TY  - THES
A1  - Barth, Enrico
T1  - Study of the properties of channel-forming proteins of the cell walls of different Corynebacteriae
T1  - Untersuchung der Eigenschaften kanalbildender Proteine aus den Zellwänden verschiedener Corynebacteriae
N2  - Die Gattung Corynebacterium gehört, neben Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus und weiteren nahverwandten Gattungen, dem unverwechselbaren, gattungsübergreifenden Taxon Mycolata an. Viele Spezies aus dieser heterogenen Gruppe Mycolsäure-haltiger Actinomyceten sind entweder aufgrund ihrer medizinischen oder ihrer biotechnologischen Bedeutung bekannt. Beispielsweise zählen Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Corynebacterium diphtheriae und Nocardia farcinica, welche weltweit Verursacher besonders gefährlicher bakterieller Infektionskrankheiten sind, zu dieser ungewöhnlichen Gruppe Gram-positiver Bakterien. Ebenso bedeutsam sind einige apathogene Mycolata-Arten, die industrielle Anwendung finden. Corynebacterium glutamicum und Corynebacterium efficiens sind leistungsfähige Bakterien, die zum Beispiel in der Produktion des Geschmacksverstärkers Glutamat und des Tierfuttermittelzusatzes Lysin eingesetzt werden, während verschiedene Rhodococcus Spezies Anwendung bei der Herstellung von Acrylsäuren finden. Die Zellwand der Mycolata zeigt, verglichen mit der klassischer Gram-positiver Bakterien, eine außergewöhnliche Zusammensetzung und Struktur auf. Abgesehen von einem Arabinogalactan-Peptidoglycan-Komplex enthält die Zellwand der meisten Actinomyceten einen hohen Anteil an Mycolsäuren. Diese langkettigen, verzweigten Fettsäuren formen eine, mit der äußeren Membran Gram-negativer Bakterien vergleichbare, stark undurchlässige, hydrophobe äußere Hülle, welche die Grundlage der außergewöhnlichen Medikamentenresistenz bei den Mycolata bildet. Wie die äußere Membran Gram-negativer Bakterien enthält die Zellwand der Mycolata porenformende Proteine, die den Durchlass hydrophiler Substanzen gestatten. Indem sie eine Verbindung zwischen dem Zellinneren und der Umwelt, in der das Bakterium lebt, schaffen und einen kontrollierten Austausch zwischen beiden ermöglichen, tragen die Kanalproteine entscheidend zur Funktion der bakteriellen Zellhülle bei. Das Ziel dieser Arbeit war das Wissen über Zellwandkanäle in Corynebakterien zu erweitern. Deshalb untersuchten wir PorA und PorH Proteine, die basierend auf früheren Studien Zellwandkanälen in C. glutamicum, C. efficiens und Corynebacterium callunae zugeordnet werden, um ungeklärten Fragen nachzugehen und um Wissen über deren Struktur zu erlangen. Ferner inspizierten wir Zellwände pathogener Corynebakterien, genauer gesagt von Corynebacterium diphtheriae und Corynebacterium jeikeium, um herauszufinden, ob diese Spezies wie ihre harmlosen Verwandten Kanalproteine besitzen. In dieser Arbeit wiesen wir mit C. diphtheriae und C. jeikeium in zwei weiteren Corynebacterium-Arten offene, mit Wasser gefüllte Zellwandkanäle nach. Des Weiteren stellten wir fest, dass sich die Zellwandkanäle von C. glutamicum, C. efficiens und C. diphtheriae aus zwei Proteinen zusammensetzen, einem zugehörig zu der Gruppe der PorH Proteine und einem weiteren aus der Gruppe der PorA Proteine. Diese heteromere Struktur von Zellwandkanälen bei Corynebakterien stellt ein Novum für Zellwandkanäle bei den Mycolata dar. Indessen besteht der Zellwandkanal von C. jeikeium aus nur einem Protein, CjPorA, angeordnet zu einem Oligomer. Obgleich das Molekulargewicht dieses Proteins (4 kDa) mit dem von PorH und PorA Proteinen vergleichbar ist (5-7 kDa), weißt seine Primärsequenz keine eindeutige Homologie zu diesen auf. Dennoch deutet vieles auf eine Verwandtschaft zwischen CjPorA und PorH/PorA Proteinen hin, da das Gen jk0268, welches für CjPorA kodiert, sich in einer Region des C. jeikeium Chromosoms befindet, die der Genomregion entspricht in welcher die porH/porA Gene der anderen Corynebakterien lokalisiert sind. Dies lässt vermuten, dass jk0268 (welches für den homomeren Zellwandkanal in C. jeikeium kodiert) und die porH/porA Gene von C. glutamicum, C. efficiens und C. diphtheriae (die einen heteromeren Zellwandkanal kodieren) wahrscheinlich Nachkommen eines gemeinsamen Vorläufergens sind. Phylogenetische Analysen der Gattung Corynebacterium unterstützen diese Annahme. Desweitern legen sie nahe, dass die hier untersuchten Zellwandkanäle innerhalb dieser Gattung wahrscheinlich weit verbreitet sind. Ein umfassendes Wissen über Zellwandkanäle, denen beim Transport gelöster Stoffe über die äußere Membran in Corynebakterien und anderen Mitgliedern der Mycolata eine entscheidende Rolle zukommt, könnte von großem wirtschaftlichem und medizinischem Nutzen sein.
