TY - THES A1 - Bakari Soale, Majeed T1 - Regulation of the Variant Surface Glycoprotein (VSG) Expression and Characterisation of the Nucleolar DExD/H box Protein Hel66 in \(Trypanosoma\) \(brucei\) T1 - Regulation der Expression des variable Oberflächen- Glykoprotein (VSG) und Charakterisierung des nukleolären DExD/H box Protein Hel66 in \(Trypanosoma\) \(brucei\) N2 - The variant surface glycoprotein (VSG) of African trypanosomes plays an essential role in protecting the parasites from host immune factors. These trypanosomes undergo antigenic variation resulting in the expression of a single VSG isoform out of a repertoire of around 2000 genes. The molecular mechanism central to the expression and regulation of the VSG is however not fully understood. Gene expression in trypanosomes is unusual due to the absence of typical RNA polymerase II promoters and the polycistronic transcription of genes. The regulation of gene expression is therefore mainly post-transcriptional. Regulatory sequences, mostly present in the 3´ UTRs, often serve as key elements in the modulation of the levels of individual mRNAs. In T. brucei VSG genes, a 100 % conserved 16mer motif within the 3´ UTR has been shown to modulate the stability of VSG transcripts and hence their expression. As a stability-associated sequence element, the absence of nucleotide substitutions in the motif is however unusual. It was therefore hypothesised that the motif is involved in other essential roles/processes besides stability of the VSG transcripts. In this study, it was demonstrated that the 100 % conservation of the 16mer motif is not essential for cell viability or for the maintenance of functional VSG protein levels. It was further shown that the intact motif in the active VSG 3´ UTR is neither required to promote VSG silencing during switching nor is it needed during differentiation from bloodstream forms to procyclic forms. Crosstalk between the VSG and procyclin genes during differentiation to the insect vector stage is also unaffected in cells with a mutated 16mer motif. Ectopic overexpression of a second VSG however requires the intact motif to trigger silencing and exchange of the active VSG, suggesting a role for the motif in transcriptional VSG switching. The 16mer motif therefore plays a dual role in VSG in situ switching and stability of VSG transcripts. The additional role of the 16mer in the essential process of antigenic variation appears to be the driving force for the 100 % conservation of this RNA motif. A screen aimed at identifying candidate RNA-binding proteins interacting with the 16mer motif, led to the identification of a DExD/H box protein, Hel66. Although the protein did not appear to have a direct link to the 16mer regulation of VSG expression, the DExD/H family of proteins are important players in the process of ribosome biogenesis. This process is relatively understudied in trypanosomes and so this candidate was singled out for detailed characterisation, given that the 16mer story had reached a natural end point. Ribosome biogenesis is a major cellular process in eukaryotes involving ribosomal RNA, ribosomal proteins and several non-ribosomal trans-acting protein factors. The DExD/H box proteins are the most important trans-acting protein factors involved in the biosynthesis of ribosomes. Several DExD/H box proteins have been directly implicated in this process in yeast. In trypanosomes, very few of this family of proteins have been characterised and therefore little is known about the specific roles they play in RNA metabolism. Here, it was shown that Hel66 is involved in rRNA processing during ribosome biogenesis. Hel66 localises to the nucleolus and depleting the protein led to a severe growth defect. Loss of the protein also resulted in a reduced rate of global translation and accumulation of rRNA processing intermediates of both the small and large ribosomal subunits. Hel66 is therefore an essential nucleolar DExD/H protein involved in rRNA processing during ribosome biogenesis. As very few protein factors involved in the processing of rRNAs have been described in trypanosomes, this finding represents an important platform for future investigation of this topic. N2 - Das variable Oberflächen-Glykoprotein (“varaint surface glycoprotein“, VSG) der Afrikanischen Trypanosomen schützt den Parasiten vor Immunfaktoren des Wirtes. Trypanosomen beherrschen die antigene Variation und expremieren nur eine einzige VSG Isoform aus einem Repertoire von ungefähr 2000 Genen. Der molekulare Mechanismus der die Expression dieser VSG Gene reguliert ist nicht komplett bekannt. Die Genexpression ist in Trypanosomen sehr ungewöhnlich. Es gibt keine typischen Promotoren für RNA Polymerase II und Gene werden polycistronisch transkribiert. Daher ist die Regulation der Genexpression hauptsächlich posttranskriptional. Die Expression individueller mRNAs wird durch regulatorische Sequenzen reguliert, die sich häufig in den 3´ UTRs befinden. In den VSG Genen von T. brucei moduliert ein zu 100% konserviertes 16mer Motiv in der 3´ UTR die Stabilität der VSG Transkripte und damit deren Expression. Für eine Sequenz, die die Stabilität der mRNA reguliert, ist das Fehlen von Nukleotid Substitutionen sehr ungewöhnlich. Es wurde deshalb spekuliert, dass das 16mer Motiv neben der Stabilisierung des VSG Transkriptes noch an anderen essentiellen Prozessen beteiligt ist. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die 100%ige Konservierung des 16mer Motives weder für das Überleben der Zellen, noch für den Erhalt der Expression des VSG Protein in funktioneller Menge notwendig ist. Außerdem wurde gezeigt dass das intakte Motiv in der 3´UTR des aktiven VSGs weder für das „VSG silencing“ während des VSG Austausches („switching“) noch für die Differenzierung von Blutbahnformen zu prozyklischen Formen benötigt wird. Auch die Interaktionen („crosstalk“), die während der Differenzierung zum Insekten Stadium zwischen den VSG und Prozyklin Genen stattfinden, sind in Zellen mit mutiertem 16mer Motiv noch funktionell. Die ektopische Überexpression eines zweiten VSGs benötigt allerdings das intakte Motiv, um das aktive VSG zu inaktivieren und auszutauschen: dies suggeriert eine Rolle des Motivs im transkriptionalen „VSG switching“. Das 16mer Motif spielt daher eine Doppelrolle bei der Regulation der Stabilität der VSG Transkripte und im VSG in situ „switching“. Letzteres, die Rolle im essentiellen Prozess der antigenen Variation, ist dabei offensichtlich die treibende Kraft hinter der 100%igen Konservierung des RNA Motives. Eine Suche nach möglichen RNA bindenden Proteinen, die mit dem 16mer interagieren, führte zur Identifikation des DExD/H box Proteins Hel66. Obwohl das Protein wohl nicht direkt an der Regulation der VSG Expression über das 16mer beteiligt ist, spielen