TY  - THES
A1  - Delto, Carolyn Francesca
T1  - Structural and Biochemical Characterization of the GABA(A) Receptor Interacting Protein Muskelin
T1  - Strukturelle und Biochemische Charakterisierung des GABA(A) Rezeptor interagierenden Proteins Muskelin
N2  - In a study from 2011, the protein muskelin was described as a central coordinator of the retrograde transport of GABA(A) receptors in neurons. As muskelin governs the transport along actin filaments as well as microtubules, it might be the first representative of a novel class of regulators, which coordinate cargo transport across the borders of these two independent systems of transport paths and their associated motorproteins. To establish a basis for understanding the mode of operation of muskelin, the aim of this thesis was an in-depth biochemical and structural characterization of muskelin and its interaction with the GABA(A) receptor.
One focus of the work was the analysis of the oligomerization of muskelin. As could be demonstrated, the oligomerization is based on two independent interactions mediated by different domains of the protein: a known interaction of the N-terminal discoidin domain with the C-terminal portion, termed head-to-tail interaction, and a dimerization of the LisH motif in muskelin that was so far neglected in the literature. For the detailed studies of both binding events, the solution of a crystal structure of a fragment of muskelin, comprising the Discoidin domain and the LisH motif, was an important basis. The fragment crystallized as a dimer, with dimerization being mediated solely by the LisH motif. Biochemical analysis corroborated that the LisH motif in muskelin serves as a dimerization element, and, moreover, showed that the C-terminal domain of the protein substantially stabilizes this dimerization. In addition, the crystal structure revealed the molecular composition of the surface of the head in the head-to-tail interaction, namely the discoidin domain. This information enabled to map the amino acids contributing to binding, which showed that the binding site of the head-to-tail interaction coincides with the generic ligand binding site of the discoidin domain.
As part of the analyses, residues that are critical for LisH-dimerization and the head-to-tail binding, respectively, were identified, whose mutation specifically interfered with each of the interactions separately. These mutations allowed to investigate the interplay of these interactions during oligomerization. It could be shown that recombinant muskelin assembles into a tetramer to which both interactions, the LisH-dimerization and the head-to-tail binding, contribute independently. When one of the two interactions was disturbed, only a dimer mediated via the respective other interaction could be formed; when both interactions were disturbed, the protein was present as monomer. Furthermore, Frank Heisler in the group of Matthias Kneussel was able to show the drastic impact of an impaired LisH-dimerization on muskelin in cells using these mutations. Disturbing the LisH-dimerization led to a complete redistribution of the originally cytoplasmic muskelin to the nucleus which was accompanied by a severe impairment of its function during GABA(A) receptor transport. Following up on these results in an analysis of muskelin variants, for which alterations of the subcellular localization had been published earlier, the crucial influence of LisH-dimerization to the subcellular localization and thereby the role of muskelin in the cell was confirmed.
The biochemical studies of the interaction of muskelin and the alpha1 subunit of the GABA(A) receptor demonstrated a direct binding with an affinity in the low micromolar range, which is mediated primarily by the kelch repeat domain in muskelin. For the binding site on the GABA(A) receptor, it was confirmed that the thirteen most C-terminal residues of the intracellular domain are critical for the binding of muskelin. In accordance with the strong conservation of these residues among the alpha subunits of the GABA(A) receptor, it could be shown that an interaction with muskelin in vitro is also possible for the alpha2 and alpha5 subunits. Based on the comparison of the binding sites between the homologous subunits, tentative conclusions can be drawn about the details of the binding, which may serve as a starting point for follow-up studies.
This thesis thereby makes valuable contributions to the understanding of muskelin, in particular the significance of its oligomerization. It furthermore provides an experimental framework for future studies that address related topics, such as the characterization of other muskelin interaction partners, or the questions raised in this work.
N2  - Das Protein Muskelin wurde in einer Studie aus dem Jahr 2011 als zentraler Koordinator des retrograden Transports von GABA(A)-Rezeptoren in Neuronen beschrieben. Da Muskelin den Transport des Rezeptors sowohl entlang von Aktinfilamenten als auch Mikrotubuli steuert, könnte es der erste bekannte Vertreter einer neuen Klasse von Regulatoren sein, die den Transport einer Fracht über die Grenzen dieser beiden unabhängigen Systeme von Transportwegen und der damit assoziierten Motorproteine hinweg koordinieren. Um Grundlagen für das Verständnis der Wirkungsweise von Muskelin zu schaffen, war das Ziel dieser Arbeit die biochemische und strukturelle Charakterisierung von Muskelin und seiner Interaktion mit dem GABA(A)-Rezeptor.
