TY - JOUR A1 - Haarmann, Axel A1 - Nehen, Mathias A1 - Deiß, Annika A1 - Buttmann, Mathias T1 - Fumaric acid esters do not reduce inflammatory NF-\(\kappa\)B/p65 nuclear translocation, ICAM-1 expression and T-cell adhesiveness of human brain microvascular endothelial cells JF - International Journal of Molecular Sciences N2 - Dimethyl fumarate (DMF) is approved for disease-modifying treatment of patients with relapsing-remitting multiple sclerosis. Animal experiments suggested that part of its therapeutic effect is due to a reduction of T-cell infiltration of the central nervous system (CNS) by uncertain mechanisms. Here we evaluated whether DMF and its primary metabolite monomethyl fumarate (MMF) modulate pro-inflammatory intracellular signaling and T-cell adhesiveness of nonimmortalized single donor human brain microvascular endothelial cells at low passages. Neither DMF nor MMF at concentrations of 10 or 50 \(\mu\)M blocked the IL-1\(\beta\)-induced nuclear translocation of NF-\(\kappa\)B/p65, whereas the higher concentration of DMF inhibited the nuclear entry of p65 in human umbilical vein endothelium cultured in parallel. DMF and MMF also did not alter the IL-1\(\beta\)-stimulated activation of p38 MAPK in brain endothelium. Furthermore, neither DMF nor MMF reduced the basal or IL-1\(\beta\)-inducible expression of ICAM-1. In accordance, both fumaric acid esters did not reduce the adhesion of activated Jurkat T cells to brain endothelium under basal or inflammatory conditions. Therefore, brain endothelial cells probably do not directly mediate a potential blocking effect of fumaric acid esters on the inflammatory infiltration of the CNS by T cells. KW - barrier integrity KW - proteins KW - multiple sclerosis KW - monomethyl fumarate KW - p38 mitogen-activated protein kinase KW - cell adhesion KW - NF-\(\kappa\)B KW - dimethyl fumarate KW - blood-brain barrier KW - endothelial cells KW - potent inducer KW - gene KW - drug KW - VCAM-1 Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-148295 VL - 16 ER - TY - JOUR A1 - Hartlieb, Eva A1 - Kempf, Bettina A1 - Partilla, Miriam A1 - Vigh, Balázs A1 - Spindler, Volker A1 - Waschke, Jens T1 - Desmoglein 2 Is Less Important than Desmoglein 3 for Keratinocyte Cohesion JF - PLoS ONE N2 - Desmosomes provide intercellular adhesive strength required for integrity of epithelial and some non-epithelial tissues. Within the epidermis, the cadherin-type adhesion molecules desmoglein (Dsg) 1-4 and desmocollin (Dsc) 1-3 build the adhesive core of desmosomes. In keratinocytes, several isoforms of these proteins are co-expressed. However, the contribution of specific isoforms to overall cell cohesion is unclear. Therefore, in this study we investigated the roles of Dsg2 and Dsg3, the latter of which is known to be essential for keratinocyte adhesion based on its autoantibody-induced loss of function in the autoimmune blistering skin disease pemphigus vulgaris (PV). The pathogenic PV antibody AK23, targeting the Dsg3 adhesive domain, led to profound loss of cell cohesion in human keratinocytes as revealed by the dispase-based dissociation assays. In contrast, an antibody against Dsg2 had no effect on cell cohesion although the Dsg2 antibody was demonstrated to interfere with Dsg2 transinteraction by single molecule atomic force microscopy and was effective to reduce cell cohesion in intestinal epithelial Caco-2 cells which express Dsg2 as the only Dsg isoform. To substantiate these findings, siRNA-mediated silencing of Dsg2 or Dsg3 was performed in keratinocytes. In contrast to Dsg3-depleted cells, Dsg2 knockdown reduced cell cohesion only under conditions of increased shear. These experiments indicate that specific desmosomal cadherins contribute differently to keratinocyte cohesion and that Dsg2 compared to Dsg3 is less important in this context. KW - expression KW - inhibition KW - DSG2 KW - cell adhesion