TY - JOUR A1 - Mieczkowski, Mateusz A1 - Steinmetzger, Christian A1 - Bessi, Irene A1 - Lenz, Ann-Kathrin A1 - Schmiedel, Alexander A1 - Holzapfel, Marco A1 - Lambert, Christoph A1 - Pena, Vladimir A1 - Höbartner, Claudia T1 - Large Stokes shift fluorescence activation in an RNA aptamer by intermolecular proton transfer to guanine JF - Nature Communications N2 - Fluorogenic RNA aptamers are synthetic functional RNAs that specifically bind and activate conditional fluorophores. The Chili RNA aptamer mimics large Stokes shift fluorescent proteins and exhibits high affinity for 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzylidene imidazolone (DMHBI) derivatives to elicit green or red fluorescence emission. Here, we elucidate the structural and mechanistic basis of fluorescence activation by crystallography and time-resolved optical spectroscopy. Two co-crystal structures of the Chili RNA with positively charged DMHBO+ and DMHBI+ ligands revealed a G-quadruplex and a trans-sugar-sugar edge G:G base pair that immobilize the ligand by π-π stacking. A Watson-Crick G:C base pair in the fluorophore binding site establishes a short hydrogen bond between the N7 of guanine and the phenolic OH of the ligand. Ultrafast excited state proton transfer (ESPT) from the neutral chromophore to the RNA was found with a time constant of 130 fs and revealed the mode of action of the large Stokes shift fluorogenic RNA aptamer. KW - Fluorogenic RNA Aptamers KW - Synthetic Functional RNAs KW - Chili RNA Aptamer KW - Co-Crystal Structures of Chili RNA KW - RNA KW - Optical Spectroscopy KW - Structural Biology KW - X-ray Crystallography Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-254527 VL - 12 ER - TY - THES A1 - Wolski, Stefanie Carola T1 - Structural and functional characterization of nucleotide excision repair proteins T1 - Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von Nucleotid-Exzisions-Reparatur Proteinen N2 - XPD is a 5‘-3‘ helicase of the superfamily 2. As part of the transcription factor IIH it functions in transcription initiation and nucleotide excision repair. This work focus on the role of XPD in nucleotide excision repair. NER is a DNA repair pathway unique for its broad substrate range. In placental mammals NER is the only repair mechanism able to remove lesions induced by UV-light. NER can be divided into four different steps that are conserved between pro- and eukaryotes. Step 1 consists of the initial damage recognition, during step 2 the putative damage is verified, in step 3 the verified damage is excised and in the 4th and final step the resulting gap in the DNA is refilled. XPD was shown to be involved in the damage verification step. It was possible to solve the first apo XPD structure by a MAD approach using only the endogenous iron from the iron sulfur cluster. Based on the apo XPD structure several questions arise: where is DNA bound? Where is DNA separated? How is damage verification achieved? What is the role of the FeS cluster? These questions were addressed in this work. Hypothesis driven structure based functional mutagenesis was employed and combined with detailed biochemical characterization of the variants. The variants were analyzed by thermal unfolding studies to exclude the possibility that the overall stability could be affected by the point mutation. DNA binding assays, ATPase assays and helicase assays were performed to delineate amino acid residues important for DNA binding, helicase activity and damage recognition. A structure of XPD containing a four base pair DNA fragment was solved by molecular replacement. This structure displays the polarity of the translocated strand with respect to the helicase framework. Moreover the properties of the FeS cluster were studied by electron paramagnetic resonance to get insights into the role of the FeS cluster. Furthermore XPD from Ferroplasma acidarmanus was investigated since it was shown that it is stalled at CPD containing lesions. The data provide the first detailed insight into the translocation mechanism of a SF2B helicase and reveal how polarity is achieved. This provides a basis for further anlayses understanding the combined action of the helicase and the 4Fe4S cluster to accomplish damage verification within the NER cascade. N2 - XPD ist eine 5‘-3‘ Helicase der Superfamilie 2. Als Untereinheit des Transkriptionsfaktors IIH ist XPD in Transkriptionsinitiation und Nucleotid-Exzisions-Reparatur involviert. Diese Arbeit fokusiert auf die Rolle von XPD in der NER. NER ist ein DNA Reparatur Weg der bekannt ist für seine breite Substratspezifität. In Säugetieren ist NER der einzige Reparaturmechanismus, der fähig ist Läsionen zu reparieren, die durch UV Strahlung induziert werden. NER kann man in vier unterschiedliche Schritte aufteilen die zwischen Pro- und Eukaryoten konserviert sind. Schritt 1 besteht aus der initialen Schadenserkennung, während des zweiten Schrittes wird der mögliche Schaden verifiziert, im dritten Schritt wird der verifizierte Schaden ausgeschnitten und im vierten und letzten Schritt wird die resultierende Lücke in der DNA geschlossen. Es wurde gezeigt, dass XPD in die Schadensverifizierung involviert ist. Ein MAD Versuch, bei dem nur das endogene Eisen des Eisen-Schwefel-Clusters verwendet wurde ermöglichte die Strukturlösung der ersten apo XPD Struktur. Basierend auf der Struktur ergeben sich verschiedene Fragen: wo wird DNA gebunden? Wo wird DNA aufgetrennt? Wie wird Schadenserkennung ermöglicht? Was ist die Rolle des Eisen-Schwefel-Clusters? Diese Fragen werden in dieser Arbeit angesprochen. Strukturbasierte funktionelle Mutagenesestudien, die auf Hypothesen basiert sind, wurden angewendet und mit einer detailierten biochemischen Charakterizierung der Varianten kombiniert. Die Varianten wurden mittels thermischen Entfaltungsstudien analysiert, um die Möglichkeit auszuschliessen, dass die Stabilität durch die Punktmutation betroffen ist. DNA-Bindungs- Assays, ATPase Assays und Helikase Assays wurden durchgeführt um Aminosäurereste zu identifizieren, die für DNA Bindung, Helikase Aktivität und Schadenserkennung wichtig sind. Eine Struktur von XPD, die ein DNA Fragment mit vier Basen enthält, wurde mittels Molekularem Ersatz gelöst. Diese Struktur zeigt die Polarität des translozierenden DNA- Stranges im Verhältnis zu der Helikasestruktur auf. Desweiteren wurden die Eigenschaften des FeS Clusters mittels paramagnetischen Elektronenresonanz Studien untersucht, um Einblicke in die Rolle des FeS Clusters zu bekommen. Ausserdem wurde XPD aus Ferroplasma acidarmanus erforscht, da gezeigt wurde, dass es an CPD enthaltenden Läsionen hängen bleibt. Diese Daten stellen die ersten detailierten Einblicke in den Translokationsmechanismus einer SF2B Helikase dar und zeigen wie Polarität erzielt wird. Das ist eine Basis für weitere Analysen, um die kombinierte Aktion von Helikase und dem 4Fe4S Cluster zu verstehen, die zur Schadenserkennung in der NER Kaskade führt. KW - DNS-Reparatur KW - Helicasen KW - Kristallographie KW - XPD KW - Xeroderma pigmentosum KW - TFIIH KW - Nukleotid-Exzisions-Reparatur KW - X-ray Crystallography KW - XPD KW - TFIIH KW - Nucleotide-Excision-Repair KW - FeS cluster Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67183 ER -