N2  - The genus Corynebacterium belongs, together with Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus and further closely related genera, to the distinctive suprageneric taxon mycolata. Many species within this diverse group of mycolic acid containing actinomycetes are known either because of their medical or biotechnological relevance. For instance, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Corynebacterium diphtheriae and Nocardia farcinica, causer of most dangerous bacterial infectious diseases world-wide, are among this exceptional group of Gram-positive bacteria. Likewise of importance are some harmless mycolata species which find use in industrial settings. Corynebacterium glutamicum and Corynebacterium efficiens are, e.g., potent producers of the flavour enhancer glutamate and the animal feed additive lysine, while several Rhodococcus species are applied in the production of acrylic acids. The cell wall of mycolata species, compared with that of Gram-positive bacteria, exhibits an unusual composition and organization. Besides an arabinogalactan-peptidoglycan complex, the cell walls of most actinomycetes contain large amounts of mycolic acids. Comparable to the outer membrane of Gram-negative bacteria, these long-chained branched fatty acids form a highly impermeable hydrophobic outer layer which provides the basis of the exceptional drug resistance of mycolata species. Like the outer membrane of Gram-negative bacteria, the cell wall of mycolata contains channel-forming proteins that allow the passage of hydrophilic solutes. By permitting and controlling the exchange and communication between the interior of the cell and the environment in which the bacterium lives, the channels play an important role for the function of the bacterial cell envelope. This thesis aimed to extend our knowledge about cell wall channels in corynebacteria. For this purpose, we examined PorA and PorH proteins that have been associated by previous studies with cell wall pores in C. glutamicum, C. efficiens and Corynebacterium callunae in order to resolve unanswered questions and to gain structural knowledge. We also investigated cell walls of pathogenic corynebacteria, in particular of Corynebacterium diphtheriae and Corynebacterium jeikeium, to investigate if these species possessed channels as is the case with their harmless relatives. In this work we provided evidence for the existence of large and water-filled cell wall channels in C. diphtheriae and C. jeikeium. Moreover, we demonstrated that the major cell wall channels of C. glutamicum, C. efficiens and C. diphtheriae consist of two distinctive polypeptides; one of whom belongs to the class of PorH proteins and the other to the class of PorA proteins. This heteromeric structure of channels of corynebacteria represents a novelty for channels of the mycolata. In contrast, the C. jeikeium channel is solely constituted by a single protein, CjPorA, arranged as an oligomer. Although the molecular mass of this protein (4kDa) is comparable to those of PorH and PorA proteins (5-7 kDa), it shares no distinctive homology in its primary sequence with them. However, there is evidence for relationship between CjPorA and PorH/PorA proteins because the gene jk0268, coding for CjPorA, is localized in a chromosomal region of C. jeikeium that corresponds to the genomic region containing the porH/porA genes in the other corynebacteria. This suggests that jk0268 (coding for the homomeric cell wall channel in C. jeikeium) and the porH/porA genes of C. glutamicum, C. efficiens and C. diphtheriae (coding for heteromeric cell wall channels) are presumably descendants of a common ancestor gene. This assumption gets support from data on phylogenetic analysis of the genus Corynebacterium. Moreover, these data suggest that the here investigated cell wall channels are presumably widespread within this genus. A profound knowledge of cell wall channels, building the main passage of solutes through the outer mycolate membrane in corynebacteria and other members of the mycolata, can be of great economical and medical value.
