TY - THES A1 - Kasaragod, Vikram Babu T1 - Biochemical and Structural Basis for the Moonlighting Function of Gephyrin T1 - Biochemische und Strukturelle Basis für die duale Funktionalität von Gephyrin N2 - Neurons are specialized cells dedicated to transmit the nerve impulses throughout the human body across specialized structures called synapses. At the synaptic terminals, a crosstalk between multiple macromolecules regulates the structure and function of the presynaptic nerve endings and the postsynaptic recipient sites. Gephyrin is the central organizer at inhibitory postsynaptic specializations and plays a crucial role in the organization of these structures by anchoring GABAA receptors (GABAAR) and glycine receptors (GlyR) to the postsynaptic membrane. This 93 kDa protein features an N-terminal G domain and a C-terminal E domain and the latter interacts directly with the intracellular loop between transmembrane helices 3 and 4 of certain subunits of the GlyRs and GABAARs. Biochemical and structural analyses have already provided valuable insights into the gephyrin-GlyR interaction. Interestingly, biochemical studies on the gephyrin-GABAAR interaction demonstrated that the GABAARs also depend on the same binding site as the GlyRs for the interaction with the gephyrin, but the molecular basis for this receptor specific interaction of gephyrin was still unknown. Co-crystal structures of GephE-GABAAR α3- derived peptides with supporting biochemical data presented in this study deciphered the receptor-specific interactions of gephyrin in atomic detail. In its moonlighting function, gephyrin also catalyzes the terminal step of the evolutionarily conserved molybdenum cofactor biosynthesis. Molybdenum, an essential transition element has to be complexed with a pterin-based cofactor resulting in the formation of the molybdenum cofactor (Moco). Moco is an essential component at the active site of all molybdenum-containing enzymes with the exception of nitrogenase. Mutations in enzymes involved in this pathway lead to a rare yet severe disease called Moco deficiency, which manifest itself in severe neurodevelopmental abnormalities and early childhood death. Moco biosynthesis follows a complex multistep pathway, where in the penultimate step, the N-terminal G domain of gephyrin activates the molybdopterin to form an adenylated molybdopterin intermediate. In the terminal step, this intermediate is then transferred to the C-terminal E domain of gephyrin, which catalyzes the metal insertion and deadenylation reaction to form active Moco. Previous biochemical and structural studies provided valuable insights into the penultimate step of the Moco biosynthesis but the terminal step remained elusive. Through the course of my dissertation, I crystallized the C-terminal E domain in the apo-form as well as in complex with ADP and AMP. These structures shed lightonto the deadenylation reaction and the formation of a ternary E-domain-ADP-Mo/W complex and thus provide structural insight into the metal insertion mechanism. Moreover, the structures also provided molecular insights into a mutation leading to Moco deficiency. Finally, ternary complexes of GephE, ADP and receptor-derived peptides provided first clues regarding the integration of gephyrin’s dual functionality. In summary, during the course of the dissertation I was able to derive high resolution structural insights into the interactions between gephyrin and GABAARs, which explain the receptor-specific interaction of gephyrin and, furthermore, these studies can be extended in the future to understand GABAAR subunit-specific interactions of gephyrin. Finally, the understanding of Moco biosynthesis shed light on the molecular basis of the fatal Moco deficiency. N2 - Neurone sind spezialisierte Zellen, die über die Synapsen Nervenimpulse im menschlichen Körper übertragen. An den synaptischen Enden reguliert ein Netzwerk aus einer Vielzahl von Makromolekülen die Struktur und die Funktion der präsynaptischen Nervenenden und der postsynaptischen Kontaktstellen. Gephyrin ist der Hauptorganisator an inhibitorischen, postsynaptischen