KW - desmosomal cadherins KW - pemphigus vulgaris KW - phenotype KW - mice KW - transinteraction KW - reorganization Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-131192 VL - 8 IS - 1 ER - TY - THES A1 - Dwertmann, Anne T1 - Impact of the Tumor Suppressor Arf on Miz1 and Sumoylation of Myc and Miz1 T1 - Wirkung des Tumorsuppressors Arf auf Miz1 und Sumoylierung von Myc und Miz1 N2 - Upon oncogenic stress, the tumor suppressor Arf can induce irreversible cell cycle arrest or apoptosis, depending on the oncogenic insult. In this study, it could be shown that Arf interacts with Myc and the Myc-associated zinc-finger protein Miz1 to facilitate repression of genes involved in cell adhesion. Formation of a DNA-binding Arf/Myc/Miz1 complex disrupts interaction of Miz1 with its coactivator nucleophosmin and induces local heterochromatinisation, causing cells to lose attachment and undergo anoikis. The assembly of the complex relies on Myc, which might explain why high Myc levels trigger apoptosis and not cell cycle arrest in the Arf response. This mechanism could play an important role in eliminating cells harboring an oncogenic mutation. Arf furthermore induces sumoylation of Miz1 at a specific lysine by repressing the desumoylating enzyme Senp3. A sumoylation-deficient mutant of Miz1 however does not show phenotypic differences under the chosen experimental conditions. Myc can also be modified by Sumo by multisumoylation at many different lysines, which is unaffected by Arf. The exact mechanism and effect of this modification however stays unsolved. N2 - Der Tumorsuppressor Arf wird durch onkogenen Stress induziert und kann entweder einen irreversiblen Zellzyklusarrest oder Apoptose auslösen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Arf mit Myc und dem Myc-interagierenden Zinkfingerprotein Miz1 assoziiert und dadurch Gene der Zelladhäsion reprimiert. Die Ausbildung eines DNA-bindenden Arf/Myc/Miz1 Komplexes verhindert eine Interaktion von Miz1 mit seinem Koaktivator Nucleophosmin und führt zur lokalen Ausbildung von Heterochromatin, was zum Ablösen der Zellen und schließlich zur Anoikis führt. Die Komplexbildung setzt die Beteiligung von Myc voraus, was erklären könnte warum hohe Mengen an Myc über Arf Apoptose und nicht Zellzyklusarrest auslösen. Dieser Mechanismus könnte eine wichtige Rolle bei der Eliminierung von Zellen mit einer onkogenen Mutation spielen. Arf induziert darüber hinaus die Sumoylierung von Miz1 an einem bestimmten Lysin indem es das desumoylierende Enzyme Senp3 inhibiert. Eine Mutante von Miz1 die nicht mehr sumoyliert werden kann zeigt jedoch in den durchgeführten Untersuchungen keinen anderen Phänotyp als Wildtyp Miz1. Myc kann ebenfalls an vielen verschiedenen Lysinen mit Sumo modifiziert werden, wobei Arf jedoch keine Rolle spielt. Der genaue Mechanismus und Effekt dieser Modifikation konnte jedoch nicht geklärt werden. KW - Apoptosis KW - Myc KW - Repression KW - Anoikis KW - Zelladhäsion KW - Miz1 KW - Sumo KW - Sumoylierung KW - arf KW - anoikis KW - cell adhesion KW - Miz1 KW - sumo KW - sumoylation Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71876 ER - TY - THES A1 - Saxena, Ambrish T1 - Role of the novel protein tyrosine phosphatase AUM for cell adhesion T1 - Die Rolle des neuen Proteins "Tyrosin phosphatase" AUM für Zell-Adhäsion N2 - Cell adhesion and migration are essential for development and homeostasis. Adhesion to the extracellular matrix occurs at specialized plasma membrane domains where transmembrane adhesion receptors, signaling proteins such as kinases and phosphatases, and a large number of adaptor proteins interact with the cytoskeleton in a tightly regulated and synchronized fashion. Whereas altered cell adhesion and migration are known to be important in cardiovascular disease and malignant tumors, the target proteins and molecular interactions that regulate these complex