TY - THES A1 - Heib, Tobias T1 - The role of Rho GTPases in megakaryopoiesis and thrombopoiesis T1 - Die Rolle von Rho GTPasen in der Megakaryopoese und Thrombopoese N2 - Platelets, derived from megakaryocytes (MKs) in the bone marrow (BM), are small, anucleated cells that circulate in the bloodstream and are critical for thrombosis and hemostasis. Megakaryo- and subsequent thrombopoiesis are highly orchestrated processes involving the differentiation and maturation of MKs from hematopoietic stem cells (HSCs), after which MKs are able to release platelets into the bloodstream, a process termed proplatelet formation (PPF). Here, the MK penetrates the endothelial lining and releases cytoplasmic portions (proplatelets) into the blood stream, which finally mature into platelets within the ciruculation. PPF requires an extensive crosstalk as well as a tight regulation of the MK cytoskeleton, in which small GTPases of the Rho family, such as RhoA and Cdc42 are critically involved and play opposing roles. MK and platelet specific Cdc42 or RhoA-deficiency in mice results in macrothrombocytopenia. Moreover, RhoA deficient mice displayed a frequent mislocalization of entire MKs into BM sinusoids, a finding that was reverted upon concomitant lack of Cdc42 but accompanied by an aggravated macrothrombocytopenia. Whether receptors are involved in the process of transendothelial MK migration, however, remained unclear. In the first part of this thesis, a centrifugation-based method (‘spin isolation’) to harvest murine BM cells was established, which not only reduces experimental time, costs and animals but is also highly suitable for studies on primary and in vitro cultured BM-derived cells. The spin isolation was used particularly for MK studies during the course of the thesis. In the second part of this thesis, a MK- and platelet-specific RhoA/Cdc42 double-deficiency was shown to result in reduced expression of a variety of MK-specific glycoproteins and cytoskeletal regulators of importance during MK maturation and PPF, a phenotype culminating in virtually abolished platelet biogenesis. We thus uncovered that RhoA/Cdc42-regulated gene expression is a prerequisite for cytoplasmic MK maturation, but dispensable for endomitosis. In the third part of this thesis we analyzed mice double-deficient in RhoA and prominent MK receptors which are potentially involved in the regulation of PPF in the BM environment. We were able to show that integrins as well as the inhibitory receptor G6b-B are dispensable for transendothelial migration of RhoA-deficient MKs. Surprisingly however, the myelofibrosis and concomitant osteosclerosis observed in G6b-B single-deficient mice was attenuated in RhoA/G6b B double-deficient mice, thus implying an important role of RhoA during myelofibrotic disease progression. BM transplantation experiments furthermore revealed that not only the macrothrombocytopenia but also the transmigration of RhoA-deficient MKs is due to cell-intrinsic defects and not related to possible Pf4-Cre off-target effects in non-hematopoietic cells. In the last part of this study we demonstrated that the new approach for MK- and platelet-specific gene ablatation using Gp1ba-Cre deleter mice is associated with intrinsic MK defects and in addition results in insufficient depletion of RhoA compared to the Pf4-Cre model, positioning the latter still as the gold standard for studying MK biology. N2 - Thrombozyten, die von Megakaryozyten (MKs) im Knochenmark abgeschnürt werden, sind kleine, kernlose Zellen, die im Blutkreislauf zirkulieren und in Thrombose und Hämostase eine wichtige Rolle spielen. Während der Megakaryopoese differenzieren und reifen MKs von hämatopoetischen Stammzellen heran, um anschließend Thrombozyten in die Sinusoide des Knochenmarks zu entlassen. Dabei durchdringt der MK das Endothel und setzt zytoplasmatische Fragmente in den Blutstrom frei, die schließlich im Blutkreislauf zu Thrombozyten reifen. Der Prozess der Thrombozytenbildung erfordert eine umfangreiche Organisation des MK-Zytoskeletts, an der kleine GTPasen der Rho-Familie wie RhoA und Cdc42 kritisch beteiligt sind, wobei sie dabei gegensätzliche Rollen spielen. Der MK- und Thrombozyten-spezifische Verlust von Cdc42 oder RhoA in Mäusen führte zu einer Makrothrombozytopenie. Darüber hinaus wurde bei RhoA-defizienten Mäusen eine Fehllokalisation ganzer MKs in den Knochenmarkssinusoiden beobachtet, die bei gleichzeitigem Mangel von Cdc42, jedoch auf Kosten einer verschlimmerten Makrothrombozytopenie, wieder rückgängig gemacht wurde. Ob Rezeptoren am Prozess der transendothelialen MK Migration beteiligt sind, blieb bisher jedoch unklar. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde eine zentrifugationsbasierte Methode namens “Spin-Isolation” zur Gewinnung muriner Knochenmarkszellen etabliert, die nicht nur die Versuchszeit, Kosten und Anzahl der benötigten Versuchstiere reduziert, sondern sich auch sehr gut für Studien an primären und in vitro kultivierten Knochenmarkszellen eignet. Die Spin-Isolation wurde insbesondere für MK Studien im Rahmen der Dissertation eingesetzt. Im zweiten Teil dieser Arbeit zeigten wir, dass der gleichzeitige Verlust von RhoA und Cdc42 in MKs zu einer reduzierten Expression MK-spezifischer Glykoproteine und Zytoskelettregulatoren von Bedeutung für MK Reifung führte, wodurch die Thrombozytenbildung stark beinträchtigt war. Dadurch konnten wir aufzeigen, dass RhoA/Cdc42-regulierte Genexpression eine Voraussetzung für die zytoplasmatische MK-Reifung, nicht aber für die Endomitose, ist. Im dritten Teil dieser Arbeit analysierten wir Mäuse mit einer Doppeldefizienz in RhoA und prominenten MK-Rezeptoren, die möglicherweise mit der Regulation der Thrombozytenbildung im Knochenmark assoziiert sein könnten. Wir zeigten, dass sowohl Integrine als auch der inhibitorische Rezeptor G6b-B für die transendotheliale Migration von RhoA-defizienten MKs entbehrlich sind. Die bei G6b-B-defizienten Mäusen beobachtete Myelofibrose und Osteosklerose wurde jedoch bei RhoA/G6b-B doppelt defizienten Mäusen abgeschwächt, was eine wichtige Rolle von RhoA in myelofibrotischen Krankheitszuständen impliziert. Knochenmarktransplantationen zeigten darüber hinaus, dass nicht nur die Makrothrombozytopenie, sondern auch die Transmigration von RhoA-defizienten MKs auf zellintrinsische Defekte zurückzuführen ist und nicht mit den berichteten unspezifischen Effekten des Pf4-Cre Systems in nicht-hämatopoetischen Zellen einhergeht. Im letzten Teil dieser Studie zeigten wir, dass der neue Ansatz für die MK/Thrombozyten-spezifische Gendeletion mithilfe der Gp1ba-Cre Maus mit intrinsischen megakaryozytären Defekten assoziiert ist und darüber hinaus im Vergleich zum Pf4-Cre Modell zu einer unzureichenden Deletion von RhoA führte, wodurch Pf4-Cre immer noch der Goldstandard für Studien zu Megakaryozytenbiologie bleibt. KW - Megakaryozyt KW - Rho-Proteine KW - megakaryocyte KW - rho gtpases KW - thrombopoiesis KW - megakaryopoiesis Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216645 ER - TY - THES A1 - Heidenreich, Julius Frederik T1 - Characterization of the widely used Rac1-inhibitors NSC23766 and EHT1864 in mouse platelets T1 - Untersuchung der Rac1-Inhibitoren NSC23766 und EHT1864 in murinen Thrombozyten N2 - Platelet activation and aggregation at sites of vascular injury is critical to prevent excessive blood loss, but may also lead to life-threatening ischemic diseases, such as myocardial infarction and stroke. Extracellular agonists induce platelet activation by stimulation of platelet membrane receptors. Signal transduction results in reorganization of the cytoskeleton, shape change, platelet adhesion and aggregation, cumulating in thrombus formation. Several Rho GTPases, including Rac1, Cdc42 and RhoA, are essential mediators of subsequent intracellular transduction of ITAM- and GPCR-signaling. Therefore, inhibition or knockout can result in severely defective platelet signaling. Mice with platelet specific Rac1-deficiency are protected from arterial thrombosis. This benefit highlights further investigation of Rac1-specific functions and its potential as a new pharmacological target for prevention of cardiovascular diseases. Two newly developed synthetic compounds, NSC23766 and EHT1864, were proposed to provide highly specific inhibition of Rac1 activity, but both drugs have never been tested in Rac1-deficient cell systems to rule out potential Rac1-independent effects. This study revealed significant off-target effects of NSC23766 and EHT1864 that occurred in a dose-dependent