TY - THES A1 - Schwarz, Jessica Denise T1 - Genome-wide reporter screens identify transcriptional regulators of ribosome biogenesis T1 - Genomweite Reporterscreens identifizieren transkriptionelle Regulatoren ribosomaler Biogenese N2 - Cellular growth and proliferation are among the most important processes for cells and organisms. One of the major determinants of these processes is the amount of proteins and consequently also the amount of ribosomes. Their synthesis involves several hundred proteins and four different ribosomal RNA species, is highly coordinated and very energy-demanding. However, the molecular mechanims of transcriptional regulation of the protein-coding genes involved, is only poorly understood in mammals. In this thesis, unbiased genome-wide knockout reporter screens were performed, aiming to identify previously unknown transcriptional regulators of ribosome biogenesis factors (RiBis), which are important for the assembly and maturation of ribosomes, and ribosomal proteins (RPs), which are ribosomal components themself. With that approach and follow-up (validation) experiments, ALDOA and RBM8A among others, could be identified as regulators of ribosome biogenesis. Depletion of the glycolytic enzyme ALDOA led to a downregulation of RiBi- and RPpromoter driven reporters on protein and transcript level, as well as to a downregulation of ribosome biogenesis gene transcripts and of mRNAs of other genes important for proliferation. Reducing the amount of the exon junction complex protein RBM8A, led to a more prominent downregulation of one of the fluorescent reporters, but this regulation was independent of the promoter driving the expression of the reporter. However, acute protein depletion experiments in combination with nascent RNA sequencing (4sU-Seq) revealed, that mainly cytosolic ribosomal proteins (CRPs) were downregulated upon acute RBM8A withdrawal. ChIP experiments showed RBM8A binding to promoters of RP genes, but also to other chromatin regions. Total POL II or elongating and initiating POL II levels were not altered upon acute RBM8A depletion. These data provide a starting point for further research on the mechanisms of transcriptional regulation of RP and RiBi genes in mammals. N2 - Zelluläres Wachstum und Proliferation zählen zu den wichtigsten Prozessen für Zellen und Organismen. Eine der größten Determinanten dieser Prozesse ist die Menge an Proteinen und in der Konsequenz auch die Menge an Ribosomen. Deren Synthese erfordert mehrere hundert Proteine und vier verschiedene ribosomale RNA-Spezies, ist stark koordiniert und sehr energiefordernd. Dennoch sind die molekularen Mechanismen der transkriptionellen Regulation der beteiligten protein-kodierenden Gene in Säugetieren nur schlecht verstanden. In dieser Arbeit wurden hypothesenfreie genomweite Knockout-Reporterscreens mit dem Ziel durchgeführt, bisher unbekannte transkriptionelle Regulatoren von ribosomalen Biogenesefaktoren (RiBis), welche wichtig für den Zusammenbau und die Reifung der Ribosomen sind, und ribosomalen Proteinen (RPs), welche selbst ribosomale Bestandteile sind, zu identifizieren. Durch diesen Ansatz und nachfolgende (Validierungs- )Experimente, konnten unter anderem ALDOA und RBM8A als Regulatoren ribosomaler Biogenese identifiziert werden. Eine Depletion des glykolytischen Enzyms ALDOA führte sowohl zu einer Herunterregulation von RiBi- und RP-Promotor-gesteuerten Reportern auf Protein- und Transkriptebene, als auch zu einer Herunterregulation von ribosomalen Biogenesegentranskripten und von mRNAs anderer für die Proliferation wichtiger Gene. Eine Reduktion der Menge des Exon-Junction-Komplexproteins RBM8A führte zu einer deutlicheren Herunterregulation eines der beiden fluoreszierenden Reporter, aber diese Regulation war unabhängig vom Promotor, der die Expression des Reporters steuert. Akute Proteinabbauexperimente in Verbindung mit einer Sequenzierung naszenter RNA (4sU-Seq) zeigten allerdings, dass hauptsächlich zytosolische ribosomale Proteine (CRPs) nach