Ein Schwerpunkt der Arbeit lag dabei auf der Analyse der Oligomerisierung von Muskelin. Wie gezeigt werden konnte, beruht die Oligomerisierung auf zwei unabhängigen, von verschiedenen Domänen des Proteins vermittelten Bindungen: zum Einen auf einer bereits bekannten Wechselwirkung der N-terminalen Discoidin-Domäne und des C-terminalen Teils (anschaulich als Head-to-tail, englisch für Kopf-an-Schwanz, bezeichnet), zum Anderen auf einer in der Literatur bisher außer Acht gelassenen Dimerisierung des LisH-Motivs in Muskelin.
Für die detaillierten Studien beider Bindungen lieferte die Aufklärung der Kristallstruktur eines Teilstücks von Muskelin, das die Discoidin-Domäne und das LisH-Motiv umfasst, eine wichtige Grundlage. Das Teilstück kristallisierte als Dimer, wobei die Dimerisierung ausschließlich über das LisH-Motiv vermittelt wurde. Die biochemischen Analysen bestätigten, dass das LisH-Motiv in Muskelin als Dimerisierungselement wirkt, und zeigten darüber hinaus, dass die C-terminale Domäne des Proteins diese Dimerisierung wesentlich stabilisiert. Zudem offenbarte die Kristallstruktur den molekularen Aufbau der Oberfläche des Kopfes in der Head-to-tail-Bindung, der Discoidin-Domäne. Die Kartierung der zur Bindung beitragenden Aminosäuren belegte, dass die Bindungsstelle der Head-to-tail-Interaktion mit der generischen Ligandenbindungsstelle der Discoidin-Domäne zusammenfällt.
Als Teil der Analysen wurden zur LisH-Dimerisierung oder zur Head-to-tail-Bindung kritisch beitragende Aminosäurenseitenketten identifiziert, durch deren Mutationen
Ispezifisch jeweils eine der beiden Interaktionen unterbunden werden konnte. Diese Mutationen ermöglichten es, das Zusammenspiel der Bindungen in der Oligomerisierung zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass rekombinantes Muskelin ein Tetramer bildet, wozu beide Interaktionen, die LisH-Dimerisierung und die Head-to-tail-Bindung, unabhängig beitragen. Wurde jeweils eine der beiden Interaktionen durch Mutation gestört, konnte nur noch ein über die jeweils andere Interaktion vermitteltes Dimer gebildet werden, bei gleichzeitiger Störung beider Interaktionen lag das Protein als Monomer vor. Darüber hinaus konnte Frank Heisler in der Arbeitsgruppe von Matthias Kneussel mit Hilfe dieser Mutationen zeigen, dass eine Störung der LisH-Dimerisierung drastische Auswirkungen auf Muskelin in Zellen hat. Die Störung der LisH-Dimerisierung führte zu einer vollständigen Umverteilung des sonst im Zytoplasma lokalisierten Muskelins in den Kern, begleitet von einer starken Beeinträchtigung seiner Funktion im Transport des GABA(A)-Rezeptors. Auf diesen Ergebnissen aufbauend wurde durch Analysen der oligomeren Zustände von Muskelin-Varianten, für die in der Literatur eine veränderte Lokalisation beschrieben worden war, die entscheidende Bedeutung der LisH-Dimerisierung für die subzelluläre Verteilung und damit die Rolle von Muskelin in der Zelle bekräftigt.
Die biochemischen Studien der Interaktion von Muskelin und der alpha1-Untereinheit des GABA(A)-Rezeptors demonstrierten eine direkte Bindung mit mikromolarer Affinität, die in Muskelin vorwiegend durch die Kelch-repeat-Domäne vermittelt wird. Für die Bindungsstelle auf Seite des GABA(A)-Rezeptors wurde bestätigt, dass die dreizehn C-terminalen Reste der intrazellulären Domäne entscheidend sind. In Übereinstimmung mit der starken Konservierung dieser Reste in verschiedenen alpha-Untereinheiten des GABA(A)-Rezeptors, konnte gezeigt werden, dass in vitro eine Bindung von Muskelin auch an die intrazelluläre Domäne der alpha2- und alpha5-Untereinheit möglich ist. Anhand des Vergleichs der Bindungsstelle zwischen den homologen Untereinheiten lassen sich erste Rückschlüsse auf die Details der Interaktion ziehen, die als Anknüpfungspunkt für kommende Studien dienen können.
Diese Arbeit liefert damit wesentliche Beiträge zum Verständnis von Muskelin, insbesondere der Bedeutung seiner Oligomerisierung. Sie bietet zudem ein experimentelles Rahmenwerk für zukünftige Studien, die sich verwandten Themen, wie der Charakterisierung weiterer Interaktionen von Muskelin, oder den in dieser Arbeit aufgeworfenen Fragen widmen.
