TY - THES A1 - Volz, Julia T1 - Studies on the influence of platelets on vascular integrity in primary tumors and the role of BIN2 in platelet calcium signaling T1 - Studien zum Einfluss von Thrombozyten auf die Gefäßintegrität im Primärtumor und zur Rolle von BIN2 im Calcium-Signalweg von Thrombozyten N2 - Maintenance of tumor vasculature integrity is indispensable for tumor growth and thus affects tumor progression. Previous studies have identified platelets as major regulators of tumor vascular integrity, as their depletion selectively renders tumor vessels highly permeable, causing massive intratumoral hemorrhage. While these results establish platelets as potential targets for anti-tumor therapy, depletion is not a treatment option due to the essential role of platelets for hemostasis. This thesis demonstrates for the first time that functional inhibition of glycoprotein (GP) VI on the platelet surface rapidly induces tumor hemorrhage and diminishes tumor growth similar to complete platelet depletion but without inducing systemic bleeding complications. Both, the intratumoral bleeding and tumor growth arrest could be reverted by depletion of Ly6G+ cells confirming them to be responsible for the induction of bleeding and necrosis within the tumor. In addition, GPVI inhibition increased intra-tumoral accumulation of co-administered chemotherapeutic agents, thereby resulting in a profound anti-tumor effect. In summary, this thesis manifests platelet GPVI as a key regulator of vascular integrity specifically in growing tumors, serving as a potential basis for the development of anti-tumor strategies. In the second part of this thesis, light is shed on the modulating role of bridging integrator 2 (BIN2) in platelet Ca2+ signaling. Stromal interaction molecule 1 (STIM1) mediated store-operated calcium entry (SOCE) is the major route of Ca2+ influx in platelets, triggered by inositol trisphosphate receptor (IP3R)-dependent Ca2+ store release. In this thesis, the BAR domain superfamily member BIN2 was identified as the first Ca2+ signaling modulator, interacting with both, STIM1 and IP3R in platelets. Deletion of BIN2 resulted in reduced Ca2+ store release and Ca2+ influx in response to all tested platelet agonists. These defects were a consequence of impaired IP3R function in combination with defective STIM1-mediated SOC channel activation, while Ca2+ store content and agonist-induced IP3 production were unaltered. These results establish BIN2 as a central regulator of platelet Ca2+ signaling. The third part of this thesis focuses on the effect of the soluble neuronal guidance protein Sema7A on platelet function. Rosenberger et al. discovered that Sema7A cleavage from red blood cells increases the formation of platelet-neutrophil complexes, thereby reinforcing thrombo-inflammation in myocardial ischemia-reperfusion injury (MIRI). This thesis establishes soluble Sema7A as a stimulator of platelet thrombus formation via its interaction with platelet GPIbα, thereby reinforcing PNC formation. Thus, interfering with the GPIb-Sema7A interaction during MIRI represents a potential strategy to reduce cardiac damage and improve clinical outcome following MI. N2 - Die Aufrechterhaltung einer intakten Gefäßstruktur im Primärtumor ist unerlässlich für dessen Wachstum und beeinflusst dadurch die Tumorentwicklung. Es wurde bereits gezeigt, dass Thrombozyten bei diesem Prozess eine große Rolle spielen, da ihre experimentelle Depletion in Mäusen zu extrem durchlässigen Gefäßen und in Folge dessen zu starken Blutungen im Tumor führt. Diese Ergebnisse machen Thrombozyten zu potentiellen Angriffspunkten in der Krebstherapie, eine komplette Depletion ist dabei jedoch auf Grund ihrer essentiellen Funktion bei der Hämostase nicht denkbar. In dieser Thesis wurde zum ersten Mal gezeigt, dass auch die Blockade des Glykoproteins (GP) VI auf der Thrombozytenoberfläche zu vergleichbaren Blutungen im Tumor und zur Hemmung des Tumorwachstums führt, ohne jedoch das generelle Blutungsrisiko zu beeinflussen. Die durch die GPVI Blockade induzierten Effekte können durch eine gleichzeitige Depletion von Ly6G+ Zellen verhindert werden, was zeigt, dass dieser Zelltyp ursächlich an der Entstehung der Blutung beteiligt ist. Des Weiteren führt die Blockade von GPVI in Kombination mit einem Chemotherapeutikum zu einer Erhöhung dessen Konzentration im Tumorgewebe und damit zu einer verstärkten antitumoralen Wirkung. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass GPVI ein wichtiger Regulator der Gefäßintegrität im wachsenden Tumor ist, was als Grundlage für die Entwicklung von Krebstherapien genutzt werden könnte. Im zweiten Teil dieser Thesis wurde die Rolle des bridging integrator 2 (BIN2) im Ca2+ Signalweg von Thrombozyten untersucht. Der STIM1 abhängige „store operated calcium entry“ (SOCE) vermittelt den größten Ca2+-Einstrom in Thrombozyten. SOCE wird durch den inositol trisphosphate receptor (IP3R)-abhängigen Ca2+ Ausstrom aus dem zelleigenen Ca2+ Reservoir aktiviert. In dieser Thesis wurde BIN2 als erstes Adapterprotein im Ca2+ Signalweg von Thrombozyten identifiziert, das sowohl mit STIM1 als auch mit IP3R interagiert. Das Fehlen von BIN2 führt zu einer Reduktion des Ca2+ Ausstroms aus dem zelleigenen Ca2+ Reservoir und eine Verminderung des Einstroms von extrazellulärem Ca2+. Diesen Defekten liegen die Beeinträchtigungen der Funktion sowohl des IP3R als auch von STIM1 zugrunde, während die Ca2+ Menge im Reservoir und die Agonisten-induzierte IP3 Produktion unverändert bleiben. Zusammenfassend konnte BIN2 als zentrales Molekül im Ca2+ Signalweg von Thrombozyten etabliert werden. Der dritte Teil der Thesis befasst sich mit dem Effekt des löslichen „neuronal guidance protein“ Sema7A auf Thrombozyten. Die Arbeitsgruppe um Prof. Rosenberger konnte bereits zeigen, dass das von Erythrozyten abgespaltene Sema7A die Bildung von Komplexen aus Thrombozyten und Neutrophilen (PNC) fördert und damit die Thrombo-Inflammation während Zusammenfassung III des Ischämie/Reperfusionsschadens des Myokards (MIRI) begünstigt. In dieser Thesis konnte gezeigt werden, dass die Interaktion des löslichen Sema7A mit GPIbα auf der Thrombozytenoberfläche die Thrombenbildung fördert und über diesen Mechanismus auch die PNC Bildung und somit Thrombo-Inflammation verstärkt. Aufgrund dessen stellt der Eingriff in die GPIbα-Sema7a Interaktion eine potentielle Strategie dar, den Gewebeschaden während des MIRI zu reduzieren und damit den Schaden nach einem Myokardinfarkt einzugrenzen. KW - Thrombozyt KW - Primärtumor KW - Maus KW - GPVI KW - Vaskuläre Integrität KW - Calcium signalling KW - BIN2 Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-217427 ER - TY - THES A1 - Becker, Isabelle Carlotta T1 - The role of megakaryocytes and platelets in vascular and osteogenic development T1 - Die Rolle von Megakaryozyten und Thrombozyten in vaskulärer und osteogener Entwicklung N2 - Platelets, small anucleate cell fragments in the blood stream, derive from large precursor cells, so-called megakaryocytes (MK) residing in the bone marrow (BM). In addition to their role in wound healing, platelets have been shown to play a significant role during inflammatory bleeding. Above all, the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) receptors GPVI as well as CLEC-2 have been identified as main regulators of vascular integrity. In addition to ITAM-bearing receptors, our group identified GPV as another potent regulator of hemostasis and thrombosis. Surprisingly, concomitant lack of GPV and CLEC-2 deteriorated blood-lymphatic misconnections observed in Clec2-/- mice resulting in severe edema formation and intestinal inflammation. Analysis of lymphatic and vascular development in embryonic mesenteries revealed severely defective blood-lymph-vessel separation, which translated