platelets are the second most abundant blood cells and their main function is maintenance of vascular integrity. In addition, platelets are increasingly recognized as cells with immune functions, as they participate in the recruitment of immune cells and modulate the progression and severity of an immune response. So-called lipid mediators, which are – besides other cells – released by activated platelets, influence the immune response. LTB4 is one of these potent lipid mediators and is able to activate neutrophils and induce their infiltration into injured tissue. 
In order to investigate the involvement of platelets in inflammatory processes, a murine model of hepatic ischemia reperfusion injury as well as confocal intravital microscopy of the liver were established. Both methods were used to analyze the influence of platelets on the inflammation that follows sterile liver inflammation. We found platelet function to be unaltered after three hours of reperfusion and platelet aggregation to be irrelevant for the outcome of hepatic ischemia reperfusion injury. However, a strong impact of the GPIb-vWF axis could be observed, as antibody mediated blockade of GPIb as well as vWF-deficiency significantly reduced liver damage markers and decreased neutrophil infiltration. GPIb-IL-4R mice were used to exclude the possibility that the protective effects of the anti-GPIbα antibody treatment (p0p/B) results from something else than blocking GPIbα. Furthermore, the slope of neutrophil infiltration was decreased in p0p/B-treated mice, leading to overall decreased neutrophil numbers in the liver after three hours of reperfusion. Blockade of the integrin αIIbβ3, however, showed no reduction in neutrophil infiltration into the post-ischemic liver, in line with unaltered liver damage.
To study the role of leukotriene B4, conditional and constitutive knockout mice for the LTA4 hydrolase, which catalyzes the last step in LTB4 synthesis, were generated. Lta4h deficiency did not affect general platelet functionality in hemostasis and thrombosis. Interestingly,
Lta4h-/- mice were not protected from cellular damage following hepatic ischemia, despite lower neutrophil numbers in the post-ischemic liver.
Intravital microscopy of the pancreas was established and revealed increased CD4+ T cell numbers in GPVI-deficient animals compared to WT controls in line with the pre-diabetic phenotype of Gp6-/- mice that was revealed in Grzegorz Sumara’s group. Furthermore, platelet ‘behavior’ in pancreatic islets was observed following glucose injection. We found a high number of platelets adherent to islet sinusoids under basal conditions and no rolling/decelerating of platelets following glucose injection. This was accompanied by temporary sinusoidal constriction and stop of the blood flow. This phenomenon was not observed in control settings (injection of PBS, insulin or L-glucose).
In a side project, which was carried out jointly with Tobias Heib, a side by side comparison of the classical syringe-based flushing and the centrifugation-based spinning method to isolate murine bone marrow was conducted. Flow cytometry revealed no differences in the distribution of hematopoietic stem cells and immune cells and functional analysis with primary and cultured megakaryocytes (MKs) showed comparable results in all conducted assays. Thus, our data demonstrated that the faster and more efficient spinning method can be used for the isolation of bone marrow cells.
N2  - Thrombozyten gehören zu den am stärksten im Blut vertretenen Zellen, deren Hauptaufgabe der Erhalt der vaskulären Integrität darstellt. Des Weiteren werden Thrombozyten immer mehr als „Immunzellen“ betrachtet, da sie andere Zellen rekrutieren, sowie zum Verlauf und der Schwere der Immunantwort beitragen. So genannte Lipidmediatoren, die neben anderen Zellen auch von Thrombozyten freigesetzt werden, sind in der Lage die Immunantwort zu beeinflussen. Leukotrien B4 (LTB4) ist ein solcher hochwirksamer Lipidmediator, der dafür bekannt ist, Neutrophile zu aktivieren und deren Infiltration in verletztes/entzündetes Gewebe zu begünstigen.