KW  - Oligomerisation
KW  - GABA-Rezeptor
KW  - Muskelin
KW  - Oligomerization
KW  - GABA(A) receptor
KW  - Interaction analysis
KW  - Strukturanalyse
KW  - Biochemie
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115922
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kober, Franz-Xaver Wilhelm
T1  - Molecular insights into the protein disulfide isomerase family
T1  - Molekulare Mechanismen der Protein Disulfid Isomerase Familie
N2  - Upon synthesis, nascent polypeptide chains are subject to major rearrangements of their side chains to obtain an energetically more favorable conformation in a process called folding. About one third of all cellular proteins pass through the secretory pathway and undergo oxidative folding in the endoplasmic reticulum (ER). During oxidative folding, the conformational rearrangements are accompanied by the formation of disulfide bonds – covalent bonds between cysteine side chains that form upon oxidation. Protein disulfide isomerase (PDI) assists in the folding of substrates by catalyzing the oxidation of pairs of cysteine residues and the isomerization of disulfide bonds as well as by acting as chaperones. In addition to PDI itself, a family of related ER-resident proteins has formed. All PDI family members share the thioredoxin fold in at least one of their domains and exhibit a subset of the PDI activities. Despite many studies, the role of most PDI family members remains unclear. The project presented in this thesis was aimed to establish tools for the biochemical characterization of single members of the PDI family and their role in the folding process. A combination of fluorescence based assays was developed to selectively study single functions of PDI family members and relate their properties of either catalysis of oxidation or catalysis of isomerization or chaperone activity to the rest of the protein family. A binding assay using isothermal titration calorimetry (ITC) was established to complement the activity assays. Using ITC we could show for the first time that members of the PDI family can distinguish between folded and unfolded proteins selectively binding the latter. The unique information provided by this method also revealed a two-site binding of unfolded proteins by PDI itself. In addition to the functional characterization, experiments were conducted to further investigate the oligomeric state of PDI. We could show that the equilibrium between structurally different states of PDI is heavily influenced by the redox state of the protein and its environment. This new data could help to further our understanding of the interplay between oxidases like PDI and their regenerative enzymes like Ero1, which may be governed by structural changes in response to the change in redox status. Another structural approach was the screening of all investigated PDI family members for suitable crystallization conditions. As a result of this screening we could obtain protein crystals of human ERp27 and were able to solve the structure of this protein with X-ray crystallography. The structure gives insight into the mechanisms of substrate binding domains within the PDI family and helps to understand the interaction of ERp27 with the redox active ERp57. In collaboration with the group of Heike Hermanns we could further show the physiological importance of this interaction under oxidative stress. In conclusion, the project presented in this thesis provides novel tools for an extensive analysis of the activities of single PDI family members as well as a useful set of methods to characterize novel oxidoreductases and chaperones. The initial results obtained with the our novel methods are very promising. At the same time, the structural approach of this project could successfully solve the structure of a PDI family member and give information about the interplay within the PDI family.
N2  - Umlagerungsprozess nennt man Proteinfaltung. Schätzungsweise ein Drittel aller zellulären Proteine werden über den sekretorischen Transportweg geschleust und durchlaufen die oxidative Proteinfaltung im endoplasmatischen Retikulum (ER). Während der oxidativen Faltung werden zusätzlich zur Umlagerung von Seitenketten auch Disulfidbrücken gebildet. Dies sind kovalente Bindungen zwischen Zystein-Seitenketten durch Oxidation entstehen. Protein Disulfid Isomerase (PDI) unterstützt die Faltung von Proteinen im ER indem es die Oxidation zweier Zystein- Seitenketten katalysiert. Neben der Oxidation katalysiert PDI ebenfalls die Isomerisierung von fehlverknüpften Disulfidbrücken und wirkt als Chaperon der Aggregation entgegen. Im Laufe der Evolution hat sich zusätzlich zu PDI eine Gruppe verwandter ER-lokalisierter Proteine gebildet. Diese Mitglieder der PDI-Familie weisen alle das Thioredoxin-Faltungsmotiv in mindestens einer ihrer Domänen auf und besitzen mindestens eine der drei PDI-Aktivitäten. Trotz eingehender Untersuchung ist die Rolle der meisten dieser PDI Familienmitglieder weiterhin unklar. Im Rahmen des Projekts, welches dieser Dissertation zugrunde liegt, wurden Methoden zur biochemischen Charakterisierung einzelner Mitglieder der PDI-Familie, und deren