into thrombocytopenia and increased vascular permeability due to reduced tight junction density in mesenteric blood vessels and consequent leakage of blood into the peritoneal cavity. Recently, platelet granule release has been proposed to ameliorate the progression of retinopathy of prematurity (ROP), a fatal disease in newborns leading to retinal degradation. The mechanisms governing platelet activation in this process remained elusive nonetheless, which prompted us to investigate a possible role of ITAM signaling. In the second part of this thesis, granule release during ROP was shown to be GPVI- and partly CLEC-2-triggered since blockade or loss of these receptors markedly deteriorated ROP progression. Proplatelet formation from MKs is highly dependent on a functional microtubule and actin cytoskeleton, the latter of which is regulated by several actin-monomer binding proteins including Cofilin1 and Twinfilin1 that have been associated with actin-severing at pointed ends. In the present study, a redundancy between both proteins especially important for the guided release of proplatelets into the bloodstream was identified, since deficiency in both proteins markedly impaired MK functionality mainly due to altered actin-microtubule crosstalk. Besides ITAM-triggered activation, platelets and MKs are dependent on inhibitory receptors, which prevent overshooting activation. We here identified macrothrombocytopenic mice with a mutation within Mpig6b encoding the ITIM-bearing receptor G6b-B. G6b-B-mutant mice developed a severe myelofibrosis associated with sex-specific bone remodeling defects resulting in osteosclerosis and -porosis in female mice. Moreover, G6b-B was shown to be indispensable for MK maturation as verified by a significant reduction in MK-specific gene expression in G6b-B-mutant MKs due to reduced GATA-1 activity. N2 - Blutplättchen, die kleinsten Zellen des hämatopoetischen Systems, werden von großen Vorläuferzellen, den Megakaryozyten (MKs), im Knochenmark gebildet. Neben ihrer Rolle bei der Blutstillung und Wundheilung sind Thrombozyten außerdem maßgeblich daran beteiligt, Blutungen in Entzündungsprozessen zu verhindern. Insbesondere den immuno- receptor tyrosine-based activation motif (ITAM) Rezeptoren GPVI und CLEC-2 wird eine tragende Rolle in der Aufrechterhaltung der vaskulären Integrität zugeschrieben. Neben den ITAM-Rezeptoren konnten wir auch für den Thrombozytenrezeptor GPV eine Funktion in Hämostase und Thrombose identifizieren. Erstaunlicherweise führte ein gleichzeitiger Verlust von GPV und CLEC-2 zu einer dramatischen Verstärkung der Blut- Lymphgefäß-Fehlbildungen, die bereits in CLEC-2-defizienten Mäusen beschrieben wurde, sodass die Tiere eine starke Ödembildung in den Extremitäten sowie Entzündungen des Dünndarms aufwiesen. Eine vertiefte Analyse der vaskulären Strukturen in Mesenterien während der Embryonalentwicklung offenbarte zusätzliche Defekte in der Blut- und Lymphgefäßtrennung in CLEC-2/GPV-defizienten Mäusen. Diese Deformationen führten zu Thrombozytopenie, Anämie und einer erhöhten vaskulären Permeabilität in adulten Mäusen, was sich auf eine reduzierte tight-junction-Dichte in Mesenterien und Darmgewebe zurückführen ließ, die zu einem Austritt von Blut in die Peritonealhöhle führte. In einer kürzlich veröffentlichten Publikation wurde Plättchengranula eine Rolle in der Auflösung retinopathischer Gefäßmissbildungen zugeschrieben. Retinopathia praema- turorum (ROP) ist eine Krankheit in Frühgeborenen, die aufgrund von Sauerstoffunter- schieden vor und nach Geburt zu Netzhautablösung und Blindheit führen kann. Die exakten Mechanismen, die hierbei zu Thrombozytenaktivierung und nachfolgender Degranulierung beitragen, sind bisher allerdings nicht bekannt. Da eine tragende Rolle von ITAM Rezeptoren in der Aufrechterhaltung vaskulärer Integrität insbesondere in krankhaftem Gewebe zuvor bereits aufgezeigt wurde, untersuchten wir die Entwicklung von Vaso-obliteration und Neovaskularisierung in CLEC-2 und GPVI-depletierten oder defizienten Mäusen und konnten einen Beitrag beider Rezeptoren zur Progression von ROP nachweisen. Die Produktion von Thrombozyten aus MKs ist stark von einem funktionalen Mikrotubuli- und Aktin-Zytoskelett abhängig. Aktinpolymerisation wird substanziell von unterschiedlichen Aktin-bindenden Proteinen reguliert, von denen Cofilin1 und Twinflin1 ein Abtrennen der Filamente induzieren. Wir konnten nun eine funktionale Redundanz beider Proteine in murinen MKs aufzeigen, die insbesondere für ein geregeltes Abschnüren von Thrombozyten in die Blutbahn essentiell ist und von einem Crosstalk zwischen Aktin- und Mikrotubuli- Zytoskeletts abhängig ist, der durch Twinfilin1 und Cofilin1 aufrechterhalten wird. Neben ITAM-induzierter Thrombozytenaktivierung spielt auch die Inhibition derselbigen durch immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif (ITIM)-Rezeptoren eine große Rolle in MKs und Plättchen, da diese eine überschießende Aktivierung verhindern. Wir konnten in der vorliegenden Arbeit eine Spontanmutation in Mpig6b, das für den ITIM-Rezeptor G6b-B codiert, in stark makrothrombozytopenen, wildtypischen Mäusen identifizieren. Außer in der stark reduzierten Thrombozytenzahl manifestierte sich die Mutation des Weiteren in einer massiven Myelofibrose, die mit einer geschlechtsspezifischen Osteosklerose und -porose in weiblichen Mäusen einherging. Überraschenderweise konnten wir zudem einen dramatischen Reifungsblock in G6b-B-mutierten MKs feststellen, der insbesondere in einer reduzierten Expression des Transkriptionsfaktors GATA-1 begründet lag. KW - Megakaryozyt KW - Thrombozyt KW - Megakaryocyte KW - platelets KW - bone marrow KW - hematopoiesis Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-210241 ER - TY - THES A1 - Aurbach, Katja T1 - Studies on the role of the cytoskeleton in platelet production T1 - Studien über die Rolle des Zytoskeletts in der Produktion von Thrombozyten N2 - Platelets are small anucleated cell fragments that originate from megakaryocytes (MKs), which are large cells located in the bone marrow (BM). MKs extend long cytoplasmic protrusions, a process which is called proplatelet formation, into the lumen of the sinusoidal vessels where platelets are sized by the bloodstream. During the process of platelet biogenesis, segments of the MK penetrate the endothelium and, through cytoskeletal remodeling inside the MK, proplatelet fragments are released. Rho GTPases, such as RhoA and RhoB, are critically involved in cytoskeletal rearrangements of both the actin and the tubulin cytoskeleton. The first part of this thesis concentrated on the protein RhoB and its involvement in cytoskeletal organization in MKs and platelets. Single knockout (KO) mice lacking RhoB had a minor microthrombocytopenia, which means a smaller platelet size and reduced platelet number, accompanied by defects in the microtubule cytoskeleton in both MKs and platelets. In particular, tubulin organization and stability, which is regulated by posttranslational modifications of α-tubulin, were disturbed in RhoB-/- platelets. In contrast, RhoB-/- MKs produced abnormally shaped proplatelets but had unaltered posttranslational modifications of α-tubulin. The second part focused on the influence of RhoA and RhoB on MK localization and platelet biogenesis in murine BM. Many intact RhoA-/- MKs are able to transmigrate through the endothelial layer and stay attached to the vessel wall, whereas only 1% of wildtype (wt) MKs are detectable in the intrasinusoidal space. Concomitant deficiency of RhoA and RhoB reverts this transmigration and results in macrothrombocytopenia, MK clusters around the vessel in the BM and defective MK development. The underlying mechanism that governs MKs to distinct localizations in the BM is poorly understood, thus this thesis