Mitglieder der DexD/H Proteinfamilie eine wichtige Rolle in der Biogenese von Ribosomen. Dieser Prozess ist in Trypanosomen noch nicht komplett verstanden und daher wurde das Protein für eine nähere Analyse ausgewählt, auch weil die 16mer Story ohne weitere Kandidaten zu einem Ende gekommen war. Die Biogenese von Ribosomen ist ein wichtiger zellulärer Prozess in Eukaryoten und benötigt ribosomale RNA, ribosomale Proteine sowie einige nicht-ribosomale, trans-agierende Protein Faktoren. Proteine der DExD/H box Familie sind die wichtigsten trans- agierenden Proteinfaktoren, die an der Biogenese der Ribosomen beteiligt sind. In der Hefe sind mehrere DExD/H box Proteine bekannt, die eine direkte Rolle in diesem Prozess spielen. In Trypanosomen sind erst sehr wenige Proteine aus dieser Familie untersucht worden und es ist daher kaum bekannt, welche spezifische Rollen sie im RNA Metabolismus spielen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Hel66 an der rRNA Prozessierung während der Biogenese der Ribosomen beteiligt ist. Hel66 ist im Nukleolus lokalisiert und die Reduktion des Proteins durch RNAi führte zu einem schweren Wachstumsphänotyp. Reduktion von Hel66 führte auch zu einer globalen Reduktion der Translation sowie zur Akkumulation von Synthese- Zwischenstadien der rRNAs sowohl der kleinen und als auch der großen ribosomalen Untereinheit. Hel66 ist daher ein essentielles nukleoläres DExD/H Protein dass an der Prozessierung der rRNA während der Biogenese der Ribosomen beteiligt ist. Da bisher erst wenige Proteine bekannt sind, die in Trypanosomen an diesem Prozess beteiligt sind, sind diese Ergebnisse ein sehr wichtiger Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen in der Zukunft. KW - Trypanosoma brucei KW - Genexpression KW - Variant Surface Glycoprotein KW - VSG KW - DExD/H box protein KW - Ribosome biogenesis KW - rRNA processing KW - Ribosome Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-258090 ER - TY - THES A1 - Maier [verh. Hartmann], Carina Ramona T1 - Regulation of the Mevalonate Pathway by the Deubiquitinase USP28 in Squamous Cancer T1 - Regulation des Mevalonat Stoffwechselwegs durch die Deubiquitinase USP28 in Plattenepithelkarzinomen N2 - The reprogramming of metabolic pathways is a hallmark of cancer: Tumour cells are dependent on the supply with metabolites and building blocks to fulfil their increased need as highly proliferating cells. Especially de novo synthesis pathways are upregulated when the cells of the growing tumours are not able to satisfy the required metabolic levels by uptake from the environment. De novo synthesis pathways are often under the control of master transcription factors which regulate the gene expression of enzymes involved in the synthesis process. The master regulators for de novo fatty acid synthesis and cholesterogenesis are sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs). While SREBP1 preferably controls the expression of enzymes involved in fatty acid synthesis, SREBP2 regulates the transcription of the enzymes of the mevalonate pathway and downstream processes namely cholesterol, isoprenoids and building blocks for ubiquinone synthesis. SREBP activity is tightly regulated at different levels: The post-translational modification by ubiquitination decreases the stability of active SREBPs. The attachment of K48-linked ubiquitin chains marks the transcription factors for the proteasomal degradation. In tumour cells, high levels of active SREBPs are essential for the upregulation of the respective metabolic pathways. The increased stability and activity of SREBPs were investigated in this thesis. SREBPs are ubiquitinated by the E3 ligase Fbw7 which leads to the subsequential proteolysis of the transcription factors. The work conducted in this thesis identified the counteracting deubiquitination enzyme USP28 which removes the ubiquitin chains from SREBPs and prevents their proteasomal degradation. It further revealed that the stabilization of SREBP2 by USP28 plays an important role in the context of squamous cancers. Increased USP28 levels are associated with a poor survival in patients with squamous tumour subtypes. It was shown that reduced USP28 levels in cell lines and in vivo result in a decrease of SREBP2 activity and downregulation of the mevalonate pathway. This manipulation led to reduced proliferation and tumour growth. A direct comparison of adenocarcinomas and squamous cell carcinomas in lung cancer patients revealed an upregulation of USP28 as well as SREBP2 and its target genes. Targeting the USP28-SREBP2 regulatory axis in squamous cell lines by inhibitors also reduced cell viability and proliferation. In conclusion, this study reports evidence for the importance of the mevalonate pathway regulated by the USP28-SREBP2 axis in tumour initiation and progression of squamous cancer. The combinatorial inhibitor treatment of USP28 and HMGCR, the rate limiting enzyme of the mevalonate pathway, by statins opens the possibility for a targeted therapeutic treatment of squamous cancer patients. N2 - Die Reprogrammierung metabolischer Stoffwechselwege ist ein Kennzeichen von Krebs: Tumorzellen sind abhängig von der Versorgung mit Metaboliten und Bausteinen, um ihren wachsenden Bedarf als hoch proliferierende Zellen zu decken. Vor allem die de novo Stoffwechselsynthesewege sich hochreguliert, wenn die Zellen des wachsenden Tumors nicht mehr in der Lage sind, ihr erforderliches metabolisches Niveau mithilfe der Aufnahme aus der Umgebung zu erfüllen. De novo Synthesewege sind oft unter der Kontrolle von zentralen Transkriptionsfaktoren die die Genexpression von Enzymen, die im Syntheseprozess beteiligt sind, regulieren. Die vorherrschenden Regulatoren, für die de novo Fettsäuresynthese und der Cholesterogenese sind die Steroid-regulatorisches-Element-bindende Proteine (SREBPs). Während SREBP1 bevorzugt die Expression von Enzymen die an der Fettsäuresynthese beteiligt sind kontrolliert, reguliert SREBP2 die Transkription von Enzymen des Mevalonat Stoffwechselwegs, sowie Prozesse unterhalb, namentlich die Cholesterol-, Isoprenoid- und die die Synthese von Bausteinen für die Ubiquinonsynthese. Die Aktivität von SREBP ist streng reguliert auf verschiedenen Ebenen: Die post-translationale Modifikation mittels Ubiquitinierung reduziert die Stabilität von aktiven SREBPs. Das Anhängen von K48-verlinkten Ubiquitinketten markiert die Transkriptionsfaktoren für den proteasomalen Abbau. In Tumorzellen sind hohe Niveaus von aktiven SREBPs essentiell für die Induktion der entsprechenden metabolischen Stoffwechselwege. Die erhöhte Stabilität und Aktivität von SREBPs wurden im Rahmen dieser Arbeit untersucht. SREBPs werden von der E3-Ligase Fbw7 ubiquitiniert, was zur Proteolyse der Transkriptionsfaktoren führt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass das entgegenwirkende Deubiquitinierungsenzym USP28 die Ubiquitinketten von SREBPs entfernt und deren proteasomalen Abbau verhindert. Diese Forschungsarbeit zeigt weiterhin, dass die Stabilisierung von SREBP2 durch USP28 eine wichtige Rolle im Kontext von Epithelkarzinomen spielt. Erhöhte USP28 Niveaus werden mit einem schlechten Überleben von Patienten in der Krebs-Untergruppe der Plattenepithelkarzinomen verbunden. Es konnte gezeigt werden, dass reduzierte USP28 Niveaus, in Zelllinien und in vivo, niedrigere SREBP2-Aktivität und eine Herunterregulierung des Mevalonat Stoffwechselwegs ergeben. Diese Manipulation führte zu reduzierter Proliferation und Tumorwachstum. Ein direkter Vergleich von Adenokarzinomen und Plattenepithelkarzinomen in Lungenkrebspatienten zeigte zudem eine Hochregulierung von USP28 ebenso wie SREBP2 und dessen Zielgenen. Der gezielte Einsatz von Inhibitoren gegen die USP28-SREBP2 regulatorische Achse in Plattenepithelzellen reduzierte die Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen. Abschließend berichtet diese Forschungsarbeit von der Bedeutung des durch die USP28-SREBP2 Achse regulierten Mevalonat Stoffwechselwegs bei der Tumorinitiation und dem Fortschreiten von Plattenepithelkarzinomen. Die kombinatorische Behandlung mit USP28- und Inhibitoren der HMGCR, dem Schlüsselenzym des Mevalonat Stoffwechselwegs, mithilfe von Statinen eröffnet die Möglichkeit für eine gezielte therapeutische Behandlung von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen. KW - Ubiquitin KW - Metabolismus KW - Deubiquitination KW - Mevalonate Pathway KW - Cancer Metabolism KW - Lung squamous cancer cells Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-348740 ER - TY - JOUR A1 - Breyer, Maximilian A1 - Grüner, Julia A1 - Klein, Alexandra A1 - Finke, Laura A1 - Klug, Katharina A1 - Sauer, Markus A1 - Üçeyler, Nurcan T1 - \(In\) \(vitro\) characterization of cells derived from a patient with the GLA variant c.376A>G (p.S126G) highlights a non-pathogenic role in Fabry disease JF - Molecular Genetics and Metabolism Reports N2 - Highlights • The GLA variant S126G is not associated with Fabry symptoms in the presented case • S126G has no effect on α-GAL A activity or Gb3 levels in this patient • S126G sensory neurons show no electrophysiological abnormalities Abstract Fabry disease (FD) is a life-limiting disorder characterized by intracellular globotriaosylceramide (Gb3) accumulations. The underlying α-galactosidase A (α-GAL A) deficiency is caused by variants in the gene GLA. Variants of unknown significance (VUS) are frequently found in GLA and challenge clinical management. Here, we investigated a 49-year old man with cryptogenic lacunar cerebral stroke and the chance finding of the VUS S126G, who was sent to our center for diagnosis and initiation of a costly and life-long FD-specific treatment. We combined clinical examination with in vitro investigations of dermal fibroblasts (HDF), induced pluripotent stem cells (iPSC), and iPSC-derived sensory neurons. We analyzed α-GAL A activity in iPSC, Gb3 accumulation in all three cell types, and action potential firing in sensory neurons. Neurological examination and small nerve fiber assessment was normal except for reduced distal skin innervation. S126G iPSC showed normal α-GAL A activity compared to controls and no Gb3 deposits were found in all three cell types. Baseline electrophysiological characteristics of S126G neurons showed no difference compared to healthy controls as investigated by patch-clamp recordings. We pioneer multi-level cellular characterization of the VUS S126G using three cell types derived from a patient and provide further evidence for the benign nature of S126G in GLA, which is of great importance in the management of such cases in clinical practice. KW - Fabry disease KW - variants of unknown significance KW - C.376A>G (p.S126G) KW - globotriaosylceramide KW - induced pluripotent stem cells KW - sensory neurons KW - disease model KW - α-Galactosidase A Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-350295 SN - 22144269 VL - 38 ER - TY - INPR A1 - Odenwald, Johanna A1 - Gabiatti, Bernardo A1 - Braune, Silke A1 - Shen, Siqi A1 - Zoltner, Martin A1 - Kramer, Susanne T1 - Beyond BioID: Streptavidin outcompetes antibody fluorescence signals in protein localization and readily visualises targets evading immunofluorescence detection T2 - eLife N2 - Immunofluorescence is a common method to localise proteins within their cellular context via fluorophore labelled antibodies and for some applications without alternative. However, some protein targets evade detection due to low protein abundance or accessibility issues. In addition, some imaging methods require a massive reduction in antigen density thus impeding detection of even medium-abundant proteins.Here, we show that the fusion of the target protein to TurboID, a biotin ligase labelling lysine residues in close proximity, and subsequent detection of biotinylation by fluorescent streptavidin offers an “all in one” solution to the above-mentioned restrictions. For a wide range of target proteins tested, the streptavidin signal was significantly stronger than an antibody signal, markedly improving the imaging sensitivity in expansion microscopy and correlative light and electron microscopy, with no loss in resolution. Importantly, proteins within phase-separated regions, such as the central channel of the nuclear pores, the nucleolus or RNA granules, were readily detected with streptavidin, while most antibodies fail to label proteins in these environments. When TurboID is used in tandem with an HA epitope tag, co-probing with streptavidin and anti-HA can be used to map antibody-accessibility to certain cellular regions. As a proof of principle, we mapped antibody access to all trypanosome nuclear pore proteins (NUPs) and found restricted antibody labelling of all FG NUPs of the central channel that are known to be phase-separated, while most non-FG Nups could be labelled. Lastly, we show that streptavidin imaging can resolve dynamic, temporally and spatially distinct sub-complexes and, in specific cases, reveal a history of dynamic protein interaction.In conclusion, streptavidin imaging has major advantages for the detection of lowly abundant or inaccessible proteins and in addition, can provide information on protein interactions and biophysical environment. KW - BioID KW - Streptavidin KW - antibody fluorescence signals KW - protein localization KW - immunofluorescence detection Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-360704 ER - TY - JOUR A1 - Meinert, Madlen A1 - Jessen, Christina A1 - Hufnagel, Anita A1 - Kreß, Julia Katharina Charlotte A1 - Burnworth, Mychal A1 - Däubler, Theo A1 - Gallasch, Till A1 - Da Xavier Silva, Thamara Nishida A1 - Dos Santos, Ancély Ferreira A1 - Ade, Carsten Patrick A1 - Schmitz, Werner A1 - Kneitz, Susanne A1 - Friedmann Angeli, José Pedro A1 - Meierjohann, Svenja T1 - Thiol starvation triggers melanoma state switching in an ATF4 and NRF2-dependent manner JF - Redox Biology N2 - The cystine/glutamate antiporter xCT is an important source of cysteine for cancer cells. Once taken up, cystine is reduced to cysteine and serves as a building block for the synthesis of glutathione, which efficiently protects cells from oxidative damage and prevents ferroptosis. As melanomas are particularly exposed to several sources of oxidative stress, we investigated the biological role of cysteine and glutathione supply by xCT in melanoma. xCT activity was abolished by genetic depletion in the Tyr::CreER; Braf\(^{CA}\); Pten\(^{lox/+}\) melanoma model and by acute cystine withdrawal in melanoma cell lines. Both interventions profoundly impacted melanoma glutathione levels, but they were surprisingly well tolerated by murine melanomas in vivo and by most human melanoma cell lines in vitro. RNA sequencing of human melanoma cells revealed a strong adaptive upregulation of NRF2 and ATF4 pathways, which orchestrated the compensatory upregulation of genes involved in antioxidant defence and de novo cysteine biosynthesis. In addition, the joint activation of ATF4 and NRF2 triggered a phenotypic switch characterized by a reduction of differentiation genes and induction of pro-invasive features, which was also observed after erastin treatment or the inhibition of glutathione synthesis. NRF2 alone was capable of inducing the phenotypic switch in a transient manner. Together, our data show that cystine or glutathione levels regulate the phenotypic plasticity of melanoma cells by elevating ATF4 and NRF2. KW - thiol starvation KW - ATF4 KW - NRF2 KW - melanoma Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-350328 VL - 70 ER - TY - THES A1 - Dehmer, Markus T1 - A novel USP11-TCEAL1-mediated mechanism protects transcriptional elongation by RNA Polymerase II T1 - Ein neuer USP11-TCEAL1 vermittelter Mechanismus schützt die transkriptionelle Elongation der RNA Polymerase II N2 - Deregulated expression of MYC oncoproteins is a driving event in many human cancers. Therefore, understanding and targeting MYC protein-driven mechanisms in tumor biology remain a major challenge. Oncogenic transcription in MYCN-amplified neuroblastoma leads to the formation of the MYCN-BRCA1-USP11 complex that terminates transcription by evicting stalling RNAPII from chromatin. This reduces cellular stress and allows reinitiation of new rounds of transcription. Basically, tumors with amplified MYC genes have a high demand on well orchestration of transcriptional processes-dependent and independent from MYC proteins functions in gene regulation. To date, the cooperation between promoter-proximal termination and transcriptional elongation in cancer cells remains still incomplete in its understanding. In this study the putative role of the dubiquitinase Ubiquitin Specific Protease 11 (USP11) in transcription regulation was further investigated. First, several USP11 interaction partners involved in transcriptional regulation in neuroblastoma cancer cells were identified. In particular, the transcription elongation factor A like 1 (TCEAL1) protein, which assists USP11 to engage protein-protein interactions in a MYCN-dependent manner, was characterized. The data clearly show that TCEAL1 acts as a pro-transcriptional factor for RNA polymerase II (RNAPII)-medi- ated transcription. In detail, TCEAL1 controls the transcription factor S-II (TFIIS), a factor that assists RNAPII to escape from paused sites. The findings claim that TCEAL1 outcompetes the transcription elongation factor TFIIS in a non-catalytic manner on chromatin of highly expressed genes. This is reasoned by the need regulating TFIIS function in transcription. TCEAL1 equili- brates excessive backtracking and premature termination of transcription caused by TFIIS. Collectively, the work shed light on the stoichiometric control of TFIIS demand in transcriptional regulation via the USP11-TCEAL1-USP7 complex. This complex protects RNAPII from TFIIS-mediated termination helping to regulate productive transcription of highly active genes in neuroblastoma. N2 - Die deregulierte Expression von MYC Onkoproteinen ist ein zentrales Event in vielen huma-nen Krebsarten. Aus diesem Grund sind das Verständnis und die gezielte Bekämpfung MYC-getriebener Mechanismen in der Tumorbiologie nach wie vor eine große Herausforderung. In MYCN-amplifizierten Neuroblastomen führt eine übermäßig hohe Transkriptionsrate zur stress-bedingten Rekrutierung des MYCN-BRCA1-USP11-Komplexes. Dieser Komplex be-endet vorzeitig die Transkription, indem er RNAPII Moleküle vom Chromatin wirft. Durch diesen Mechanismus wird zellulärer Stress reduziert und ermöglicht dadurch einen erneuten Start der Transkription. Grundsätzlich stellen Tumoren mit einer Amplifikation von einem der MYC Proteine hohe Anforderungen an eine feine Abstimmung der einzelnen Schritte in der Transkription. Dies ist sowohl abhängig als auch unabhängig von den bereits beschriebe-nen Funktionen der MYC-Proteine in der Genregulation. Bis heute ist das Zusammenspiel zwischen promoter-proximaler Termination und transkriptioneller Elongation noch nicht vollständig aufgeklärt. In dieser Studie wurde eine potenzielle Rolle von USP11 in der Regulation der Transkription weitergehend untersucht. Zunächst wurden mehrere Interaktionspartner von USP11, die an der Regulation der Transkription in Neuroblastom Krebszellen beteiligt sind, identifiziert. Es wurde insbesondere das Transcription Elongation Factor A Like 1 (TCEAL1) Protein charak-terisiert. Dieses Protein unterstützt USP11 dabei, Protein-Protein-Interaktionen MYCN-vermittelt einzugehen. Die Daten zeigen, dass TCEAL1 als pro-transkriptioneller Faktor für die RNA-Polymerase II (RNAPII) -vermittelte Transkription fungiert. Genauer, TCEAL1 kontrolliert den Transkriptionsfaktor S-II (TFIIS), einen Faktor, der der RNAPII dabei hilft, die Transkription nach einem kurzen Pausieren („pausing“) fortzusetzen. Die Ergebnisse zei-gen, dass TCEAL1 den Elongationsfaktor TFIIS auf nicht-katalytische Weise von dem Chromatin von hochexprimierten Genen verdrängt. Dies ist darin begründet, dass die Funkti-on von TFIIS bei der Transkription reguliert werden muss. TCEAL1 gleicht übermäßiges Zurückwandern der RNAPII und die vorzeitige Beendigung der Transkription, das durch TFIIS vermittelt wird, aus. Diese Arbeit gibt Aufschluss über die stöchiometrische Kontrolle des TFIIS-Bedarfs bei der Transkriptionsregulation durch den USP11-TCEAL1-USP7-Komplex. Dieser Komplex schützt die RNAPII vor der TFIIS-vermittelter Termination der Transkription und trägt zur Regulierung