TY - JOUR A1 - Herrmann, Thomas A1 - Karunakaran, Mohindar M. T1 - Butyrophilins: γδ T cell receptor ligands, immunomodulators and more JF - Frontiers in Immunology N2 - Butyrophilins (BTN) are relatives of the B7 family (e.g., CD80, PD-L1). They fulfill a wide range of functions including immunomodulation and bind to various receptors such as the γδ T cell receptor (γδTCR) and small molecules. One intensively studied molecule is BTN3A1, which binds via its cytoplasmic B30.2 domain, metabolites of isoprenoid synthesis, designated as phosphoantigen (PAg), The enrichment of PAgs in tumors or infected cells is sensed by Vγ9Vδ2 T cells, leading to the proliferation and execution of effector functions to remove these cells. This article discusses the contribution of BTNs, the related BTNL molecules and SKINT1 to the development, activation, and homeostasis of γδ T cells and their immunomodulatory potential, which makes them interesting targets for therapeutic intervention. KW - butyrophilin KW - immune therapy KW - T cell receptor KW - γδ T cell KW - BTN3A1 KW - BTN2A1 KW - phosphoantigen KW - tumor Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-265944 SN - 1664-3224 VL - 13 ER - TY - JOUR A1 - De Lira, Maria Nathalia A1 - Raman, Sudha Janaki A1 - Schulze, Almut A1 - Schneider-Schaulies, Sibylle A1 - Avota, Elita T1 - Neutral Sphingomyelinase-2 (NSM 2) Controls T Cell Metabolic Homeostasis and Reprogramming During Activation JF - Frontiers in Molecular Biosciences N2 - Neutral sphingomyelinase-2 (NSM2) is a member of a superfamily of enzymes responsible for conversion of sphingomyelin into phosphocholine and ceramide at the cytosolic leaflet of the plasma membrane. Upon specific ablation of NSM2, T cells proved to be hyper-responsive to CD3/CD28 co-stimulation, indicating that the enzyme acts to dampen early overshooting activation of these cells. It remained unclear whether hyper-reactivity of NSM2-deficient T cells is supported by a deregulated metabolic activity in these cells. Here, we demonstrate that ablation of NSM2 activity affects metabolism of the quiescent CD4\(^+\) T cells which accumulate ATP in mitochondria and increase basal glycolytic activity. This supports enhanced production of total ATP and metabolic switch early after TCR/CD28 stimulation. Most interestingly, increased metabolic activity in resting NSM2-deficient T cells does not support sustained response upon stimulation. While elevated under steady-state conditions in NSM2-deficient CD4\(^+\) T cells, the mTORC1 pathway regulating mitochondria size, oxidative phosphorylation, and ATP production is impaired after 24 h of stimulation. Taken together, the absence of NSM2 promotes a hyperactive metabolic state in unstimulated CD4\(^+\) T cells yet fails to support sustained T cell responses upon antigenic stimulation. KW - neutral sphingomyelinase-2 KW - T cell receptor KW - Seahorse XF KW - oxidative phosphorylation KW - ATP-adenosine triphosphate KW - Mitochondria Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211311 SN - 2296-889X VL - 7 ER - TY - JOUR A1 - Börtlein, Charlene A1 - Schumacher, Fabian A1 - Kleuser, Burkhard A1 - Dölken, Lars A1 - Avota, Elita T1 - Role of neutral sphingomyelinase-2 (NSM 2) in the control of T cell plasma membrane lipid composition and cholesterol homeostasis JF - Frontiers in Cell and Developmental Biology N2 - The activity of neutral sphingomyelinase-2 (NSM2) to catalyze the conversion of sphingomyelin (SM) to ceramide and phosphocholine at the cytosolic leaflet of plasma membrane (PM) is important in T cell receptor (TCR) signaling. We recently identified PKCζ as a major NSM2 downstream effector which regulates microtubular polarization. It remained, however, unclear to what extent NSM2 