suggests that this process may be dependent on RhoB protein levels, as RhoA deficiency is coincided with increased RhoB levels in MKs and platelets. The third part of this thesis targeted the protein PDK1, a downstream effector of Rho GTPases, in regard to MK maturation and polarization throughout thrombopoiesis. MK- and platelet-specific KO in mice led to a significant macrothrombocytopenia, impaired actin cytoskeletal reorganization during MK spreading and proplatelet formation, with defective MK maturation. This was associated with decreased PAK activity and, subsequently, phosphorylation of its substrates LIMK and Cofilin. Together, the observations of this thesis highlight the importance of Rho GTPases and their downstream effectors on the regulation of the MK and platelet cytoskeleton. N2 - Thrombozyten sind kleine Zellfragmente ohne Zellkern, die von Megakaryozyten (MKs) produziert werden. MKs sind riesige Zellen im Knochenmark, welche lange zytoplasmatische Ausläufer in die sinusoidalen Blutgefäße strecken, woraus durch den Blutstrom Thrombozyten abgeschnürt werden. Während der Thrombozyten-Biogenese penetrieren Teile des MKs das Endothel und durch zytoskeletales Umorganisieren innerhalb des MKs werden Proplättchen-Fragmente gebildet. Rho GTPasen wie die Proteine RhoA und RhoB sind maßgebliche Regulatoren des Zytoskeletts, sowohl des Aktins als auch des Tubulin Zytoskeletts. Der erste Teil dieser Thesis konzentrierte sich auf das Protein RhoB und dessen Einfluss auf die Organisation des Zytoskeletts. Mäuse mit einer Defizienz für das Protein RhoB zeigen eine Microthrombozytopenie und eine Reduktion der Thrombozytenzahl und -größe. Dies ist begleitet von Defekten des Mikrotubuli Zytoskeletts sowohl in MKs als auch in Blutplättchen. In Thrombozyten waren insbesondere Tubulin Organisation und Stabilisation betroffen, welche durch posttranslationale Modifizierungen von α-Tubulin bestimmt wurde. RhoB-negative MKs hingegen produzierten abnormal geformte Proplättchen, hatten jedoch unveränderte posttranslationale Modifizierungen von α-Tubulin. Der zweite Teil dieser Thesis fokussierte sich auf den Einfluss von RhoA und RhoB auf die Lokalisation von MKs im Knochenmarkt von Mäusen. Eine große Anzahl von RhoA-negativen MKs können durch das Endothel in die Blutgefäße wandern und bleiben dort adhärent, während nur etwa 1% wildtypischer MKs am Blutgefäß detektierbar sind. Gleichzeitige Defizienz von RhoA und RhoB revertiert die Translokation von RhoA-negativen MKs und führt in Mäusen zu Makrothrombozytopenie, die Formierung von MK Clustern um die Gefäßwand im Knochenmarkt und eine fehlerhafte MK Entwicklung. Der Mechanismus, der MKs zu bestimmten Positionen im Knochenmarkt führt, ist bisher kaum verstanden. In dieser Thesis konnte gezeigt werden, dass dieser Prozess von dem Level an RhoB Protein abhängig sein könnte, da eine Defizienz von RhoA zu einer Hochregulierung von RhoB in MKs und Thrombozyten führte. Der dritte Teil dieser Thesis zielte auf ein Signalprotein der Rho GTPasen ab, dem Protein PDK1. Es wurde die Rolle von PDK1 in der Regulation von MK Reifung und Polarisation während der Bildung von Thrombozyten untersucht. Ein MK und Thrombozyten spezifischer KO von PDK1 führte zu einer signifikanten Makrothrombozytopenie, einem gestörten Aktin Zytoskelett, während des MK Spreadings und der Proplättchen Bildung, begleitet von einer fehlerhaften MK Reifung. Dies war mit einer Reduktion in der Aktivität von PAK und folglich dem Phosphorylierungsstatus seiner Substrate LIMK und Cofilin assoziiert. Die Beobachtungen dieser Doktorarbeit arbeiteten die Relevanz von Rho GTPasen und ihren Signalproteinen für die Regulation des MK und Thrombozyten Zytoskelettes im Maus-Modell hervor. KW - Megakaryozyt KW - Thrombozyt KW - Zellskelett KW - Thrombopoiesis KW - Cytoskeleton Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-234669 ER - TY - THES A1 - Klingler, Philipp T1 - Exploration of proteasome interactions with human platelet function T1 - Untersuchung von Proteasom-Wechselwirkungen mit der Funktion humaner Thrombozyten N2 - Platelets are anucleated cell fragments derived from megakaryocytes. They play a fundamental role in hemostasis, but there is rising evidence that they are also involved in immunological processes. Despite absence of a nucleus, human platelets are capable of de novo protein synthesis and contain a fully functional proteasome system, which is, in nucleated cells, involved in processes like cell cycle progression or apoptosis by its ability of protein degradation. The physiological significance of the proteasome system in human platelets is not yet fully understood and subject of ongoing research. Therefore, this study was conducted with the intention to outline the role of the proteasome system for functional characteristics of human platelets. For experimentation, citrated whole blood from healthy donors was obtained and preincubated with proteasome inhibitors. In addition to the commonly used bortezomib, the potent and selective proteasome inhibitor carfilzomib was selected as a second inhibitor to rule out agent-specific effects and to confirm that observed changes are related to proteasome inhibition. Irreversibly induced platelet activation and aggregation were not affected by proteasome blockade with bortezomib up to 24 hours. Conversely, proteasome inhibition led to enhanced threshold aggregation and agglutination up to 25 %, accompanied by partial alleviation of induced VASP phosphorylation of approximately 10-15 %. Expression of different receptors were almost unaffected. Instead, a significant increase of PP2A activity was observable in platelets after proteasome blockade, accompanied by facilitated platelet adhesion to coated surfaces in static experiments or flow chamber experiments. Carfilzomib, used for the first time in functional experimentation with human platelets in vitro, led to a dose-dependent decrease of proteasome activity with accumulation of poly ubiquitylated proteins. Like bortezomib, carfilzomib treatment resulted in enhanced threshold aggregation with attenuated VASP phosphorylation. As the main conclusion of this thesis, proteasome inhibition enhances the responsiveness of human platelets, provided by an alleviation of platelet inhibitory pathways and by an additional increase of PP2A activity, resulting in facilitated platelet adhesion under static and flow conditions. The proteasome system appears to be involved in the promotion of inhibitory counterregulation in platelets. The potential of proteasome inhibitors for triggering thromboembolic adverse events in patients must be clarified in further studies, in addition to their possible use for targeting platelet function to improve the hemostatic reactivity of platelets. N2 - Thrombozyten sind kernlose Zellfragmente, welche aus Megakaryozyten gebildet werden. Sie spielen eine fundamentale Rolle in der Hämostase, aber es gibt immer mehr Hinweise, dass Thrombozyten auch in immunologischen Prozessen involviert sind. Trotz Fehlen eines Zellkerns haben humane Thrombozyten die Fähigkeit zur de novo Proteinsynthese und besitzen außerdem ein voll funktionstüchtiges Proteasomsystem, welches in kernhaltigen Zellen über den Proteinabbau an Prozessen wie dem Fortschreiten des Zellzyklus oder der Apoptose beteiligt ist. Die physiologische Bedeutung des Proteasomsystems in humanen Thrombozyten ist nicht vollständig geklärt und ist aus diesem Grund Gegenstand aktueller Forschung. Daher war es Ziel dieser Studie, die Rolle des Proteasomsystems für die funktionellen Eigenschaften humaner Thrombozyten zu erforschen. Für die Experimente wurde Citrat-Vollblut von gesunden Spendern gewonnen und mit Proteasom-Hemmstoffen vorinkubiert. Es wurde neben dem gängigen Bortezomib der potente und selektive Proteasom-Inhibitor Carfilzomib