Spezialisierungen und spielt durch die Verankerung von GABAA-Rezeptoren (GABAAR) und Glycinrezeptoren (GlyR) in der postsynaptischen Membran eine zentrale Rolle für den Aufbau dieser Strukturen. Dieses 93 kDa Protein enthält eine N-terminale G-Domäne (GephG) und eine C-terminale E-Domäne (GephE), wobei letztere direkt mit der intrazellulären unstrukturierten Region zwischen Transmembranhelices 3 und 4 bestimmter Untereinheiten der GlyR und GABAAR interagiert. Biochemische und strukturelle Analysen lieferten bereits wertvolle Erkenntnisse über die Gephyrin-GlyR Interaktion. Interessanterweise zeigten Versuche zur Gephyrin-GABAAR Interaktion, dass GABAARs die gleiche Bindungsstelle auf Gephyrin benutzen wie GlyRs, wobei die molekulare Basis für diese Interaktion nicht bekannt war. In dieser Arbeit zeige ich Co-Kristallstrukturen von GephE-GABAARα3 sowie unterstützende biochemische Daten, die die atomaren Details der rezeptorspezifischen Interaktionen von Gephyrin entschlüsseln. Als zweite Funktion katalysiert Gephyrin den terminalen Schritt der evolutionär konservierten Molybdän Cofaktor Biosynthese. Dabei muss das essentielle Übergangselement Molybdän mit einem Pterin-basierten Cofaktor komplexiert werden, um den Molybdän Cofaktor (Moco) zu bilden. Moco ist essentieller Bestandteil im aktiven Zentrum aller Molybdän-enthaltenden Enzyme mit Ausnahme der Nitrogenase. Mutationen in Enzymen, die in die Molybdän Cofaktor Biosynthese involviert sind, verursachen eine Moco Defizienz, eine seltene, jedoch schwere Erkrankung, die sich durch schwere neurologische Entwicklungsstörungen und Tod im frühen Kindesalter äußert. Die Moco Biosynthese folgt einem komplexen mehrstufigen Ablauf. Im vorletzten Schritt adenyliert GephG das Molybdopterin und ein Zwischenprodukt entsteht. Im letzten Schritt wird dieses Zwischenprodukt auf GephE übertragen, das die Insertion des Metalls und die Deadenylierungsreaktion katalysiert, wodurch der aktive Moco entsteht. Frühere biochemische und strukturelle Studien brachten wertvolle Erkenntnisse über den vorletzten Schritt der Moco Biosynthese, aber die Kenntnisse über den letzten Schritt blieben vage. Während meiner Dissertation kristallisierte ich GephE in der apo-Form sowie im Komplex mit ADP oder AMP. Diese Strukturen gaben Aufschluss über die Deadenylierungsreaktion und die Formation eines ternären GephE-ADP-Mo/W Komplexes und gewährten so einen strukturellen Einblick in den Mechanismus der Metallinsertion. Darüber hinaus ermöglichten die Strukturen eine Mutation, die zu Moco Mangel führt, auf molekularer Ebene zu verstehen. Schließlich lieferten ternäre Komplexe aus GephE, ADP und von Rezeptoren abgeleiteten Peptiden ersten Aufschluss bezüglich der Verflechtung von Gephyrins dualer Funktion. Zusammenfassend konnte ich während der Dissertation hochauflösende strukturelle Einblicke in den Komplex aus GephE und GABAAR α3 Untereineinheit gewinnen, die die rezeptorspezifische Interaktion von Gephyrin erklären. Weiterhin können diese Studien in der Zukunft ausgeweitet werden, um die GABAAR-untereinheitenspezifische Interaktion mit Gephyrin zu verstehen. Schließlich erlauben die Studien zur Moco Biosynthese die tödliche Moco Defizienz auf molekularer Ebene zu verstehen. KW - Gephyrin KW - Moco biosynthesis Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-143077 ER - TY - THES A1 - Wencker, Freya Dorothea Ruth T1 - The methionine biosynthesis operon in \(Staphylococcus\) \(aureus\): Role of concerted RNA decay in transcript stability and T-box riboswitch turnover T1 - Das Methioninbiosynthese-Operon in \(Staphylococcus\) \(aureus\): Der Einfluss von koordiniertem RNA Abbau auf Transkriptstabilität und T-Box-Riboswitch-Prozessierung N2 - Methionine is the first amino acid of every newly synthesised protein. In combination with its role as precursor for the vital methyl-group donor S-adenosylmethionine, methionine is essential for every living cell. The opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is capable of synthesising methionine de novo, when it becomes scarce in the environment. All genes required for the de