Um einen besseren Einblick in den Beitrag von Thrombozyten in entzündlichen Prozessen zu bekommen, wurden ein Mausmodell des hepatischen Ischämie/Reperfusionsschadens sowie konfokale Intravitalmikroskopie etabliert. Beide Methoden wurden benutzt, um den Einfluss von Thrombozyten auf eine sterile Entzündungsreaktion zu untersuchen. Wir konnten zeigen, dass die Thrombozytenaktivität nach 3-stündiger Reperfusion unverändert blieb. Des Weiteren scheint Thrombozytenaggregation für den Ausgang im hepatischen Ischämie- und Reperfusionsmodell vernachlässigbar zu sein, während ein deutlicher Einfluss der GPIb-vWF Achse beobachtet wurde. Antikörper vermittelte GPIb-Blockade sowie vWF Defizienz zeigten reduzierte Werte des Leberschadens sowie geringere Neutrophilzahlen im Lebergewebe. Um auszuschließen, dass die schützenden Effekte der anti-GPIbα Applikation (p0p/B) durch etwas anderes als die Blockade von GPIbα verursacht werden, wurden GPIb-IL-4R Tiere verwendet. Hinzu kommt ein flacherer Anstieg der Neutrophilzahlen in p0p/B behandelten Tieren, was letztlich auch zur geringeren Gesamtzahl nach 3-stündiger Reperfusion führt. Die Blockade des Integrins αIIbβ3 zeigte im Vergleich zu Kontrolltieren unveränderte Einwanderung von neutrophilen Granulozyten in der post-ischämischen Leber, was in Einklang mit dem unveränderten Leberschaden nach Ischämie/Reperfusion steht.
Um den Einfluss von Leukotrienen zu untersuchen, wurden konstitutive und konditionelle Knockout Tiere für die LTA4 Hydrolase generiert, die den letzten Schritt der LTB4-Synthese katalysiert. LTA4H-Defizienz hatte keinen Einfluss auf normale Thrombozytenfunktion in Thrombose und Hämostase. Interessanterweise zeigten diese Tiere jedoch keinen Leber-spezifischen Schutz nach Ischämie, obwohl die Zahl der einwandernden neutrophilen Granulozyten signifikant verringert war.
Intravitalmikroskopie des Pankreas wurde erfolgreich etabliert und zeigte erhöhte CD4+ T-Zellzahlen in GPVI-defizienten Tieren im Vergleich zu WT Kontrolltieren. Diese Ergebnisse sind im Einklang mit dem von Grzegorz Sumaras Gruppe gefundenen prä-diabetischen Phänotyp in Gp6-/- Mäusen. Des Weiteren wurde das „Verhalten“ von Thrombozyten in Langerhans-Inseln nach Glukoseinjektion untersucht. Wir fanden bereits unter Grundbedingungen eine hohe Anzahl von adhärenten Thrombozyten im Gefäßsystem, jedoch kein Verlangsamen/Rollen von Thrombozyten nach Glukose Injektion. Dieser Effekt wurde von einer temporären Verengung des Gefäßsystems und einem Stoppen des Blutflusses begleitet und konnte nicht in Kontrollbedingungen (Injektion von PBS, Insulin oder L-Glukose) beobachtet werden.
In einem Nebenprojekt, das gemeinsam mit Tobias Heib durchgeführt wurde, wurden die klassische nadel-basierte Flush- sowie die Zentrifugations-basierte Spin-Methode zur Isolation von murinem Knochenmark verglichen. Durchflusszytometrie zeigte, dass die Verteilung von Stamm- und Immunzellpopulationen unverändert war. Des Weiteren zeigten funktionale Analysen von primären und kultivierten Megakaryozyten (MKs) vergleichbare Ergebnisse in allen durchgeführten Tests. Somit haben unsere Daten gezeigt, dass die schnellere und effizientere Spin-Methode zur Isolierung von Knochenmarkszellen verwendet werden kann.
KW  - ischemia reperfusion injury
KW  - liver
KW  - platelets
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216180
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Neagoe, Raluca A. I.
A1  - Gardiner, Elizabeth E.
A1  - Stegner, David
A1  - Nieswandt, Bernhard
A1  - Watson, Steve P.
A1  - Poulter, Natalie S.
T1  - Rac inhibition causes impaired GPVI signalling in human platelets through GPVI shedding and reduction in PLCγ2 phosphorylation
JF  - International Journal of Molecular Sciences
N2  - Rac1 is a small Rho GTPase that is activated in platelets upon stimulation with various ligands, including collagen and thrombin, which are ligands for the glycoprotein VI (GPVI) receptor and the protease-activated receptors, respectively. Rac1-deficient murine platelets have impaired lamellipodia formation, aggregation, and reduced PLCγ2 activation, but not phosphorylation. The objective of our study is to investigate the role of Rac1 in GPVI-dependent human platelet activation and downstream signalling. Therefore, we used human platelets stimulated using GPVI agonists (collagen and collagen-related peptide) in the presence of the Rac1-specific inhibitor EHT1864 and analysed platelet activation, aggregation, spreading, protein phosphorylation, and GPVI clustering and shedding. We observed that in human platelets, the inhibition of Rac1 by EHT1864 had no significant effect on GPVI clustering on collagen fibres but decreased the ability of platelets to spread or aggregate in response to GPVI agonists. Additionally, in contrast to what was observed in murine Rac1-deficient platelets, EHT1864 enhanced GPVI shedding in platelets and reduced the phosphorylation levels of PLCγ2 following GPVI activation. In conclusion, Rac1 activity is required for both human and murine platelet activation in response to GPVI-ligands, but Rac1’s mode of action differs between the two species.