processes still remain incompletely understood. Whereas numerous kinases are known to regulate cell adhesion dynamics, information about the involved protein phosphatases is still very limited. A newly emerging phosphatase family contains the unconventional active site sequence DXDX(T/V) and belongs to the haloacid dehalogenase (HAD) superfamily of hydrolases. Our laboratory has recently discovered AUM, a novel phosphatase that belongs to this poorly characterized enzyme family. Initial findings pointed toward a potential involvement of AUM in the regulation of cell adhesion to the extracellular matrix. The objective of the present study was to study the potential role of AUM in cell adhesion. We could show that cells stably depleted of AUM are characterized by accelerated adhesion on immobilized fibronectin. To confirm these findings, we used an siRNA-based approach for the acute depletion of AUM and observed a similar phenomenon. Rescue experiments were performed with stably AUM-depleted cells to ensure that the above mentioned effects are indeed AUM specific. We observed that the re-addition of AUM normalizes cellular adhesion kinetics on fibronectin. These results clearly show that AUM exerts important functions in cell-matrix adhesion. To investigate the molecular basis of these effects, we have characterized integrin expression patterns using flow cytometry. Interestingly, fibronectin-stimulated AUM-depleted cells are characterized by an increase in the cell surface expression of conformationally active 1-integrins. Consistent with the important role of 1-integrins in the regulation of RhoA activity, we also observed a specific increase in RhoA-GTP, but not Rac1-GTP-levels during cell adhesion to fibronectin. Consistent with these findings and with the important role of RhoA for focal adhesion maturation, AUM depleted cells showed more elongated and more centripetally oriented focal adhesions as compared to control cells when spread on fibronectin. Taken together, this study has revealed an important role of AUM for cell-matrix adhesion. Our findings strongly suggest that AUM functions as a negative regulator of 1-integrins and RhoA-dependent cytoskeletal dynamics during cell adhesion. N2 - Die Adhäsion und Migration von Zellen auf extrazellulären Matrixmolekülen ist essentiell für die Entwicklung und Homöostase vielzelliger Organismen. Die Adhäsion an extrazellulärer Matrix findet über spezialisierte Plasmamembran-Domänen statt, an denen transmembranäre Adhäsionsrezeptoren, Signalproteine wie Kinasen und Phosphatasen und eine große Anzahl von Adapterproteinen auf eng regulierte und synchronisierte Weise mit dem Zytoskelett interagieren. Während feststeht, dass Veränderungen der Zelladhäsion und Migration eine wichtige Rolle zum Beispiel bei kardiovaskulären Erkrankungen und bei metastasierenden Tumoren spielen, sind die Schlüsselmoleküle und Protein-Protein-Interaktionen, welche diese Prozesse regulieren immer noch unvollständig verstanden. Obwohl von zahlreichen Kinasen bekannt ist, dass sie die Zelladhäsions-Dynamik regulieren, existieren kaum Informationen über an diesen Prozessen beteiligte Phosphatasen. Seit Kurzem wird einer noch wenig charakterisierten Phosphatase-Familie mit der unkonventionellen Aminosäuresequenz DXDX(T/V) im aktiven Zentrum des Enzyms vermehrt Beachtung geschenkt. Diese Phosphatasen gehören zur Haloazid-Dehalogenase (HAD) Superfamilie von Hydrolasen. Unserem Labor ist es kürzlich gelungen, eine neue Phosphatase aus dieser Enzymfamilie zu identifizieren. Erste Befunde aus unserer Arbeitsgruppe weisen darauf hin, dass AUM möglicherweise an der Regulation der Zelladhäsion an extrazelluläre Matrixmoleküle beteiligt sein könnte. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die mögliche Rolle von AUM bei der Zelladhäsion genauer zu untersuchen. Es gelang uns zu zeigen, dass stabil AUM-shRNA exprimierende Zellen durch eine beschleunigte Adhäsion auf immobilisiertem Fibronektin gekennzeichnet sind. Um diese Befunde zu erhärten, wurde endogenes AUM mittels transienter Expression von siRNAs akut depletiert. Auch unter diesen Bedingungen konnte gezeigt werden, dass eine Reduktion der endogenen AUM-Proteinexpression die Zelladhäsion auf Fibronektin beschleunigt. Weiterhin wurden rescue-Experimente mit stabil AUM-depletierten Zellen durchgeführt, um sicherzustellen, dass die oben genannten Effekte spezifisch sind. Dabei wurde beobachtet, dass die Re-Expression von AUM die zelluläre Adhäsionskinetik auf Fibronektin normalisiert. Diese Ergebnisse belegen eindeutig, dass AUM wichtige Funktionen bei der Zell-Matrix-Adhäsion erfüllt. Um die molekulare Grundlage dieser Effekte zu untersuchen, haben wir zunächst das zelluläre Integrin-Expressionsmuster mittels Durchflußzytometrie charakterisiert. Interessanterweise konnte nachgewiesen werden, dass Fibronektin-stimulierte, AUM-depletierte Zellen vermehrt 1-Integrine in ihrer aktiven Konformation auf der Zelloberfläche exprimieren. Übereinstimmend mit der wichtigen Rolle von 1-Integrinen für die Regulation der RhoA-Aktivität konnten wir auch eine spezifische Zunahme der RhoA-GTP, nicht aber der Rac1-GTP-Spiegel während der Zelladhäsion auf Fibronektin beobachten. Konsistent mit diesen Ergebnissen und der bekannten Rolle von RhoA für die Reifung fokaler Adhäsionen, zeigten AUM-depletierte Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen vermehrt elongierte und zentripetal orientierte fokale Adhäsionen. Zusammengenommen ist es in der vorliegenden Arbeit gelungen, eine wichtige Rolle von AUM bei der Zell-Matrix-Adhäsion aufzudecken. Unsere Befunde legen nahe, dass AUM im Rahmen der Zell-Adhäsion als ein negativer Regulator von 1-Integrinen und der RhoA-abhängigen Zytoskelett-Dynamik fungiert. KW - Proteintyrosinphosphatase KW - Zelladhäsion KW - Tyrosin phosphatase KW - Zell-Adhäsion KW - AUM KW - tyrosine phosphatase KW - AUM KW - cell adhesion Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65503 ER - TY - THES A1 - Heupel, Wolfgang-Moritz Felix T1 - Role and modulation of cadherins in pathologic processes T1 - Rolle und Modulation von Cadherinen in pathologischen Prozessen N2 - Ca2+ dependent cell adhesion molecules (cadherins) are central for a variety of cell and tissue functions such as morphogenesis, epithelial and endothelial barrier formation, synaptic function and cellular signaling. Of paramount importance for cadherin function is their specific extracellular adhesive trans-interaction. Cadherins are embedded in a cellular environment of intracellular and extracellular regulators that modify cadherin binding in response to various physiological and pathological stimuli. Most experimental approaches used for studying cadherin interaction however lack a physiological proof of principle mostly by not investigating cadherins in their physiological environment. In the present cumulative dissertation, experimental approaches were applied to characterize and modulate vascular endothelial (VE)-cadherin and desmocadherin functions in the (patho-)physiological contexts of endothelial permeability regulation and disturbance of epidermal barrier function, which is typical to the blistering skin disease pemphigus, respectively. Whereas VE-cadherin is a key regulator of the endothelial barrier that separates the blood compartment from the interstitial space of tissues, desmosomal cadherins are crucial for maintenance of epidermal integrity and separation of the external environment from the body’s internal milieu. Cadherin functions were both investigated in cell-free and cell-based conditions: by using biophysical single molecule techniques like atomic force microscopy (AFM), cadherin function could be investigated in conditions, where contributions of intracellular signaling were excluded. These