TY - JOUR A1 - Vural, Atay A1 - Doppler, Kathrin A1 - Meinl, Edgar T1 - Autoantibodies Against the Node of Ranvier in Seropositive Chronic Inflammatory Demyelinating Polyneuropathy: Diagnostic, Pathogenic, and Therapeutic Relevance JF - Frontiers in Immunology N2 - Discovery of disease-associated autoantibodies has transformed the clinical management of a variety of neurological disorders. Detection of autoantibodies aids diagnosis and allows patient stratification resulting in treatment optimization. In the last years, a set of autoantibodies against proteins located at the node of Ranvier has been identified in patients with chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP). These antibodies target neurofascin, contactin1, or contactin-associated protein 1, and we propose to name CIDP patients with these antibodies collectively as seropositive. They have unique clinical characteristics that differ from seronegative CIDP. Moreover, there is compelling evidence that autoantibodies are relevant for the pathogenesis. In this article, we review the current knowledge on the characteristics of autoantibodies against the node of Ranvier proteins and their clinical relevance in CIDP. We start with a description of the structure of the node of Ranvier followed by a summary of assays used to identify seropositive patients; and then, we describe clinical features and characteristics linked to seropositivity. We review knowledge on the role of these autoantibodies for the pathogenesis with relevance for the emerging concept of nodopathy/paranodopathy and summarize the treatment implications. KW - autoantibody KW - seropositive KW - chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy KW - node of Ranvier KW - paranode KW - neurofascin KW - contactin KW - contactin-associated protein 1 Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-233279 VL - 9 ER - TY - JOUR A1 - Kaltdorf, Kristin Verena A1 - Theiss, Maria A1 - Markert, Sebastian Matthias A1 - Zhen, Mei A1 - Dandekar, Thomas A1 - Stigloher, Christian A1 - Kollmannsberger, Philipp T1 - Automated classification of synaptic vesicles in electron tomograms of C. elegans using machine learning JF - PLoS ONE N2 - Synaptic vesicles (SVs) are a key component of neuronal signaling and fulfil different roles depending on their composition. In electron micrograms of neurites, two types of vesicles can be distinguished by morphological criteria, the classical “clear core” vesicles (CCV) and the typically larger “dense core” vesicles (DCV), with differences in electron density due to their diverse cargos. Compared to CCVs, the precise function of DCVs is less defined. DCVs are known to store neuropeptides, which function as neuronal messengers and modulators [1]. In C. elegans, they play a role in locomotion, dauer formation, egg-laying, and mechano- and chemosensation [2]. Another type of DCVs, also referred to as granulated vesicles, are known to transport Bassoon, Piccolo and further constituents of the presynaptic density in the center of the active zone (AZ), and therefore are important for synaptogenesis [3]. To better understand the role of different types of SVs, we present here a new automated approach to classify vesicles. We combine machine learning with an extension of our previously developed vesicle segmentation workflow, the ImageJ macro 3D ART VeSElecT. With that we reliably distinguish CCVs and DCVs in electron tomograms of C. elegans NMJs using image-based features. Analysis of the underlying ground truth data shows an increased fraction of DCVs as well as a higher mean distance between DCVs and AZs in dauer larvae compared to young adult hermaphrodites. Our machine learning based tools are adaptable and can be applied to study properties of different synaptic vesicle pools in electron tomograms of diverse model organisms. KW - synaptic vesicles KW - Caenorhabditis elegans KW - machine learning Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176831 VL - 13 IS - 10 ER - TY - JOUR A1 - Dindas, Julian A1 - Scherzer, Sönke A1 - Roelfsema, M. Rob G. A1 - Meyer, Katharina von A1 - Müller, Heike M. A1 - Al-Rasheid, K. A. S. A1 - Palme, Klaus A1 - Dietrich, Petra A1 - Becker, Dirk A1 - Bennett, Malcolm J. A1 - Hedrich, Rainer T1 - AUX1-mediated root hair auxin influx governs SCFTIR1/AFB-type Ca2+ signaling JF - Nature Communications N2 - Auxin is a key regulator of plant growth and development, but the causal relationship between hormone transport and root responses remains unresolved. Here we describe auxin uptake, together with early steps in signaling, in Arabidopsis root hairs. Using intracellular microelectrodes we show membrane depolarization, in response to IAA in a concentration- and pH-dependent manner. This depolarization is strongly impaired in aux1 mutants, indicating that AUX1 is the major transporter for auxin uptake in root hairs. Local intracellular auxin application triggers Ca2+ signals that propagate as long-distance waves between root cells and modulate their auxin responses. AUX1-mediated IAA transport, as well as IAA- triggered calcium signals, are blocked by treatment with the SCFTIR1/AFB - inhibitor auxinole. Further, they are strongly reduced in the tir1afb2afb3 and the cngc14 mutant. Our study reveals that the AUX1 transporter, the SCFTIR1/AFB receptor and the CNGC14 Ca2+ channel, mediate fast auxin signaling in roots. KW - auxin KW - permeation and transport Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-225368 VL - 9 ER - TY - JOUR A1 - Straub, Tobias A1 - Freudenberg, Marina A. A1 - Schleicher, Ulrike A1 - Bogdan, Christian A1 - Gasteiger, Georg A1 - Pircher, Hanspeter T1 - Bacterial coinfection restrains antiviral CD8 