activity affected overall composition of PM lipids and downstream effector lipids in antigen stimulated T cells. Here, we provide a detailed lipidomics analyses on PM fractions isolated from TCR stimulated wild type and NSM2 deficient (ΔNSM) Jurkat T cells. This revealed that in addition to that of sphingolipids, NSM2 depletion also affected concentrations of many other lipids. In particular, NSM2 ablation resulted in increase of lyso-phosphatidylcholine (LPC) and lyso-phosphatidylethanolamine (LPE) which both govern PM biophysical properties. Crucially, TCR dependent upregulation of the important T cell signaling lipid diacylglycerol (DAG), which is fundamental for activation of conventional and novel PKCs, was abolished in ΔNSM cells. Moreover, NSM2 activity was found to play an important role in PM cholesterol transport to the endoplasmic reticulum (ER) and production of cholesteryl esters (CE) there. Most importantly, CE accumulation was essential to sustain human T cell proliferation. Accordingly, inhibition of CE generating enzymes, the cholesterol acetyltransferases ACAT1/SOAT1 and ACAT2/SOAT2, impaired TCR driven expansion of both CD4\(^+\) and CD8\(^+\) T cells. In summary, our study reveals an important role of NSM2 in regulating T cell functions by its multiple effects on PM lipids and cholesterol homeostasis. KW - neutral sphingomyelinase-2 KW - T cell receptor KW - plasma membrane KW - lyso-phospholipids KW - diacylglycerol KW - cholesteryl ester Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-190596 SN - 2296-634X VL - 7 IS - 226 ER - TY - THES A1 - Romer Roche, Paula Sofia T1 - Separation from self explains failure of circulating T-cells to respond to the CD28 superagonist TGN1412 T1 - Verlust der "Selbst"-Erkennung erklärt die fehlende Reaktion zirkulierender T-Zellen auf den CD28-Superagonisten TGN1412 N2 - Stimulatory or superagonistic (SA) CD28-specific monoclonal antibodies (mAbs) are potent polyclonal activators of regulatory T cells and have proven highly effective as treatment in a wide range of rodent models for autoimmune and inflammatory diseases. In these models, a preferential activation of regulatory T cells was observed by in vivo administration of CD28SA. In stark contrast, human volunteers receiving TGN1412, a humanized CD28-specific mAb, experienced a life-threatening cytokine release syndrome during the first-in-man trial. Preclinical tests employing human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) failed to announce the rapid cytokine release measured in the human volunteers in response to TGN1412. The aim of this thesis project was to find an explanation of why standard PBMC assays failed to predict the unexpected TGN1412-induced "cytokine storm" observed in human volunteers. CD28 superagonists can activate T cells without T cell receptor (TCR) ligation. They do depend, however, on “tonic” TCR signals received by MHC scanning, signals that they amplify. PBMC do not receive these signals in the circulation. Short-term in vitro preculture of human PBMC at a high cell density (HDC) resulted in massive cytokine release during subsequent TGN1412 stimulation. Restoration of reactivity was cell-contact dependent, associated with TCR polarization and tyrosine-phosphorylation, and blocked by HLA-specific mAb. In HDC, both CD4 T cells and monocytes functionally mature in a mutually dependent fashion. However, only CD4 memory T-cells proliferate upon TGN1412 stimulation, and were identified as the main source of pro-inflammatory cytokines. Importantly, responses to other T-cell activating agents were also enhanced if PBMC were first allowed to interact under tissue-like conditions. A new in vitro protocol is provided that returns circulating T-cells to a tissue-like