Rolle im Faltungsprozess, entwickelt. Eine Kombination von Fluoreszenzexperimenten wurde etabliert mit der selektiv einzelne Aktivitäten von Faltungshelfern analysiert und qualitativ in die PDI- Familie eingeordnet werde können. Diese fluoreszenzbasierten Methoden wurden durch isothermale Titrationkalorimetrie (ITC) ergänzt. Mit ITC konnten wir als Erste zeigen, dass PDI- Familienmitglieder gefaltete von ungefalteten Proteinen unterscheiden können und letztere selektiv binden. Die zusätzlichen Informationen, die in einem ITC-Experiment gewonnen wurden, zeigten, dass PDI mit Substraten mit Hilfe von zwei unterschiedlichen Bindungsstellen interagiert. Neben der funktionellen Analyse der PDI-Familie wurde Experimente durchgeführt um den oligomeren Zustand von PDI näher zu untersuchen. Wir konnten zeigen, dass das Gleichgewicht zwischen strukturell verschiedenen Zuständen entscheidend vom Redox-Status von PDI abhängt. Diese neuen Daten werfen ein neues Licht auf die Interaktion zwischen Oxidasen wie PDI und ihren regenerativen Enzymen wie Ero1. Diese Interaktion könnte sehr wohl durch strukturelle Veränderungen, ausgelöst durch Redox-Reaktionen, reguliert werden. Als weiteren strukturellen Ansatz zur Erforschung der PDI-Familie wurden alle verwendeten Familienmitglieder auf aussichtsreiche Kristallisationsbedingungen hin untersucht. Durch dieses Screening konnte ERp27 kristallisiert und seine Struktur durch Röntgenkristallografie aufgeklärt werden. Die so gewonnene Struktur gibt Aufschluss über die Mechanismen der Substratbindung in der PDI- Familie und hilft ebenfalls dabei, die Interaktion zwischen ERp27 und dem redoxaktiven ERp57 besser zu verstehen. Auf Grund dieser Daten konnten wir gemeinsam mit der Gruppe von Heike Hermanns die physiologische Bedeutung dieser Interaktion bei oxidativem Stress aufzeigen. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieses Projektes neue Werkzeuge zur eingehenden Analyse der PDI-Familie etabliert werden, welche auch zur Charakterisierung neuer Oxidoreduktasen und Chaperone verwendet werden können. Die ersten Ergebnisse die mit Hilfe dieser neuen Methoden gewonnen werden konnten sind vielversprechen. Gleichzeitig konnten wir mit ERp27 die Struktur eines weiteren PDI-Familienmitgliedes lösen und so weitere Einblicke in das komplexe Netzwerk der PDI-Familie gewinnen.
KW  - Biochemie
KW  - Proteinfaltung
KW  - Disulfidbrücken
KW  - Protein Disulfid Isomerase
KW  - Biochemistry
KW  - protein folding
KW  - disulfide bonds
KW  - protein disulfide isomerase
KW  - PDI
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72144
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Schäfer, Simon
A1  - Weibel, Stephanie
A1  - Donat, Ulrike
A1  - Zhang, Qian
A1  - Aguilar, Richard J.
A1  - Chen, Nanhai G.
A1  - Szalay, Aladar A.
T1  - Vaccinia virus-mediated intra-tumoral expression of matrix metalloproteinase 9 enhances oncolysis of PC-3 xenograft tumors
N2  - Background: Oncolytic viruses, including vaccinia virus (VACV), are a promising alternative to classical mono-cancer treatment methods such as surgery, chemo- or radiotherapy. However, combined therapeutic modalities may be more effective than mono-therapies. In this study, we enhanced the effectiveness of oncolytic virotherapy by matrix metalloproteinase (MMP-9)-mediated degradation of proteins of the tumoral extracellular matrix (ECM), leading to increased viral distribution within the tumors. Methods: For this study, the oncolytic vaccinia virus GLV-1h255, containing the mmp-9 gene, was constructed and used to treat PC-3 tumor-bearing mice, achieving an intra-tumoral over-expression of MMP-9. The intra-tumoral MMP-9 content was quantified by immunohistochemistry in tumor sections. Therapeutic efficacy of GLV-1h255 was evaluated by monitoring tumor growth kinetics and intra-tumoral virus titers. Microenvironmental changes mediated by the intra-tumoral MMP-9 over-expression were investigated by microscopic quantification of the collagen IV content, the blood vessel density (BVD) and the analysis of lymph node metastasis formation. Results: GLV-1h255-treatment of PC-3 tumors led to a significant over-expression of intra-tumoral MMP-9, accompanied by a marked decrease in collagen IV content in infected tumor areas, when compared to GLV-1h68-infected tumor areas. This led to considerably elevated virus titers in GLV-1h255 infected tumors, and to enhanced tumor regression. The analysis of the BVD, as well as the lumbar and renal lymph node volumes, revealed lower BVD and significantly smaller lymph nodes in both GLV-1h68- and GLV-1h255- injected mice compared to those injected with PBS, indicating that MMP-9 over-expression does not alter the metastasis-reducing effect of oncolytic VACV. Conclusions: Taken together, these results indicate that a GLV-1h255-mediated intra-tumoral over-expression of MMP-9 leads to a degradation of collagen IV, facilitating intra-tumoral viral dissemination, and resulting in accelerated tumor regression. We propose that approaches which enhance the oncolytic effect by increasing the intra-tumoral viral load, may be an effective way to improve therapeutic outcome.