T-cell response via LPS-induced inhibitory NK cells JF - Nature Communications N2 - Infection of specific pathogen-free mice with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) is a widely used model to study antiviral T-cell immunity. Infections in the real world, however, are often accompanied by coinfections with unrelated pathogens. Here we show that in mice, systemic coinfection with E. coli suppresses the LCMV-specific cytotoxic T-lymphocyte (CTL) response and virus elimination in a NK cell- and TLR2/4-dependent manner. Soluble TLR4 ligand LPS also induces NK cell-mediated negative CTL regulation during LCMV infection. NK cells in LPS-treated mice suppress clonal expansion of LCMV-specific CTLs by a NKG2D- or NCR1-independent but perforin-dependent mechanism. These results suggest a TLR4-mediated immunoregulatory role of NK cells during viral-bacterial coinfections. KW - Bacterial infection KW - infection KW - lymphocyte activation KW - viral infection Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-240075 VL - 9 ER - TY - JOUR A1 - Bartmann, Catharina A1 - Janaki Raman, Sudha R. A1 - Flöter, Jessica A1 - Schulze, Almut A1 - Bahlke, Katrin A1 - Willingstorfer, Jana A1 - Strunz, Maria A1 - Wöckel, Achim A1 - Klement, Rainer J. A1 - Kapp, Michaela A1 - Djuzenova, Cholpon S. A1 - Otto, Christoph A1 - Kämmerer, Ulrike T1 - Beta-hydroxybutyrate (3-OHB) can influence the energetic phenotype of breast cancer cells, but does not impact their proliferation and the response to chemotherapy or radiation JF - Cancer & Metabolism N2 - Background: Ketogenic diets (KDs) or short-term fasting are popular trends amongst supportive approaches for cancer patients. Beta-hydroxybutyrate (3-OHB) is the main physiological ketone body, whose concentration can reach plasma levels of 2–6 mM during KDs or fasting. The impact of 3-OHB on the biology of tumor cells described so far is contradictory. Therefore, we investigated the effect of a physiological concentration of 3 mM 3-OHB on metabolism, proliferation, and viability of breast cancer (BC) cells in vitro. Methods: Seven different human BC cell lines (BT20, BT474, HBL100, MCF-7, MDA-MB 231, MDA-MB 468, and T47D) were cultured in medium with 5 mM glucose in the presence of 3 mM 3-OHB at mild hypoxia (5% oxygen) or normoxia (21% oxygen). Metabolic profiling was performed by quantification of the turnover of glucose, lactate, and 3-OHB and by Seahorse metabolic flux analysis. Expression of key enzymes of ketolysis as well as the main monocarboxylic acid transporter MCT2 and the glucose-transporter GLUT1 was analyzed by RT-qPCR and Western blotting. The effect of 3-OHB on short- and long-term cell proliferation as well as chemo- and radiosensitivity were also analyzed. Results: 3-OHB significantly changed the oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in BT20 cells resulting in a more oxidative energetic phenotype. MCF-7 and MDA-MB 468 cells had increased ECAR only in response to 3-OHB, while the other three cell types remained uninfluenced. All cells expressed MCT2 and GLUT1, thus being able to uptake the metabolites. The consumption of 3-OHB was not strongly linked to mRNA overexpression of key enzymes of ketolysis and did not correlate with lactate production and glucose consumption. Neither 3-OHB nor acetoacetate did interfere with proliferation. Further, 3-OHB incubation did not modify the response of the tested BC cell lines to chemotherapy or radiation. Conclusions: We found that a physiological level of 3-OHB can change the energetic profile of some BC cell lines. However, 3-OHB failed to influence different biologic processes in these cells, e.g., cell proliferation and the response to common breast cancer chemotherapy and radiotherapy. Thus, we have no evidence that 3-OHB generally influences the biology of breast cancer cells in vitro. KW - ketogenic diet KW - β-Hydroxybutyrate KW - ketone bodies KW - breast cancer KW - seahorse KW - metabolic profile KW - chemotherapy KW - ionizing radiation Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175607 VL - 6 IS - 8 ER - TY - THES A1 - Jones, Gabriel T1 - Bioinspired FGF-2 delivery for pharmaceutical application T1 - Bioinspiriertes Delivery von FGF-2 für eine pharmazeutische Applikation N2 - In resent years the rate of biologics (proteins, cytokines and growth-factors) as newly registered drugs has steadily risen. The greatest challenge for pharmaceutical biologics poses its arrival at the desired target location due to e.g. proteolytic and pH dependent degradation, plasma protein binding, insolubility etc. Therefore, advanced drug delivery systems, where biologics are site directed immobilized to carriers mimicking endogenous storage sites such as the extra cellular matrix can enormously assist the application and consequently the release of exogenous administered pharmaceutical biologics. We have resorted to the fibroblast growth factor 2/ heparansulfate/ fibroblast growth factor bindingprotein 1 system as a model. Phase I deals with the selection and subcloning of a wild type murine FGF-2 construct into the bacterial pHis-Trx vector system for high yields of expression and fast, feasible purification measurements. This first step enables the provision of mFGF-2, which plays a pivotal part as a growth factor in the wound healing process as well as the vascularization of tumors, for future investigations. Therefore, the correct expression of mFGF-2 was monitored via MALDI-MS and SDS-PAGE, whereas the proper folding of the tertiary beta-trefoil structure was assessed by fluorescence spectroscopy. The MTT assay allowed us to ensure that the bioactivity was comparable to sourced FGF-2. In the last