experiments were, however, compared and combined with cell-based experiments in which cadherins of epidermal or endothelial cell cultures were probed by laser force microscopy (laser tweezers), fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and other techniques. The autoimmune blistering skin diseases pemphigus foliaceus (PF) and pemphigus vulgaris (PV) are caused by autoantibodies directed against the extracellular domains of the desmosomal cadherins desmoglein (Dsg) 1 and 3, which are important for epidermal adhesion. The mechanism of autoantibody-induced cell dissociation (acantholysis) in pemphigus, however, is still not fully understood. For the first time, it is shown by AFM force spectroscopy that pemphigus autoantibodies directly inhibit Dsg3 adhesion by steric hindrance but do not inhibit adhesion of Dsg1. However, the full pathogenicity of the autoantibodies depended on cellular signaling processes, since autoantibodies targeting Dsg1 also resulted in loss of cadherin-mediated adhesion in cell-based experiments. However, two other signaling pathways that have been reported to be involved in pemphigus pathogenesis, i.e. epidermal growth factor receptor (EGFR) and c-Src activation, were not found to be important in this context. Furthermore, peptide-based modulators of cadherin functions were generated for Dsg1/3 and VE-cadherin. By comparing Dsg1, Dsg3 and VE-cadherin sequences to published X-ray structures of cadherin trans-interactions, specific amino acid sequences of the binding pockets of these cadherins were identified. Peptide versions of these motifs were synthesized and the antagonistic functions of these “single peptides” were validated by AFM force spectroscopy as well as by cell-based assays. By linking two single peptides in tandem, stabilization of cadherin bonds because of by cross-bridge formation between trans-interacting cadherins was demonstrated. Protective effects of tandem peptides were shown by partly preventing pemphigus autoantibody-induced acantholysis, or in the case of VE-cadherin, by stabilizing endothelial barrier properties against barrier disrupting agents like the Ca2+ ionophore A23187 and an inhibitory VE-cadherin antibody. Most importantly, VE-cadherin tandem peptides abolished microvascular hyperpermeability induced by the physiologic inflammatory agent tumor necrosis factor-α in the rat mesentery in vivo. Both classes of tandem peptides therefore can be considered as a starting point for the generation of potential therapeutic agents that might prevent cell dissociation in pemphigus and breakdown of the endothelial barrier under inflammatory conditions. N2 - Die Familie der Ca2+ - abhängigen Adhäsionsproteine (Cadherine) spielt eine zentrale Rolle bei elementaren zellulären, geweblichen und Entwicklungsprozessen. Eine in der vorliegenden kumulativen Dissertation untersuchte Funktion von Cadherinen ist ihre Rolle beim Aufbau und der Aufrechterhaltung der epidermalen Barriere der Haut und der endothelialen Barriere von Blutgefäßen. Cadherine vermitteln Adhäsion über die extrazelluläre Bindung mit Cadherinen auf der Zelloberfläche angrenzender Zellen. Die durch Cadherine vermittelte Zelladhäsion ist ein dynamischer Prozess, der durch extrazelluläre und intrazelluläre Modulatoren im Zusammenspiel mit vielfältigen physiologischen Prozessen reguliert wird. Vielen Experimentalsystemen fehlt der realistische physiologische und gewebliche Bezug zur funktionellen Bedeutung der untersuchten Eigenschaften der Cadherine. In der vorliegenden kumulativen Dissertation wurden verschiedene Ansätze zur Untersuchung und Modulation von Cadherinen im Hinblick zweier (patho-)physiologischer Prozesse durchgeführt. Zum einen befasst sich die Doktorarbeit mit den Blasen-bildenden Hauterkrankungen der Pemphigus-Gruppe, bei welcher die Funktionsstörung desmosomaler Cadherine im Mittelpunkt steht. Zum anderen wurde das