KW  - Zellwand
KW  - Corynebacterium
KW  - Corynebacterium callunae
KW  - Corynebacterium diphtheriae
KW  - Corynebacterium efficiens
KW  - Corynebacterium glutamicum
KW  - Porin
KW  - Corynebacterium jeikeium
KW  - C. jeikeium
KW  - C. glutamicum
KW  - C. efficiens
KW  - C. callunae
KW  - C. diphtheriae
KW  - Mykolsäuren
KW  - Lipid Bilayer Membran
KW  - Corynebacterium jeikeium
KW  - C. jeikeium
KW  - C. glutamicum
KW  - C. efficiens
KW  - C. callunae
KW  - C. diphtheriae
KW  - Mycolic acid
KW  - Lipid Bilayer Membrane
KW  - porin
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36325
ER  - 
TY  - THES
A1  - Thein, Marcus
T1  - Porins of Lyme Disease and Relapsing Fever Spirochetes
T1  - Porine aus Lyme-Borreliose- und Rückfallfieber- Spirochäten
N2  - Die Gattung Borrelia gehört zur Abteilung der Spirochäten, einem alten Zweig der Bakteriendomäne, der nur entfernt mit Gram-negativen Bakterien verwandt ist. Sämtliche Arten dieser Gattung sind obligate Parasiten. Borrelien können in die Erreger zweier humaner Krankheiten eingeteilt werden: die Lyme-Borreliose und das Rückfallfieber. Borrelien besitzen mit 0.91 Mb ein sehr kleines Chromosom und sind daher in ihren metabolischen Fähigkeiten eingeschränkt. Folglich ist das Überleben sämtlicher Borrelienarten absolut abhängig von Nährstoffen, die von ihren Wirten bereitgestellt werden. Der Transport dieser Nährstoffe und anderer Moleküle über die äußere Membran wird durch porenformende Proteine, so genannte Porine ermöglicht. Porine sind wassergefüllte Kanäle, die in zwei Klassen unterteilt werden können: allgemeine Diffusionsporen und substratspezifische Porine. Aus dem Lyme-Borreliose Erreger Borrelia burgdorferi wurden bisher drei mutmaßliche Porine charakterisiert und beschrieben: P13, Oms28 und P66. Demgegenüber sind die Kenntnisse über Porine in Rückfallfieberarten rudimentär und es wurde bisher noch kein einziges Porin für Vertreter dieser Krankheit identifiziert. Unter Berücksichtigung dieses Hintergrunds war die allgemeine Zielsetzung dieser Arbeit, einen Einblick in die Porinzusammensetzung von sowohl Lyme Borreliose- als auch Rückfallfieber-Spirochäten zu erlangen. Dieses Ziel konnte erreicht werden, indem Porine aus den Außenmembranen von Borrelien isoliert und identifiziert wurden und anschließend biophysikalisch in künstlichen Lipidmembranen charakterisiert wurden. Ein Kapitel dieser Arbeit beschreibt die Identifizierung und Charakterisierung des ersten Porins aus Rückfallfiebererregern. Das porenformende Protein wurde aus den Außenmembranen von Borrelia duttonii, Borrelia hermsii und Borrelia recurrentis isoliert und Oms38 genannt, für „outer membrane-spanning protein of 38 kDa“. Die biophysikalische Charakterisierung mit der „black lipid bilayer“ Methode zeigte, dass Oms38 kleine, wassergefüllte Kanäle mit einer Einzelkanalleitfähigkeit von 80 pS in 1 M KCl bildet. Diese Kanäle sind nicht spannungsabhängig und leicht selektiv für Anionen mit einem Permeabilitätsverhältnis von Kationen zu Anionen von 0,41 in KCl. Ein homologes Protein zu Oms38 wurde in den Lyme Borreliose Erregern Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii und Borrelia afzelii identifiziert. Das porenformende Protein dieser Arten weist eine hohe Sequenzhomologie zu Oms38 auf und zeigt ähnliche biophysikalische Eigenschaften, das heißt es formt Poren von 50 pS in 1 M KCl. Durch Titrationsexperimente konnte gezeigt werden, dass die Pore teilweise durch Dicarboxylate blockiert werden kann. Eine Auswertung dieser Versuche legte nahe, dass dieses Protein keine allgemeine Diffusionspore darstellt, sondern einen Kanal mit einer spezifischen Bindestelle für diese Komponenten. Daher wurde dieses Porin DipA genannt, was für „dicarboxylate-specific porin A“ steht. In einer anderen Versuchsreihe wurde gezeigt, dass das Porin P66 sowohl in Lyme Borreliose Erregern als auch in Rückfallfieberarten vorhanden ist. Hierfür wurden die Außenmembranen der Lyme Borreliose Erreger Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii und Borrelia garinii und der Rückfallfieberarten Borrelia duttonii, Borrelia recurrentis und Borrelia hermsii genauer untersucht. Mit Ausnahme des P66 Homologs von Borrelia hermsii rekonstituierten P66 Proteine aus allen Arten sehr aktiv in künstliche Membranen und formten Poren zwischen 9 und 11 nS in 1 M KCl. Die biophysikalischen Eigenschaften der Homologe wurden in Experimenten mit „black lipid bilayer“ Membranen ausführlich verglichen. Des Weiteren wurden Porendurchmesser und Konstitution des Borrelia burgdorferi Porins P66 genau untersucht. Hierfür wurde die P66 Einzelkanalleitfähigkeit in Anwesenheit von verschiedenen Nichtelektrolyten in künstlichen Lipidmembranen analysiert. Der effektive Durchmesser des P66 Wasserlumens wurde auf ~1.9 nm bestimmt. Darüber hinaus konnte P66 mit bestimmten Nichtelektrolyten wie PEG 400, PEG 600 und Maltohexaose blockiert werden. Weitere Blockierungsexperimente auf Einzelkanalebene deckten sieben Unterzustände von P66 auf, die auf ein P66 Heptamer schließen ließen. Dieser heptamere Charakter konnte durch Blue native PAGE Analysen bestätigt werden. Zusammenfassend beschreibt diese Dissertation detaillierte biochemische und biophysikalische Untersuchungen von Porinen aus sowohl Lyme Borreliose- als auch Rückfallfieber-Borrelien. Erkenntnisse aus dieser Arbeit bringen das Verstehen der Nährstoffaufnahme über Außenmembranen dieser streng wirtsabhängigen, pathogenen Spirochäten einen großen Schritt vorwärts. Ein fundiertes Wissen über oberflächenexponierte Proteine wie Porine ist Vorraussetzung für die Herstellung erfolgreicher Impfstoffe und Therapeutika gegen die von Borrelien verursachten Krankheiten.