fashion in both wild-type and Rac1-deficient platelets. Both inhibitors individually affected resting platelets after treatment, either by altering membrane protein expression (NSC23766) or by a marked decrease of platelet viability (EHT1864). Platelet apoptosis could be confirmed by enhanced levels of phosphatidylserine exposure and decreased mitochondrial membrane potential. Phosphorylation studies of the major effector proteins of Rac1 revealed that NSC23766 and EHT1864 abolish PAK1/PAK2 activation independently of Rac1 in wild-type and knockout platelets, which may contribute to the observed off-target effects. Additionally, this study demonstrated the involvement of Rac1 in G protein-coupled receptor-mediated platelet activation and GPIb-induced signaling. Furthermore, the data revealed that Rac1 is dispensable in the process of integrin IIb 3-mediated clot retraction. This study unveiled that new pharmacological approaches in antithrombotic therapy with Rac1 as molecular target have to be designed carefully in order to obtain high specificity and minimize potential off-target effects. N2 - Die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten nach Gefäßverletzungen ist entscheidend um starken Blutverlust zu vermeiden. Allerdings können diese Prozesse auch zu lebensbedrohlichen ischämischen Erkrankungen führen, wie beispielsweise Myokardinfarkt und Schlaganfall. Die Stimulation der Membranrezeptoren durch Triggersubstanzen leitet die Thrombozytenaktivierung und somit die Reorganisation des Zytoskeletts ein. Dies ermöglicht die Adhäsion und Aggregation der Thrombozyten und führt letztendlich zur Thrombusbildung. Die Rho GTPasen Rac1, Cdc42 und RhoA sind als wichtige Mediatoren an der intrazellulären Signaltransduktion beteiligt. Eine medikamentöse Hemmung oder ein genetischer Knockout kann daher die intrazellulären Signalkaskaden so stark beeinträchtigen, dass eine effiziente Aktivierung der Thrombozyten nicht mehr möglich ist. In Mäusen mit thrombozytenspezifischem Knockout von Rac1 wurde festgestellt, dass der Funktionsverlust von Rac1 gleichzeitig auch Schutz vor der Entwicklung von arterieller Thrombose bedeutet. Könnte man sich diese Tatsache pharmakologisch zunutze machen, würde die Hemmung von Rac1 möglicherweise einen neuen, erfolgsversprechenden Ansatz in der Prävention von kardiovaskulären Erkrankungen darstellen. Für den Forschungseinsatz wurden die zwei synthetischen Inhibitoren NSC23766 und EHT1864 entwickelt um Rac1-vermittelte Funktionen zu studieren. Beide Substanzen versprechen eine hochspezifische Hemmung der Rac(1)-Aktivität, wurden bisher jedoch nicht in Zellsystemen mit Rac1-Defizienz verwendet um die Substanzen kritisch auf mögliche, unerwünschte Nebenwirkungen zu untersuchen. In dieser Dissertation wurde gezeigt, dass NSC23766 und EHT1864 zwar effektive Hemmstoffe für Rac1 sind, allerdings genauso Rac1-unabhängige Nebenwirkungen verursachen. Beide Hemmstoffe führten zu Veränderungen der Thrombozyten: Während unter NSC23766 eine verminderte Expression von Membranrezeptoren beobachtet wurde, führte EHT1864 zu einer stark beeinträchtigten Vitalität der Thrombozyten. Anhand von erhöhten Phosphatidylserin-Werten und einer Veränderung des mitochondrialen Membranpotenzials in den behandelten Thrombozyten konnte die EHT1864-vermittelte Apoptose nachgewiesen werden. Letztendlich wurde anhand der verminderten Phosphorylierung von PAK1/PAK2 gezeigt, dass die Aktivierung dieser Rac1-Effektorproteine durch NSC23766 und EHT1864 direkt unterdrückt wird. Zusätzlich zu den Inhibitor-vermittelten Effekten wurde anhand von Rac1-defizienten Thrombozyten nachgewiesen, dass Rac1 auch an GPCR- und GPIb-vermittelten Signalkaskaden beteiligt ist. Außerdem wurde beobachtet, dass Rac1 für die Integrin IIb 3-vermittelte clot retraction entbehrlich ist. Die Ergebnisse dieser Studie legen dar, dass neue pharmakologische Substanzen für die antithrombotische Therapie mit Rac1 als Zielmolekül gründlich erforscht und hinterfragt werden müssen um die Spezifität zu maximieren und vor allem das Nebenwirkungsprofil zu minimieren. KW - Thrombozyt KW - Thrombose KW - Signaltransduktion KW - Enzyminhibitor KW - Rho-Proteine KW - mouse platelets KW - rac1 inhibitors Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-165453 ER -