KW  - Biochemie
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78220
ER  - 
TY  - THES
A1  - Zanucco, Emanuele
T1  - Role of oncogenic and wild type B-RAF in mouse lung tumor models
T1  - Untersuchungen zur Rolle der onkogenen und wildtypischen B-RAF Kinase in Lungentumormodellen der Maus
N2  - Von Wachstumsfaktoren regulierte Signalkaskaden sind Schlüsselelemente in der Gewebeentwicklung und Geweberegeneration. Eine Deregulation dieser Kaskaden führt zu Entwicklungsstörungen und neoplastischen Krankheiten. Für viele humane Krebsformen sind aktivierende Mutationen der Kinasen der RAF Familie verantwortlich. Das erste Projekt dieser Doktorarbeit fokussiert auf der Rolle des B-RAF V600E, welches als eine der am häufigsten vorkommenden Mutantionen in humanen Krebszellen identifiziert worden ist. Um die onkogene Funktion des B-RAF V600E zu untersuchen, haben wir transgene Mauslinien hergestellt, welche das aktivierte Onkogen spezifisch in alveolaren Lungenepithelzellen des Typ II exprimieren. Konstitutive Expression des B-RAF V600E führte zu einer abnormen alveolaren Epithelzellbildung und zu Emphysem-ähnlichen Läsionen. Diese Läsionen wiesen Zeichen einer Gewebsumstrukturierung auf, oft in Assoziation mit chronischer Inflammation und geringer Inzidenz von Lungentumoren. Die Infiltration der entzündlichen Zellen erfolgte erst nach der Entstehung von Emphysem-ähnlichen Läsionen und könnte zur späteren Tumorbildung beigetragen haben. Diese Ergebnisse unterstützen ein Modell, in welchem der kontinuierliche regenerative Prozess eine tumorfördernde Umgebung schafft. Dabei induziert die Aktivität des onkogenen B-RAF eine alveolare Störung, welche ursächlich verantwortlich ist für den kontinuierlichen regenerativen Prozess. Das zweite Projekt fokussiert auf die Rolle von endogenem (wildtypischen) B-RAF in einem durch onkogenes C-RAF induzierten Maus Lungentumormodell. Für unsere Untersuchungen haben wir eine Mauslinie geschaffen, in welcher B-RAF in den C-RAF Lungentumoren konditionell eliminiert werden kann. Eine konditionelle Eliminierung des B-RAF hat die Entstehung von Lungentumoren nicht blockiert, aber zu reduziertem Tumorwachstum geführt. Dieses reduzierte Tumorwachstum konnte auf eine reduzierte Zellproliferation zurückgeführt werden. Außerdem konnten wir durch die B-RAF Elimination eine Reduktion der Intensität der mitogenen Signalkaskade beobachten. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass das onkogene Potential von C-RAF in vivo unabhängig von B-RAF ist und eine Kooperation von B-RAF und C-RAF jedoch für die vollständige Aktivierung der mitogenen Signalkaskade wichtig ist.
N2  - Growth factor induced signaling cascades are key regulatory elements in tissue development, maintenance and regeneration. Deregulation of the cascades has severe consequences, leading to developmental disorders and neoplastic diseases. As a major function in signal transduction, activating mutations in RAF family kinases are the cause of many human cancers. In the first project described in this thesis we focused on B-RAF V600E that has been identified as the most prevalent B-RAF mutant in human cancer. In order to address the oncogenic function of B-RAF V600E, we have generated transgenic mice expressing the activated oncogene specifically in lung alveolar epithelial type II cells. Constitutive expression of B-RAF V600E caused abnormalities in alveolar epithelium formation that led to airspace enlargements. These lung lesions showed signs of tissue remodeling and were often associated with chronic inflammation and low incidence of lung tumors. Inflammatory cell infiltration did not precede the formation of emphysema-like lesions but was rather accompanied with late tumor development. These data support a model where the continuous regenerative process initiated by oncogenic B-RAF-driven alveolar disruption provides a tumor-promoting environment associated with chronic inflammation. In the second project we focused on wild type B-RAF and its role in an oncogenic-C-RAF driven mouse lung tumor model. Toward this aim we have generated compound mice in which we could conditionally deplete B-RAF in oncogenic-C-RAF driven lung tumors. Conditional elimination of B-RAF did not block lung tumor formation however led to reduced tumor growth. The diminished tumor growth was not caused by increased cell death instead was a consequence of reduced cell proliferation. Moreover, B-RAF ablation caused a reduction in the amplitude of the mitogenic signalling cascade. These data indicate that in vivo B-RAF is dispensable for the oncogenic potential of active C-RAF; however it cooperates with oncogenic C-RAF in the activation of the mitogenic cascade.