N2  - The genus Borrelia belongs to the spirochete phylum, an ancient evolutionary branch of the domain bacteria that is only afar related to Gram-negative bacteria. Borreliae can be subdivided into the agents of the two borrelian-caused human diseases, Lyme disease and relapsing fever. Both disease patterns are closely related to the peculiar biology of Borrelia species and exhibit a wide spectrum of diverse clinical manifestations. Due to the small 0.91 Mb chromosome, borreliae have a lack of biosynthetic capacity. Thus, all Borrelia species are highly dependent on nutrients provided by their hosts. The transport of nutrients and other molecules across the outer membrane is enabled by pore-forming proteins, so-called porins. Porins are water-filled channels and can be subdivided into two different classes, general diffusion pores and substrate-specific porins. In terms of the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi, three putative porins were characterized in previous studies: P13, Oms28 and P66. In contrast to Lyme disease species, the porin knowledge of relapsing fever Borrelia is low, which means that not any porin has actually been described for representatives of these agents. Thus, the general aim of this thesis was to provide insight into the porin content of both, Lyme disease and relapsing fever spirochetes. This aim could be achieved by isolating and identifying porins from Borrelia outer membranes and by biophysically characterizing them in artificial lipid membranes. In one chapter of this study, the first identification and characterization of a relapsing fever porin is presented. The pore-forming protein was isolated from outer membranes of Borrelia duttonii, Borrelia hermsii and Borrelia recurrentis and designated Oms38, for “outer membrane-spanning protein of 38 kDa”. Biophysical characterization of Oms38 was achieved by using the black lipid bilayer method and demonstrated that Oms38 forms small, water-filled channels with a single-channel conductance of 80 pS in 1 M KCl. The Oms38 channel did not exhibit voltage-dependent closure and is slightly selective for anions with a permeability ratio of cations over anions of 0.41 in KCl. Subsequently, a protein homologous to Oms38 was identified in the Lyme disease agents Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii and Borrelia afzelii. The pore-forming protein of these species exhibits high sequence homology to Oms38 and similar biophysical properties, i.e. it forms pores of 50 pS in 1 M KCl. Interestingly, titration experiments revealed that this pore could be partly blocked by dicarboxylic anions, which means that this protein does not form a general diffusion pore but a channel with a binding-site specific for those compounds. Consequently, this porin was termed DipA, for “dicarboxylate-specific porin A”. In another set of experiments, it was shown that the porin P66 is present in both Lyme disease and relapsing fever species. Therefor, the outer membranes of the Lyme disease species Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii and the relapsing fever species Borrelia duttonii, Borrelia recurrentis and Borrelia hermsii were closer investigated. Except of the P66 homologue of Borrelia hermsii P66 of all species was highly active in artificial lipid membranes, forming pores with huge single-channel conductances between 9 and 11 nS in 1 M KCl. Moreover, the channel diameter and the constitution of Borrelia burgdorferi P66 were investigated in detail. Therefor, the P66 single-channel conductance in the presence of different nonelectrolytes with known hydrodynamic radii was analyzed in black lipid bilayers. The effective diameter of the P66 channel lumen was determined to be ~1.9 nm. Furthermore, as derived from multi-channel experiments the P66-induced membrane conductance could be blocked by certain nonelectrolytes, such as PEG 400, PEG 600 and maltohexaose. Additional blocking experiments on the single-channel level revealed seven subconducting states and indicated a heptameric constitution of the P66 channel. This indication could be confirmed by Blue native PAGE analysis which demonstrated that P66 units form a complex with a corresponding mass of approximately 440 kDa. Taking together, this thesis describes detailed biochemical and biophysical investigations of both Lyme disease and relapsing fever Borrelia porins and represents an important step forward in understanding the outer membrane pathways for nutrient uptake of these strictly host-dependent, pathogenic spirochetes. Furthermore, it provides some knowledge of the outer-membrane protein composition of Borrelia spirochetes. A profound knowledge of surface-exposed proteins, such as porins, is one precondition for the production of a successful vaccine and the drug design against the two borrelian-caused diseases.