step, the purity; a requirement for future binding- and protein-protein interaction assays was monitored chromatographically (RP-HPLC). In addition, a formulation for freeze-drying was developed to ensure protein stability and integrity over a period of 60 days. Altogether, the bacterial expression and purification proved to be suitable, leading to bioactive and stable production of mFGF-2. In Phase II the expression, purification and characterization of FGFBP1, as the other key partner in the FGF-2/ HS/ FGFBP1 system is detailed. As FGFBP1 exhibits a complex tertiary structure, comprised of five highly conserved disulfide bonds and presumably multiple glycosylation sites, a eukaryotic expression was used. Human embryonic kidney cells (HEK 293F) as suspension cells were transiently transfected with DNA-PEI complexes, leading to expression of Fc-tagged murine FGFBP1. Different PEI to DNA ratios and expression durations were investigated for optimal expression yields, which were confirmed by western blot analysis and SDS-PAGE. LC-MS/MS analysis of trypsin and elastase digested FGFBP1 gave first insights of the three O-glycosylation sites. Furthermore, the binding protein was modified by inserting a His6-tag between the Fc-tag (for purification) and the binding protein itself to enable later complexation with radioactive 99mTc as radio ligand to track bio distribution of administered FGFBP1 in mice. Overall, expression, purification and characterization of mFGFBP1 variants were successful with a minor draw back of instability of the tag free binding protein. Combining the insights and results of expressed FGF-2 as well as FGFBP1 directed us to the investigation of the interaction of each partner in the FGF-2/ HS/ FGFBP1 system as Phase III. Thermodynamic behavior of FGF-2 and low molecular weight heparin (enoxaparin), as a surrogate for HS, under physiological conditions (pH 7.4) and pathophysiological conditions, similar to hypoxic, tumorous conditions (acidic pH) were monitored by means of isothermal titration calorimetry. Buffer types, as well as the pH influences binding parameters such as stoichiometry (n), enthalpy (ΔH) and to some extent the dissociation constant (KD). These findings paved the way for kinetic binding investigations, which were performed by surface plasmon resonance assays. For the first time the KD of full length FGFBP1 and FGF-2 was measured. Furthermore the binding behavior of FGF-2 to FGFBP1 in the presence of various heparin concentrations suggest a kinetic driven release of bound FGF-2 by its chaperone FGFBP1. Having gathered multiple data on the FGF-2 /HS /FGFBP1 system mainly in solution, our next step in Phase IV was the development of a test system for immobilized proteins. With the necessity to better understand and monitor the cellular effects of immobilized growth factors, we decorated glass slides in a site-specific manner with an RGD-peptide for adhesion of cells and via the copper(I)-catalyzed-azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) a fluorescent dye (a precursor for modified proteins for click chemistry). Human osteosarcoma cells were able to grow an the slides and the fluorescence dye was immobilized in a biocompatible way allowing future thorough bioactivity assay such as MTT-assays and phospho-ERK-assays of immobilized growth factors. N2 - In den letzten Jahren ist der Anteil an Biologika (Proteine, Zytokine und Wachstumsfaktoren), die neu zugelassen wurden, kontinuierlich angestiegen. Die größte Herausforderung für Biopharmazeutika stellt das Erreichen des gewünschten Wirkortes dar, aufgrund von beispielsweise enzymatischen und pH abhängigem Abbau, Plasmaproteinbindung, und niedriger Löslichkeit. Daher können moderne Wirkstoffträgersysteme, in denen Biologika ortsspezifisch an Träger immobilisiert sind und endogene Aufbewahrungsorte nachahmen, wie zum Beispiel die extrazelluläre Matrix, die Anwendung enorm erleichtern und folglich auch die Freisetzung von Biopharmazeutika, die exogen verabreicht wurden ermöglichen. Wir haben uns auf das Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2/ Heparansulfat/ Fibroblasten-Wachstumsfaktor Bindungsprotein 1 (FGF-2/ HS/ FGFBP1) System als Modell gestützt. Abschnitt I handelt von der Auswahl und der Subklonierung von einem wildtypischen, murinen FGF-2 Konstrukt in ein bakterielles pHis-Trx Vektorsystem – für hohe Ausbeuten bei der Expression und für eine schnell durchführbare Aufreinigung. Dieser erste Schritt ermöglicht die Bereitstellung von mFGF-2 für zukünftige Untersuchungen, das eine zentrale Rolle als Wachstumsfaktor im Wundheilungsprozess spielt, genauso wie bei der Gefäßversorgung von Tumoren. Daher wurde die richtige Expression von mFGF-2 durch MALDI-MS und SDS-PAGE überwacht, wobei die korrekte Faltung der tertiären beta-Faltblatt-Struktur durch Fluoreszenzmikroskopie ausgewertet wurde. Mit dem MTT Test konnten wir gewährleisten, dass die Bioaktivität von mFGF-2 und dem käuflich erworbenen FGF-2 übereinstimmen. Im letzten Schritt wurde die Reinheit, die eine wichtige Voraussetzung für künftige Bindungs- und Protein-Protein-Wechselwirkung-Untersuchungen darstellt, chromatographisch (RP-HPLC) überwacht. Des Weiteren wurde eine Formulierung zur Gefriertrocknung entwickelt, um die Stabilität und Unversehrtheit des Proteins über 60 Tage sicherzustellen. Insgesamt erwiesen sich die bakterielle Expression und Aufreinigung als geeignet und führten zur Herstellung von bioaktivem und stabilem mFGF-2. Im Abschnitt II wird die Expression, Aufreinigung und Charakterisierung von FGFBP1 genau beschrieben, ein ebenso wichtiger Partner im FGF-2/HS/FGFBP1-System. Da FGFBP1 eine komplexe tertiäre Struktur aufweist, die aus