status where they respond to TGN1412 stimulation, and it might represent a more reliable preclinical in vitro test for both activating and inhibitory immunomodulatory drugs. Finally, the surprising observation was made that the IgG1 “sibling” of TGN1412, which is of the poorly Fc receptor-binding IgG4 isotype, has a much lower stimulatory activity. We could exclude steric hindrance as an explanation and provide evidence for removal of TGN1112 from the T-cell surface by trans-endocytosis. N2 - Stimulatorische oder superagonistische (SA) CD28-spezifische monoklonale Antikörper (mAbs) (CD28SA) haben sich in diversen Nagetiermodellen für Autoimmunerkrankungen sowie für inflammatorische Erkrankungen als effektive Behandlungsmöglichkeit erwiesen. In diesen Modellen konnte nachgewiesen werden, dass CD28SA-Injektionen zu einer verstärkten Aktivierung regulatorischer T-Zellen in führen. Entgegen diesen Beobachtungen im Tiermodell reagierten die Teilnehmer einer ersten klinischen Studie auf die Administration des humanisierten CD28SA TGN1412 mit einer akut lebensbedrohlichen systemischen Zytokinausschüttung. Vorklinische Studien an humanen mononukleären Zellen des Blutes (PBMC) hatten keinen Hinweis auf eine mögliche plötzliche Zytokinausschüttungen als Reaktion auf TGN1412 gegeben. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht eine Erklärung zu finden, warum PBMC-basierte Tests, wie sie vorklinischen Studien als Standard eingesetzt werden, nicht auf den unerwarteten TGN1412-induzierten „Zytokinsturm“ der Probanden hinwiesen. CD28SA aktivieren T-Zellen ohne Ligation des T-Zell Rezeptors (TCR). Jedoch werden zur CD28SA-abhängigen Aktivierung von T-Zellen „tonische“ TCR Signale benötigt, die durch MHC Scanning der T-Zellen an der Oberfläche anderer Zellen erzeugt werden. PBMC, welche sich in der Zirkulation befinden, erhalten diese „tonischen“ TCR Signale nicht. Kurzzeitige Vorkultur humaner PBMC bei hoher Zelldichte (high-density culture, HDC) führte zu einer starken Zytokinantwort bei nachfolgender TGN1412 Stimulation. Diese wiedererlangte Reaktivität gegenüber TGN1412 ging mit Tyrosin-Phospholrylierung sowie der Polarisierung von TCR Molekülen einher, war abhängig von Zellkontakten und konnte durch HLA-spezifische mAbs geblockt werden. Während der HDC durchlaufen sowohl CD4 T-Gedächtniszellen, als auch Monozyten eine voneinander abhängige funktionelle Reifung. TGN1412-induzierte Zellproliferation beschränkt sich jedoch auf CD4 T-Gedächtniszellen, die auch die Hauptquelle der proinflammatorische Zytokine sind. Antworten auf weitere T-Zell aktivierende Agenzien waren ebenfalls erhöht, wenn PBMC zunächst auf gewebeartige Bedingungen zurückgesetzt wurden. Die vorliegende Arbeit beschreibt damit ein neuartiges in vitro Protokoll für humane PBMC, welches T-Zellen der Zirkulation in einen gewebeartigen funktionellen Status versetzt, in welchem sie auf TGN1412 antworten. Dieses Protokoll könnte auch einen verlässlicheren vorklinischen in vitro Test sowohl für aktivierende als auch für inhibierende immunmodulatorische Medikamente darstellen. Im letzten Teil der Arbeit wird die erstaunliche Beobachtung vorgestellt, dass TGN1112, ein IgG1 Antikörper mit gleicher Spezifität wie der IgG4 Antikörper Antikörper TGN1412, trotz seiner höheren Affinität für Fc-Rezeptoren eine viel geringere stimulatorische Aktivität zeigt. Sterische Hinderung konnte als eine mögliche Erklärung ausgeschlossen werden. Vielmehr scheint das Entfernen von TGN1112/CD28 Komplexen von der T-Zelloberfläche durch Trans-Endozytose eine mögliche Erklärung für die geringere Aktivität zu sein. KW - T-Lymphozyten-Rezeptor KW - Antigen CD28 KW - Monoklonaler Antikoerper KW - CD28-Superagonist KW - TGN1412 KW - T cell receptor KW - CD28 antigen KW - monoclonal antibody KW - CD28-superagonist KW - TGN1412 Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74933 ER - TY - THES A1 - Föger, Niko T1 - Costimulatory function of CD44 T1 - Die kostimulatorische Funktion von CD44 N2 - T cell activation is supposed to require two signals via engagement of the TCR and a costimulatory molecule. However, the signaling cascade of costimulatory molecules has remained elusive. Here, I provide evidence that CD44 supports proliferation as well as apoptosis mainly, if not exclusively, by enhancing signal transduction via the TCR/CD3 complex. Blockade of CD44 interferes with mounting of an immune response. This has been demonstrated by the significantly decreased IL-2 production of a T helper line, when stimulated in the presence of a competing CD44 receptor globulin. To evaluate the underlying mechanism, CD44 was cross-linked by an immobilized antibody (IM7). Cross-linking of CD44 induces proliferation of peripheral T cells and apoptosis of thymocytes and a T helper line in the presence of subthreshold levels of anti-CD3. CD44-induced proliferation was accompanied by an upregulation of the activation markers CD25 and CD69 and an increased cytokine production. TCR-mediated apoptosis was accompanied by an upregulation of CD95 ligand and CD95 receptor, which could be greatly enhanced by costimulation via CD44. On the level of signal transduction, coligation of CD44 with CD3 resulted in a strong and sustained increase of early tyrosine phosphorylation events and upregulated downstream signal transduction pathways, such as the ras/ERK and the JNK signaling cascades. These pleiotropic effects of CD44 are due to its involvement in the most proximal events in TCR signaling, as demonstrated by a strong increase in the phosphorylation of the TCR z-chain and ZAP-70. Notably, cross-linking of CD44 was binding-site dependent and was only effective when supporting colocalization of the TCR/CD3 complex and CD44. Cross-linking of CD44 via immobilized IM7 also induced profound changes in cell morphology, characterized by strong adhesion, spreading and development of surface extensions, which were dependent on a functional tubulin and actin cytoskeleton. These cytoskeletal rearrangements were mediated by rac1, a small GTPase of the rho subfamily, and src-family kinases, two of which, fyn and lck, were found to be associated with CD44. By cross-linkage of CD44 these kinases were redistributed into so called lipid rafts. It is supposed that for T cell activation a relocation of the TCR/CD3 complex into the same membrane microdomains is required. The data are interpreted in the sense that the costimulatory function of CD44 relies on its cooperativity with the TCR. Most likely by recruitment of phosphokinases CD44 significantly lowers the threshold for the initiation of signaling via the TCR. The requirement for immobilized anti-CD44, the necessity for neighbouring anti-CD3 and the dependence on the binding site of CD44 strongly suggest that the costimulatory mechanism involves cytoskeletal rearrangements, which facilitate recruitment and redirection of src-family protein kinases in glycolipid enriched membrane microdomains. N2 - Es ist bekannt, dass die Aktivierung von T-Zellen zwei Signale erfordert, die Bindung des T-Zell-Rezeptors (TZR) an den Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex und die Bindung sogenannter kostimulatorischer Moleküle an ihren Liganden. Über diese Rezeptor-Liganden-Interaktionen wird eine Kettenreaktion von Signalen ausgelöst, die die Aktivierung einer ganzen Reihe von Genen bewirken. Die Signale die über die Liganden Bindung des TZR in Gang gesetzt werden, sind weitgehend bekannt. Hingegen ist unser Wissen über das Funktionsprinzip kostimulatorischer