als zweiter Inhibitor eingesetzt, um substanzspezifische Effekte auszuschließen und zu bestätigen, dass die beobachteten Veränderungen auf der Proteasom-Inhibition beruhen. Die irreversibel induzierte Thrombozytenaktivierung und -aggregation wurde durch die Hemmung des Proteasoms mit Bortezomib bis zu 24 Stunden nicht beeinflusst. Allerdings führte die Proteasom-Hemmung zu einer verstärkten Schwellenwertaggregation und -agglutination um bis zu 25 % sowie zu einer partiellen Abschwächung der induzierten VASP-Phosphorylierung um etwa 10-15 %. Die Expression verschiedener Rezeptoren blieb nahezu unbeeinflusst. Stattdessen konnte unter Proteasom-Inhibition eine erhöhte Enzymaktivität der PP2A beobachtet werden, begleitet von einer erleichterten Thrombozytenadhäsion an beschichteten Oberflächen bei statischen Versuchen ober bei Flusskammerversuchen. Carfilzomib, welches erstmals für funktionelle Experimente mit menschlichen Thrombozyten in vitro eingesetzt wurde, führte zu einer dosisabhängigen Abnahme der Proteasom-Aktivität mit einer Akkumulation von poly ubiquitylierten Proteinen. Wie Bortezomib mündete die Behandlung mit Carfilzomib in einer verstärkten Schwellenwertaggregation und abgeschwächter VASP-Phosphorylierung. Die wichtigste Schlussfolgerung dieser Arbeit ist, dass die Inhibition des Proteasoms die Reaktivität humaner Thrombozyten erhöht, gekennzeichnet durch eine Abschwächung der hemmenden Signalwege der Thrombozyten und durch eine zusätzliche Erhöhung der PP2A-Enzymaktivität, was zu einer erleichterten Thrombozytenadhäsion unter statischen Verhältnissen und unter Flussbedingungen führt. Das Proteasomsystem scheint an der Förderung der hemmenden Gegenregulation in Thrombozyten beteiligt zu sein. Das Potenzial von Proteasom Inhibitoren, thromboembolische Nebenwirkungen bei Patienten auszulösen, muss in weiteren Studien geklärt werden, ebenso wie ihr möglicher Einsatz für die gezielte Beeinflussung der Thrombozytenfunktion zur Verbesserung der hämostatischen Reaktivität der Thrombozyten. KW - Thrombozyt KW - Proteasom KW - Platelet KW - Proteasome KW - Bortezomib Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-321089 ER - TY - THES A1 - Baumann, Juliane T1 - Studies on the influence of mutations in the Myh9 gene on platelet function T1 - Studien zum Einfluss von Mutationen im Myh9 Gen auf die Thrombozytenfunktion N2 - The platelet cytoskeleton ensures normal size and discoid shape under resting conditions and undergoes immediate reorganization in response to changes in the extracellular environment through integrin-based adhesion sites, resulting in actomyosin-mediated contractile forces. Mutations in the contractile protein non-muscle myosin heavy chain IIA display, among others, macrothrombocytopenia and a mild to moderate bleeding tendency in human patients. It is insufficiently understood which factors contribute to the hemostatic defect found in MYH9-related disease patients. Therefore, a better understanding of the underlying biophysical mechanisms in thrombus formation and stabilization is warranted. This thesis demonstrates that an amino acid exchange at the positions 702, 1424 and 1841 in the heavy chain of the contractile protein non-muscle myosin IIA, caused by heterozygous point mutations in the gene, resulted in macrothrombocytopenia and increased bleeding in mice, reflecting the clinical hallmark of the MYH9-related disease in human patients. Basic characterization of biological functions of Myh9 mutant platelets revealed overall normal surface glycoprotein expression and agonist-induced activation when compared to wildtype platelets. However, myosin light chain phosphorylation after thrombin-activation was reduced in mutant platelets, resulting in less contractile forces and a defect in clot retraction. Altered biophysical characteristics with lower adhesion and interaction forces of Myh9 mutant platelets led to reduced thrombus formation and stability. Platelets from patients with the respective mutations recapitulated the findings obtained with murine platelets, such as impaired thrombus formation and stiffness. Besides biological and biophysical characterization of mutant platelets from mice and men, treatment options were investigated to prevent increased bleeding caused by reduced platelet forces. The antifibrinolytic agent tranexamic acid was applied to stabilize less compact thrombi, which are presumably more vulnerable to fibrinolysis. The hemostatic function in Myh9 mutant mice was improved by interfering with the fibrinolytic system. These results show the beneficial effect of fibrin stabilization to reduce bleeding in MYH9-related disease. N2 - Das thrombozytäre Zytoskelett gewährleistet eine normale Zellgröße und diskoide Form unter ruhenden Bedingungen. Als Reaktion auf Veränderungen in der extrazellulären Umgebung wird das Zytoskelett durch Integrin-basierte Adhäsionsstellen reorganisiert, was zu Aktomyosin-vermittelten kontraktilen Kräften führt. Mutationen in der schweren Kette des kontraktilen nicht-muskulären Proteins Myosin IIA führen bei Patienten u. a. zu einer Makrothrombozytopenie und einer leichten bis mittelschweren Blutungsneigung. Es ist unzureichend geklärt, welche Faktoren zum hämostatischen Defekt bei Patienten mit MYH9-bedingter Erkrankung beitragen. Daher ist ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden biophysikalischen Mechanismen bei der Thrombusbildung und -stabilisierung erforderlich. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Austausch von einzelnen Aminosäuren an den Positionen 702, 1424 und 1841 im kontraktilen Protein Myosin IIA, hervorgerufen durch Punktmutationen im kodierenden Gen, zu einer Makrothrombozytopenie und zu einer verlängerten Blutungszeit in Mäusen führt. Dies spiegelt die klinischen Merkmale der MYH9-assoziierte Erkrankungen bei Patienten wider. Die basale Charakterisierung der biologischen Funktionen von Myh9-mutierten Thrombozyten im Vergleich zu Wildtyp-Thrombozyten ergab eine insgesamt normale Oberflächenglykoproteinexpression und Agonisten-induzierte Aktivierung. Interessanterweise war die Phosphorylierung der leichten Myosinkette in den mutierten Thrombozyten nach Aktivierung reduziert, was zu einer geringeren Kontraktionskraft und damit zu einem Defekt beim Zusammenziehen des Gerinnsels führte. Mit Hilfe von biophysikalischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass geringere Adhäsions- und Interaktionskräfte von Thrombozyten mit Punktmutationen im Myh9 Gen zu einer verminderten Thrombusbildung und -stabilität führen. Thrombozyten von Patienten mit den entsprechenden Mutationen rekapitulierten die mit murinen Thrombozyten erhaltenen Ergebnisse, wie z. B. eine beeinträchtigte Thrombusbildung und -steifigkeit. Neben der biologischen und biophysikalischen Charakterisierung der Thrombozyten von Mäusen und Menschen mit den Punktmutationen wurden Behandlungsmöglichkeiten untersucht, um die erhöhte Blutungsneigung aufgrund der verminderten Thrombozytenkräfte zu verhindern. Das Antifibrinolytikum Tranexamsäure wurde eingesetzt, um weniger kompakte Thromben zu stabilisieren, die vermutlich anfälliger für Fibrinolyse sind. Die hämostatische Funktion von Mäusen mit Myh9-Mutationen konnte durch die Gabe von Tranexamsäure verbessert werden. Diese Ergebnisse zeigen die positive Wirkung der Fibrinstabilisierung zur Verringerung von Blutungsneigungen bei MYH9-assoziierte Erkrankungen. KW - Thrombozyt KW - Zellskelett KW - Platelets KW - Cytoskeleton KW - Biomechanics KW - Myosin IIA KW - Biomechanik Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-287953 ER - TY - THES A1 - Mott, Kristina T1 - Regulation of platelet biogenesis in the native and myeloablated bone marrow niche T1 - Die Regulation der Thrombozytenbiogenese im nativen und myeloablatierten Knochenmark N2 - Megakaryocytes (MKs) are