fünf hochkonservierten Disulfidbrücken und vermutlich einigen Glykosylierungsstellen besteht, wurde ein eukaryotisches Expressionssystem angewendet. Menschliche embryonale Nierenzellen (HEK 293F) wurden als Suspensionszellen transient mit DNA-PEI Komplexen transfiziert und führten zur Expression von Fc markiertem mausartigem FGFBP1. Verschiedene PEI:DNA Verhältnisse wurden untersucht, sowie die Dauer der Expression variiert, um die Ausbeute der Expression zu optimieren. Die Ergebnisse wurden mittels Western Blot und SDS-PAGE bestätigt. Die LC-MS/MS Messung, des mit Trypsin und Elastase verdautem FGFBP1, ergaben erste Erkenntnisse über die drei O-Glykosylierungsstellen. Des Weiteren wurde das Fusionsprotein durch Einschub eines His6-tags zwischen den Fc-tag und FGFBP1 erweitert, um dem Protein die Eigenschaft zu geben, mehrwertige Kationen zu komplexieren. 99mTc, als radioaktiver Ligand, kann in späteren Untersuchungen die Verteilung im Gewebe, anhand von Mäusen darstellen. Die Expression, Aufreinigung, sowie die Charakterisierung von den murinen FGFBP1 Varianten war erfolgreich, jedoch erwies sich das Bindungsprotein ohne Fc-Teil als weniger stabil. Durch Zusammenfassung der Ergebnisse und Erkenntnisse der beiden exprimierten Proteine mFGF-2 und FGFBP1, konnten wir die Wechselwirkungen der Partner im FGF-2 /HS / FGFBP1 Systems untereinander im Abschnitt III untersuchen. Isotherme Titrationskalorimetrie wurde herangezogen, um das thermodynamische Verhalten von FGF-2 mit niedermolekularem Heparin (Enoxaparin), als Stellvertreter für HS, unter physiologischen Bedingungen (pH 7,4) und pathologischer Bedingungen (saurer pH, hervorgerufen durch Sauerstoffmangel im Tumorgewebe) aufzuklären. Sowohl die Art des Puffersystems als auch der pH Wert beeinflussen die Bindungsparameter: Enthalpie (DH), die Stöchiometrie (n) und zu einem gewissen Teil sogar die Dissoziationkonstante (KD). Die thermodynamischen Untersuchungen ermöglichten im folgenden Schritt, mittels Oberflächen Plasmon Resonanz (SPR), kinetische Bindungsverhältnisse zu ermitteln. Zum ersten Mal wurde dank der SPR Dissoziationskonstanten von FGFBP1 und FGF-2 erfasst. Da alle bisherigen Erkenntnisse des FGF-2/ HS/ FGFBP1 Systems hauptsächlich von in Lösung gebrachten Partnern gewonnen wurden, erfolgte im Abschnitt IV die Entwicklung eines Testsystems für immobilisierte Proteine. Durch die zwingende Notwendigkeit zelluläre Effekte von immobilisierten Wachstumsfaktoren zu verstehen und zu beobachten, haben wir Objektträger aus Glas, in einem ortsspezifischem Verfahren mit einem RGD-Peptid, für die Zellanhaftung und mittels 1,3-Dipolare Cycloaddition einen Fluoreszenzfarbstoff (ein Vorläufer für „clickbare“, modifizierte Proteine) dekoriert. Menschliche Knochenkrebszellen waren in der Lage auf diesen Objektträgern zu wachsen und der Farbstoff konnte in einem nicht zytotoxischen Verfahren spezifisch an der Oberfläche immobilisiert werden. Dieses Testsystem erlaubt in Zukunft ausführliche Bioaktivitäts- und Proliferationsstudien von immobilisierten Proteinen durchzuführen. KW - Fibroblastenwachstumsfaktor KW - Extrazelluläre Matrix KW - FGF KW - advanced drug delivery system KW - extra cellular matrix Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-153179 ER - TY - JOUR A1 - Soares Machado, J. A1 - Tran-Gia, J. A1 - Schlögl, S. A1 - Buck, A. K. A1 - Lassmann, M. T1 - Biokinetics, dosimetry, and radiation risk in infants after \(^{99m}\)Tc-MAG3 scans JF - EJNMMI Research N2 - Background: Renal scans are among the most frequent exams performed on infants and toddlers. Due to the young age, this patient group can be classified as a high-risk group with a higher probability for developing stochastic radiation effects compared to adults. As there are only limited data on biokinetics and dosimetry in this patient group, the aim of this study was to reassess the dosimetry and the associated radiation risk for infants undergoing \(^{99m}\)Tc-MAG3 renal scans based on a retrospective analysis of existing patient data. Consecutive data were collected from 20 patients younger than 20 months (14 males; 6 females) with normal renal function undergoing \(^{99m}\)Tc-MAG3 scans. To estimate the patient-specific organ activity, a retrospective calibration was performed based on a set of two 3D-printed infant kidneys filled with known activities. Both phantoms were scanned at different positions along the anteroposterior axis inside a water phantom, providing depth- and size-dependent attenuation correction factors for planar imaging. Time-activity curves were determined by drawing kidney, bladder, and whole-body regions-of-interest for each patient, and subsequently applying the calibration factor for conversion of counts to activity. Patient-specific time-integrated activity coefficients were obtained by integrating the organ-specific time-activity curves. Absorbed and effective dose coefficients for each patient were assessed with OLINDA/EXM for the provided newborn and 1-year-old model. The risk estimation was performed individually for each of the 20 patients with the NCI Radiation Risk Assessment Tool. Results: The mean age of the patients was 7.0 ± 4.5 months, with a weight between 5 and 12 kg and a body size between 60 and 89 cm. The injected activities ranged from 12 to 24 MBq of \(^{99m}\)Tc-MAG3. The patients' organ-specific mean absorbed dose coefficients were 0.04 ± 0.03 mGy/MBq for the kidneys and 0.27 ± 0.24 mGy/MBq for the bladder. The mean effective dose coefficient was 0.02 ± 0.02 mSv/MBq. Based on the dosimetry results, an evaluation of the excess lifetime risk for the development of radiation-induced cancer showed that the group of newborns has a risk of 16.8 