TY - THES A1 - Kumari, Geeta T1 - Molecular Characterization of the Induction of Cell Cycle Inhibitor p21 in Response to Inhibition of the Mitotic Kinase Aurora B T1 - Untersuchungen zur Induktion des Zellzyklusinhibitors p21 nach Inhibition der Mitotischen Kinase Aurora B N2 - Aurora B ist eine mitotische Kinase, die entscheidende Funktionen in der Zellteilung ausübt. Aurora B ist außerdem in einer Vielzahl von Krebsarten mutiert oder überexprimiert. Daher ist die Aurora B Kinase ein attraktives Ziel für die Tumortherapie. Gegenwärtig werden Aurora B-Inhibitoren zur Behandlung von soliden Tumoren und Leukämien in verschiedenen klinischen Studien getestet. Es fehlen jedoch Informationen, welche molekularen Mechanismen den beschriebenen Phänotypen wie Zellzyklusarrest, Aktivierung des Tumorsuppressors p53 und seines Zielgens p21 nach Aurora B-Hemmung zugrunde liegen. Hauptziel dieser Arbeit war es die Mechanismen der p21-Induktion nach Hemmung von Aurora B zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass nach Hemmung von Aurora B die p38 MAPK phosphoryliert und somit aktiviert wird. Experimente mit p38-Inhbitoren belegen, dass p38 für die Induktion von p21 und den Zellzyklusarrest benötigt wird. Die Stabilisierung von p53 nach Aurora B-Inhibition und die Rekrutierung von p53 an den p21-Genpromotor erfolgen jedoch unabhängig vom p38-Signalweg. Stattdessen ist p38 für die Anreicherung der elongierenden RNA-Polymerase II in der kodierenden Region des p21-Gens und für die Bildung des p21 mRNA Transkripts notwendig. Diese Daten zeigen, dass p38 transkriptionelle Elongation des p21-Gens nach Aurora B Hemmung fördert. In weiteren Untersuchungen konnte ich zeigen, dass die Aurora B-Hemmung zu einer Dephosphorylierung des Retinoblastoma-Proteins führt und dadurch eine Abnahme der E2F-abhängigen Transkription bewirkt. Dies löst indirekt einen Zellzyklusarrest aus. Weiterhin konnte mit Hilfe von synchronisierten Zellen gezeigt werden, dass p21 nach Durchlaufen einer abnormalen Mitose induziert wird, jedoch nicht nach Aurora B-Hemmung in der Interphase. Interessanterweise werden p38, p53 und p21 schon bei partieller Inhibition von Aurora B aktiviert. Die partielle Inhibition von Aurora B führt zu chromosomaler Instabilität aber nicht zum Versagen der Zytokinese und zur Bildung polyploider Zellen. Damit korreliert die Aktivierung des p38-p53-p21-Signalweges nicht mit Tetraploidie sondern mit vermehrter Aneuploidie. Die partielle Hemmung von Aurora B führt außerdem zur vermehrten Entstehung von reaktive Sauerstoffspezies (ROS), welche für die Aktivierung von p38, p21 und für den Zellzyklusarrest benötigt werden. Basierend auf diesen Beobachtungen kann folgendes Modell postuliert werden: Die Hemmung von Aurora B führt zu Fehlern in der Chromosomenverteilung in der Mitose und damit zu Aneuploidie. Dies führt zu vermehrter Produktion von ROS, möglicherweise durch proteotoxischer Stress, hervorgerufen durch die Imbalanz der Proteinbiosynthese in aneuploiden Zellen. ROS bewirkt eine Aktivierung der p38 MAPK und trägt damit zur Induktion von p21 und dem resultierenden Zellzyklusarrest bei. Aneuploidie, proteotoxischer und oxidativer Stress stellen Schlüsselmerkmale von Tumorkrankungen dar. Anhand der Ergebnisse dieser Arbeit könnte die Kombination von Aurora B-Hemmstoffen mit Medikamenten, die gezielt aneuploide Zellen angreifen, in Tumorerkrankungen therapeutisch wirksam sein. N2 - Aurora B is a mitotic kinase that is essential for cell division. Because it is mutated or overexpressed in a range of cancer types, it has been suggested as a novel therapeutic target. Currently chemical inhibitors against Aurora B are in various phases of clinical trials for treatment of solid tumors and leukemia. Information regarding the molecular requirements for the reported phenotypes of Aurora B inhibition such as cell cycle arrest, activation of the tumor suppressor p53 and its target p21 are not well understood. In this study, I investigated the requirements for p21 induction after Aurora B inhibition. I found that p38 is phosphorylated and activated when Aurora B is inhibited. Experiments with chemical inhibitors against p38 indicate that p38 is required for p21 induction and cell cycle arrest in response to Aurora B inhibition. p53 induction after impairment of Aurora B function and the recruitment of p53 to its binding site in the p21 gene promoter occur independently of p38 signaling. Instead, I found that p38 is required for the enrichment of the elongating RNA Polymerase II in the coding region of the p21 gene. Furthermore, p38 is required for formation of the full-length p21 mRNA transcript. These data indicate that p38 promotes the transcriptional elongation of p21 gene in response to Aurora B inhibition. In further experiments I could show