the largest cells of the hematopoietic system and the precursor cells of platelets. During proplatelet formation (PPF) bone marrow (BM) MKs extent large cytoplasmic protrusions into the lumen of sinusoidal blood vessels. Under homeostatic conditions PPF occurs exclusively in the direction of the sinusoid, while platelet generation into the marrow cavity is prevented. So far, the mechanisms regulating this process in vivo are still not completely understood, especially when PPF is deregulated during disease. This thesis investigated the mechanisms of PPF in native BM and after myeloablation by total body irradiation (TBI). First, we have identified a specialized type of BM stromal cells, so called CXCL12-abundant reticular (CAR) cells, as novel possible regulators of PPF. By using complementary high-resolution microscopy techniques, we have studied the morphogenetic events at the MK/vessel wall interface in new detail, demonstrating that PPF formation preferentially occurs at CAR cell-free sites at the endothelium. In the second part of this thesis, we analyzed the processes leading to BM remodeling in response to myeloablation by TBI. We used confocal laser scanning microscopy (CLSM) to study the kinetic of radiation-triggered vasodilation and mapped extracellular matrix (ECM) proteins after TBI. We could demonstrate that collagen type IV and laminin α5 are specifically degraded at BM sinusoids. At the radiation-injured vessel wall we observed ectopic release of platelet-like particles into the marrow cavity concomitantly to aberrant CAR cell morphology, suggesting that the balance of factors regulating PPF is disturbed after TBI. ECM proteolysis is predominantly mediated by the matrix metalloproteinase MMP9, as revealed by gelatin-zymography and by a newly established BM in situ zymography technique. In transgenic mice lacking MMP9 vascular recovery was delayed, hinting towards a role of MMP9 in vessel reconstitution after myeloablation. In a third series of experiments, we studied the irradiated BM in the context of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). By using mice as BM donors that ubiquitously express the fluorescent reporter protein dsRed we tracked engraftment of donor cells and especially MKs in the recipient BM. We found a distinct engraftment pattern and cluster formation for MKs, which is different from other blood cell lineages. Finally, we assessed platelet function after TBI and HSCT and were the first to demonstrate that platelets become massively hyporeactive, particularly upon stimulation of the collagen receptor GPVI. In summary, our findings shed light on the processes of PPF during health and disease which will help to develop treatments for aberrant thrombopoiesis. N2 - Megakaryozyten (MKs) sind die größten Zellen des hämatopoetischen Systems und die Vorläuferzellen der Blutplättchen. Während der Ausbildung von Proplättchen schnüren MKs im Knochenmark (KM) große zytoplasmatische Ausläufer in das Lumen der sinusoidalen Blutgefäße ab. Unter homöostatischen Bedingungen erfolgt die Proplättchenbildung ausschließlich in Richtung der Sinusoide, während die Thrombozytenbildung in die Knochenmarkkavität verhindert wird. Bislang sind die Mechanismen, die diesen Prozess in vivo steuern, noch nicht vollständig aufgeklärt insbesondere, wenn die Thrombozytenbiogenese unter Krankheitsbedingungen dereguliert ist. In dieser Arbeit wurden die Mechanismen der Thrombopoese im nativen Knochenmark und nach Myeloablation durch Ganzkörperbestrahlung (total body irradiation, TBI) untersucht. Zunächst haben wir einen spezialisierten Typ von KM-Stromazellen, die sog. CXCL12-abundant reticular (CAR) Zellen, als neue mögliche Regulatoren der Proplättchenbildung identifiziert. Durch den Einsatz komplementärer hochauflösender Mikroskopietechniken haben wir die morphogenetischen Vorgänge an der Schnittstelle zwischen MKs und Gefäßwand genauer untersucht und gezeigt, dass die Generierung von Proplättchen bevorzugt an CAR-Zell-freien Stellen am Endothel stattfindet. Im zweiten Teil dieser Arbeit analysierten wir die Prozesse, die zum Knochenmarkumbau nach Myeloablation durch TBI führen. Mit Hilfe von konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie untersuchten wir die Kinetik der strahleninduzierten Vasodilatation und kartierten die extrazelluläre Matrix (EZM) Proteine nach TBI. So konnten wir zeigen, dass Kollagen Typ IV und Laminin α5 spezifisch an den Knochenmarksinusoiden abgebaut werden. An der strahlengeschädigten Gefäßwand beobachteten wir die ektope Freisetzung plättchenartiger Partikel in die Knochenmarkkavität, die mit einer abnormalen CAR-Zellmorphologie einherging. Dies weist darauf hin, dass das Gleichgewicht der Faktoren, die die gerichtete Proplättchenbildung regulieren, nach TBI gestört ist. Die EZM-Proteolyse wird vor allem durch die Matrix-Metalloproteinase MMP9 vermittelt, was durch Gelatine-Zymographie und durch eine neu etablierte in situ Zymographie-Technik für das Knochenmark nachgewiesen wurde. Bei transgenen Mäusen, die defizient für MMP9 sind, war die Regeneration der Vaskulatur verzögert, was auf eine Rolle von MMP9 bei der Gefäßrekonstitution nach Myeloablation hindeutet. In einer dritten Versuchsreihe untersuchten wir das bestrahlte KM im Rahmen einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSZT). Mit Hilfe von Mäusen als KM-Spender, die ubiquitär das fluoreszierende Reporterprotein dsRed exprimieren, verfolgten wir das Anwachsen von Spenderzellen und insbesondere von MKs im Empfängerknochenmark. Wir beobachteten ein eindeutiges Muster bzw. Clusterbildung für anwachsende MKs, die sich von anderen Blutzelllinien unterschied. Schließlich untersuchten wir die Funktion von Thrombozyten nach TBI und HSZT und konnten als erste zeigen, dass Thrombozyten eine massive Hyporeaktivität ausbilden, insbesondere nach Stimulation des Kollagenrezeptors GPVI. Zusammenfassend geben unsere Ergebnisse Aufschluss über die Prozesse der Thrombopoese im nativen und pathologischen Knochenmark, was zur Entwicklung von Therapien zu Behandlung von defekter Thrombozytenbiogenese beitragen wird. KW - Knochenmark KW - Knochenmarktransplantation KW - Megakaryozyt KW - Thrombozyt KW - Ganzkörperbestrahlung KW - bone marrow KW - myeloablation KW - thrombopoiesis Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-289630 ER - TY - THES A1 - Göb [née Klaus], Vanessa Aline Domenica T1 - Pathomechanisms underlying ischemic stroke T1 - Pathomechanismen des ischämischen Schlaganfalles N2 - Every year, stroke affects over 100 million people worldwide and the number of cases continues to grow. Ischemic stroke is the most prevalent form of stroke and rapid restoration of blood flow is the primary therapeutic aim. However, recanalization might fail or reperfusion itself induces detrimental processes leading to infarct progression. Previous studies identified platelets and immune cells as drivers of this so-called ischemia/reperfusion (I/R) injury, establishing the concept of ischemic stroke as thrombo-inflammatory disease. Reduced cerebral blood flow despite recanalization promoted the hypothesis that thrombus formation within the cerebral microcirculation induces further tissue damage. The results presented in this thesis refute this: using complementary methodologies, it was shown that infarct growth precedes the occurrence of thrombi excluding them as I/R injury-underlying cause. Blood brain barrier disruption is one of the hallmarks of ischemic stroke pathology and was confirmed as early event during reperfusion injury in the second part of this study. Abolished platelet α-granule release protects mice from vascular leakage in the early reperfusion phase resulting in smaller infarcts. Using in vitro assays, platelet α-granule-derived PDGF-AB was identified as one factor contributing