KW  - platelets
KW  - Rac1
KW  - glycoprotein VI
KW  - EHT1864
KW  - GPVI shedding
KW  - phospholipase C gamma 2
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-284350
SN  - 1422-0067
VL  - 23
IS  - 7
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Rosa, Annabelle
A1  - Butt, Elke
A1  - Hopper, Christopher P.
A1  - Loroch, Stefan
A1  - Bender, Markus
A1  - Schulze, Harald
A1  - Sickmann, Albert
A1  - Vorlova, Sandra
A1  - Seizer, Peter
A1  - Heinzmann, David
A1  - Zernecke, Alma
T1  - Cyclophilin a is not acetylated at lysine-82 and lysine-125 in resting and stimulated platelets
JF  - International Journal of Molecular Sciences
N2  - Cyclophilin A (CyPA) is widely expressed by all prokaryotic and eukaryotic cells. Upon activation, CyPA can be released into the extracellular space to engage in a variety of functions, such as interaction with the CD147 receptor, that contribute to the pathogenesis of cardiovascular diseases. CyPA was recently found to undergo acetylation at K82 and K125, two lysine residues conserved in most species, and these modifications are required for secretion of CyPA in response to cell activation in vascular smooth muscle cells. Herein we addressed whether acetylation at these sites is also required for the release of CyPA from platelets based on the potential for local delivery of CyPA that may exacerbate cardiovascular disease events. Western blot analyses confirmed the presence of CyPA in human and mouse platelets. Thrombin stimulation resulted in CyPA release from platelets; however, no acetylation was observed—neither in cell lysates nor in supernatants of both untreated and activated platelets, nor after immunoprecipitation of CyPA from platelets. Shotgun proteomics detected two CyPA peptide precursors in the recombinant protein, acetylated at K28, but again, no acetylation was found in CyPA derived from resting or stimulated platelets. Our findings suggest that acetylation of CyPA is not a major protein modification in platelets and that CyPA acetylation is not required for its secretion from platelets.
KW  - Cyclophilin A
KW  - acetylation
KW  - platelets
KW  - CD147
KW  - EMMPRIN
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-284011
SN  - 1422-0067
VL  - 23
IS  - 3
ER  - 
TY  - THES
A1  - Becker, Isabelle Carlotta
T1  - The role of megakaryocytes and platelets in vascular and osteogenic development
T1  - Die Rolle von Megakaryozyten und Thrombozyten in vaskulärer und osteogener Entwicklung
N2  - Platelets, small anucleate cell fragments in the blood stream, derive from large precursor cells, so-called megakaryocytes (MK) residing in the bone marrow (BM). In addition to their role in wound healing, platelets have been shown to play a significant role during inflammatory bleeding. Above all, the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) receptors GPVI as well as CLEC-2 have been identified as main regulators of vascular integrity.
In addition to ITAM-bearing receptors, our group identified GPV as another potent regulator of hemostasis and thrombosis. Surprisingly, concomitant lack of GPV and CLEC-2 deteriorated blood-lymphatic misconnections observed in Clec2-/- mice resulting in severe edema formation and intestinal inflammation. Analysis of lymphatic and vascular development in embryonic mesenteries revealed severely defective blood-lymph-vessel separation, which translated into thrombocytopenia and increased vascular permeability due to reduced tight junction density in mesenteric blood vessels and consequent leakage of blood into the peritoneal cavity.
Recently, platelet granule release has been proposed to ameliorate the progression of retinopathy of prematurity (ROP), a fatal disease in newborns leading to retinal degradation. The mechanisms governing platelet activation in this process remained elusive nonetheless, which prompted us to investigate a possible role of ITAM signaling. In the second part of this thesis, granule release during ROP was shown to be GPVI- and partly CLEC-2-triggered since blockade or loss of these receptors markedly deteriorated ROP progression.
Proplatelet formation from MKs is highly dependent on a functional microtubule and actin cytoskeleton, the latter of which is regulated by several actin-monomer binding proteins including Cofilin1 and Twinfilin1 that have been associated with actin-severing at pointed ends. In the present study, a redundancy between both proteins especially important for the guided release of proplatelets into the bloodstream was identified, since deficiency in both proteins markedly impaired MK functionality mainly due to altered actin-microtubule crosstalk.