novo biosynthesis are encoded by the metICFE-mdh operon, except for metX. Expression is controlled by a hierarchical network with a methionyl-tRNA-specific T-box riboswitch (MET-TBRS) as centrepiece, that is also referred to as met leader (RNA). T-box riboswitches (TBRS) are regulatory RNA elements located in the 5’-untranslated region (5’-UTR) of genes. The effector molecule of T-box riboswitches is uncharged cognate tRNA. The prevailing mechanism of action is premature termination of transcription of the nascent RNA in the absence of the effector (i.e. uncharged cognate tRNA) due to formation of a hairpin structure, the Terminator stem. In presence of the effector, a transient stabilisation of the alternative structure, the Antiterminator, enables transcription of the downstream genes (‘read-through’). Albeit, after the read-through the thermodynamically more stable Terminator eventually forms. The Terminator and the Antiterminator are two mutually exclusive structures. Previous work of the research group showed that in staphylococci the MET-TBRS ensures strictly methionine-dependent control of met operon expression. Uncharged methionyl-tRNA that activates the system is only present in sufficient amounts under methionine-deprived conditions. In contrast to other bacterial TBRS, the staphylococcal MET-TBRS has some characteristic features regarding its length and predicted secondary structure whose relevance for the function are yet unkown. Aim of the present thesis was to experimentally determine the structure of the met leader RNA and to investigate the stability of the met operon-specific transcripts in the context of methionine biosynthesis control. Furthermore, the yet unknown function of the mdh gene within the met operon was to be determined. In the context of this thesis, the secondary structure of the met leader was determined employing in-line probing. The structural analysis revealed the presence of almost all highly conserved T-box riboswitch structural characteristics. Furthermore, three additional stems, absent in all T-box riboswitches analysed to date, could be identified. Particularly remarkable is the above average length of the Terminator stem which renders it a potential target of the double-strand-specific endoribonuclease III (RNase III). The RNase III-dependent cleavage of the met leader could be experimentally verified by the use of suitable mutants. Moreover, the exact cleavage site within the Terminator was determined. The unusual immediate separation of the met leader from the met operon mRNA via the RNase III cleavage within the Terminator stem induces the rapid degradation of the met leader RNA and, most likely, that of the 5’-region of the met mRNA. The met mRNA is degraded from its 5’-end by the exoribonuclease RNase J. The stability of the met mRNA was found to vary over the length of the transcript with an instable 5’-end (metI and metC) and a longer half-life towards the 3’-end (metE and mdh). The varying transcript stability is reflected by differences in the available cellular protein levels. The obtained data suggest that programmed mRNA degradation is another level of regulation in the complex network of staphylococcal de novo methionine biosynthesis control. In addition, the MET-TBRS was studied with regard to a future use as a drug target for novel antimicrobial agents. To this end, effects of a dysregulated methionine biosynthesis on bacterial growth and survival were investigated in met leader mutants that either caused permanent transcription of the met operon (‘ON’) or prevented operon transcription (‘OFF’), irrespective of the methionine status in the cell. Methionine deprivation turned out to be a strong selection pressure, as ‘OFF’ mutants acquired adaptive mutations within the met leader to restore met operon expression that subsequently re-enabled growth. The second part of the thesis was dedicated to the characterisation of the Mdh protein that is encoded by the last gene of the met operon and whose function is unknown yet. At first, co-transcription and -expression with the met operon could be