KW  - Porin
KW  - Membranproteine
KW  - Borrelia
KW  - Lyme-Borreliose
KW  - Rückfallfieber
KW  - Spirochäten
KW  - porin
KW  - membrane protein
KW  - Borrelia
KW  - Lyme disease
KW  - relapsing fever
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35158
ER  - 
TY  - THES
A1  - Stegmeier, Johannes Friedrich
T1  - Study of Omp85 Family Proteins YaeT and YtfM and Multidrug Export Machineries in Escherichia coli
T1  - Charakterisierung von YaeT und YtfM sowie Multidrugefflux Systemen in Escherichia coli
N2  - In this study the Omp85 family proteins YaeT and YtfM of Escherichia coli were investigated by using biochemical and electrophysiological methods as well as bioinformatical and structural analysis. In addition, knock-out strains were constructed to further study the relevance of these proteins in vivo. The prediction that Omp85 proteins are composed of two domains, a periplasmic amino-terminal POTRA (polypeptide translocation associated) domain and a carboxy-terminal domain anchoring these proteins in the outer membrane, was confirmed by the construction of mutants. It could be shown that the carboxy-terminal part of the proteins is able to insert into the outer bacterial membrane, even if the POTRA domain is removed. Furthermore, pore-forming activity in the black-lipid bilayer was observed for both full-length proteins as well as their carboxy-terminal membrane located parts. The channels formed by both proteins in the black lipid bilayer showed variable single channel conductance states rather than a defined value for conductance. In 1M KCl, e.g. YaeT forms pores with a channel conductance of 100 to 600 pS containing a most abundant value at 400 pS. This variability is at least reasonable for YaeT due to a prerequisite flexibility of its channel for OMP insertion. YaeT was identified to form a cation selective, YtfM an anion selective channel, which is less pH dependent than YaeT. Another feature of the YaeT channel is that its selectivity and conductance is influenced by charged detergent molecules indicating an accumulation of these molecules in hydrophobic pockets inside the compact channel. YaeT revealed heat-modifiable mobility in SDS-PAGE which is characteristic for β-barrel OMPs, whereas YtfM did not show this behaviour. This result could be explained by sequence alignment and structural comparison of YaeT and YtfM via CD and FTIR spectra displaying much higher β-strand content for the carboxy-terminal part of YaeT compared to YtfM. Since the carboxy-terminal parts were shown to have pore forming ability and are inserted in the OM in vivo, the substitution of the essential protein YaeT by its carboxy-terminal mutant was attempted in a yaeT knock-out strain. The carboxy-terminal half of YaeT was not sufficient to compensate depletion of the full-length protein indicating an important role of the amino-terminus for cell viability. In contrary, YtfM is shown to be a non-essential protein and lack of YtfM had no effects on the composition and integrity of the OM. However, chromosomal deletion of ytfM remarkably reduced the growth rate of cells. This study provides the first detailed investigation of the structure of YaeT and describes its electrophysiological behaviour, which could be a basis for further studies of YaeT and its substrate proteins. Furthermore, YtfM was characterised and its in vivo function was investigated revealing YtfM as the second Omp85 family protein of importance in E. coli. In a second part of this study assembly and function of multidrug efflux pumps were investigated. Drug efflux pumps are tripartite export machineries in the cell envelope of Gram-negative bacteria conferring multidrug resistance and therefore causing severe problems for medical treatment of diseases. Protein structures of all three efflux pump components are solved, but the exact interaction sites are still unknown. Assembly of a hybrid exporter system composed of the Pseudomonas aeruginosa channel tunnel OprM, the E. coli adaptor protein AcrA and its associated transporter AcrB could be shown by chemical cross-linking, even though this efflux pump is not functional. Exchange of the hairpin domain of AcrA by the corresponding hairpin from the adaptor protein MexA of P. aeruginosa restored functionality tested by antibiotic sensitivity assays. This shows the importance of the MexA hairpin domain for functional interaction with the OprM channel tunnel. Interestingly, the hybrid protein was also able to assemble with TolC as outer membrane component to form a functional efflux pump indicating a higher flexibility of TolC compared to OprM concerning interaction partners. Based on these results, an interaction model of the hairpin domain and the channel tunnel on molecular level for AcrA and TolC as well as MexA and OprM, respectively, is presented. This model provides a basis for directed mutagenesis to reveal the exact contact sites of the hairpin of the adapter protein and the outer membrane component