einer produktiven Transkription hochaktiver Gene im Neuroblastom bei. KW - Transkription KW - N-Myc KW - Transcription Regulation KW - Pause Release KW - Ubiquitin Specific Protease 11 KW - transcription elongation factor A (SII)-like 1 (TCEAL1) KW - RNA Polymerase II (RNAPII) KW - Transcriptional Stress Response Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-360544 ER - TY - THES A1 - Schwebs, Marie T1 - Structure and dynamics of the plasma membrane: a single-molecule study in \(Trypanosoma\) \(brucei\) T1 - Die Struktur und Dynamik der Plasmamembran: eine Einzelmolekülstudie in \(Trypanosoma\) \(brucei\) N2 - The unicellular, flagellated parasite Trypanosoma brucei is the causative agent of human African sleeping sickness and nagana in livestock. In the last decades, it has become an established eukaryotic model organism in the field of biology, as well as in the interdisciplinary field of biophysics. For instance, the dense variant surface glycoprotein (VSG) coat offers the possibility to study the dynamics of GPI-anchored proteins in the plasma membrane of living cells. The fluidity of the VSG coat is not only an interesting object of study for its own sake, but is critically important for the survival of the parasite in the mammalian host. In order to maintain the integrity of the coat, the entire VSG coat is recycled within a few minutes. This is surprisingly fast for a purely diffusive process with the flagellar pocket (FP) as the sole site for endo- and exocytosis. Previous studies characterising VSG dynamics using FRAP reported diffusion coefficients that were not sufficient to to enable fast turnover based on passive VSG randomisation on the trypanosome surface. In this thesis, live-cell single-molecule fluorescence microscopy (SMFM) was employed to elucidate whether VSG diffusion coefficients were priorly underestimated or whether directed forces could be involved to bias VSGs towards the entrance of the FP. Embedding the highly motile trypanosomes in thermo-stable hydrogels facilitated the investigation of VSG dynamics on living trypanosomes at the mammalian host's temperature of 37°C. To allow for a spatial correlation of the VSG dynamics to the FP entrance, a cell line was employed harbouring a fluorescently labelled structure as a reference. Sequential two-colour SMFM was then established to allow for recording and registration of the dynamic and static single-molecule information. In order to characterise VSG dynamics, an algorithm to obtain reliable information from short trajectories was adapted (shortTrAn). It allowed for the quantification of the local dynamics in two distinct scenarios: diffusion and directed motion. The adaptation of the algorithm to the VSG data sets required the introduction of an additional projection filter. The algorithm was further extended to take into account the localisation errors inherent to single-particle tracking. The results of the quantification of diffusion and directed motion were presented in maps of the trypanosome surface, including an outline generated from a super-resolved static structure as a reference. Information on diffusion was displayed in one map, an ellipse plot. The colour code represented the local diffusion coefficient, while the shape of the ellipses provided an indication of the diffusion behaviour (aniso- or isotropic diffusion). The eccentricity of the ellipses was used to quantify deviations from isotropic diffusion. Information on directed motion was shown in three maps: A velocity map, representing the amplitude of the local velocities in a colour code. A quiver plot, illustrating the orientation of directed motion, and a third map which indicated the relative standard error of the local velocities colour-coded. Finally, a guideline based on random walk simulations was used to identify which of the two motion scenarios dominated locally. Application of the guideline to the VSG dynamics analysed by shortTrAn yielded supermaps that showed the locally dominant motion mode colour-coded. I found that VSG dynamics are dominated by diffusion, but several times faster than previously determined. The diffusion behaviour was additionally characterised by spatial heterogeneity. Moreover, isolated regions exhibiting the characteristics of round and elongated traps were observed on the cell surface. Additionally, VSG dynamics were studied with respect to the entrance of the FP. VSG dynamics in this region displayed similar characteristics compared to the remainder of the cell surface and forces biasing VSGs into the FP were not found. Furthermore, I investigated a potential interference of the attachment of the cytoskeleton to the plasma membrane with the dynamics of VSGs which are anchored to the outer leaflet of the membrane. Preliminary experiments were conducted on osmotically swollen trypanosomes and trypanosomes depleted for a microtubule-associated protein anchoring the subpellicular microtubule cytoskeleton to the plasma membrane. The measurements revealed a trend that detachment of the cytoskeleton could be associated with a reduction in the VSG diffusion coefficient and a loss of elongated traps. The latter could be an indication that these isolated regions were caused by underlying structures associated with the cytoskeleton. The measurements on cells with an intact cytoskeleton were complemented by random walk simulations of VSG dynamics with the newly determined diffusion coefficient on long time scales not accessible in experiments. Simulations showed that passive VSG randomisation is fast enough to allow for a turnover of the full VSG coat within a few minutes. According to an estimate based on the known rate of endocytosis and the newly determined VSG diffusion coefficient, the majority of exocytosed VSGs could escape from the FP to the cell surface without being immediately re-endocytosed. N2 - Der einzellige, begeißelte Parasit Trypanosoma brucei ist der Erreger der humanen Afrikanischen Schlafkrankheit und Nagana bei Nutztieren. In den vergangenen Jahrzehnten hat er sich sowohl in der Biologie als auch im interdisziplinären Bereich der Biophysik als eukaryotischer Modellorganismus etabliert. So bietet der dichte variant surface glycoprotein (VSG) Mantel beispielsweise die Möglichkeit, die Dynamik von GPI-verankerten Proteinen in der Plasmamembran von lebenden Zellen zu untersuchen. Die Fluidität des VSG-Mantels ist nicht nur um ihrer selbst Willen ein interessantes Studienobjekt, sondern auch von entscheidender Bedeutung für das Überleben des Parasiten im Säugetierwirt. Damit die Integrität des Mantels erhalten bleibt, wird der gesamte VSG Mantel kontinuierlich innerhalb weniger Minuten ausgetauscht. Dies ist erstaunlich schnell für einen rein diffusiven Prozess, bei welchem die Geißeltasche (GT) der einzige Ort für