akuter RBM8A-Depletion herunterreguliert waren. ChIP-Experimente zeigten RBM8A-Bindung an Promotoren von RP-Genen, aber auch an andere Chromatinregionen. Gesamt-POL II- oder elongierende und initiierende POL II-Mengen waren nach akuter RBM8A-Depletion nicht verändert. Diese Daten stellen einen Ausgangspunkt für weitere Forschung zu den Mechanismen transkriptioneller Regulation von RP- und RiBi-Genen in Säugetieren dar. KW - Ribosom KW - Fructosebisphosphat-Aldolase KW - Transkription KW - Genregulation KW - ribosome biogenesis KW - Rbm8a KW - genetic screen KW - reporter screen Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-279010 ER - TY - JOUR A1 - Mamontova, Victoria A1 - Trifault, Barbara A1 - Boten, Lea A1 - Burger, Kaspar T1 - Commuting to work: Nucleolar long non-coding RNA control ribosome biogenesis from near and far JF - Non-Coding RNA N2 - Gene expression is an essential process for cellular growth, proliferation, and differentiation. The transcription of protein-coding genes and non-coding loci depends on RNA polymerases. Interestingly, numerous loci encode long non-coding (lnc)RNA transcripts that are transcribed by RNA polymerase II (RNAPII) and fine-tune the RNA metabolism. The nucleolus is a prime example of how different lncRNA species concomitantly regulate gene expression by facilitating the production and processing of ribosomal (r)RNA for ribosome biogenesis. Here, we summarise the current findings on how RNAPII influences nucleolar structure and function. We describe how RNAPII-dependent lncRNA can both promote nucleolar integrity and inhibit ribosomal (r)RNA synthesis by modulating the availability of rRNA synthesis factors in trans. Surprisingly, some lncRNA transcripts can directly originate from nucleolar loci and function in cis. The nucleolar intergenic spacer (IGS), for example, encodes nucleolar transcripts that counteract spurious rRNA synthesis in unperturbed cells. In response to DNA damage, RNAPII-dependent lncRNA originates directly at broken ribosomal (r)DNA loci and is processed into small ncRNA, possibly to modulate DNA repair. Thus, lncRNA-mediated regulation of nucleolar biology occurs by several modes of action and is more direct than anticipated, pointing to an intimate crosstalk of RNA metabolic events. KW - long non-coding RNA KW - RNA polymerase II KW - nucleolus KW - ribosome biogenesis Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-242756 SN - 2311-553X VL - 7 IS - 3 ER - TY - THES A1 - Hovhanyan, Anna T1 - Functional analyses of Mushroom body miniature (Mbm) in growth and proliferation of neural progenitor cells in the central brain of Drosophila melanogaster T1 - Funktionelle Analyse des Mushroom body minature (Mbm) in das Wachstum und die Proliferation von neuronalen Vorläuferzellen im zentralen Gehirn von Drosophila melanogaster N2 - Zellwachstum und Zellteilung stellen zwei miteinander verknüpfte Prozesse dar, die dennoch grundsätzlich voneinander zu unterscheiden sind. Die Wiederaufnahme der Proliferation von neuralen Vorläuferzellen (Neuroblasten) im Zentralhirn von Drosophila nach der spät-embryonalen Ruhephase erfordert zunächst Zellwachstum. Der Erhalt der regulären Zellgröße ist eine wichtige Voraussetzung für die kontinuierliche Proliferation der Neuroblasten über die gesamte larvale Entwicklungsphase. Neben extrinsischen Ernährungssignalen ist für das Zellwachstum eine kontinuierliche Versorgung mit funktionellen Ribosomen notwendig, damit die Proteinsynthese aufrechterhalten werden kann. Mutationen im mushroom body miniature (mbm) Gen wurden über einen genetischen Screen nach strukturellen Gehirnmutanten identifiziert. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der funktionellen Charakterisierung des Mbm Proteins als neues nukleoläres Protein und damit seiner möglichen Beteiligung in der Ribosomenbiogenese. Der Vergleich der relativen Expressionslevel von Mbm und anderen nuklearen Proteinen in verschiedenen Zelltypen zeigte eine verstärkte Expression von Mbm in der fibrillären Komponente des Nukleolus von Neuroblasten. Diese Beobachtung legte die Vermutung nahe, dass in Neuroblasten neben generell benötigten Faktoren der Ribosomenbiogenese auch Zelltyp-spezifische Faktoren existieren. Mutationen in mbm verursachen Proliferationsdefekte von Neuroblasten, wirken sich jedoch nicht auf deren Zellpolarität, die Orientierung der mitotischen Spindel oder die Asymmetrie der Zellteilung aus. Stattdessen wurde eine Reduktion der Zellgröße beobachtet, was im Einklang mit einer Beeinträchtigung der Ribosomenbiogenese steht. Insbesondere führt der Verlust der Mbm Funktion zu einer Retention der kleinen ribosomalen Untereinheit im Nukleolus, was eine verminderte Proteinsynthese zur Folge hat. Interessanterweise wurden Störungen der Ribosomenbiogenese nur in den Neuroblasten beobachtet. Zudem ist Mbm offensichtlich nicht erforderlich, um Wachstum oder die Proliferation von Zellen der Flügelimginalscheibe und S2-Zellen zu steuern, was wiederum dafür spricht, dass Mbm eine Neuroblasten-spezifische Funktion erfüllt. Darüber hinaus wurden die transkriptionelle Regulation des mbm-Gens und die funktionelle Bedeutung von posttranslationalen Modifikationen analysiert. Mbm Transkription wird von dMyc reguliert. Ein gemeinsames Merkmal von dMyc Zielgenen ist das Vorhandensein einer konservierten „E-Box“-Sequenz in deren Promotorregionen. In der Umgebung der mbm-Transkriptionsstartstelle befinden sich zwei „E-Box“-Motive. Mit Hilfe von Genreporteranalysen konnte nachgewiesen werden, dass nur eine von ihnen die dMyc-abhängige Transkription vermittelt. Die dMyc-abhängige Expression von Mbm konnte auch in Neuroblasten verifiziert werden. Auf posttranslationaler Ebene wird Mbm durch die Proteinkinase CK2 phosphoryliert. In der C-terminalen Hälfte des Mbm Proteins wurden in zwei Clustern mit einer Abfolge von sauren Aminosäuren sechs Serin- und Threoninreste als CK2- Phosphorylierungsstellen identifiziert. Eine Mutationsanalyse dieser Stellen bestätigte deren Bedeutung für die Mbm Funktion in vivo. Weiterhin ergaben sich Evidenzen, dass die Mbm-Lokalisierung durch die CK2-vermittelte Phosphorylierung gesteuert wird. Obwohl die genaue molekulare Funktion von Mbm in der Ribosomenbiogenese noch im Unklaren ist, unterstreichen die Ergebnisse dieser Studie die besondere Rolle von Mbm in der Ribosomenbiogenese von Neuroblasten um Zellwachstum und Proliferation zu regulieren. N2 - Cell growth and cell division are two interconnected yet distinct processes. Initiation of proliferation of central brain progenitor cells (neuroblasts) after the late embryonic quiescence stage requires cell growth, and maintenance of proper cell size is an important prerequisite for continuous larval neuroblast proliferation. Beside extrinsic nutrition signals, cell growth requires constant supply with functional ribosomes to maintain protein synthesis. Mutations in the mushroom body miniature (mbm) gene were previously identified in a screen for structural brain mutants. This study focused on the function of the Mbm protein as a new nucleolar protein, which is the site of ribosome biogenesis. The comparison of the relative expression levels of Mbm and other nucleolar proteins in different cell types showed a pronounced expression of Mbm in neuroblasts, particularly in the fibrillar component of the nucleolus, suggesting that in addition to nucleolar components generally required for ribosome biogenesis, more neuroblast specific nucleolar factors exist. Mutations in mbm cause neuroblast proliferation defects but do not interfere with cell polarity, spindle orientation or asymmetry of cell division of neuroblasts. Instead a reduction in cell size was observed, which correlates with an impairment of ribosome biogenesis. In particular, loss of Mbm leads to the retention of the small ribosomal subunit in the nucleolus resulting in decreased protein synthesis. Interestingly, the defect in ribosome biogenesis was only observed in neuroblasts. Moreover, Mbm is apparently not required for cell size and