to blood-brain barrier disruption. In vivo visualization of platelet activation would provide important insights in the spatio-temporal context of platelet activation in stroke pathology. As platelet signaling results in elevated intracellular Ca2+ levels, this is an ideal readout. To overcome the limitations of chemical calcium indicators, a mouse line expressing an endogenous calcium reporter specifically in platelets and megakaryocytes was generated. Presence of the reporter did not interfere with platelet function, consequently these mice were characterized in in vivo and ex vivo models. Upon ischemic stroke, neutrophils are among the first cells that are recruited to the brain. Since for neutrophils both, beneficial and detrimental effects are described, their role was investigated within this thesis. Neither neutrophil depletion nor absence of NADPH-dependent ROS production (Ncf-/- mice) affected stroke outcome. In contrast, abolished NET-formation in Pad4-/- mice resulted in reduced infarct sizes, revealing detrimental effects of NETosis in the context of ischemic stroke, which might become a potential therapeutic target. Cerebral venous (sinus) thrombosis, CV(S)T is a rare type of stroke with mainly idiopathic onset. Whereas for arterial thrombosis a critical contribution of platelets is known and widely accepted, for venous thrombosis this is less clear but considered more and more. In the last part of this thesis, it was shown that fab-fragments of the anti-CLEC-2 antibody INU1 trigger pathological platelet activation in vivo, resulting in foudroyant CVT accompanied by heavy neurological symptoms. Using this novel animal model for CVT, cooperative signaling of the two platelet receptors CLEC-2 and GPIIb/IIIa was revealed as major trigger of CVT and potential target for treatment. N2 - Jährlich sind weltweit über 100 Millionen Menschen von einem Schlaganfall betroffen, wobei die Zahl der Fälle weiter zunimmt. Der ischämische Schlaganfall ist die häufigste Form des Schlaganfalls, und die sofortige Wiederherstellung des Blutflusses ist das oberste Therapie¬ziel. Allerdings kommt es vor, dass die Rekanalisierung des betroffenen Gefäßes fehlschlägt oder die Reperfusion selbst zu schädlichen Prozessen führt, die das Fortschreiten des Infarkts begünstigen. In vorangegangen Studien wurden Thrombozyten und Immunzellen als treibende Kräfte dieser so genannten Ischämie/Reperfusion (I/R)-Schädigung identifiziert und der ischämische Schlaganfall als thrombo-inflammatorische Erkrankung definiert. Eine verminderte zerebrale Durchblutung trotz Rekanalisation führte zu der Hypothese, dass die Bildung von Thromben in der zerebralen Mikrozirkulation zu weiteren Gewebeschäden führt. Die hier vorgestellten Ergebnisse widerlegen dies: Mit Hilfe komplementärer Methoden konnte gezeigt werden, dass das Infarktwachstum dem Auftreten von Thromben vorausgeht, was diese als Ursache für die I/R-Verletzung ausschließt. Die Störung der Blut-Hirn-Schranke ist eines der charakteristischen Kennzeichen der Pathologie des ischämischen Schlaganfalls und wurde im zweiten Teil dieser Studie als frühes Ereignis während des Reperfusionsschadens bestätigt. Mit Hilfe transgener Mäuse konnte gezeigt werden, dass die Ausschüttung von α-Granula aus Thrombozyten in der frühen Reperfusionsphase an Störungen der Blut-Hirn-Schranke beteiligt ist und somit zum Infarktwachstum beiträgt. In in-vitro-Versuchen konnte gezeigt werden, dass PDGF-AB, ein Bestandteil der α-Granula, an Prozessen, die für die Beeinträchtigung der Blut-Hirn-Schranke verantwortlich sind, beteiligt ist. Die Sichtbarmachung von aktivierten Thrombozyten in vivo, würde wichtige Erkenntnisse über den räumlichen und zeitlichen Kontext der Aktivierung von Thrombozyten im Verlauf des Schlaganfalls liefern. Da alle aktivierenden Signalwege zum Anstieg des intrazellulären Kalziumspiegels führen, ist Kalzium ein idealer Indikator der Thrombozytenaktivierung. Um die Grenzen chemischer Kalziumindikatoren zu überwinden, wurde eine transgene Mauslinie erzeugt, welche einen endogenen Kalziumreporter speziell in Thrombozyten und Megakaryozyten exprimiert. Die Anwesenheit des Reporters hatte keine Auswirkung auf die Funktionalität der Thrombozyten und die Mäuse wurden in vivo sowie ex vivo in verschiedenen Experimenten charakterisiert. In der Folge eines ischämischen Schlaganfalles gehören Neutrophile zu den am frühesten ins Gehirn einwandernden Zellen. Dabei werden Neutrophilen sowohl günstige als auch schädliche Wirkungen auf den Verlauf des ischämischen Schlaganfalls zugeschrieben. Aus diesem Grund wurde ihre Rolle in dieser Arbeit näher untersucht. Weder die Abwesenheit von Neutrophilen noch das Fehlen der NADPH-abhängigen Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (Ncf1-/- Mäuse) beeinflussen den Ausgang eines Schlaganfalls. Im Gegensatz dazu, führte die Verhinderung der NET-Bildung (NET = neutrophil extracellular traps) in Pad4-/- Mäusen zu verringerten Infarktgrößen, was auf eine schädliche Wirkung der NETose im Zusammenhang des Schlaganfalls hinweist und somit ein therapeutisches Angriffsziel darstellen könnte. Sinusvenenthrombosen sind eine seltene Form des Schlaganfalls, die meist ohne bekannte Ursache auftreten. Während für die arterielle Thrombose ein kritischer Beitrag der Thrombozyten bekannt und weithin akzeptiert ist, ist dies für venöse Thrombosen weniger klar, wird aber immer mehr in Betracht gezogen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Fab-Fragmente des anti-CLEC-2-Antikörpers INU1 in vivo eine pathologische Aktivierung von Thrombozyten auslösen, die zu einer fulminanten Sinusvenenthrombose mit schweren neurologischen Symptomen führt. Mit Hilfe dieses neuartigen Tiermodells wurde die zusammenwirkende Signalübertragung der beiden Thrombozytenrezeptoren CLEC-2 und GPIIb/IIIa als Hauptauslöser der Sinusvenenthrombose und damit potenzielles Ziel für eine Behandlung identifiziert. KW - Schlaganfall KW - Thrombozyt KW - Maus KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Sinusthrombose KW - thrombo-inflammation KW - ischemic stroke KW - blood brain barrier KW - CVT KW - platelets Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-286727 ER - TY - THES A1 - Brown, Helena Charlotte T1 - Investigating the role of the platelet receptor C-type lectin-like receptor 2 in models of thrombosis T1 - Untersuchungen zur Rolle des Thrombozytenrezeptors CLEC-2 (C- type lectin-like receptor 2) in Thrombosemodellen N2 - Platelets have a key physiological role in haemostasis however, inappropriate thrombus formation can lead to cardiovascular diseases such as myocardial infarction or stroke. Although, such diseases are common worldwide there are comparatively few anti-platelet drugs, and these are associated with an increased risk of bleeding. Platelets also have roles in thrombo-inflammation, immuno-thrombosis and cancer, in part via C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) and its ligand podoplanin. Although CLEC-2 contributes to these diseases in mice, as well as to thrombus stability, it is unclear whether CLEC-2 has similar roles in humans, particularly as human CLEC-2 (hCLEC-2) cannot be investigated experimentally in vivo. To investigate hCLEC-2 in vivo, we generated a humanised CLEC-2 mouse (hCLEC-2KI) model, as well as a novel monoclonal antibody, HEL1, that binds to a different site than an existing antibody, AYP1. Using these antibodies, we have provided proof of principle for the use of hCLEC-2KI mice to test potential therapeutics targeting hCLEC-2, and shown for the first time that hCLEC-2 can be immunodepleted, with little effect on haemostasis. However, our results have also suggested that there are species differences in the role of CLEC-2 in arterial thrombosis. We further confirmed this using human blood where blocking CLEC-2 