TY - THES A1 - Fuchs, Manuela T1 - Global discovery and functional characterization of Hfq-associated sRNA-target networks in \(C.\) \(difficile\) T1 - Globale Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von Hfq-assoziierten sRNA-Zielnetzwerken in \(C.\) \(difficile\) N2 - In this work, dRNA-seq (differential RNA sequencing) and RNAtag-seq were applied to first define the global transcriptome architecture of C. difficile, followed by Hfq RIP-seq (RNA immunoprecipitation followed by RNA-seq) and RIL-seq (RNA interaction by ligation and sequencing) to characterize the Hfq-mediated sRNA interactome on a transcriptome-wide scale. These approaches resulted in the annotation of > 60 novel sRNAs. Notably, it not only revealed 50 Hfq-bound sRNAs, but also > 1000 mRNA-sRNA interactions, confirming Hfq as a global RNA matchmaker in C. difficile. Similar to its function in Gram-negative species, deletion of Hfq resulted in decreased sRNA half-lives, providing evidence that Hfq affects sRNA stability in C. difficile. Finally, several sRNAs and their function in various infection relevant conditions were characterized. The sRNA nc085 directly interacts with the two-component response regulator eutV, resulting in regulation of ethanolamine utilization, an abundant intestinal carbon and nitrogen source known to impact C. difficile pathogenicity. Meanwhile, SpoY and SpoX regulate translation of the master regulator of sporulation spo0A in vivo, thereby affecting sporulation initiation. Furthermore, SpoY and SpoX deletion significantly impacts C. difficile gut colonization and spore burden in a mouse model of C. difficile infection. N2 - Der anaerobe Gram-positive humanpathogene Erreger Clostridioides difficile (C. difficile) gilt als Hauptursache für nosokomiale Antibiotika-assoziierte Diarrhöe. Verschiedene Virulenzfaktoren und -eigenschaften beeinflussen das Fortschreiten und den Schweregrad der Krankheit, darunter Toxinexpression und Sporenbildung. Kleine regulatorische RNAs (sRNAs) sind bekannte post- transkriptionelle Regulatoren von Virulenz- und Stress-assoziierten Stoffwechselwegen in vielen pathogenen Bakterien. In Gram-negativen Arten wird sRNA-abhängige post-transkriptionelle Regulierung häufig durch das RNA-Chaperon Hfq vermittelt, welches die sRNA-mRNA- Basenpaarung erleichtert. Trotz ihrer Bedeutung in Gram-negativen Bakterien ist vergleichsweise wenig über die verschiedenen Aspekte der post-transkriptionellen Regulation in Gram-positiven Arten bekannt. Erste Daten deuten auf eine wichtige Funktion von Hfq bei der Regulierung verschiedener infektionsassoziierter Signalwege in C. difficile hin, sowie auf die Existenz eines umfangreichen post-transkriptionellen Netzwerks. Eine globale Identifizierung von Hfq- assoziierten RNAs und deren Einfluss auf die Virulenz von und Kolonisierung durch C. difficile ist jedoch bisher noch nicht erfolgt. In dieser Arbeit wurde dRNA-seq (differentielle RNA-Sequenzierung) und RNAtag-seq angewandt, um zunächst die globale Transkriptom-Architektur von C. difficile zu definieren. Anschließend wurde Hfq RIP-seq (RNA-Immunpräzipitation gefolgt von RNA-seq) und RIL-seq (RNA-Interaktion durch Ligation und Sequenzierung) durchgeführt, um das Hfq-vermittelte sRNA-Interaktom auf globaler Ebene zu charakterisieren. Diese Ansätze führten zur Annotation von > 60 neuen sRNAs. Darüber hinaus wurden 50 Hfq-gebundene sRNAs, sowie > 1000 mRNA- sRNA-Interaktionen identifiziert, wodurch Hfq als globaler RNA-Matchmaker in C. difficile bestätigt wurde. Analog zu seiner Funktion in Gram-negativen Arten, führte die Deletion von Hfq zu verringerten sRNA-Halbwertszeiten, was darauf hindeutet, dass Hfq die sRNA-Stabilität in C. difficile beeinflusst. Schließlich wurden mehrere sRNAs und ihre Funktion unter verschiedenen infektionsrelevanten Bedingungen charakterisiert. Die sRNA nc085 interagiert direkt mit dem Zweikomponenten-Regulator eutV, was zu einer Regulierung der Ethanolaminverwertung führt. Als häufig vorkommenden Kohlenstoff- und Stickstoffquelle im Darm, kann Ethanolamin die Pathogenität von C. difficile beeinflussen. SpoY und SpoX regulieren dagegen die Translation des Hauptregulators der Sporulation spo0A in vivo und damit die