Endo- und Exozytose ist. Bisherige Studien zur Charakterisierung der VSG Dynamik mit FRAP ermittelten Diffusionskoeffizienten, welche nicht ausreichten, um einen schnellen Austausch durch eine passive Randomisierung der VSG auf der Trypanosomenoberfläche zu ermöglichen. In dieser Arbeit wurde die Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie (EMFM) an lebenden Zellen eingesetzt, um herauszufinden, ob die VSG Diffusionskoeffizienten zuvor unterschätzt wurden oder ob gerichtete Kräfte beteiligt sein könnten, um VSGs zum Eingang der GT zu leiten. Die Einbettung der hochmotilen Trypanosomen in thermostabilen Hydrogelen erlaubte die Analyse der VSG Dynamik auf lebenden Trypanosomen bei einer Temperatur des Säugetierwirts von 37°C. Um eine räumliche Korrelation der VSG Dynamik mit dem Eingang zur GT zu ermöglichen, wurde eine Zelllinie verwendet, die eine fluoreszenzmarkierte Struktur als Referenz besaß. Anschließend wurde die sequenzielle EMFM in zwei Farben etabliert, um sowohl die Aufzeichnung als auch die Registrierung der dynamischen und statischen Einzelmolekülinformationen zu gewährleisten. Um die VSG Dynamik zu charakterisieren, wurde ein Algorithmus zur Gewinnung von zuverlässigen Informationen aus kurzen Trajektorien adaptiert (shortTrAn). Dieser ließ die Quantifizierung der lokalen Dynamik anhand zweier unterschiedlicher Szenarien zu: Diffusion und gerichtete Bewegung. Die Anpassung des Algorithmus an die VSG Datensätze erforderte die Einführung eines zusätzlichen Projektionsfilters. Darüber hinaus wurde der Algorithmus erweitert, um die Lokalisierungsfehler zu berücksichtigen, die bei der Verfolgung von Einzelpartikeln unvermeidbar auftreten. Anschließend wurden die Ergebnisse der Quantifizierung von Diffusion und gerichteter Bewegung in Karten präsentiert, die die Trypanosomenoberfläche abbildeten, einschließlich eines Umrisses, der als Referenz aus einer hochaufgelösten statischen Struktur generiert wurde. Die Informationen zur Diffusion wurden in einer Karte, einem Ellipsenplot, dargestellt. Dabei repräsentierte eine Farbkodierung die lokalen Diffusionskoeffizienten, während die Form der Ellipsen einen Hinweis auf das Diffusionsverhalten (aniso- oder isotrope Diffusion) gab. Die Exzentrizität der Ellipsen wurde hierbei genutzt, um die Abweichung von isotroper Diffusion zu quantifizieren. Die Informationen zur gerichteten Bewegung wurden in drei Karten wiedergegeben: Eine Karte für die Geschwindigkeit zeigte die Amplitude der lokalen Geschwindigkeiten farbkodiert. Ein Köcherplot veranschaulichte die Richtung der Geschwindigkeit und eine dritte Karte zeigte den relativen Standardfehler der lokalen Geschwindigkeiten farblich kodiert an. Abschließend wurde ein auf Random-Walk-Simulationen basierender Leitfaden herangezogen, um zu entscheiden, welches der beiden Szenarien lokal dominierte. Die Anwendung des Leitfadens auf die mit shortTrAn analysierte VSG Dynamik ergab Übersichtskarten, in denen der lokal dominierende Bewegungsmodus farblich kodiert war. Ich konnte zeigen, dass die VSG Dynamik von der Diffusion dominiert wird. Jedoch war diese um ein Vielfaches schneller als bisher angenommen. Das Diffusionsverhalten war zudem durch eine räumliche Heterogenität charakterisiert. Des Weiteren wurden auf der Zelloberfläche isolierte Regionen beobachtet, die die Eigenschaften von runden und länglichen Fallen aufwiesen. Zusätzlich wurde die VSG Dynamik in Bezug auf den Eingang der GT untersucht. Die VSG Dynamik in dieser Region wies ähnliche Kennwerte auf wie die restliche Zelloberfläche, und es konnten keine Kräfte festgestellt werden, welche die VSGs in die GT dirigieren. Des Weiteren habe ich den potenziellen Einfluss der Verankerung des Zytoskeletts an der Plasmamembran auf die Dynamik der VSGs untersucht, die in der äußeren Membranschicht verankert sind. Hierzu wurden vorläufige Experimente auf osmotisch geschwollenen Trypanosomen und Trypanosomen durchgeführt, denen ein Mikrotubuli assoziiertes Protein fehlte, welches das subpellikuläre Mikrotubuli-Zytoskelett an der Plasmamembran verankert. Bei den Messungen wurde ein Trend festgestellt, wonach die Ablösung des Zytoskeletts mit einer Verringerung des VSG Diffusionskoeffizienten und dem Verlust der länglichen Fallen korrelieren könnte. Letzteres könnte ein Hinweis darauf sein, dass diese isolierten Regionen durch darunter liegende, mit dem Zytoskelett verbundene Strukturen verursacht wurden. Die Messungen auf Zellen mit intaktem Zytoskelett wurden durch Random-Walk-Simulationen von VSG Trajektorien mit dem neu ermittelten Diffusionskoeffizienten auf langen, experimentell nicht zugänglichen Zeitskalen ergänzt. Die Simulationen zeigten, dass die passive Randomisierung der VSGs schnell genug ist, um einen Austausch des gesamten VSG Mantels innerhalb weniger Minuten zu ermöglichen. Einer Schätzung zufolge, die auf der bekannten Endozytoserate und dem neu ermittelten VSG Diffusionskoeffizienten basierte, könnte der Großteil der exozytierten VSGs aus der GT zur Zelloberfläche gelangen, ohne unmittelbar wieder endozytiert zu werden. KW - Trypanosoma brucei KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - Membranproteine KW - Diffusionskoeffizient KW - Single-molecule fluorescence microscopy KW - Single-molecule tracking KW - Variant surface glycoprotein KW - GPI-anchored protein KW - Diffusion coefficient KW - Zellskelett KW - Zytoskelett Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-275699 ER - TY - INPR A1 - Dandekar, Thomas T1 - How do qubits interact? Implications for fundamental physics N2 - Proteins fold in water and achieve a clear structure despite a huge parameter space. Inside a (protein) crystal you have everywhere the same symmetries as there is everywhere the same unit cell. We apply this to qubit interactions to do fundamental physics: We modify cosmological inflation: we replace the big bang by a condensation event in an eternal all-encompassing ocean of free qubits. Rare interactions of qubits in the ocean provide a nucleus or seed for a new universe (domain), as the qubits become decoherent and freeze-out into defined bit ensembles. Next, we replace inflation by a crystallization event triggered by the nucleus of interacting qubits to which rapidly more and more qubits attach (like in everyday crystal growth). The crystal unit cell guarantees same symmetries (and laws of nature) everywhere inside the crystal, no inflation scenario is needed. Interacting qubits solidify, quantum entropy decreases in the crystal, but increases outside in the ocean. The interacting qubits form a rapidly growing domain where the n**m states become separated ensemble states, rising long-range forces stop ultimately further growth. After this very early modified steps, standard cosmology with the hot fireball model takes over. Our theory agrees well with