ligand binding had no effect on thrombosis, whereas we confirmed a minor role for mouse CLEC-2 in thrombus stability. We also investigated the effect of blocking CLEC-2 signalling using the Bruton’s tyrosine kinase inhibitor PRN473 on CLEC-2 mediated immuno-thrombosis in a Salmonella typhimurium infection model. However, no effect on thrombosis was observed suggesting that CLEC-2 signalling is not involved. Overall, our results suggest that there may be differences in the role of human and mouse CLEC-2, at least in arterial thrombosis, which could limit the potential of CLEC-2 as an anti-thrombotic target. However, it appears that the interaction between CLEC-2 and podoplanin is conserved and therefore CLEC-2 could still be a therapeutic target in immuno-thrombosis, thrombo-inflammation and cancer. Furthermore, any potential human specific therapeutics could be investigated in vivo using hCLEC-2KI mice. N2 - Thrombozyten sind ein wichtiger Bestandteil der Hämostase, können allerdings durch die Bildung eines Blutgerinnsels auch kardiovaskuläre Krankheitsbilder wie Myokardinfarkte oder Schlaganfälle hervorrufen. Obwohl diese Erkrankungen weltweit zu den führenden Todesursachen zählen, gibt es vergleichsweise wenig Thrombozyteninhibitoren und die bislang verfügbaren Wirkstoffe gehen mit einem erhöhten Blutungsrisiko einher. Darüber hinaus spielen Thrombozyten auch bei thrombo-inflammatorischen oder malignen Erkrankungen eine Rolle und sind maßgeblich an Entzündungs-vermittelten Thrombosen (Immunothrombosen) beteiligt. Daten aus Mausmodellen legen nahe, dass die Interaktion zwischen dem Thrombozytenrezeptor CLEC-2 (C-type lectin-like receptor 2) und seinem Liganden Podoplanin von Bedeutung für diese Krankheitsbilder, und die Thrombusstabilität ist. Allerdings ist bislang unklar, ob CLEC-2 im Menschen eine ähnliche Rolle spielt, da die Rolle des menschlichen CLEC-2 (hCLEC-2) in diesen Prozessen bislang nicht experimentell in vivo erforscht werden kann. Um hCLEC-2 in vivo zu erforschen, haben wir Mäuse generiert, die humanes CLEC-2 exprimieren (hCLEC-2KI), sowie einen neuen, monoklonalen Antikörper (HEL1) entwickelt, der an eine andere Bindungsstelle als der zuvor generierter Antikörper (AYP1) bindet. Mit Hilfe dieser Antikörper haben wir erstmalig gezeigt, dass hCLEC-2KI Mäuse geeignet sind, um potenzielle Therapeutika zu testen, die auf hCLEC-2 abzielen. Des Weiteren konnten wir erstmalig zeigen, dass auch hCLEC-2 immunodepletiert werden kann und dass der Verlust des Rezeptors in zirkulierenden Thrombozyten die Hämostase nur minimal beeinträchtigt. Allerdings deuten unsere Ergebnisse auch darauf hin, dass es hinsichtlich der Bedeutung CLEC-2 für die arterielle Thrombose artspezifische Unterschiede gibt: Während Maus CLEC-2 zur Stabilität der Thromben beiträgt, hatte die Blockade der Ligandenbindungsstelle von hCLEC-2 keinen Einfluss auf Thrombose. Des Weiteren wurde mit Hilfe des Bruton’s tyrosine kinase Inhibitors PRN473 der Effekt einer Blockierung des CLEC-2 Signalwegs auf die durch CLEC-2 hervorgerufene Immuno-Thrombose in einem Salmonella typhimurium Infektionsmodel erforscht. Da jedoch keine Effekte nachgewiesen werde konnten, schlussfolgern wir, dass der CLEC-2 Signalweg nicht in diesen Prozess involviert ist. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass es Unterschiede in der Rolle von CLEC-2 zwischen Mensch und Maus gibt, zumindest im Kontext der arteriellen Thrombose, was das Potenzial von CLEC-2 als antithrombotisches Ziel einschränken könnte. Da allem Anschein nach die Interaktion zwischen CLEC-2 und Podoplanin konserviert ist, könnte CLEC-2 dennoch als Therapeutikum für Thrombo-Inflammation, Immunothrombose und Krebsbildungen genutzt werden. Des Weiteren könnten für den Menschen entwickelte Therapieansätze mit Hilfe von hCLEC-2KI Mäusen in vivo untersucht werden. KW - Thrombozyt KW - Thrombose KW - Platelet KW - Thrombosis KW - Rezeptor Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-293108 ER - TY - THES A1 - Zimmermann [née Papp], Lena T1 - Platelets as modulators of blood-brain barrier disruption and inflammation in the pathophysiology of ischemic stroke T1 - Thrombozyten als Modulatoren der Blut-Hirn-Schrankenstörung und Inflammation in der Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls N2 - Ischemia-reperfusion injury (I/R injury) is a common complication in ischemic stroke (IS) treatment, which is characterized by a paradoxical perpetuation of tissue damage despite the successful re-establishment of vascular perfusion. This phenomenon is known to be facilitated by the detrimental interplay of platelets and inflammatory cells at the vascular interface. However, the spatio-temporal and molecular mechanisms underlying these cellular interactions and their contribution to infarct progression are still incompletely understood. Therefore, this study intended to clarify the temporal mechanisms of infarct growth after cerebral vessel recanalization. The data presented here could show that infarct progression is driven by early blood-brain-barrier perturbation and is independent of secondary thrombus formation. Since previous studies unravelled the secretion of platelet granules as a molecular mechanism of how platelets contribute to I/R injury, special emphasis was placed on the role of platelet granule secretion in the process of barrier dysfunction. By combining an in vitro approach with a murine IS model, it could be shown that platelet α-granules exerted endothelial-damaging properties, whereas their absence (NBEAL2-deficiency) translated into improved microvascular integrity. Hence, targeting platelet α-granules might serve as a novel treatment option to reduce vascular integrity loss and diminish infarct growth despite recanalization. Recent evidence revealed that pathomechanisms underlying I/R injury are already instrumental during large vessel occlusion. This indicates that penumbral tissue loss under occlusion and I/R injury during reperfusion share an intertwined relationship. In accordance with this notion, human observational data disclosed the presence of a neutrophil dominated immune response and local platelet activation and secretion, by the detection of the main components of platelet α-granules, within the secluded vasculature of IS patients. These initial observations of immune cells and platelets could be further expanded within this thesis by flow cytometric analysis of local ischemic blood samples. Phenotyping of immune cells disclosed a yet unknown shift in the lymphocyte population towards CD4+ T cells and additionally corroborated the concept of an immediate intravascular immune response that is dominated by granulocytes. Furthermore, this thesis provides first-time evidence for the increased appearance of platelet-leukocyte-aggregates within the secluded human vasculature. Thus, interfering with immune cells and/or platelets already under occlusion might serve as a potential strategy to diminish infarct expansion and ameliorate clinical outcome after IS. N2 - Eine häufig auftretende Komplikation in der Behandlung des ischämischen Schlaganfalls ist der Ischämie/Reperfusion Schaden (I/R Schaden), welcher trotz der erfolgreichen Wiederherstellung der zerebralen Durchblutung durch ein paradoxes Fortschreiten des entstandenen Gewebeschadens charakterisiert ist. Dieses Phänomen wird durch das schädigende Zusammenspiel von Thrombozyten und inflammatorischen Zellen am vaskulären Endothel verursacht. Allerdings sind die räumlich-temporalen und molekularen Mechanismen dieser zellulären Interaktionen und deren Beteiligung am Infarktwachstum noch nicht vollständig verstanden. Daraus folgend, beabsichtigte diese Arbeit eben diese temporalen Mechanismen des fortschreitenden Infarktwachstums nach der zerebralen Gefäßwiedereröffnung aufzuklären. Die hier vorgestellten