Sporulationsinitiation. Darüber hinaus hat die Deletion von SpoY und SpoX signifikante Auswirkungen auf die Besiedlung des Darms mit C. difficile sowie die Sporenbelastung in einem Mausmodell der C. difficile-Infektion. Insgesamt liefert diese Arbeit Beweise für eine umfassende Hfq-abhängige post-transkriptionelle Regulierung, die die Physiologie und Virulenz eines Gram-positiven Erregers beeinflusst. Auch wenn mit dieser Arbeit die Charakterisierung der sRNA-vermittelten Regulation in C. difficile gerade erst begonnen hat, können die RIL-seq-Daten als Grundlage für zukünftige mechanistische Studien der RNA-basierten Genregulation in C. difficile herangezogen werden. KW - Clostridium difficile KW - Non-coding RNA KW - Small RNA KW - RNA-bindendes Protein KW - Sporulation KW - post-transcriptional regulation KW - anaerobe KW - Gram-positive KW - differential RNA-seq KW - transcriptional termination site KW - Hfq KW - RIL-seq KW - Spo0A KW - RNS-Bindungsproteine KW - Sporenbildung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-345982 ER - TY - THES A1 - Bauriedl, Saskia Corinna T1 - The influence of riboregulation on fitness and virulence in Neisseria meningitidis T1 - Der Einfluss der Riboregulation auf Fitness und Virulenz von Neisseria meningitidis N2 - Neisseria meningitidis (N. meningitidis) is a human commensal that occasionally causes life-threatening infections such as bacterial meningitis and septicemia. Despite experi-mental evidence that the expression of small non-coding RNAs (sRNAs) as well as the RNA chaperone Hfq affect meningococcal physiology, the impact of RNA-based regula-tion (riboregulation) on fitness and virulence in N. meningitidis is only poorly understood. Therefore, this study addressed these issues using a combination of high-throughput tech-nologies. A differential RNA-sequencing (dRNA-seq) approach was applied to produce a single-nucleotide resolution map of the primary transcriptome of N. meningitidis strain 8013. The dRNA-seq analysis predicted 1,625 transcriptional start sites including 65 putative sRNAs, of which 20 were further validated by northern blot analysis. By Hfq RNA im-munopreci-pitation sequencing a large Hfq-centered post-transcriptional regulatory net-work comprising 23 sRNAs and 401 potential mRNA targets was identified. Rifampicin stability assays demonstrated that Hfq binding confers enhanced stability on its associat-ed sRNAs. Based on these data, the interactions of two paralogous sRNAs and their cog-nate target mRNA prpB were validated in vivo as well as in vitro. Both sRNAs directly repress prpB encoding a methylisocitrate lyse which was previously shown to be involved in meningococcal colonization of the human nasopharynx. Besides the well-described RNA chaperone Hfq, FinO-domain proteins have recently been recognized as a widespread family of RNA-binding proteins (RBPs) with regulatory roles in diverse bacteria. They display an intriguing bandwidth of target sites, ranging from a single RNA pair as recognized by plasmid-encoded FinO to the global RNA regu-lons of enterobacterial ProQ proteins. To better understand the intrinsic targeting mode of this RBP family, in vivo targets of the minimal ProQ protein of N. meningitidis were de-termined. In vivo UV crosslinking with RNA deep sequencing (UV-CLIP) identified as-sociations of ProQ with 16 sRNAs and 166 mRNAs encoding a variety of biological functions and thus revealed ProQ as another global RBP in meningococci. It could be shown that meningococcal ProQ predominantly binds to highly structured RNA regions including DNA uptake sequences (DUS) and rho-independent transcription terminators and stabilizes many of its RNA targets as proved by rifampicin stability experiments. As expected from the large suite of ProQ-bound RNAs, proQ deletion globally affects both gene and protein expression in N. meningitidis, changing the expression levels of at least 244 mRNAs and 80 proteins. Phenotypic analyses suggested that ProQ promotes oxida-tive stress tolerance and UV damage repair capacity, both of which are required for full virulence of N. meningitidis. Together, this work uncovers the co-existence of two major post-transcriptional regulons, one governed by ProQ, the other