N2  - In dieser Arbeit wurden die Omp85 Familienproteine YaeT und YtfM aus E. coli biochemisch und elektrophysiologisch charakterisiert, sowie bioinformatisch und strukturell analysiert. Des Weiteren wurden Bakterienstämme mit chromosomalen Deletionen der beiden zugehörigen Gene hergestellt, um die Relevanz der beiden Proteine in vivo zu untersuchen. Für Omp85 aus N. meningitdis wurde vorhergesagt, dass das Protein aus zwei strukturellen Untereinheiten besteht, einer periplasmatischen amino-terminalen Domäne, der POTRA – („polypeptide-transport-associated“ -) Domäne und einer carboxy-terminalen Domäne, die das Protein in der Außenmembran verankert. Diese Vorhersagen wurden für die Omp85 Homologen YaeT und YtfM mit Hilfe von geeigneten Mutanten bestätigt. Es konnte gezeigt werden, dass der carboxy-terminale Teil beider Proteine, YaeT und YtfM, auch bei Fehlen der amino-terminalen Domäne noch in der äußeren Membran zu finden ist. Bestätigt wurde dieses Ergebnis durch „Black Lipid Bilayer“ Experimente. Für beide nativen Proteine, sowie deren carboxy-terminale Mutanten, konnte der Einbau in eine künstliche Membran und Porenbildung gezeigt werden. Anders als bei herkömmlichen Porinen, die normalerweise eine sehr gut definierte Leitfähigkeit haben, musste man den beiden untersuchten Proteinen eher eine Leitfähigkeitsspanne zuordnen. Bei Messungen in 1M KCl wurden für YaeT beispielsweise Poren mit einer Leitfähigkeit von 100 bis 600 pS aufgezeichnet, wobei 400 pS der am häufigsten vorkommende Wert ist. Diese Variabilität ist bei YaeT zumindest dadurch begründbar, dass für den Einbau anderer Proteine in die äußere Membran ein flexibler Kanal mit einer möglichen lateralen Öffnung notwendig ist. Die YaeT Poren sind kationenselektiv, für YtfM wurde ein anionenselektiver Kanal nachgewiesen, welcher zusätzlich im Vergleich zu YaeT weniger pH anfällig ist. Weiterhin haben die elektrophysiologischen Experimente gezeigt, dass die Ionenselektivität und Leitfähigkeit von YaeT durch Detergenzmoleküle beeinflussbar ist. Dies lässt hydrophobe Bereiche im Kanalinnern vermuten, an denen sich die Moleküle mit ihrem unpolaren Teil anlagern und dann durch ihre polaren Köpfe die Nettoladungen im Kanalinnern verändern. Mittels Gelelektrophorese konnte für YaeT das typische Laufverhalten von Außenmembranproteinen gezeigt werden. Wenn YaeT ungekocht auf ein SDS-Gel aufgetragen wurde, wanderte es schneller, als wenn man es vorher auf 100°C erhitzte, was für eine kompakte Struktur spricht. Für YtfM wurde dieses Verhalten nicht festgestellt. Die Erklärung für diesen Unterschied lieferten ein Sequenzvergleich beider Proteine, sowie die strukturelle Untersuchung mittels CD- und FTIR-Spektroskopie, welche im Vergleich zu YtfM einen deutlich höheren β-Faltblatt-Anteil für den carboxy-terminalen Teil von YaeT ergaben. Da der carboxy-terminale Teil der Proteine in der Außenmembran zu finden ist und porenformende Aktivität besitzt, wurde versucht, YaeT durch seine carboxy-terminale Mutante in einem Knock-out Stamm zu ersetzen. Dies schlug jedoch fehl, was auf eine bestimmte Funktion der amino-terminalen Hälfte in vivo hindeutet. Im Vergleich zu YaeT ist YtfM kein essentielles Protein und sein Fehlen beeinflusst die Zusammensetzung und die Funktion der äußeren Membran nicht. Die chromosomale Deletion von ytfM führte jedoch zu einer deutlichen Reduktion der Wachstumsrate. Bei den Multidrug Efflux Pumpen AcrAB/TolC und MexAB/OprM sind mittlerweile Strukturen aller drei Pumpenkomponenten bekannt, ihre Interaktionsstellen sind allerdings noch nicht bekannt. Mit einem chemischen „Cross-linker“ konnte der Zusammenbau eines hybriden Exportsystems bestehend aus der Außenmembrankomponente OprM aus Pseudomonas aeruginosa, dem Adapterprotein AcrA aus E. coli, sowie dessen zugehörigem Innenmembrantransporter AcrB, nachgewiesen werden. Der Zusammenbau ist insofern erstaunlich, da diese hybride Effluxpumpe nicht funktionell ist. Die Funktionalität dieser Effluxpumpe, nachgewiesen durch Antibiotikasensitivitätstests, konnte jedoch durch den Austausch der „Hairpin“-Domäne von AcrA durch den „Hairpin“ von MexA wieder hergestellt werden. Dieses Ergebnis zeigt deutlich die Wichtigkeit dieser Haarnadelstruktur für die funktionelle Interaktion mit der Außenmembrankomponente OprM. Interessanterweise konnte das hybride Adapterprotein eine funktionelle Effluxpumpe mit TolC als Außenmembrankomponente bilden, was für eine höhere Flexibilität von TolC im Gegensatz zu OprM bezüglich der Interaktionspartner spricht. Aufgrund der oben genannten Ergebnisse wurde ein Interaktionsmodell der „Hairpin“-Domäne von AcrA bzw. MexA mit den Außenmembranproteinen TolC und OprM auf molekularer Ebene erstellt. Dieses Modell kann nun als Vorlage für zielgerichtete Mutationen dienen, um die Interaktionsstellen des Adapterproteins mit der zugehörigen Außenmembrankomponente genau zu beschreiben.