proliferation control in wing imaginal disc and S2 cells supporting the idea of a neuroblast-specific function of Mbm. Furthermore, the transcriptional regulation of the mbm gene and the functional relevance of posttranslational modifications were analyzed. Mbm is a transcriptional target of dMyc. A common feature of dMyc target genes is the presence of a conserved E-box sequence in their promoter regions. Two E-box motifs are found in the vicinity of the transcriptional start site of mbm. Gene reporter assays verified that only one of them mediates dMyc-dependent transcription. Complementary studies in flies showed that removal of dMyc function in neuroblasts resulted in reduced Mbm expression levels. At the posttranslational level, Mbm becomes phosphorylated by protein kinase CK2. Six serine and threonine residues located in two acidic amino acid rich clusters in the C-terminal half of the Mbm protein were identified as CK2 phosphorylation sites. Mutational analysis of these sites verified their importance for Mbm function in vivo and indicated that Mbm localization is controlled by CK2-mediated phosphorylation. Although the molecular function of Mbm in ribosome biogenesis remains to be determined, the results of this study emphasize the specific role of Mbm in neuroblast ribosome biogenesis to control cell growth and proliferation. KW - Taufliege KW - Mbm KW - Neuroblast KW - cell growth KW - proliferation KW - ribosome biogenesis KW - CK2 KW - Myc KW - Vorläuferzellen KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-91303 ER - TY - JOUR A1 - Schwarz, Jessica Denise A1 - Lukassen, Sören A1 - Bhandare, Pranjali A1 - Eing, Lorenz A1 - Snaebjörnsson, Marteinn Thor A1 - García, Yiliam Cruz A1 - Kisker, Jan Philipp A1 - Schulze, Almut A1 - Wolf, Elmar T1 - The glycolytic enzyme ALDOA and the exon junction complex protein RBM8A are regulators of ribosomal biogenesis JF - Frontiers in Cell and Developmental Biology N2 - Cellular growth is a fundamental process of life and must be precisely controlled in multicellular organisms. Growth is crucially controlled by the number of functional ribosomes available in cells. The production of new ribosomes depends critically on the activity of RNA polymerase (RNAP) II in addition to the activity of RNAP I and III, which produce ribosomal RNAs. Indeed, the expression of both, ribosomal proteins and proteins required for ribosome assembly (ribosomal biogenesis factors), is considered rate-limiting for ribosome synthesis. Here, we used genetic screening to identify novel transcriptional regulators of cell growth genes by fusing promoters from a ribosomal protein gene (Rpl18) and from a ribosomal biogenesis factor (Fbl) with fluorescent protein genes (RFP, GFP) as reporters. Subsequently, both reporters were stably integrated into immortalized mouse fibroblasts, which were then transduced with a genome-wide sgRNA-CRISPR knockout library. Subsequently, cells with altered reporter activity were isolated by FACS and the causative sgRNAs were identified. Interestingly, we identified two novel regulators of growth genes. Firstly, the exon junction complex protein RBM8A controls transcript levels of the intronless reporters used here. By acute depletion of RBM8A protein using the auxin degron system combined with the genome-wide analysis of nascent transcription, we showed that RBM8A is an important global regulator of ribosomal protein transcripts. Secondly, we unexpectedly observed that the glycolytic enzyme aldolase A (ALDOA) regulates the expression of ribosomal biogenesis factors. Consistent with published observations that a fraction of this protein is located in the nucleus, this may be a mechanism linking transcription of growth genes to metabolic processes and possibly to metabolite availability. KW - ribosome biogenesis KW - Ribosomal protein gene KW - genetic screen KW - genome-wide screen KW - RBM8A KW - Y14 KW - AldoA KW - aldolase A Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-290875 SN - 2296-634X VL - 10 ER -