KW  - Lungenkrebs
KW  - Biochemie
KW  - Maus
KW  - Lung cancer
KW  - RAF
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69603
ER  - 
TY  - THES
A1  - Fischer, Andreas
T1  - The Role of Protein-Protein Interactions in the Activation Cycle of RAF Kinases
T1  - Die Rolle von Protein-Protein Interaktionen im Aktivierungszyklus der RAF Kinasen
N2  - Members of the RAF protein kinase family are key regulators of diverse cellular processes. The need for isoform-specific regulation is reflected by the fact that all RAFs not only display a different degree of activity but also perform isoform-specific functions at diverse cellular compartments. Protein-protein-interactions and phosphorylation events are essential for the signal propagation along the Ras-RAF-MEK-ERK cascade. More than 40 interaction partners of RAF kinases have been described so far. Two of the most important regulators of RAF activity, namely Ras and 14-3-3 proteins, are subject of this work. So far, coupling of RAF with its upstream modulator protein Ras has only been investigated using truncated versions of RAF and regardless of the lipidation status of Ras. We quantitatively analyzed the binding properties of full-length B- and C-RAF to farnesylated H-Ras in presence and absence of membrane lipids. While the isolated Ras-binding domain of RAF exhibit a high binding affinity to both, farnesylated and nonfarnesylated H-Ras, the full-length RAF kinases demonstrate crucial differences in their affinity to Ras. In contrast to C-RAF that requires carboxyterminal farnesylated H-Ras for interaction at the plasma membrane, B-RAF also binds to nonfarnesylated H-Ras in the cytosol. For identification of the potential farnesyl binding site we used several fragments of the regulatory domain of C-RAF and found that the binding of farnesylated H-Ras is considerably increased in the presence of the cysteine-rich domain of RAF. In B-RAF a sequence of 98 amino acids at the extreme N terminus enables binding of Ras independent of its farnesylation status. The deletion of this region altered Ras binding as well as kinase properties of B-RAF to resemble C-RAF. Immunofluorescence studies in mammalian cells revealed essential differences between B- and C-RAF regarding the colocalization with Ras. In conclusion, our data suggest that that B-RAF, in contrast to C-RAF, is also accessible for nonfarnesylated Ras in the cytosolic environment due to its prolonged N terminus. Therefore, the activation of B-RAF may take place both at the plasma membrane and in the cytosolic environment. Furthermore, the interaction of RAF isoforms with Ras at different subcellular sites may also be governed by the complex formation with 14-3-3 proteins. 14-3-3 adapter proteins play a crucial role in the activation of RAF kinases, but so far no information about the selectivity of the seven mammalian isoforms concerning RAF association and activation is available. We analyzed the composition of in vivo RAF/14-3-3 complexes isolated from mammalian cells with mass spectrometry and found that B-RAF associates with a greater variety of 14-3-3 proteins than C- and A-RAF. In vitro binding assays with purified proteins supported this observation since B-RAF showed highest affinity to all seven 14-3-3 isoforms, whereas C-RAF exhibited reduced affinity to some and A-RAF did not bind to the 14-3-3 isoforms epsilon, sigma, and tau. To further examine this isoform specificity we addressed the question of whether both homo- and heterodimeric forms of 14-3-3 proteins participate in RAF signaling. By deleting one of the two 14-3-3 isoforms in Saccharomyces cerevisiae we were able to show that homodimeric 14-3-3 proteins are sufficient for functional activation of B- and C-RAF. In this context, the diverging effect of the internal, inhibiting and the activating C-terminal 14-3-3 binding domain in RAF could be demonstrated. Furthermore, we unveil that prohibitin stimulates C-RAF activity by interfering with 14-3-3 at the internal binding site. This region of C-RAF is also target of phosphorylation as part of a negative feedback loop. Using tandem MS we were able to identify so far unknown phosphorylation sites at serines 296 and 301. Phosphorylation of these sites in vivo, mediated by activated ERK, leads to inhibition of C-RAF kinase activity. The relationship of prohibitin interference with 14-3-3 binding and phosphorylation of adjacent sites has to be further elucidated. Taken together, our results provide important new information on the isoform-specific regulation of RAF kinases by differential interaction with Ras and 14-3-3 proteins and shed more light on the complex mechanism of RAF kinase activation.