KW  - Escherichia coli
KW  - Porin
KW  - Omp85
KW  - YaeT
KW  - YtfM
KW  - Multidrug Efflux
KW  - Omp85
KW  - YaeT
KW  - YtfM
KW  - Multidrug Efflux
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18171
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hünten, Peter
T1  - Channel-forming proteins in the cell wall of amino acid-producing Corynebacteria
T1  - Kanalbildende Proteine in der Zellwand Aminosäure-produzierender Corynebakterien
N2  - Corynebacterium glutamicum is together with C. callunae and C. efficiens a member of the diverse group of mycolic-acid containing actinomycetes, the mycolata. These bacteria are potent producer of glutamate, lysine and other amino acids on industrial scale. The cell walls of most actinomycetes contain besides an arabinogalactan-peptidoglycan complex large amounts of mycolic acids. This three-layer envelope is called MAP (mycolyl-arabinogalactan-peptidoglycan) complex and it represents a second permeability barrier beside the cytoplasmic membrane similar to the outer membrane of Gram-negative bacteria. In analogy to the situation in the outer membrane of Gram-negative bacteria, channels are present in the mycolic acid layer of the mycobacterial cell wall for the passage of hydrophilic solutes. Molecular studies have provided far-reaching findings on the amino acid flux and its balance in C. glutamicum in general, but the L-glutamate export still remains unknown. The properties of the outer layers, typical of mycolata, seem to be of major importance in this process, and diffusion seems to play a key role for this part of the cell wall. The major aim of this thesis was to identify and study novel channel-forming proteins of the amino acid producers C. glutamicum, C. callunae and C. efficiens. Cell wall extracts of the organisms were investigated and a novel pore-forming protein, named PorH, that is homologue in all three organisms, was detected and characterized. PorHC.glut was isolated from C. glutamicum cells cultivated in minimal medium. The protein was identified in lipid bilayer experiments and purified to homogeneity by fast-protein liquid chromatography across a HiTrap-Q column. The purified protein forms cation-selective channels with a diameter of about 2.2 nm and an average single-channel conductance of about 2.5 nS in 1 M KCl in the lipid bilayer assay. Organic solvent extracts were used to study the permeability properties of the cell wall of C. callunae and C.efficiens. The cell extracts contained channel-forming activity, the corresponding proteins were purified to homogeneity by fast-protein liquid chromatography across a HiTrap-Q column and named PorHC.call and PorHC.eff. Channels formed by PorHC.call are cation-selective with a diameter of about 2.2 nm and an average single-channel conductance of 3 nS, whereas PorHC.eff forms slightly anion selective channels with an average single-channel conductance of 2.3 nS in 1 M KCl in the lipid bilayer assay. The PorH proteins were partially sequenced and the corresponding genes, which were designated as porH, were identified in the published genome sequence of C. glutamicum and C. efficiens. The chromosome of C. callunae is not sequenced, but PorHC.call shows a high homology to PorHC.eff and PorHC.glut. The proteins have no N-terminal extension, only the inducer methionine, which suggests that secretion of the proteins could be very similar to that of PorAC.glut of C. glutamicum. PorHC.glut is coded in the bacterial chromosome by a gene that is localized in the vincinity of the porAC.glut gene, within a putative operon formed by 13 genes that are encoded by the minus strand. Both porins are cotranscribed and coexist in the cell wall, which was demonstrated in RT-PCR and immunological detection experiments. The arrangement of porHC.glut and porAC.glut on the chromosome is similar to that of porBC.glut and porCC.glut and it was found that PorAC.glut, PorHC.glut, PorBC.glut and PorCC.glut coexist in the cell wall of C. glutamicum. The molecular mass of about 6 kDa of the PorH channel forming proteins is rather small and suggests that the cell wall channels are formed by oligomers. A possibly hexameric form was demonstrated for PorHC.glut in Western blot analysis with anti- PorHC.glut antibodies. Secondary structure predictions for PorHC.glut, PorHC.call and PorHC.eff predict that a stretch of about 42 amino acids of PorHC.glut and 28 amino acids of PorHC.call and PorHC.eff forms amphipathic -helices with a total length of 6.3 nm and 4.2 nm respectively. This should be sufficient to cross the mycolic acid layer. Another objective of this work was to establish an heterologous expression system for corynebacterial channel-forming proteins, to investigate the channel-forming properties of the up to now only hypothetical porins PorA, PorB, PorC from C. efficiens and PorC from C. glutamicum. We could demonstrate with recombinant expression experiments in E. coli that porBC.eff and porCC.eff encode for channel-forming proteins. They are, like PorBC.glut, anion-selective with a similar single-channel conductance of 1 nS in 1 M KCl.