per 100,000 persons, which is about 12% higher in comparison with the 1-year-old group with 14.7 per 100,000 persons (all values are given as mean plus/minus one standard deviation except otherwise specified). Conclusion: In this study, we retrospectively derived new data on biokinetics and dosimetry for infants with normal kidney function after undergoing renal scans with \(^{99m}\)Tc-MAG3. In addition, we analyzed the associated age- and gender-specific excess lifetime risk due to ionizing radiation. The radiation-associated stochastic risk increases with the organ doses, taking age- and gender-specific influences into account. Overall, the lifetime radiation risk associated with the \(^{99m}\)Tc-MAG3 scans is very low in comparison to the general population risk for developing cancer. KW - \(^{99m}\)Tc-MAG3 KW - absorbed dose KW - biokinetics KW - dosimetry KW - pediatric patients KW - risk assessment Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175582 VL - 8 IS - 10 ER - TY - THES A1 - Behets, Jean Nicolas T1 - Biomimetic calcium phosphate modification of 3D-printed tissue engineering scaffolds using reactive star-shaped macromers T1 - Biomimetische Calcium-Phosphat Modifikation auf 3D-gedruckten tissue engineering Scaffolds mit reaktiven stern-förmigen Makromeren N2 - Biomimetic calcium phosphate (CaP) coatings imitate the trabecular bones surface structure and have shown to promote osteogenic differentiation in multipotent cells. The work of this thesis focused on the problem of former CaP coatings cracking and flaking off when being put on a bendable core structure like a 3D-printed poly (ε-caprolactone) (PCL) scaffold. The aim was to provide a chemical linkage between PCL and CaP using a star-shaped polymer (sPEG) and a phosphonate, 2-aminoethylphosphonic acid (2-AEP). First, a published CaP coating protocol was revised and investigated in terms of etching parameters for the PCL scaffold. Results presented reproducible thick coatings for all groups. The protocol was then broadened to include subsequent scaffold incubation in sPEG and 2-AEP solutions. Homogenous CaP coatings of decreased thickness presented themselves, proving feasibility. However, as is often found with physical CaP coating depositions, there were some irregular outcomes even during the same experimental group. A lower consumption of the chemical 2-AEP, for economic reasons, meant that the protocol was altered to simultaneously incubate scaffolds with sPEG and 2-AEP including preceding calculations for molar ratios. For ratios 1:1, 1:2 and 1:3, again a homogenous CaP coating was produced on most of the samples, although reproducibility issues maintained. However, the mechanical bending to induce surface cracking showed that the CaP did strongly bond to the sPEG/2-AEP, while the control CaP coating flaked off the surface in large pieces. This research demonstrates that chemically-bound CaP coatings resist flaking off the fiber surface. Future investigations should focus on the mechanisms of CaP crystallization, to improve reproducibility. N2 - Biomimetische Calciumphosphat (CaP) - Beschichtungen imitieren die oberflächliche Struktur des spongiösen Knochens und wirkten sich bereits begünstigend auf die osteogene Differenzierung von multipotenten Zellen aus. Diese Dissertation konzentriert sich auf das Problem des Reißens und Abplatzens bisheriger CaP-Beschichtungen, wenn diese sich auf einem biegsamen Kern-Gerüst, wie einem 3D-gedruckten Polycaprolacton (PCL)-Konstrukt befanden. Das Ziel war, durch den Gebrauch eines sternförmigen Polymers (sPEG) und eines Phosphonates, 2-Aminoethylphosphonsäure (2-AEP), eine chemische Verknüpfung zwischen PCL und CaP herzustellen. Zuerst wurde ein bereits publiziertes CaP-Beschichtungs-Protokoll nachgestellt und verschiedene Ätzungsparameter untersucht. Die Ergebnisse zeigten reproduzierbare, dicke Beschichtungen in allen Gruppen. Danach wurde dieses Protokoll erweitert, indem es nun nacheinander gestellte Inkubationen in sPEG- und 2-AEP-Lösungen mit einbezog. Dünnere, homogene Beschichtungen waren das Ergebnis, was beweist, dass die Hypothese realisierbar ist. Jedoch zeigten die Ergebnisse nicht reproduzierbare Resultate. Desweiteren, war der 2-AEP Verbrauch nicht wirtschaftlich. Daher wurde das Protokoll weiterentwickelt, indem die Proben, nach vorherigen Berechnungen zu den molaren Verhältnissen, simultan mit sPEG und 2-AEP inkubiert wurden. Für die Verhältnisse 1:1, 1:2 und 1:3 wurden wiederum homogene CaP-Beschichtungen produziert. Mit der Absicht Reproduzierbarkeit zu erzielen, wurden weitere Parameter untersucht. Dies blieb jedoch erfolglos. Zuletzt wurde ein mechanischer Test durchgeführt, welcher eine verbesserte CaP-Adhäsion zu den PCL-Fasern nahelegt, wenn diese zuvor mit sPEG und 2-AEP inkubiert wurden. Zukünftige Untersuchungen werden jedoch von Nöten sein, um Daten zur Oberflächenanalyse und von weiteren mechanischen Tests bereitzustellen und um das Protokoll in Bezug auf die Reproduzierbarkeit zu verbessern. KW - Tissue engineering KW - Calcium phosphate KW - Melt electrospinning KW - Star-shaped poly(ethylene glycol) KW - 2-Aminoethylphosphonic acid Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-171728 ER - TY - THES A1 - Braun, Alexandra Carolin T1 - Bioresponsive delivery of anticatabolic and anabolic agents for muscle regeneration using bioinspired strategies T1 - Bioresponsive Verabreichung anti-kataboler und anaboler Wirkstoffe zur Muskelregeneration unter Verwendung bioinspirierter Strategien N2 - Progressive loss of skeletal muscle mass, strength and function poses a major threat to independence and quality of life, particularly in the elderly. To date, sarcopenia therapy