that the p21 causes cell cycle arrest due to a decrease in E2F-dependent transcription by promoting the dephosphorylation of the retinoblastoma protein. Using synchronized cells I could show that the induction of p21 in response to Aurora B inhibition requires transition through an aberrant mitosis and does not occur in cells that are arrested in interphase. Interestingly, p38, p53 and p21 are already induced by partial inhibition of Aurora B, which results in aneuploidy but not in cytokinesis failure and in tetraploidy. This supports the notion that activation of p38-p53-p21 signaling correlates with aneuploidy but not with tetraploidy or binucleation. Partial inhibition of Aurora B also leads to increased generation of reactive oxygen species (ROS), which are required for the activation of p38, p21 and cell cycle arrest. Based on these observations I propose the following model: Inhibition of Aurora B leads to chromosome missegregation resulting in aneuploidy. This results in increased generation of ROS (reactive oxygen species) possibly through proteotoxic stress caused by an imbalance of protein synthesis in aneuploid cells. ROS triggers the activation of p38, which then stimulates the transcriptional elongation of p21 resulting in cell cycle arrest. Aneuploidy, proteotoxic stress and oxidative stress are hallmarks of cancer cells. Based on my results reported in this study, I suggest that the combination of Aurora B inhibitors with drugs that specifically target aneuploid cells might be a novel strategy for cancer therapy, as this is a lethal combination for proliferation of cancer cells. KW - Zellzyklus KW - Biomedicine KW - Inhibitor KW - Cell Cycle KW - Aneuploidy KW - Aurora B Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-101327 ER - TY - THES A1 - Knobloch, Gunnar T1 - Biochemical and structural characterization of chronophin T1 - Die biochemische und strukturelle Charakterisierung von Chronophin N2 - The haloacid dehalogenase (HAD) family of phosphatases is an ancient, ubiquitous group of enzymes, and their emerging role in human health and disease make them attractive targets for detailed analyses. This thesis comprises the biochemical and structural characterization of chronophin, an HAD-type phosphatase, which has been shown to act on Ser3-phosphorylated cofiln-1, a key regulator of actin dynamics, and on the Ser/Thr-phosphorylated steroid receptor co-activator 3 (SRC-3). Besides being a specific phosphoprotein phosphatase, chronophin also acts on the small molecule pyridoxal 5'-phosphate (PLP, vitamin B6), implying that chronophin serves as a regulator of a variety important physiological pathways. The analysis of chronophin was performed on different levels, ranging from intrinsic regulatory mechanisms, such as the allosteric regulation via dimerization or the characterization of specificity determinants, to modes of extrinsic modulation, including the association with putative interacting proteins or the generation of chronophin-specific inhibitors. The association of the previously identified putative chronophin interactors calcium- and integrinbinding protein 1 (CIB1) and calmodulin was investigated using recombinantly expressed and purified proteins. These studies revealed that the interaction of chronophin with CIB1 or calmodulin is mutually exclusive and regulated by calcium. Neither CIB1 nor calmodulin had an effect on the in vitro chronophin phosphatase activity towards PLP or phospho-cofilin-1, but might regulate other functions of this important phosphatase. The role of chronophin dimerization was studied by generating a constitutively monomeric variant, which showed reduced PLP hydrolyzing activity. X-ray crystallographic studies revealed that dimerization is essential for the positioning of the substrate specificity loop in chronophin, unraveling a previously unknown mechanism of allosteric regulation through a homophilic interaction. This mechanism potentially applies to other enzymes of the C2a subfamily of HAD-type phosphatases, as all structurally characterized members show a conserved mode of dimerization. The general determinants of substrate specificity in the C2a subfamily of HAD phosphatases were investigated by performing domain swapping experiments with chronophin and its paralog AUM and subsequent biochemical analyses of the hybrid proteins. The X-ray crystallographic structure determination of the chronophin catalytic domain equipped with the AUM capping domain revealed the first partial structure of AUM. This structural information was then used in subsequent studies that analyzed the divergent substrate specificities of AUM and chronophin in an evolutionary context. Finally, a set of four chronophin inhibitors were generated based on the structure of PLP and characterized