Besides ITAM-triggered activation, platelets and MKs are dependent on inhibitory receptors, which prevent overshooting activation. We here identified macrothrombocytopenic mice with a mutation within Mpig6b encoding the ITIM-bearing receptor G6b-B. G6b-B-mutant mice developed a severe myelofibrosis associated with sex-specific bone remodeling defects resulting in osteosclerosis and -porosis in female mice. Moreover, G6b-B was shown to be indispensable for MK maturation as verified by a significant reduction in MK-specific gene expression in G6b-B-mutant MKs due to reduced GATA-1 activity.
N2  - Blutplättchen, die kleinsten Zellen des hämatopoetischen Systems, werden von großen Vorläuferzellen, den Megakaryozyten (MKs), im Knochenmark gebildet. Neben ihrer Rolle bei der Blutstillung und Wundheilung sind Thrombozyten außerdem maßgeblich daran beteiligt, Blutungen in Entzündungsprozessen zu verhindern. Insbesondere den immuno- receptor tyrosine-based activation motif (ITAM) Rezeptoren GPVI und CLEC-2 wird eine tragende Rolle in der Aufrechterhaltung der vaskulären Integrität zugeschrieben.
Neben den ITAM-Rezeptoren konnten wir auch für den Thrombozytenrezeptor GPV eine Funktion in Hämostase und Thrombose identifizieren. Erstaunlicherweise führte ein gleichzeitiger Verlust von GPV und CLEC-2 zu einer dramatischen Verstärkung der Blut- Lymphgefäß-Fehlbildungen, die bereits in CLEC-2-defizienten Mäusen beschrieben wurde, sodass die Tiere eine starke Ödembildung in den Extremitäten sowie Entzündungen des Dünndarms aufwiesen. Eine vertiefte Analyse der vaskulären Strukturen in Mesenterien während der Embryonalentwicklung offenbarte zusätzliche Defekte in der Blut- und Lymphgefäßtrennung in CLEC-2/GPV-defizienten Mäusen. Diese Deformationen führten zu Thrombozytopenie, Anämie und einer erhöhten vaskulären Permeabilität in adulten Mäusen, was sich auf eine reduzierte tight-junction-Dichte in Mesenterien und Darmgewebe zurückführen ließ, die zu einem Austritt von Blut in die Peritonealhöhle führte.
In einer kürzlich veröffentlichten Publikation wurde Plättchengranula eine Rolle in der Auflösung retinopathischer Gefäßmissbildungen zugeschrieben. Retinopathia praema- turorum (ROP) ist eine Krankheit in Frühgeborenen, die aufgrund von Sauerstoffunter- schieden vor und nach Geburt zu Netzhautablösung und Blindheit führen kann. Die exakten Mechanismen, die hierbei zu Thrombozytenaktivierung und nachfolgender Degranulierung beitragen, sind bisher allerdings nicht bekannt. Da eine tragende Rolle von ITAM Rezeptoren in der Aufrechterhaltung vaskulärer Integrität insbesondere in krankhaftem Gewebe zuvor bereits aufgezeigt wurde, untersuchten wir die Entwicklung von Vaso-obliteration und Neovaskularisierung in CLEC-2 und GPVI-depletierten oder defizienten Mäusen und konnten einen Beitrag beider Rezeptoren zur Progression von ROP nachweisen.
Die Produktion von Thrombozyten aus MKs ist stark von einem funktionalen Mikrotubuli- und Aktin-Zytoskelett abhängig. Aktinpolymerisation wird substanziell von unterschiedlichen Aktin-bindenden Proteinen reguliert, von denen Cofilin1 und Twinflin1 ein Abtrennen der Filamente induzieren. Wir konnten nun eine funktionale Redundanz beider Proteine in murinen MKs aufzeigen, die insbesondere für ein geregeltes Abschnüren von Thrombozyten in die Blutbahn essentiell ist und von einem Crosstalk zwischen Aktin- und Mikrotubuli- Zytoskeletts abhängig ist, der durch Twinfilin1 und Cofilin1 aufrechterhalten wird.