demonstrated. Next, the Mdh protein was overexpressed and purified and the crystal structure of Mdh was solved to high resolution by the Kisker research group (Rudolf-Virchow-Zentrum Würzburg). Analysis of the structure revealed the amino acid residues crucial for catalytic activity, and zinc was identified as a co-factor of Mdh. Also, Mdh was shown to exist as a dimer. However, identification of the Mdh substrate was, in the context of this thesis, (still) unsuccessful. Nevertheless, interactions of Mdh with enzymes of the met operon could be demonstrated by employing the bacterial two-hybrid system. This fact and the high conservation of mdh/Mdh on nucleotide and amino acid level among numerous staphylococcal species suggests an important role of Mdh within the methionine metabolism that should be a worthwhile subject of future research. N2 - Methionin ist die erste Aminosäure in jedem neu gebildeten Protein. Zusammen mit seiner Funktion als Vorläufermolekül für die Synthese des essenziellen Methylgruppendonors S-Adenosylmethionin ist Methionin damit für jede lebende Zelle unverzichtbar. Staphylococcus aureus, ein opportunistisches Humanpathogen, ist in der Lage, Methionin de novo zu synthetisieren, wenn es nicht in ausreichender Menge in der Umgebung vorhanden ist. Mit Ausnahme von MetX sind alle für die Methioninsynthese benötigten Enzyme im metICFE-mdh-Operon kodiert. Die Expression des Operons wird durch ein komplexes hierarchisches Netzwerk reguliert, dessen zentrales Steuerelement ein Methionyl-tRNA-spezifischer T-Box-Riboswitch (MET-TBRS) ist, der auch als met-leader (RNA) bezeichnet wird. T-Box Riboswitches (TBRS) sind regulatorische RNA-Elemente, die in der untranslatierten Region am 5'-Ende (5'-UTR) ihrer zu kontrollierenden Gene liegen. Sie nutzen unbeladene tRNAs als Effektormoleküle. Die Funktionsweise der meisten TBRS beruht auf dem vorzeitigen Abbruch der Transkription der naszierenden mRNA, der durch die Ausbildung einer Haarnadelstruktur (Terminator) im Transkript herbeigeführt wird, wenn das Effektormolekül (i.e. unbeladene tRNA) fehlt. Sobald passende unbeladene tRNA verfügbar ist und bindet, wird eine alternative Struktur, der Antiterminator, kurzzeitig stabilisiert, der die Transkription und damit ein "Durchlesen" in die stromabwärtsliegenden Gene ermöglicht. Terminator und Antiterminator sind zwei sich gegenseitig ausschließende Strukturen, wobei der Terminator die thermodynamisch deutlich stabilere Struktur des TBRS ist, die sich dementsprechend auch in den vollständigen Transkripten erneut ausbildet. Bisherige Vorarbeiten der Arbeitsgruppe zeigten, dass in Staphylokokken der MET-TBRS die Kontrolle der Methioninsynthese in strikter Abhängigkeit von Methionin gewährleistet. Unbeladene Methionyl-tRNA, die nur unter Methioninmangelbedingungen in ausreichenden Konzentrationen vorliegt, aktiviert das System. Im Unterschied zu anderen bakteriellen TBRS weist der Staphylokokken-MET-TBRS (met-leader) hinsichtlich seiner Länge und vorhergesagten Struktur einige Besonderheiten auf, deren Bedeutung für die Funktion bislang unklar sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Struktur der met-leader-RNA experimentell zu bestimmen und die Stabilität met-Operon-spezifischer Transkripte im Kontext der Methioninbiosynthesekontrolle zu untersuchen. Ebenso sollte die bisher unbekannte Funktion des mdh-Genes im Operon aufgeklärt werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Sekundärstruktur der met-leader-RNA mit Hilfe des so genannten In-line Probings bestimmt. Die Sekundärstruktur weist neben fast allen hochkonservierten Strukturmerkmalen eines T-Box-Riboswitches auch drei zusätzliche Haarnadelstrukturen auf, die bisher in keinem anderen T-Box-Riboswitch gefunden wurden. Besonders auffällig ist die überdurchschnittliche Länge des met-leader-Terminators, der dadurch zur potentiellen Zielstruktur für die Doppelstrang-spezifische Endoribonuklease RNase III wird. Mittels geeigneter Mutanten konnte die RNase III-abhängige Prozessierung der met-leader-RNA experimentell bewiesen werden. Ebenso wurde die exakte Schnittstelle im Terminator