N2  - RAF Protein Kinasen sind essentielle Regulatoren verschiedener zellulärer Prozesse. Unterschiedlich starke Aktivitäten und Lokalisation der drei RAF Isoformen erfordern eine isoform-spezifische Regulation. Der Einfluss von Protein-Protein Interaktionen und Phosphorylierungen ist dabei mitentscheidend für die Signalweiterleitung entlang der Ras-RAF-MEK-ERK Kaskade. Mehr als 40 Interaktionspartner der RAF Kinasen wurden bereits beschrieben von denen zwei der wichtigsten, Ras und 14-3-3 Proteine, Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind. Die Interaktion von RAF mit seinem vorgeschaltetem Modulatorprotein Ras wurde bislang nur mit verkürzten RAF-Proteinen und ohne Rücksicht auf den Lipidierungsgrad von Ras untersucht. Wir haben die Bindeeigenschaften von B- und C-RAF in voller, nativer Länge zu farnesyliertem H-Ras in Gegenwart und Abwesenheit von Membranlipiden quantifiziert. Während die isolierte Ras-Bindungsdomäne eine hohe Affinität sowohl zu farnesyliertem als auch nicht-farnesyliertem H-Ras aufweist, zeigen die RAF Proteine in voller Länge entscheidende Unterschiede in ihrem Bindeverhalten zu Ras. C-RAF benötigt für eine effiziente Interaktion mit H-Ras dessen C-terminale Farnesylgruppe, wobei B-RAF auch an nicht-farnesyliertes H-Ras im Cytosol bindet. Um die verantwortliche Farnesylbinderegion zu identifizieren haben wir verschiedene Fragmente der regulatorischen Domäne von C-RAF eingesetzt. Dadurch konnten wir zeigen, dass die Affinität zu farnesyliertem Ras in Gegenwart der sogenannten Cystein-reichen Domäne von RAF beträchtlich erhöht war. In B-RAF ist eine Sequenz von 98 Aminosäuren am N-Terminus verantwortlich für die Ras-Bindung unabhängig von dessen Farnesylierungszustand. Die Deletion dieser Sequenz von B-RAF veränderte die Ras-Bindungseigenschaften sowie die Kinaseaktivität vergleichbar mit C-RAF. Durch Immunfluoreszenzversuche in Säugerzellen konnten darüber hinaus Unterschiede in der Kolokalisation von B- und C-RAF mit Ras beobachtet werden. Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass B-RAF, im Gegensatz zu C-RAF, aufgrund seines verlängerten N-Terminus in der Lage ist bereits im Cytosol auch mit unfarnesyliertem Ras zu interagieren, wodurch die Aktivierung von B-RAF sowohl im Cytosol als auch an der Plasmamenbran erfolgen kann. Die Interaktion der RAF-Isoformen mit Ras in unterschiedlichen zellulären Kompartimenten kann aber auch durch die Komplexbildung mit 14-3-3 Proteinen beeinflusst werden. Die 14-3-3 Adapter Proteine spielen eine entscheidende Rolle im Aktivierungszyklus der RAF Proteine. Bislang waren jedoch keine Details bezüglich der Selektivität der sieben 14-3-3 Isoformen aus Säugerzellen hinsichtlich der Assoziation mit und Aktivierung der RAF Kinasen bekannt. Wir haben RAF/14-3-3 Komplexe aus Säugerzellen isoliert und durch Massenspektrometrie analysiert. Dadurch konnten wir zeigen, dass B-RAF mit einer größeren Vielfalt an 14-3-3 Isoformen bindet als C- und A-RAF. In vitro Bindungsversuche mit gereinigten Proteinen bestätigten die höhere Affinität von B-RAF zu allen sieben Säuger-14-3-3 Proteinen. C-RAF dagegen zeigte eine deutlich reduzierte Affinität, während für A-RAF keine Bindung zu den 14-3-3 Isoformen epsilon, sigma, und tau festgestellt wurde. Um diese Isoformspezifität weiter aufzuklären haben wir untersucht, ob sowohl Homo- als auch Heterodimere von 14-3-3 in der Lage sind die RAF-Signaltransduktion zu beeinflussen. Durch die Deletion einer der beiden 14-3-3 Isoformen aus Saccharomyces cerevisiae konnten wir zeigen, dass bereits ein 14-3-3 Homodimer für die korrekte Aktivierung von B- und C-RAF ausreichend ist. In diesem Zusammenhang konnte auch die Rolle der internen, inhibierenden 14-3-3 Bindestelle in RAF gegenüber der C-terminalen, aktivierenden Stelle dargelegt werden. Zusätzlich zeigen wir, dass Prohibitin seinen aktivierenden Einfluss gegenüber C-RAF durch die Beeinträchtigung der 14-3-3 Bindung an der internen Stelle in RAF ausübt. Diese Region in C-RAF ist das Ziel von Phosphorylierungen im Zuge eines negativen Rückkopplungsmechanismus. Durch den Einsatz von Tandem-Massenspektrometrie konnten wir bislang unbekannte Phosphorylierungsstellen an den Serinen 296 und 301 identifizieren deren ERK-vermittelte Phosphorylierung in vivo eine Inaktivierung der C-RAF bewirkt. Der Zusammenhang zwischen der Behinderung der 14-3-3 Anlagerung durch Prohibitin und die Phosphorylierung in unmittelbarer Nachbarschaft bedarf weiterer Untersuchungen. Zusammengefasst liefern unsere Ergebnisse wichtige Informationen bezüglich der isoform-spezifischen Regulation der RAF Kinasen durch die Interaktion mit Ras und 14-3-3 Proteinen und helfen die komplexen Mechanismen der RAF Aktivierung weiter aufzuklären.
KW  - Signaltransduktion
KW  - Raf <Biochemie>
KW  - Biochemie
KW  - Ras
KW  - H-ras
KW  - Proteininteraktion
KW  - signal transduction
KW  - biochemistry
KW  - Ras
KW  - Raf
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48139
N1  - Aus rechtlichen Gründen sind die in der Dissertation abgedruckten, bereits in Zeitschriften veröffentlichten Artikel (Seiten 34 - 80) nicht in der elektronischen Version enthalten.