lack of inflation traces in cosmic background measurements. Applying the Hurwitz theorem to qubits we prove that initiation of qubit interactions can only be 1,2,4 or 8-dimensional (agrees with E8 symmetry of our universe). Repulsive forces at ultrashort distances result from quantization, long-range forces limit crystal growth. The phase space of the crystal agrees with the standard model of the basic four forces for n quanta. It includes all possible ensemble combinations of their quantum states m, a total of n**m states. We describe a six-bit-ensemble toy model of qubit interaction and the repulsive forces of qubits for ultra-short distances. Neighbor states reach according to transition possibilities (S-matrix) with emergent time from entropic ensemble gradients. However, in our four dimensions there is only one bit overlap to neighbor states left (almost solid, only below Planck´s quantum is liquidity left). The E8 symmetry of heterotic string theory has six curled-up, small dimensions. These keep the qubit crystal together and never expand. We give energy estimates for free qubits vs bound qubits, misplacements in the qubit crystal and entropy increase during qubit crystal formation. Implications are fundamental answers, e.g. why there is fine-tuning for life-friendliness, why there is string theory with rolled-up dimension and so many free parameters. We explain by cosmological crystallization instead of inflation the early creation of large-scale structure of voids and filaments, supercluster formation, galaxy formation, and the dominance of matter: the unit cell of our crystal universe has a matter handedness avoiding anti-matter. Importantly, crystals come and go in the qubit ocean. This selects for the ability to lay seeds for new crystals, for self-organization and life-friendliness. Vacuum energy gets appropriate low inside the crystal by its qubit binding energy, outside it is 10**20 higher. Scalar fields for color interaction/confinement and gravity could be derived from the qubit-interaction field. KW - protein folding KW - qubit interaction KW - early cosmology KW - qubit KW - modified inflation KW - crystallization KW - decoherence Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-357435 ER - TY - JOUR A1 - Klimm, Fabian S. A1 - Bräu, Markus A1 - König, Sebastian A1 - Mandery, Klaus A1 - Sommer, Carolin A1 - Zhang, Jie A1 - Krauss, Jochen T1 - Importance of habitat area, quality and landscape context for heteropteran diversity in shrub ecotones JF - Landscape Ecology N2 - Context Habitat loss and degradation impose serious threats on biodiversity. However, not all habitats receive the attention commensurate with their ecological importance. Shrub ecotones (successional stages between grasslands and forests) can be highly species-diverse but are often restricted to small areas as prevalent management practices either promote open grassland or forest habitats, threatening the effective conservation of ecotone species. Objectives In this study, we assessed the importance of habitat and landscape features of shrub ecotones for the rarely studied true bugs (Heteroptera), a functionally diverse taxon that comprises highly specialized species and broad generalists. Methods True bugs were sampled with a beating tray in 118 spatially independent shrub ecotones in a region of 45,000 square kilometers in Germany. In addition to habitat area and landscape context, we used a hedge index to evaluate habitat quality. Results Shrub ecotones in open habitats harbored a greater species richness and abundance compared to shaded ones in later seral stages, and species composition differed. Richness and abundance were positively affected by increasing habitat area and quality, whereas an increase in the proportion of semi-natural habitats within 1 km only enhanced richness. While feeding and habitat specialists were more sensitive to habitat area reduction than generalists, this was not the case for weak dispersers and carnivores. Conclusions Our findings emphasize the importance of large and high-quality ecotones that form a patchy mosaic of shrubs and herbaceous plants. Such ecotones can benefit both grassland species and species depending on woody plants. Conservation authorities should balance between promoting shrubs and keeping such habitats open to maximize species diversity. KW - hedge index KW - hedgerow KW - true bug KW - semi-natural habitat KW - bush ecotone KW - succession KW - transitional shrubland Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-358106 SN - 0921-2973 VL - 39 ER - TY - THES A1 - Nirchal, Naveen Kumar T1 - Mechanistische Regulierung des gastroösophagealen Übergangs und die Rolle der Retinsäure bei der Entwicklung des Barrett-Ösophagus T1 - Mechanistic regulation of gastroesophageal junction and role of retinoic acid in the development of Barrett's esophagus N2 - Der gastroösophageale Übergang (GEJ), der die Region abgrenzt, in der der distale Ösophagus auf die proximale Magenregion trifft, ist bekannt für die Entwicklung pathologischer Zustände, wie Metaplasie und Adenokarzinom des Ösophagus (EAC). Es ist wichtig, die Mechanismen der Entwicklungsstadien zu verstehen, die zu EAC führen, da die Inzidenzrate von EAC in den letzten 4 Jahrzehnten um das 7-fache gestiegen ist und die Gesamtüberlebensrate von 5 Jahren 18,4 % beträgt. In den meisten Fällenwird die Diagnose im fortgeschrittenen Stadium ohne vorherige Symptome erstellt. Der Hauptvorläufer für die Entwicklung von EAC ist eine prämaligne Vorstufe namens Barrett-Ösophagus (BE). BE ist der metaplastische Zustand, bei dem das mehrschichtige Plattenepithel des nativen Ösophagus durch ein spezialisiertes einschichtiges Säulenepithel ersetzt wird, das die molekularen Eigenschaften des Magen- sowie des Darmepithels aufweist. Zu den wichtigsten Risikofaktoren für die Entwicklung von BE gehören die chronische gastroösophageale Refluxkrankheit (GERD), eine veränderte Mikrobiota und veränderte Retinsäure-Signalwege (RA). Es ist unklar, welche Zelle der Ursprung für BE ist, da es keine eindeutigen Beweisen für den Prozess der BE-Initiation gibt. In dieser Arbeit habe ich untersucht, wie die GEJ-Homöostase in gesundem Gewebe durch stammzellregulatorische Morphogene aufrechterhalten wird, welche Rolle der Vitamin-A (RA-Signalübertragung) spieltund wie ihre Veränderung zur BE-Entwicklung beiträgt. Im ersten Teil meiner Dissertation habe ich anhand von Einzelmolekül-RNA in situ-Hybridisierung und Immunhistochemie eindeutig das Vorhandensein von zwei Arten von Epithelzellen nachweisen können, dem Plattenepithel in der Speiseröhre und dem Säulenepithel imMagenbereich des GEJ. Mittels Abstammungsanalysen im Mausmodell konnte ich zeigen, dass die Epithelzellen des Ösophagus und des Magens von zwei verschiedenen epithelialen Stammzelllinien