Moleküle äußerst lückenhaft. In der vorliegenden Arbeit wird aufgezeigt, dass und auf welche Weise CD44, eines dieser kostimulatorischen Moleküle, maßgeblich zur Verstärkung der über den TZR transduzierten Signale beiträgt. Ausgangspunkt der vorgelegten Studie war der Befund, dass eine Blockade von CD44, z.B. mittels eines kompetitiven löslichen CD44 Moleküls, die Antigen-induzierte Aktivierung einer T-Zelllinie blockieren kann. Zur Klärung des zugrunde liegenden Mechanismus wurde CD44 mittels immobilisierter Antikörper quervernetzt. Bei gleichzeitiger, suboptimaler Stimulation des T-Zell-Rezeptors induzierte die Quervernetzung von CD44 zum einen die Proliferation reifer T-Zellen, zum anderen den apoptotischen Zelltod von Thymozyten beziehungsweise einer T-Helferzelllinie. Erwartungsgemäß war die CD44-induzierte Proliferation mit der Expression sogenannter Aktivierungsmarker wie CD25 und CD69 und einer erhöhten Zytokinproduktion verbunden. Dementsprechend wurde bei CD44-induzierter Apoptose eine deutlich gesteigerte Expression des CD95 Moleküls und seines Liganden beobachtet. Die kostimulatorische Aktivität von CD44 war mit einer gesteigerten Tyrosinphosphorylierung und einer Hochregulation der ras/ERK und JNK Signalkaskaden verbunden. Da von allen beobachteten Veränderungen bekannt ist, dass sie auch über die Besetzung des TZR mit einem geeigneten Stimulus ausgelöst werden können, war es naheliegend anzunehmen, dass sich die kostimulatorische Funktion von CD44 auf eine Verstärkung der TZR-vermittelten Signale zurückführen läßt. Der Befund einer gesteigerten Phosphorylierung der TZR-z-Kette und der ZAP-70 Kinase, über die die Aktivierung von T-Zellen eingeleitet wird, unterstützt nachhaltig diese Hypothese. Hinzu kommen zwei weitere Befunde: 1. Die Quervernetzung von CD44 führt nur unter der Voraussetzung einer räumlichen Annäherung von CD44 und dem TZR zu einer Unterstützung der T-Zellaktivierung. Diese findet in sogenannten "Rafts" statt; 2. Die Quervernetzung von CD44 führt zu Adhäsion und Zellspreitzung, bedingt durch ein Rearrangement des Zytoskeletts an dem die GTPase rac1 und die src-Kinasen fyn und lck beteiligt sind. Diese beiden Kinasen sind konstitutiv mit CD44 assoziiert. Bei Quervernetzung des Moleküls und Reorganisation des Zytoskeletts wird eine deutliche Anreicherung von fyn und lck in den Rafts, also in direkter Nachbarschaft zum TZR, beobachtet. Diese Daten unterstützen nachhaltig meine Arbeitshypothese, dass sich die kostimulatorische Funktion von CD44 auf eine kooperative Aktivität mit dem TZR zurückführen läßt. Es ist wahrscheinlich, dass durch Rekrutierung der Kinasen lck und fyn der Schwellenwert für die Initiierung von Signalen über den TZR signifikant erniedrigt wird. Die Rekrutierung dieser Kinasen wird durch eine Reorganisation des Zytoskeletts, die mit der Einbringung dieser Kinasen in den Bereich der Rafts einhergeht, ermöglicht. Inwieweit die erhobenen Befunde zur kostimulatorischen Aktivität des Adhäsionsmoleküls CD44 im Sinne eines Verstärkungs-mechanismus eingeleitet durch räumliche Annäherung generelle Gültigkeit haben, kann noch nicht abschließend beantwortet werden. Die Mehrheit der in jüngster Zeit erhobenen Befunde zur Klärung des Funktionsprinzips kostimulatorischer Moleküle bestätigt jedoch das Prinzip nachbarschaftlicher Kooperation. KW - Antigen CD44 KW - T-Lymphozyten-Rezeptor KW - T-Lymphozyt KW - Aktivierung KW - T-Lymphozyten KW - Signal Transduktion KW - Kostimulatorisches Molekül KW - T-Zell-Rezeptor KW - Lipid Mikrodomänen KW - Aktin-Zytoskelett KW - T lymphocytes KW - signal transduction KW - costimulatory molecule KW - T cell receptor KW - lipid microdomains KW - actin cytoskeleton Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1186 ER -