biochemically, showing moderate inhibitory effects with IC50-values in the micromolar range. These compounds nevertheless constitute valuable tools for future in vitro experiments, such as studies concerning the structure-function relationship of chronophin as a PLP phosphatase. In addition, the crystal structure of one inhibitor bound to chronophin could be solved. These results provide the basis for the further development of competitive chronophin inhibitors with increased specificity and potency. N2 - HAD Phosphatasen gehören zu einer phylogenetisch alten Proteinfamilie, die in allen drei Domänen des Lebens vertreten ist. Enzyme dieser vergleichsweise wenig charakterisierten Familie von Phosphatasen erweisen sich zunehmend als biomedizinisch interessante Zielmoleküle, da immer mehr Krankheiten identifiziert werden, bei denen HAD Phosphatasen eine Rolle spielen. In der hier vorliegenden Doktorarbeit wurde die HAD Phosphatase Chronophin biochemisch und strukturell charakterisiert. Bisher konnte gezeigt werden, dass Chronophin die Proteine Cofilin-1, ein Schlüsselprotein in der Regulation des Aktin-Zytoskeletts, und den Steroidrezeptor Coaktivator 3 (SRC-3) dephosphoryliert. Darüberhinaus ist bekannt, dass Chronophin eine spezifische Pyridoxal 5'-Phosphat (PLP, Vitamin B6) Phosphatase ist, und somit an der Regulation verschiedenster Signalwege beteiligt ist. Die hier beschriebene Analyse von Chronophin beinhaltet die Untersuchung intrinsischer Regulationsmechanismen, wie z.B. Determinanten der Substratspezifität, die allosterische Regulation über Dimerisierung, bis hin zur Kontrolle durch extrinsische Faktoren wie interagierende Proteine oder Inhibitoren. Die Interaktion von Chronophin mit den kürzlich in unserer Arbeitsgruppe identifizierten Interaktionspartnern CIB1 (Kalzium- und Integrin-bindendes Protein 1) und Calmodulin wurde mit Hilfe rekombinant exprimierter und gereinigter Proteine untersucht. Dabei kam heraus, dass sich die Assoziation von CIB1 und Calmodulin an Chronophin gegenseitig ausschließt, und dass dieser Prozess durch Kalzium reguliert wird. Dabei beeinflusst weder die Bindung an CIB1 noch an Calmodulin die Phosphataseaktivität von Chronophin gegenüber den Substraten PLP oder phosphoryliertem Cofilin-1. Möglicherweise regulieren die beiden interagierenden Proteine die Funktion von Chronophin auf eine andere, hier nicht weiter untersuchte Art und Weise. Der Einfluss der Chronophin-Dimerisierung wurde untersucht, indem wir eine konstitutiv monomere Variante des üblicherweise dimeren Chronophins geschaffen haben. Diese monomere Variante des Enzyms wies eine deutlich reduzierte Aktivität gegenüber PLP auf. Durch röntgenkristallographische Analysen des wild-typischen Proteins und der monomeren Variante konnten wir zeigen, dass die Dimerisierung von Chronophin notwendig ist, um ein Strukturelement, welches wichtig für die Substratspezifität ist, in einer korrekten Position zu halten. Dieser allosterische Mechanismus zur Aufrechterhaltung der Substratspezifität war bisher unbekannt, und trifft möglicherweise auf alle Proteine der C2a Unterfamilie von HAD Phosphatasen zu, die strukturell mit Chronophin verwandt sind. Die Faktoren, welche auf die Substratspezifität von Chronophin Einfluss nehmen wurden untersucht, indem einzelne Proteindomänen mit dem paralogen Protein AUM ausgetauscht, und die so geschaffenen Protein-Hybride biochemisch untersucht wurden. Durch das Lösen der röntgenkristallographischen Struktur eines Protein-Hybrids, bestehend aus der katalytischen Domäne von Chronophin und der capping-Domäne von AUM, konnte die die erste partielle Struktur von AUM untersucht werden. Mit Hilfe dieser strukturellen Information und durch bioinformatische Analysen konnten anschließend die unterschiedliche Substratspezifitäten der beiden paralogen Phosphatasen Chronophin und AUM in einem evolutionsbiologischen Kontext untersucht werden. Zusätzlich wurden vier mögliche Chronophin-Inhibitoren auf der Basis der PLP-Struktur synthetisiert. Die biochemische Analyse der Substanzen als Chronophin-Hemmer ergab moderate inhibitorische Eigenschaften mit IC50-Werten im micromolaren Bereich. Jedoch stellen die hier charakterisierten Inhibitoren nützliche Werkzeuge für die Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehungen von Chronophin als PLP-Phosphatase dar. Die röntgenkristallographische Struktur von Chronophin mit einem der Inhibitoren liefert außerdem eine wichtge Grundlage für die zukünfitige Verbesserung der Inhibitoren bezüglich Effektivität und Spezifität. KW - Phosphatasen KW - Pyridoxalphosphat KW - Dimerisierung KW - Inhibitor KW - Chronophin KW - Pyridoxal 5'-phosphate phosphatase KW - Haloacid dehalogenase KW - HAD phosphatase KW - PLP phosphatase Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-110088 ER -