imGEJ abstammen. Die Grenze zwischen Plattenepithel und Säulenepithelzellen im SCJ des GEJ wirddurch gegensätzliche Wnt-Mikroumgebungen streng reguliert. Plattenepithelstammzellen des Ösophagus werden durch das Wnt-hemmende Mikroumgebungssignal aufrechterhalten, während Magensäulenepithelzellen durch das Wnt-aktivierende Signal aus dem Stromakompartiment erhalten werden. Ich habe die in vivo Erhaltung der Epithelstammzellen des GEJ mit Hilfe eines in vitro Epithel-3D-Organoidkulturmodells rekonstruiert. Das Wachstum und die Vermehrung von Magensäulenepithel-Organoiden hängen von Wnt-Wachstumsfaktoren ab, während das Wachstum von Plattenepithel-Organoiden von Wnt-defizienten Kulturbedingungen abhängt. Darüber hinaus zeigte die Einzelzell-RNA-Sequenzanalyse (scRNA-seq) der aus Organoiden gewonnenenEpithelzellen, dass der nicht-kanonische Wnt/ planar cell polarity (PCP) Signalweg an der Regulierung der Plattenepithelzellen beteiligt ist. Im Gegensatz dazu werden säulenförmige Magenepithelzellen durch den kanonischen Wnt/beta-Catenin- und den nicht-kanonischen Wnt/Ca2+-Weg reguliert. Meine Daten zeigen, dass die SCJ-Epithelzellen, die am GEJ verschmelzen, durch entgegengesetzte stromale Wnt-Faktoren und unterschiedliche Wnt-Weg-Signalee in den Epithelzellen reguliert werden. Im zweiten Teil der Dissertation untersuchte ich die Rolle der bioaktiven Vitamin A Verbindung RA auf Ösophagus- und Magenepithelstammzellen. Die In-vitro-Behandlung von epithelialen Organoiden der Speiseröhre und des Magens mitRA oder seinem pharmakologischen Inhibitors BMS 493 zeigte, dass jeder Zelltyp unterschiedlich reguliert wurde. Ich beobachtete, dass eine verstärkte RA die Differenzierung von Stammzellen und den Verlust der Schichtung förderte, während die RA-Hemmung zu einer verstärkten Stammzellbildung und Regeneration im mehrschichtigen Epithel der Speiseröhre führte. Im Gegensatz zur Speiseröhre ist der RA-Signalweg in Magen-Organoiden aktiv, und die Hemmung von RA hat ein reduziertes Wachstum von Magen-Organoiden. Globale transkriptomische Daten und scRNA-seq-Daten zeigten, dass derRA-Signalweg einen Ruhephänotyp in den Ösophaguszellen induziert. Dagegen führt das Fehlen von RA in Magenepithelzellen zur Expression von Genen, die mit BE assoziiert sind. Daher isteine räumlich definierte Regulation der Wnt- und Retinsäure-Signalgebung amGEJ entscheidend für eine gesunde Homöostase, und ihre Störung führt zur Entwicklung von Krankheiten. N2 - Gastroesophageal junction (GEJ), demarcating the region where the distal esophagus meets with the proximal stomach region, is known for developing pathological conditions, including metaplasia and esophageal adenocarcinoma (EAC). It is essential to understand the mechanisms of developmental stages which lead to EAC since the incidence rate of EAC increased over 7-fold during the past four decades, and the overall five years survival rate is 18.4%. In most cases, patients are diagnosed in the advanced stage without prior symptoms. The main precursor for the development of EAC is a pre-malignant condition called Barrett's esophagus (BE). BE is the metaplastic condition where the multilayered squamous epithelium of the native esophagus is replaced by specialized single-layered columnar epithelium, which shows the molecular characteristics of the gastric as well as intestinal epithelium. The main risk factors for BE development include chronic gastro-esophageal acid reflux disease (GERD), altered microbiota, and altered retinoic acid signaling (RA). The cell of origin of BE is under debate due to a lack of clear evidence demonstrating the process of BE initiation. Here, I investigated how GEJ homeostasis is maintained in healthy tissue by stem cell regulatory morphogens, the role of vitamin A (RA signaling), and how its alteration contributes to BE development. In the first part of my thesis, I showed the presence of two types of epithelial cells, the squamous type in the esophagus and the columnar type in the stomach region in the GEJ, using single-molecule RNA in situ hybridization (smRNA-ISH) and immunohistochemistry. Employing lineage tracing in the mouse model, I have demonstrated that the esophageal epithelial and stomach epithelial cells derived from two distinct epithelial stem cell lineages in the GEJ. The border between squamous and columnar epithelial cells in the Squamo-columnar junction (SCJ) of GEJ is regulated by opposing Wnt microenvironments. The regeneration of stomach columnar epithelial stem cells is maintained by Wnt activating signal from the stromal compartment while squamous epithelial stem cells of the esophagus are maintained by the Wnt inhibitory signals. I recapitulated the in vivo GEJ epithelial stem cell maintenance by using in vitro epithelial 3D organoid culture model. The growth and propagation of stomach columnar epithelial organoids depend on Wnt growth factors, while squamous epithelial organoids' development needs Wnt-deficient culture conditions. Further, single-cell RNA sequence (scRNA-seq) analysis of organoid-derived epithelial cells revealed the non-canonical Wnt/ planar cell polarity (PCP) pathway involvement in regulating the squamous epithelial cells. In contrast, columnar stomach epithelial cells are regulated by the canonical Wnt/ beta-catenin and non-canonical Wnt/Ca2+ pathways. My data indicate that the SCJ epithelial cells that merge at the GEJ are regulated by opposing stromal Wnt factors and distinct Wnt pathway signaling in the epithelial cells. In the second part of the thesis, I investigated the role of Vitamin A-derived bioactive compound RA on esophageal and stomach epithelial stem cells. In vitro treatment of esophageal and stomach, epithelial organoids with RA or its pharmacological inhibitor BMS 493 revealed that each cell type was regulated distinctly. I observed that enhanced RA promoted esophageal stem cell differentiation and loss of stratification, while RA inhibition led to enhanced stemness and regeneration of the esophagus stratified epithelium. As opposed to the esophagus, RA signaling is active in the stomach organoids, and inhibition of RA reduces the growth of stomach organoids. Global transcriptomic data and scRNA-seq data revealed that RA signaling induces dormancy phenotype in the esophageal cells. In contrast, the absence of RA in stomach epithelial cells induces the expression of genes associated with BE. Thus, spatially defined regulation of Wnt and RA signaling at GEJ is critical for healthy homeostasis, and its perturbation leads to disease development. KW - Retinoesäure KW - Esophageal adenocarcinoma KW - Intestinal metaplasia KW - Epithelial lineage KW - Organoid KW - Retinoic acid KW - Gastroesophageal reflux KW - Endobrachyösophagus KW - Esophageal disease Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-311556 ER -