consists of resistance exercise training in combination with protein supplementation due to the limited efficacy of available pharmacological options in counteracting the effects of muscle wasting. Therapeutic intervention with growth factors including insulin-like growth factor I (IGF-I) or inhibitors of myostatin  a potent suppressor of myogenesis  hold potential to rebalance the altered activity of anabolic and catabolic cytokines. However, dosing limitations due to acute side effects and disruptions of the homeostasis have so far precluded clinical application. Intending to provide a therapy with a superior safety and efficacy profile by directing drug release to inflamed tissue and minimizing off-target activity, we designed bioresponsive delivery systems for an anti-catabolic peptide and anabolic IGF-I responding to local flares of muscle wasting. In Chapter I, current concepts for bioorthogonal conjugation methods are discussed and evaluated based on various drug delivery applications. With a focus on protein delivery, challenges and potential pitfalls of each chemical and enzymatic conjugation strategy are analyzed and opportunities regarding their use for coupling of biomolecules are given. Based on various studies conjugating proteins to polymers, particles and biomaterials using different site-directed approaches, the chapter summarizes available strategies and highlights certain aspects requiring particular consideration when applied to biomolecules. Finally, a decision process for selection of an optimum conjugation strategy is exemplarily presented. Three of these bioorthogonal coupling reactions are applied in Chapter II detailing the potential of site-directed conjugation in the development of novel, homogenous drug delivery systems. The chapter describes the design of a delivery system of a myostatin inhibitor (MI) for controlled and local release counteracting myositis flares. MI release from the carrier is driven by increased matrix metalloproteinase (MMP) levels in compromised muscle tissues cleaving the interposed linker, thereby releasing the peptide inhibitor from the particulate carrier. Release experiments were performed to assess the response towards various MMP isoforms (MMP-1, -8, -9 and -13) – as upregulated during skeletal muscle myopathies – and the release pattern of the MI in case of disease progression was analyzed. By selection of the protease-sensitive linker (PSL) showing variable susceptibilities to proteases, release rates of the MI can be controlled and adapted. Immobilized MI as well as released MI as response to MMP upregulation was able to antagonize the effects of myostatin on cell signalling and myoblast differentiation. The approach of designing bioresponsive protein delivery systems was also applied to the anabolic growth factor IGF-I, as described in Chapter III. Numerous studies of PEGylated proteins or peptides reveal, that successful therapy is challenged by safety and efficacy issues, as polymer attachment considerably alters the properties of the biologic, thereby jeopardizing clinical efficacy. To this end, a novel promising approach is presented, intending to exploit beneficial effects of PEGylation on pharmacokinetics, but addressing the pharmacodynamic challenges by releasing the protein upon entering the target tissue. This was realized by integration of a PSL between the PEG moiety and the protein. The soluble polymer conjugate was produced by site-directed, enzymatic conjugation of IGF-I to the PSL, followed by attachment of a 30 kDa-PEG using Strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC). This strategy illustrates the potential of bioorthogonal conjugation (as described in Chapter I) for generation of homogenous protein-polymer conjugates with reproducible outcome, but also emphasizes the altered protein properties resulting from permanent polymer conjugation. As compared to wild type IGF-I, the PEGylated protein showed considerable changes in pharmacologic effects – such as impaired insulin-like growth factor binding protein (IGFBPs) interactions, submaximal proliferative activity and altered endocytosis patterns. In contrast, IGF-I characteristics were fully restored upon local disintegration of the conjugate triggered by MMP upregulation and release of the natural growth factor. For successful formulation development for the proteins and conjugates, the careful selection of suitable excipients is crucial for a safe and reliable therapy. Chapter IV addresses one aspect by highlighting the chemical heterogeneity of excipients and associated differences in performance. Polysorbate 80 (PS80) is a surfactant frequently used in protein formulations to prevent aggregation and surface adsorption. Despite being widely deployed as a standard excipient, heterogeneous composition and performance entails the risk of eliciting degradation and adverse effects on protein stability. Based on a comprehensive study using different batches of various suppliers, the PS80 products were characterized regarding chemical composition and physicochemical properties, facilitating the assessment of excipient performance in a formulation. Noticeable deviations were recorded between different suppliers as well as between batches of the same suppliers. Correlation of all parameters revealed, that functionality related characteristics (FRCs) could be reliably predicted based on chemical composition alone or by a combination of chemical and physicochemical properties, respectively. In summary, this thesis describes and evaluates novel strategies for the targeted delivery and controlled release of biologics intended to counteract the imbalance of anabolic and catabolic