by Hfq, in N. meningitidis. It further highlights the role of these distinct RBPs and its associated sRNAs to bacterial virulence and indicates that riboregulation is likely to contribute to the way how meningococci adapt to different host niches. N2 - Neisseria meningitidis (N. meningitidis) ist ein kommensal lebendes Bakterium, welches unter nicht vollständig geklärten Bedingungen auch lebensbedrohliche Infektionen im Menschen wie bakterielle Meningitis und Sepsis verursachen kann. Obwohl experimentell nachgewiesen wurde, dass die Expression kleiner, nicht kodierender RNAs (sRNAs) so-wie des RNA-Chaperons Hfq in Meningokokken physiologisch relevant ist, blieb der Ein-fluss der RNA-basierten Genregulation (Riboregulation) auf die Fitness und Virulenz von N. meningitidis bisher unvollständig verstanden. Daher befasste sich diese Studie durch Kombination verschiedener Hochdurchsatz-Technologien mit dieser Fragestellung. Es wurde differentielle RNA-Sequenzierung (dRNA-seq) angewendet, um das primäre Transkriptom des N. meningitidis Stamms 8013 möglichst genau zu kartieren. Die durch-geführte dRNA-seq-Analyse detektierte 1.625 Transkriptionsstartstellen (TSS) einschließ-lich 65 potentieller sRNAs. Durch Anwendung von Northern-Blot-Analysen konnten an-schließend 20 sRNAs experimentell validiert werden. Darüber hinaus wurde durch Ko-Immunopräzipitation mit Hfq (RIP-seq) ein großes, Hfq-zentriertes, post- transkripti-onelles regulatorisches Netzwerk identifiziert, welches 23 sRNAs und 401 mRNAs um-fasst. Rifampicin-Stabilitätsversuche zeigten, dass durch Hfq-Bindung die Stabilität die-ser sRNAs erhöht wird. Basierend auf diesen Daten konnte die Interaktion zwischen zweier Hfq-gebundener paraloger sRNAs und der prpB mRNA sowohl in vivo als auch in vitro bestätigt werden. Beide sRNAs reprimieren die Translation des PrpB-Genes, wel-ches für eine Methylisocitratlyase kodiert und wahrscheinlich die Kolonisation des menschlichen Nasopharynxs durch Meningokokken begünstigt. Neben dem ausführlich charakterisierten RNA-Chaperon Hfq wurden Proteine mit FinO-Domäne kürzlich als eine neue Familie von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) mit regula-torischen Funktionen in verschiedenen Bakterien identifiziert. Sie weisen eine große Bandbreite regulierter Gene auf: Während das Plasmid-kodierte FinO-Protein nur ein ein-zelnes RNA-Paar bindet, stellt das enterobakterielle ProQ-Protein ein globales RBP dar. Um die Wirkungsweise dieser RBP-Familie besser zu verstehen, wurde in vivo untersucht, wie viele RNAs mit dem minimalen ProQ-Protein in N. meningitidis assoziiert sind. Durch Kombination von UV-Crosslinken mit RNA-Sequenzierung (UV-CLIP) konnte die Bin-dung von 16 sRNAs und 166 biologisch diverser mRNAs mit ProQ identifiziert werden, welches daher ebenfalls ein globales RBP in Meningokokken darstellt. Es konnte gezeigt werden, dass ProQ vorwiegend RNA-Regionen mit ausgeprägter Sekundärstruktur bin-det, darunter DNA-Aufnahmesequenzen (DUS) und Rho-unabhängige Transkriptions-terminatoren. Die ProQ-Bindung führt dabei häufig zur Stabilisation der RNAs, was durch Rifampicin-Stabilitätsexperimente nachgewiesen wurde. Wie aufgrund der großen Zahl ProQ-gebundener RNAs zu erwarten, beeinflusste die Deletion des ProQ Proteins die zelluläre Expression von mindestens 244 mRNAs und 80 Proteinen. Phänotypische Analysen deuten darauf hin, dass ProQ sowohl die Toleranz gegenüber oxidativem Stress als auch die Reparatur von DNA-Schäden reguliert, die beide für die vollständige Viru-lenz von N. meningitidis von Bedeutung sind. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit die Koexistenz von zwei großen posttranskrip-tionellen Regulons in N. meningitidis, von denen eines von ProQ und das andere von Hfq kontrolliert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle beider RBPs und ihrer assozi-ierten sRNAs für die bakterielle Virulenz verdeutlicht und hervorgehoben, dass Riboregu-lation sehr wahrscheinlich dazu beiträgt, wie sich Meningokokken an verschiedene Wirts-nischen anpassen. KW - Neisseria meningitidis KW - Small non-messenger RNS KW - Hfq KW - ProQ KW - Non-coding RNA KW - High throughput screening Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192978 ER -