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Schwarz, Klaus
A1  - Hameister, Horst
A1  - Gessler, Manfred
A1  - Grzeschik, Karl-Heinz
A1  - Hansen-Hagge, Thomas E.
A1  - Bartram, Claus R.
T1  - Confirmation of the localization of the human recombination activating gene 1 (RAG1) to chromosome 11p13
N2  - The human recombination activating gene 1 (RAGl) has previously been mapped to chromosomes 14q and 11 p. Here we confirm the chromosome 11 assignment by two independent approaches: autoradiographic and fluorescence in situ hybridization to metaphase spreads and analysis of human-hamster somatic cell hybrid DNA by the polymerase chain reaction (PCR) and Southern blotting. Our results unequivocally localize RAG1 to llp13.
KW  - Biochemie
Y1  - 1994
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-59136
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Schwartz, Faina
A1  - Neve, Rachel
A1  - Eisenman, Robert
A1  - Gessler, Manfred
A1  - Bruns, Gail
T1  - A WAGR region gene between PAX-6 and FSHB expressed in fetal brain
N2  - Developmental delay or mental retardation is a frequent component of multi-system anomaly syndromes associated with chromosomal deletions. Isolation of genes involved in the mental dysfunction in these disorders should define loci important in brain formation or function. We have identified a highly conserved locus in the distal part of 11 p 13 that is prominently expressed in fetal brain. Minimal expression is observed in a number of other fetal tissues. The gene maps distal to PAX-6 but proximal to the loci for brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and the beta subunit of follicle stimulating hormone (FSHB), within a region previously implicated in the mental retardation component of some WAGR syndrome patients. Within fetal brain, the corresponding transcript is prominent in frontal, motor and primary visual cortex as weil as in the caudate-putamen. The characteristics of this gene, including the striking evolutionary conservation at the locus, suggest that the encoded protein may function in brain development.
KW  - Biochemie
Y1  - 1994
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-59125
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Müller, T.
A1  - Dieckmann, T.
A1  - Sebald, Walter
A1  - Oschkinat, H.
T1  - Aspects of receptor binding and signalling of interleukin-4 investigated by site-directed mutagenesis and NMR spectroscopy
N2  - Cytokines are hormones that carry information from ceJI to ceH. This information is read from their surface upon binding to transmembrane receptors and by the subsequent initiation of receptor oligomerization. An inftuence on this process through mutagenesis on the hormone surface is highly desirab)e for medical reasons. However, an understanding of hormone-receptor interactions requires insight into the structural changes introduced by the mutations. In this line structural studies on human TL-4 and the medically important IL-4 antagonists YI24D and Y124G are presented. The site a.round YI24 is an important epitope responsible for the a.bility of 11-4 t.o ca.use a signal in the target cells. It is shown that the local main-chain structure around residue 124 in the variants remains unchanged. A strategy is presented here which allows the study of these types of proteins and their variants by NMR which does not require carbon Iabeiied sa.mples.
KW  - Biochemie
KW  - Interleukin-4
KW  - protein structure
KW  - NMR
KW  - signal transduction
Y1  - 1994
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-62444
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Müller, T.
A1  - Sebald, Walter
A1  - Oschkinat, H.
T1  - Antagonist design through forced electrostatic mismatch
N2  - No abstract available
KW  - Biochemie
Y1  - 1994
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-62408
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Reusch, P.
A1  - Arnold, S.
A1  - Heusser, C.
A1  - Wagner, K.
A1  - Weston, B.
A1  - Sebald, Walter
T1  - Neutralizing monoclonal antibodies define two different functional sites in human interleukin-4
N2  - Human interleukin-4 (IL-4) is a small four-helix-bundle protein which is essential for organizing defense reactions against macroparasites, in particular helminths. Human IL-4 also appears to exert a pathophysiological role during various IgE-mediated allergic diseases. Seven different monoclonal antibodies neutralizing the activity of human IL-4 were studied in order to identify functionally important epitopes. A collection of 41 purified IL-4 variants was used to analyse how defined amino acid replacements affect binding affinity for each individual mAb. Specific amino acid positions could be assigned to four different epitopes. mAbs recognizing epitopes on helix A and/or C interfered with IL-4 receptor binding and thus inhibited IL-4 function. However, other mAbs also inhibiting IL-4 function recognized an epitope on helix D of IL-4 and did not inhibit IL-4 binding to the receptor protein. One mAb, recognizing N-terminal and C-terminal residues, partially competed for binding to the receptor. The results of these mAb epitope analyses confirm and extend previous data on the functional consequences of the amino acid replacements which showed that amino acid residues in helices A and C of IL-4 provide a binding site for the cloned IL-4 receptor and that a signalling site in helix D interacts with a further receptor protein.
KW  - Biochemie
Y1  - 1994
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-62418
ER  -