proteins observed during aging and musculoskeletal diseases. Two delivery platforms were developed and characterized in vitro – (i) using anti-catabolic peptides immobilized on a carrier for local delivery and (ii) using soluble IGF-I polymer conjugates for systemic application. Both approaches were implemented by bioorthogonal coupling strategies, which were carefully selected in consideration of limitations, side reactions and efficiency aspects. Bioresponsive release of the active biomolecules following increased protease activity could be successfully realized. The therapeutic potential of these approaches was demonstrated using various cell-based potency assays. The systems allow targeted and controlled release of the growth factor IGF-I and anti-catabolic peptides thereby overcoming safety concerns of current growth factor therapy and thus positively impacting the benefit-risk profile of potent therapeutics. Taking potential heterogeneity and by-product concerns into account, comprehensive excipient characterization was performed and a predictive algorithm for FRCs developed, in order to facilitate formulation design and guarantee a safe and efficient therapy from start to finish. N2 - Der zunehmende Verlust an Skelettmuskelmasse, Kraft und Funktion stellt insbesondere bei Älteren eine wesentliche Gefährdung der Unabhängigkeit und Lebensqualität dar. Bislang besteht die Sarkopenie-Therapie infolge der eingeschränkten Wirksamkeit verfügbarer pharmakologischer Möglichkeiten, den Auswirkungen des Muskelschwunds entgegenzuwirken, aus einer Kombination von Krafttraining und erhöhter Proteinzufuhr. Therapeutische Intervention mit Wachstumsfaktoren wie Insulin-like growth factor (IGF-I) oder Inhibitoren von Myostatin – eines wirkungsvollen Hemmstoffes der Myogenese – bietet das Potenzial, die veränderte Aktivität der anabolen und katabolen Zytokine wieder ins Gleichgewicht zu bringen. Allerding haben Dosiseinschränkungen aufgrund akuter Nebenwirkungen und Beeinträchtigungen der Homöostase bislang eine klinische Anwendung ausgeschlossen. Mit der Absicht, eine Therapie mit besserem Sicherheits- und Wirksamkeitsprofil zu bieten, indem die Freisetzung des Wirkstoffs auf entzündetes Gewebe gelenkt wird und Aktivitäten außerhalb des Zielgewebes minimiert werden, entwickelten wir bioresponsive Freisetzungssysteme für ein antikataboles Peptid und das anabole IGF-I, die auf lokalen Ausbruch von Muskelschwund reagieren. In Kapitel I werden aktuelle Konzepte bioorthogonaler Konjugationsmethoden diskutiert und auf Basis einer Vielzahl von Drug Delivery Anwendungen beurteilt. Mit besonderem Fokus auf die Verabreichung von Proteinen werden Herausforderungen und Schwierigkeiten jeder chemischen und enzymatischen Konjugationsstrategie analysiert und Möglichkeiten im Hinblick auf ihre Verwendung für die Kopplung von Biomolekülen aufgezeigt. Auf Grundlage diverser Studien zur Verknüpfung von Proteinen mit Polymeren, Partikeln und Biomaterialien unter Verwendung verschiedener ortsspezifischer Ansätze, fasst das Kapitel vorhandene Strategien zusammen und hebt gewisse Aspekte hervor, die bei Anwendung auf Biomoleküle besondere Beachtung erfordern. Abschließend wird ein Entscheidungsprozess zur Auswahl einer optimalen Verknüpfungsstrategie exemplarisch dargestellt. Drei dieser bioorthogonalen Kopplungsreaktionen werden in Kapitel II angewendet, wodurch das Potenzial der ortsgerichteten Konjugation für die Entwicklung neuer, homogener Drug Delivery Systeme detailliert aufgezeigt wird. Dieses Kapitel beschreibt die Gestaltung eines Delivery Systems für einen Myostatin- Inhibitor (MI) für kontrollierte und lokale Freisetzung, um Myositis-Ausbrüchen entgegenzuwirken. Die Freisetzung des MI vom Träger wird durch erhöhte Konzentration an Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) in betroffenem Muskelgewebe vorangetrieben, die durch Spaltung des dazwischen positionierten Linkers das Peptid vom Partikelträger freisetzen. Es wurden Freisetzungsexperimente durchgeführt, um die Reaktion gegenüber mehreren MMP-Isoformen (MMP-1, -8, -9 und -13), die im Verlauf von Skelettmuskelmyopathien hochreguliert sind, festzustellen, und es wurde das Freisetzungsmuster des MI im Falle einer Krankheitsprogression analysiert. Durch Auswahl der Protease-sensitiven Linker (PSL), die unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber Proteasen zeigen, können die Freisetzungsraten des MI kontrolliert und angepasst werden. Sowohl der immobilisierte MI, als auch der auf MMP-Hochregulation hin freigesetzte MI, waren dazu in der Lage, die Wirkungen von Myostatin auf Signaltransduktion von Zellen und Myoblastendifferenzierung aufzuheben. Das Konzept, bioresponsive Delivery Systeme für Proteine zu designen, wurde auch auf den anabolen Wachstumsfaktor IGF-I angewendet, wie in Kapitel III beschrieben wird. Zahlreiche Studien zu PEGylierten Proteinen oder Peptiden offenbaren, dass eine erfolgreiche Therapie durch Sicherheits- und Wirksamkeitsprobleme herausgefordert wird, da der Polymeranhang die Eigenschaften des biologischen Wirkstoffs beachtlich verändern und dadurch die klinische Wirksamkeit gefährden kann. Zu diesem Zweck wird ein neuer, vielversprechender Ansatz vorgestellt, mit der Absicht, die vorteilhaften Auswirkungen der PEGylierung auf die Pharmakokinetik zu nutzen, aber auch die pharmakodynamischen Herausforderungen dadurch zu adressieren, dass das Protein bei Eintritt ins Zielgewebe freigesetzt wird. Das wurde durch Einfügen eines PSL zwischen den PEG-Teil und das Protein erreicht. Das lösliche Polymerkonjugat wurde durch ortsspezifische, enzymatische Konjugation von IGF-I an den PSL hergestellt, gefolgt von Verknüpfung mit einem 30k Da-PEG