Neben ITAM-induzierter Thrombozytenaktivierung spielt auch die Inhibition derselbigen durch immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif (ITIM)-Rezeptoren eine große Rolle in MKs und Plättchen, da diese eine überschießende Aktivierung verhindern. Wir konnten in der vorliegenden Arbeit eine Spontanmutation in Mpig6b, das für den ITIM-Rezeptor G6b-B codiert, in stark makrothrombozytopenen, wildtypischen Mäusen identifizieren. Außer in der stark reduzierten Thrombozytenzahl manifestierte sich die Mutation des Weiteren in einer massiven Myelofibrose, die mit einer geschlechtsspezifischen Osteosklerose und -porose in weiblichen Mäusen einherging. Überraschenderweise konnten wir zudem einen dramatischen Reifungsblock in G6b-B-mutierten MKs feststellen, der insbesondere in einer reduzierten Expression des Transkriptionsfaktors GATA-1 begründet lag.
KW  - Megakaryozyt
KW  - Thrombozyt
KW  - Megakaryocyte
KW  - platelets
KW  - bone marrow
KW  - hematopoiesis
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-210241
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Essig, Fabian
A1  - Babilon, Lilith
A1  - Vollmuth, Christoph
A1  - Kollikowski, Alexander M.
A1  - Pham, Mirko
A1  - Solymosi, László
A1  - Haeusler, Karl Georg
A1  - Kraft, Peter
A1  - Stoll, Guido
A1  - Schuhmann, Michael K.
T1  - High mobility group box 1 protein in cerebral thromboemboli
JF  - International Journal of Molecular Sciences
N2  - High-mobility group box 1 protein (HMGB1) is a damage-associated molecular pattern (DAMP) involved in neutrophil extracellular trap (NET) formation and thrombosis. NETs are regularly found in cerebral thromboemboli. We here analyzed associated HMGB1 expression in human thromboemboli retrieved via mechanical thrombectomy from 37 stroke patients with large vessel occlusion. HMGB1 was detected in all thromboemboli, accounting for 1.7% (IQR 0.6–6.2%) of the total thromboemboli area and was found to be colocalized with neutrophils and NETs and in spatial proximity to platelets. Correlation analysis revealed that the detection of HMGB1 was strongly related to the number of neutrophils (r = 0.58, p = 0.0002) and platelets (r = 0.51, p = 0.001). Our results demonstrate that HMGB1 is a substantial constituent of thromboemboli causing large vessel occlusion stroke.
KW  - acute ischemic stroke
KW  - thromboemboli
KW  - HMGB1
KW  - neutrophils
KW  - platelets
KW  - immunohistochemistry
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-265568
SN  - 1422-0067
VL  - 22
IS  - 20
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Vogelsang, Anna
A1  - Eichler, Susann
A1  - Huntemann, Niklas
A1  - Masanneck, Lars
A1  - Böhnlein, Hannes
A1  - Schüngel, Lisa
A1  - Willison, Alice
A1  - Loser, Karin
A1  - Nieswandt, Bernhard
A1  - Kehrel, Beate E.
A1  - Zarbock, Alexander
A1  - Göbel, Kerstin
A1  - Meuth, Sven G.
T1  - Platelet inhibition by low-dose acetylsalicylic acid reduces neuroinflammation in an animal model of multiple sclerosis
JF  - International Journal of Molecular Sciences
N2  - Aside from the established immune-mediated etiology of multiple sclerosis (MS), compelling evidence implicates platelets as important players in disease pathogenesis. Specifically, numerous studies have highlighted that activated platelets promote the central nervous system (CNS)-directed adaptive immune response early in the disease course. Platelets, therefore, present a novel opportunity for modulating the neuroinflammatory process that characterizes MS. We hypothesized that the well-known antiplatelet agent acetylsalicylic acid (ASA) could inhibit neuroinflammation by affecting platelets if applied at low-dose and investigated its effect during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model to study MS. We found that oral administration of low-dose ASA alleviates symptoms of EAE accompanied by reduced inflammatory infiltrates and less extensive demyelination. Remarkably, the percentage of CNS-infiltrated CD4\(^+\) T cells, the major drivers of neuroinflammation, was decreased to 40.98 ± 3.28% in ASA-treated mice compared to 56.11 ± 1.46% in control animals at the disease maximum as revealed by flow cytometry. More interestingly, plasma levels of thromboxane A\(_2\) were decreased, while concentrations of platelet factor 4 and glycoprotein VI were not affected by low-dose ASA treatment. Overall, we demonstrate that low-dose ASA could ameliorate the platelet-dependent neuroinflammatory response in vivo, thus indicating a potential treatment approach for MS.
KW  - acetylsalicylic acid
KW  - experimental autoimmune encephalomyelitis
KW  - platelets
KW  - multiple sclerosis
KW  - thromboxane
KW  - glycoprotein VI
KW  - platelet factor 4
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-284535
SN  - 1422-0067
VL  - 22
IS  - 18
ER  -