N2  - C. glutamicum gehört zusammen mit C. efficiens und C. callunae zu den bedeutensten Aminosäureproduzenten weltweit. Sie sind Mitglieder der heterogenen Gruppe der mykolsäurehaltigen Aktinomyceten, den Mycolaten. Die Zellwände der meisten Aktinomyceten weisen neben einem Arabinogalactan-Peptidoglycankomplex große Mengen an Mycolsäuren auf. Diese MAP(Mycolyl-Arabinogalactan-Peptidoglycan) genannte dreischichtige Hülle stellt neben der Cytoplasmamembran eine zweite Permeabilitätsbarriere dar, und übernimmt somit die gleiche Funktion wie die äußere Membran der Gram-negativen Bakterien was zur Folge hat, dass für den Transport von hydrophilen Stoffen kanalbildende Proteine benötigt werden. Analog zur Situation in Gram-negativen Bakterien sind in der Mykolsäureschicht von C. efficiens, C. callunae und C. glutamicum porenbildende Transmembranproteine vorhanden. Es ist bisher vieles bekannt über den Aminosäurefluss über die Cytoplasmamembran und dessen Regulation in C. glutamicum, aber der Export von L-Glutamat ist noch ungeklärt. Die besondere Beschaffenheit der äußeren Membran von Mycolaten scheint in diesem Zusammenhang eine wichtige Rolle zu spielen, da man annimmt, dass die Diffusion im Bezug auf den Transport über die Mycolsäureschicht eine Schlüsselrolle einnimmt. Das Ziel dieser Arbeit war es neue porenbildende Proteine der Aminosäureproduzenten C. glutamicum, C. efficiens und C. callunae zu identifizieren und zu charakterisieren. Bei Untersuchungen von Zellwandextrakten wurde ein neuer, in allen drei Organismen homologer, Zellwandkanal, PorH, gefunden und charakterisiert. PorHC.glut wurde aus in Minimalmedium kultivierten C. glutamicum Zellen isoliert. Das Protein wurde in Lipid-Bilayer Experimenten gefunden und mit Hilfe der Ionenaustauscher-chromotographie über eine HiTrap-Q Säule aufgereinigt. PorHC.glut bildet in Black-Lipid Bilayer Experimenten kationenselektive Kanäle mit einem Durchmesser von 2,2 nm und hat eine Einzelkanalleitfähigkeit von 2,5 nS in 1 M KCl. Aus organischen Zellwandextrakten von C. callunae und C. efficiens wurden PorHC.call und PorHC.eff isoliert. PorHC.call bildet einen kationenselektiven Kanal mit einem Durchmesser von 2,2 nm und einer Einzel-kanalleitfähigkeit von 3 nS, PorHC.eff hingegen bildet einen leicht anionenselektiven Kanal mit einer Leitfähigkeit von 2,3 nS in 1 M KCl. Über die Sequenzierung der PorH Proteine wurden die entsprechenden porH Gene im Genom von C. glutamicum und C. efficiens identifiziert. Das Genom von C. callunae ist nicht bekannt, jedoch weisen die PorH Proteinsequenzen eine hohe Homologie untereinander auf. Es ist keine Signalsequenz vorhanden, so dass man annimmt, dass der Export über die Plasmamembran ähnlich funktioniert wie bei PorAC.glut aus C. glutamicum. Das Gen porHC.glut aus C. glutamicum befindet sich in unmittelbarer Nähe zu porAC.glut in einem möglichen Cluster das aus 13 Genen besteht. In RT-RCR Experimenten und immunologischen Reaktionen mit polyklonalen Antikörpern konnte gezeigt werden, dass die Gene porAC.glut und porHC.glut zusammen transkribiert werden und die Porine in der Zellwand coexistieren. Die Anordnung von porAC.glut und porHC.glut im Genom von C. glutamicum ist ähnlich der von porBC.glut und porCC.glut, und es konnte gezeigt werden, dass die vier Porine in der Zellwand gleichzeitig vorhanden sind. Das Molekulargewicht von PorH ist mit 6 kDa sehr klein für Kanalproteine und man nimmt an, dass die Kanäle von Oligomeren gebildet werden. In Western Blots wurde eine mögliche hexamere Form von PorHC.glut nachgewiesen. Sekundärstrukturvorhersagen für PorH sagen aus, dass 42 Aminosäuren von PorHC.glut und 28 von PorHC.eff und PorHC.call amphiphatische α-Helices mit einer Länge von 6,3 nm, bzw. 4,2 nm ausbilden. Diese Länge würde ausreichen, um die Mykolsäureschicht zu durchspannen. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, ein heterologes Expressionssystem für corynebakterielle Kanalproteine zu erstellen, um die kanalbildenden Eigenschaften von bisher nur hypothetischen Porinen wie PorAC.eff, PorBC.eff und PorCC.eff von C. efficiens, oder PorCC.glut von C. glutamicum zu bestimmen. In rekombinanten Expressions-Experimenten in E. coli konnte gezeigt werden, dass die Gene porBC.eff und porCC.eff für Proteine mit kanalbildender Aktivität kodieren. Die Kanäle sind anionenselekitv, mit einer Einzelkanalleitfähigkeit von 1 nS in 1 M KCl, vergleichbar mit den Eigenschaften von PorBC.glut aus C. glutamicum.
KW  - Corynebacterium callunae
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KW  - Lipid bilayer membrane
KW  - C. glutamicum
KW  - C. efficiens
KW  - C. callunae
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13890
ER  -