Daten implizieren, dass das anhaltende Fortschreiten des Gewebeschadens durch die Schädigung der Bluthirnschranke verursacht wird und somit unabhängig vom Auftreten sekundär gebildeter Thromben ist. In vorangegangenen Studien konnte die Freisetzung von thrombozytären Granula als molekularer Mechanismus, mit welchem Thrombozyten zum I/R Schaden beitragen, aufgedeckt werden. Basierend auf diesen Studien wurde in dieser Arbeit ein besonderes Augenmerk auf die Sekretion thrombozytärer Granula im Zusammenhang mit der Beeinträchtigung der endothelialen Barriere gelegt. Durch die Kombination eines in vitro Ansatzes mit einem murinen Model des ischämischen Schlaganfalls konnte gezeigt werden, dass α-Granula endothelialen Schaden verursachen, wohingegen deren Absenz (NBEAL2 Defizienz) zu einer verbesserten mikrovaskulären Integrität führte. Aufgrund dessen könnte das Adressieren der α-Granula als eine neuartige Therapieoption zum Erhalt der vaskulären Integrität und zur Verminderung des Infarktwachstums trotz Rekanalisation genutzt werden. Neuste Erkenntnisse enthüllten, dass die dem I/R Schaden zu Grunde liegenden Pathomechanismen bereits während des Verschlusses eines großen hirnversorgenden Gefäßes zu beobachten sind. Dies deutet darauf hin, dass der Verlust von penumbralem Gewebe unter Okklusion und I/R Schädigung während der Reperfusion im engen Zusammenhang stehen. Im Einklang hiermit konnten humane Daten eine Neutrophilen-dominierte Immunantwort und lokale Thrombozyten Aktivierung und deren Sekretion, anhand der Detektion der α-Granula Hauptkomponenten, im verschlossenen Gefäßsystem von ischämischen Schlaganfall Patienten nachweisen. Diese anfänglichen Beobachtungen konnten im Rahmen dieser Arbeit anhand durchflusszytometrischer Untersuchungen von lokal abgenommenen ischämischen Blutproben erweitert werden. Die Phänotypisierung von Immunzellen enthüllte eine bisher unbekannte Verschiebung der Lymphozyten Population hin zu CD4+ T-Zellen und bekräftigte zusätzlich das Konzept einer unmittelbaren intravaskulären Immunantwort, welche durch Granulozyten dominiert wird. Darüber hinaus konnte in dieser Thesis das erste Mal das erhöhte Auftreten von Thrombozyten-Leukozyten-Aggregaten in dem verschlossenen humanen Gefäßsystem nachgewiesen werden. Demzufolge könnte eine Beeinflussung von Immunzellen und/oder Thrombozyten bereits unter Okklusion als potentiell vielversprechende Strategie genutzt werden, um die Ausweitung des Infarktes einzuschränken und klinische Endpunkte nach einem ischämischen Schlaganfall zu verbessern. KW - Schlaganfall KW - Thrombozyt KW - Entzündung KW - Thrombo-inflammation KW - Ischemic stroke KW - Platelets KW - Inflamamtion KW - Immune cells KW - Vascular system Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-302850 ER - TY - THES A1 - Karwen, Till T1 - Platelets promote insulin secretion of pancreatic β-cells T1 - Thrombozyten fördern die Insulinsekretion von pankreatischen β-Zellen N2 - The pancreas is the key organ for the maintenance of euglycemia. This is regulated in particular by α-cell-derived glucagon and β-cell-derived insulin, which are released in response to nutrient deficiency and elevated glucose levels, respectively. Although glucose is the main regulator of insulin secretion, it is significantly enhanced by various potentiators. Platelets are anucleate cell fragments in the bloodstream that are essential for hemostasis to prevent and stop bleeding events. Besides their classical role, platelets were implemented to be crucial for other physiological and pathophysiological processes, such as cancer progression, immune defense, and angiogenesis. Platelets from diabetic patients often present increased reactivity and basal activation. Interestingly, platelets store and release several substances that have been reported to potentiate insulin secretion by β-cells. For these reasons, the impact of platelets on β-cell functioning was investigated in this thesis. Here it was shown that both glucose and a β-cell-derived substance/s promote platelet activation and binding to collagen. Additionally, platelet adhesion specifically to the microvasculature of pancreatic islets was revealed, supporting the hypothesis of their influence on glucose homeostasis. Genetic or pharmacological ablation of platelet functioning and platelet depletion consistently resulted in reduced insulin secretion and associated glucose intolerance. Further, the platelet-derived lipid fraction was found to enhance glucose-stimulated insulin secretion, with 20-hydroxyeicosatetraenoic acid (20-HETE) and possibly also lyso-precursor of platelet-activating factor (lysoPAF) being identified as crucial factors. However, the acute platelet-stimulated insulin secretion was found to decline with age, as did the levels of platelet-derived 20-HETE. In addition to their direct stimulatory effect on insulin secretion, specific defects in platelet activation have also been shown to affect glucose homeostasis by potentially influencing islet vascular development. Taking together, the results of this thesis suggest a direct and indirect mechanism of platelets in the regulation of insulin secretion that ensures glucose homeostasis, especially in young individuals. N2 - Der Pankreas ist das Schlüsselorgan für die Aufrechterhaltung der Glukosehomöostase. Diese wird insbesondere durch das von α-Zellen stammende Glukagon und von β-Zellen stammende Insulin reguliert, die als Reaktion auf Nährstoffmangel beziehungsweise erhöhte Glukosespiegel freigesetzt werden. Obwohl Glukose der Hauptregulator der Insulinsekretion ist, wird sie durch verschiedene Potentiatoren erheblich gesteigert. Thrombozyten sind kernlose Zellfragmente im Blutkreislauf, die für die Hämostase unerlässlich sind. Neben ihrer klassischen Funktion sind sie auch an anderen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt, etwa an der Tumorentwicklung, der Immunabwehr und der Angiogenese. Thrombozyten von Diabetikern weisen häufig eine erhöhte Reaktivität und basale Aktivierung auf. Außerdem speichern und sekretieren sie Substanzen, von denen bekannt ist, dass sie die Insulinsekretion durch β-Zellen verstärken. Aus diesen Gründen wurde in dieser Arbeit der Einfluss von Thrombozyten auf die Funktion von β-Zellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl Glukose als auch eine aus β-Zellen stammende Substanz/en die Thrombozytenaktivierung und die Bindung an Kollagen fördern. Darüber hinaus wurde eine spezifische Thrombozytenadhäsion an der Mikrovaskulatur der pankreatischen Inseln festgestellt, was die Hypothese ihres Einflusses auf die Glukosehomöostase unterstützt. Eine genetische oder pharmakologische Ablation der Thrombozytenfunktion sowie eine Depletion von Thrombozyten führten zu einer verminderten Insulinsekretion und einer damit verbundenen Glukoseintoleranz. Hierbei erwies sich die Lipidfraktion von Thrombozyten als essentieller Potentiator für die glukosestimulierte Insulinsekretion, wobei 20-Hydroxyeicosatetraensäure (20-HETE) und die Lyso-Vorstufe des Plättchen-Aktivierenden Faktors (LysoPAF) als entscheidende Faktoren identifiziert werden konnten. Weiterhin wurde festgestellt, dass sowohl der direkte stimulierende Effekt von Thrombozyten auf die Insulinsekretion, als auch deren 20-HETE Sekretion mit zunehmendem Alter abnimmt. Thrombozyten beeinflussten außerdem die Inselvaskularisierung, welche mutmaßlich zusätzlich zu Glukoseintoleranz führt. Insgesamt deuten die Ergebnisse dieser Arbeit auf einen direkten und indirekten Mechanismus der Thrombozyten bei der Regulierung der Insulinsekretion hin, der die Glukosehomöostase insbesondere bei jungen Menschen gewährleistet. KW - platelet KW - β cell KW - insulin KW - pancreas KW - diabetes KW - Thrombozyt KW - Insulinsekretion Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-313933 ER -