unter Verwendung von kupferfreier Azid-Alkin Cycloaddition (SPAAC). Diese Strategie veranschaulicht das Potenzial der bioorthogonalen Konjugation (wie in Kapitel I beschrieben) zur Erzeugung homogener Protein-Polymer-Konjugate mit reproduzierbarem Ergebnis, aber betont auch die veränderten Proteineigenschaften, die sich aus der dauerhaften Polymerkonjugation ergeben. Verglichen mit dem Wildtyp-IGF-I zeigte das PEGylierte Protein beachtliche Veränderungen der pharmakologischen Eigenschaften, wie verminderte Interaktionen mit Insulin-like growth factor Bindungsproteinen (IGFBPs), eine submaximale proliferative Aktivität und ein verändertes Endozytosemuster. Im Gegensatz dazu wurden die Eigenschaften von IGF-I bei lokaler Spaltung des Konjugates durch MMP-Hochregulation und Freisetzung des natürlichen Wachstumsfaktors vollständig wiederhergestellt. Für eine erfolgreiche Formulierungsentwicklung der Proteine und Konjugate ist eine sorgfältige Auswahl geeigneter Hilfsstoffe für eine sichere und zuverlässige Therapie essenziell. Kapitel IV befasst sich mit einem Aspekt davon, indem die chemische Heterogenität von Hilfsstoffen und damit verbundene Unterschiede in der Leistung hervorgehoben werden. Polysorbat 80 (PS80) ist ein in Proteinformulierungen häufig verwendeter Hilfsstoff, der Aggregation und Oberflächenadsorption verhindern soll. Trotz dieser breiten Anwendung als Standardhilfsstoff birgt die heterogene Zusammensetzung und Performance Risiken, wie eine begünstigte Zersetzung und nachteilige Auswirkungen auf die Proteinstabilität. Auf Basis einer umfassenden Studie mit verschiedenen Chargen diverser Anbieter wurden die PS80 Produkte hinsichtlich ihrer chemischen Zusammensetzung und ihrer physikochemischen Eigenschaften charakterisiert, um eine Beurteilung der Hilfsstoffperformance in einer Formulierung zu ermöglichen. Auffällige Abweichungen sowohl zwischen unterschiedlichen Anbietern, also auch zwischen Chargen des gleichen Anbieters konnten verzeichnet werden. Die Korrelation aller Parameter ergab, dass funktionalitätsbezogene Eigenschaften (FRCs) auf Basis der chemischen Zusammensetzung alleine bzw. durch eine Kombination aus chemischen und physikochemischen Eigenschaften zuverlässig prognostiziert werden konnten. Zusammenfassend beschreibt und bewertet diese Dissertation neue Strategien für eine zielgerichtete und kontrollierte Freisetzung von biologischen Wirkstoffen mit der Absicht, dem Ungleichgewicht zwischen anabolen und katabolen Proteinen, welches im Laufe der Alterung und im Zuge muskuloskelettaler Erkrankungen beobachtet wird, entgegenzuwirken. Zwei Wirkstoff-Verabreichungsplattformen wurden entwickelt und in vitro charakterisiert: (i) unter Verwendung antikataboler Peptide, die für eine lokale Applikation auf einem Träger immobilisiert werden, und (ii) unter Verwendung löslicher IGF-I-Polymer Konjugate für die systemische Anwendung. Beide Ansätze wurden mittels bioorthogonaler Kopplungsstrategien, die unter Berücksichtigung von Einschränkungen, Nebenreaktionen und Effizienzaspekten sorgfältig ausgewählt wurden, durchgeführt. Die bioresponsive Freisetzung der aktiven Biomoleküle als Folge einer erhöhten Proteaseaktivität konnte erfolgreich umgesetzt werden. Das therapeutische Potenzial dieser Ansätze wurde anhand mehrerer zellbasierter Wirksamkeitsassays gezeigt. Die Systeme ermöglichen eine zielgerichtete und kontrollierte Freisetzung des Wachstumsfaktors IGF-I und antikataboler Peptide, wobei sie die Sicherheitsbedenken aktueller Wachstumsfaktortherapie bewältigen und somit das Nutzen-Risiko-Profil hochwirksamer Therapeutika positiv beeinflussen. Unter Berücksichtigung der potenziellen Bedenken bezüglich Heterogenität und Nebenprodukten wurde eine umfassende Hilfsstoffcharakterisierung durchgeführt und ein prognostischer Algorithmus für FRCs entwickelt, um die Formulierungsentwicklung zu erleichtern und eine sichere und effiziente Therapie von Anfang bis zum Ende zu garantieren. KW - Muskelatrophie KW - Kontrollierte Wirkstofffreisetzung KW - Insulin-like Growth Factor KW - Myositis KW - bioresponsive KW - protease-sensitive release KW - co-delivery Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-169047 ER - TY - JOUR A1 - Pfitzner, Christian A1 - May, Stefan A1 - Nüchter, Andreas T1 - Body weight estimation for dose-finding and health monitoring of lying, standing and walking patients based on RGB-D data JF - Sensors N2 - This paper describes the estimation of the body weight of a person in front of an RGB-D camera. A survey of different methods for body weight estimation based on depth sensors is given. First, an estimation of people standing in front of a camera is presented. Second, an approach based on a stream of depth images is used to obtain the body weight of a person walking towards a sensor. The algorithm first extracts features from a point cloud and forwards them to an artificial neural network (ANN) to obtain an estimation of body weight. Besides the algorithm for the estimation, this paper further presents an open-access dataset based on measurements from a trauma room in a hospital as well as data from visitors of a public event. In total, the dataset contains 439 measurements. The article illustrates the efficiency of the approach with experiments with persons lying down in a hospital, standing persons, and walking persons. Applicable scenarios for the presented algorithm are body weight-related dosing of emergency patients. KW - RGB-D KW - human body weight KW - image processing KW - kinect KW - machine learning KW - perception KW - segmentation KW - sensor fusion KW - stroke KW - thermal camera Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176642 VL - 18 IS - 5 ER -