vaskuläre endotheliale (VE)-Cadherin und dessen Rolle bei der Regulation und pathologischen Entgleisung der Gefäßpermeabilität untersucht. Die Funktion dieser Cadherine wurde in der Arbeit sowohl in Zell-freien als auch in Zell-basierten Experimenten analysiert: mittels biophysikalischer Charakterisierung auf Einzelmolekülebene durch Kraftspektroskopie mit dem Atomkraftmikroskop (AFM) konnte die Adhäsion (Transinteraktion) von Cadherinen frei von zellulären Einflüssen isoliert untersucht werden. Diese Einzelmolekülstudien wurden durch Laserkraftmikroskopie (Laserpinzette) und verschiedene zellphysiologische Untersuchungen an epithelialen und endothelialen Zellkulturen und Geweben komplettiert. Bei der autoimmunen Hauterkrankung Pemphigus foliaceus (PF) und Pemphigus vulgaris (PV) bewirken Autoantikörper, die gegen die desmosomale Cadherine Desmoglein (Dsg) 1 und 3 gerichtet sind, eine Zelldissoziation (Akantholyse), die zu einer charakteristischen Blasenbildung auf der Haut der Patienten teils mit Ablösung der Epidermis führt. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe der AFM-Kraftspektroskopie zum ersten Mal gezeigt, dass Pemphigus-Autoantikörper direkt die Dsg3-vermittelte Adhäsion durch sterische Behinderung inhibieren. Zusätzlich wurden auch Unterschiede in der Pathogenität der Autoantikörper in Abhängigkeit von zellulären Signalwegen gefunden. In früheren Studien konnte bereits gezeigt werden, dass neben der vermuteten Hemmung der Cadherinbindung durch die Autoantikörper auch inhibitorische, die Zelladhäsion herabsetzende zytoplasmatische Signalwege für die Pathogenese dieser Krankheit wichtig sind. Daneben belegen Experimente dieser Arbeit, dass die durch Autoantikörper vermittelte Akantholyse in unseren Versuchsbedingungen unabhängig von der in anderen Studien postulierten Beteilung des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) und von c-Src war. In weiteren Experimenten wurden Peptide zur Modulation der Funktion von Dsg1/3 und VE-Cadherin entwickelt. Dazu wurden die Sequenzen von Dsg1, Dsg3 und VE-Cadherin mit bereits beschriebenen Röntgenkristallstrukturen von anderen Cadherinen verglichen und eigene Strukturmodelle auf der Grundlage einer Analogiemodellierung generiert. Auf diese Weise wurden Sequenzabschnitte identifiziert, die für die Cadherin-Transinteraktion wichtig sind. Aus diesen Sequenzen wurden Peptide abgeleitet, die die Cadherinfunktion entweder in einer agonistischen oder antagonistischen Weise beeinflussen sollten. Die inhibitorische Funktion der Einzelpeptide wurde sowohl durch AFM-Kraftspektroskopie als auch in Zell-basierten Laserpinzetten-Studien validiert. Durch das Zusammenfügen von zwei separaten Einzelpeptidsequenzen wurden Tandempeptide erzeugt. Diese sollten die jeweilige Cadherininteraktion durch das Überbrücken benachbarter adhäsiver Cadherindomänen stabilisieren. Das Dsg-spezifische Tandempeptid verhinderte teilweise die durch Autoantikörper hervorgerufene Akantholyse beim Pemphigus und das VE-Cadherin-spezifische Tandempeptid schützte die Endothelbarriere vor Permeabilitätserhöhung durch das Ca2+ - Ionophor A23187 oder durch einen inhibitorischen VE-Cadherin-Antikörper. In in-vivo-Experimenten an perfundierten Mikrogefäßen des Rattenmesenteriums verhinderte das VE-Cadherin-Tandempeptid den Anstieg der Endothelpermeabilität durch den physiologischen Entzündungsmediator Tumornekrosefaktor-α. Die Tandempeptide können als Ausgangspunkt für die Identifikation von spezifischen therapeutischen Agenzien zur Prävention der Akantholyse beim Pemphigus oder Verlust der VE-Cadherin-Bindung bei vaskulärer Hyperpermeabilität angesehen werden. KW - Cadherine KW - Zelladhäsion KW - Pemphigus KW - Desmosom KW - Endothel KW - Zelladhäsion KW - Cadherine KW - Desmogleine KW - VE-Cadherin KW - cell adhesion KW - cadherins KW - desmosomes Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52716 ER -