bestimmt. Die ungewöhnliche Prozessierung des Terminators durch die RNase III spaltet die met-leader-RNA von der met-mRNA ab, was den raschen weiteren Abbau der met-leader-RNA und sehr wahrscheinlich auch den der met-mRNA einleitet. So wird die met-mRNA durch die Exoribonuklease RNase J vom 5'-Ende her abgebaut, wobei die Stabilität bezogen auf die Gesamtheit des Moleküls stark variiert: Das 5'-Ende mit den Genen metI und metC wird äußerst schnell degradiert, während das 3'-Ende mit metE und mdh deutlich stabiler ist. Die variierende mRNA-Stabilität spiegelt sich auch in Unterschieden hinsichtlich der verfügbaren zellulären Proteinmengen wider. Die Daten legen daher nahe, dass programmierte mRNA-Degradation eine weitere Ebene im komplexen Kontrollnetzwerk darstellt, durch die in Staphylokokken die Methioninbiosynthese sehr exakt den jeweiligen Bedürfnissen angepasst wird. Des Weiteren wurde der MET-TBRS im Hinblick auf eine zukünftige Nutzung als Angriffspunkt für neue antibakterielle Wirkstoffe untersucht. Dazu wurden die Auswirkungen einer dysregulierten Methioninbiosynthese auf das bakterielle Wachstum und Überleben mit Hilfe von met-leader-Mutanten analysiert, die entweder zu einer permanenten Aktivierung („ON“) oder Deaktivierung („OFF“) der met-Operon-Transkription, unabhängig vom Methioninstatus in der Zelle, führten. Es zeigte sich, dass Methioninmangel einen starken Selektionsdruck darstellt, da die „OFF“-Mutanten in der Lage waren, durch den Erwerb von adaptiven Mutationen innerhalb der met-leader-Sequenz, das met-Operon erneut zu aktivieren und wieder zu wachsen. Der zweite Teil dieser Arbeit widmete sich der Charakterisierung des Mdh-Proteins, das im letzten Gen des met-Operons kodiert ist und dessen Funktion derzeit gänzlich unbekannt ist. Zunächst konnte die Kotranskription und -expression von mdh mit dem met-Operon gezeigt werden. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Kisker (Rudolf-Virchow-Zentrum Würzburg) wurden anhand von Kristallstrukturanalysen die Aminosäuren identifiziert, die entscheidend für die katalytische Aktivität des Mdh-Enzyms sind, wobei Zink als ein Kofaktor fungiert. Ebenso zeigte sich, dass Mdh als Dimer vorliegt. Allerdings ist die Identifizierung des Mdh-Substrates im Rahmen dieser Arbeit (noch) nicht gelungen. Mittels eines bakteriellen Zwei-Hybridsystems wurde jedoch nachgewiesen, dass Mdh mit den anderen Enzymen des met-Operons interagiert. Dies und die hohe Konservierung von mdh/Mdh auf Nukleotid- und Aminosäureebene in verschiedenen Staphylokokkenarten legt eine wichtige Funktion von Mdh im Methioninstoffwechsel nahe, die lohnenswerter Gegendstand weiterer Untersuchungen sein sollte. KW - Staphylococcus aureus KW - RNA Abbau KW - Methioninbiosynthese KW - MET-T-box riboswitch KW - riboswitch KW - methionine biosynthesis KW - RNA decay Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207124 ER - TY - THES A1 - Lisowski, Clivia T1 - Maturation of the \(Salmonella\) containing vacuole is compromised in G1 arrested host cells T1 - Die Reifung der \(Salmonella\)-enthaltenden Vakuole ist kompromittiert in G1-arretierten Wirtszellen N2 - The interaction of bacterial pathogens and the human host is a complex process that has shaped both organisms on a molecular, cellular and population level. When pathogenic bacteria infect the human body, a battle ensues between the host immune system and the pathogen. In order to escape an immune response and to colonize the host, pathogenic bacteria have developed diverse virulence strategies and some pathogens even replicate within host cells. For survival and propagation within the dynamic environment of a host cell, these bacteria interfere with the regulation of host pathways, such as the cell cycle, for their own benefit. The intracellular pathogen Salmonella Typhimurium invades eukaryotic cells and resides and replicates in a modified vacuolar compartment in which it is protected from the innate immune response. To this end, it employs a set of virulence factors that help to invade cells (SPI-1 effectors) and to hijack and modify the host endolysosomal system, in order to stabilize and mature its vacuolar niche (SPI-2 effectors). Previous studies have shown that Salmonella arrests host cells in G2/M phase and that Salmonella infected cells progress faster from G1 into S phase, suggesting that the G1 phase is disadvantageous for Salmonella infection. In fact, it has already been observed that Salmonella replication is impaired in G1 arrested cells. However, the reason for this impairment remained unclear. The current study addressed this question for the first time and revealed that the highly adapted, intracellular lifestyle of Salmonella is drastically altered upon G1 arrest of the host cell. It is shown that proteasomal degradation in G1 arrested cells is delayed and endolysosomal and autophagosomal trafficking is compromised. Accordingly, processing of lysosomal proteins is insufficient and lysosomal activity is decreased; resulting in uneven distribution and accumulation of endolysosomes and autophagosomes, containing undegraded cargo. The deregulation of these cellular signaling pathways affects maturation of the Salmonella containing vacuole (SCV). For the first time it is shown that acidification of SCVs is impaired upon G1 arrest. Thus, an important environmental factor for the switch from SPI-1 to SPI-2 gene expression is missing and the SPI-2 system is not activated. Consequently, targeting and modification of host cell structures by SPI-2 effectors e.g. recruitment of endolysosomal membrane proteins, like LAMP1, or exchange of endosomal cargo, is compromised. In addition, degradation of Salmonella SPI-1 effectors by the host proteasome is delayed. Their prolonged presence sustained the recruitment of early endosomes and contributed to the SCV remaining in an early, vulnerable maturation stage. Finally, it was shown that SCV membrane integrity is compromised; the early SCV ruptures and bacteria are released into the cytoplasm. Depending on the host cell type, SPI-2 independent, cytoplasmic replication is promoted. This might favor bacterial spreading, dissemination into the tissue and provide an advantage in host colonization. Overall, the present study establishes a link between host cell cycle regulation and the outcome of Salmonella infection. It fills the gap of knowledge as to why the host cell cycle stage is of critical importance for Salmonella infection and sheds light on a key aspect of host-pathogen interaction. N2 - Die Interaktion zwischen bakteriellen Krankheitserregern und dem menschlichen Wirt ist ein komplexer Prozess, der beide Organismen auf molekularer, zellulärer und Populationsebene geprägt hat. Wenn pathogene Bakterien den menschlichen Körper infizieren, kommt es zu einem Kampf zwischen dem Immunsystem des Wirtes und dem Krankheitserregers. Um einer Immunantwort zu entgehen und den Wirt zu besiedeln, haben pathogene Bakterien diverse Strategien entwickelt und einige Erreger vermehren sich sogar innerhalb von Wirtszellen. Zum Überleben und zur Vermehrung innerhalb der dynamischen Umgebung einer Wirtszelle, manipulieren diese Bakterien die Regulation zellulärer Netzwerke, wie zum Beispiel den Zellzyklus, zu ihrem eigenen Vorteil. Salmonella Typhimurium, ein intrazelluläres Bakterium, dringt in eukaryotische Wirtszellen ein und vermehrt sich in einem modifizierten, vakuolären Kompartiment, welches gleichzeitig vor der angeboren Immunantwort des Wirtes schützt. Zu diesem Zweck entwickelten Salmonellen eine Reihe von Virulenzfaktoren. Diese sind zum einen für die Invasion von Zellen verantwortlich (SPI-1 Faktoren), zum anderen greifen sie das endolysosomale System der Wirtszelle an und modifizieren es, mit dem Ziel die intrazelluläre Salmonellen-enthaltende Vakuole (SCV) zu stabilisieren und reifen zu lassen (SPI-2 Faktoren). Frühere Studien haben gezeigt, dass Salmonellen ihre Wirtszellen in der G2/M Phase blockieren. Zudem gehen Salmonellen-infizierte Zellen schneller von der G1 in die S-Phase über, was auf einen Nachteil der G1-Phase für die Salmonelleninfektion hindeutet. In der Tat wurde bereits beobachtet, dass die Vermehrung von Salmonellen in G1-arretierten Zellen beeinträchtigt war. Der Grund für diese Beeinträchtigung blieb jedoch unklar. Die vorliegende Studie befasst sich zum ersten Mal mit dieser Frage und zeigt auf, dass der hoch angepasste, intrazelluläre Lebensstil von Salmonellen während des G1-Arrest der Wirtszelle dramatisch verändert wird. Im Rahmen der hier vorgelegten Arbeit wurde gezeigt, dass der proteasomale Abbau in G1-arretierten Zellen verzögert und die endolysosomalen und autophagosomalen Transportnetzwerke beeinträchtigt sind. Dementsprechend ist die Prozessierung lysosomaler Proteine unzulänglich und die lysosomale Aktivität herabgesetzt; was zu einer ungleichmäßigen Verteilung und Anreicherung von Endolysosomen und Autophagosomen führt, die nicht abgebaute Stoffwechselprodukte akkumulieren. Die Deregulierung der genannten zellulären Signalwege beeinflusst die Reifung der SCV. Es konnte hier zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Ansäuerung der SCV in G1-arretierten Zellen inhibiert ist. Somit fehlt ein essentieller Faktor für den Wechsel von SPI-1 zu SPI-2-Genexpression und das SPI-2 System wird nicht aktiviert. Folglich findet keine Modifikation der Wirtszelle durch SPI-2-Effektoren, z.B. die Rekrutierung endolysosomaler Membranproteine, wie LAMP1 oder der Austausch endosomaler Fracht statt. Zudem ist der Abbau von bakteriellen SPI-1-Effektoren durch das Wirtsproteasom verzögert. Die verlängerte Präsenz der SPI-1 Effektoren fördert eine anhaltende Rekrutierung von frühen Endosomen und trägt zum Verbleib der SCV in einem frühen, sehr instabilen Reifestadium bei. Schließlich wurde gezeigt, dass die Integrität der SCV Membran kompromittiert ist, die Vakuole aufbricht und die Bakterien ins Zytoplasma entlassen werden. In Abhängigkeit des Wirtszelltyps wird eine SPI-2 unabhängige, zytoplasmatische Vermehrung begünstigt, was möglicherweise die Ausbreitung der Bakterien ins Gewebe erleichtert und somit einen Vorteil bei der Besiedelung des Wirtes darstellt. Insgesamt etabliert die vorliegende Studie einen Zusammenhang zwischen der Regulation des Wirtszellzyklus und dem Ergebnis einer Salmonelleninfektion. Es wird aufgezeigt, warum der Zellzyklus der Wirtszelle von entscheidender Bedeutung für den Verlauf der Salmonelleninfektion ist und beleuchtet somit einen essentiellen Aspekt der Wirt-Pathogen-Interaktion. KW - Salmonella Typhimurium KW - Zellzyklus KW - Lysosom KW - endosomal trafficking KW - SCV maturation KW - Cell cycle KW - lysosome KW - Cells Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-185239 ER - TY - THES A1 - Wallstabe, Lars T1 - Development and preclinical evaluation of tumour-reactive T cells expressing a chemically programmable chimeric antigen receptor T1 - Entwicklung und präklinische Evaluierung tumorreaktiver T- Zellen, die einen chemisch programmierbaren chimären Antigenrezeptor exprimieren N2 - The genetic modification of T cells for the expression a chimeric antigen receptor (CAR) endows them with a new specificity for an antigen. Adoptive immunotherapy with CD19-CAR T cells has achieved high rates of sustained complete remissions in B cell malignancies. However, the downregulation or loss of the targeted antigen after mono-specific CAR T cell therapy, e.g. against CD19 or CD22, has been reported. Targeting multiple antigens on tumour cells, sequentially or simultaneously, could overcome this limitation. Additionally, targeting multiple antigens with CAR T cells could drive the translation from hematologic malignancies to prevalent solid cancers, which often express tumour-associated antigens heterogeneously. We hypothesised that expression of a universal CAR, which can be programmed with hapten-like molecules, could endow T cells with specificities for multiple antigens. In this study we introduce a novel chemically programmable CAR (cpCAR) based on monoclonal antibody h38C2. Our data show, that cpCARs form a reversible chemical bond to molecules containing a diketone-group and therefore can be programmed to acquire multiple specificities. We programmed cpCAR T cells with hapten-like compounds against integrins αvβ3 and α4β1 as well as the folate receptor. We observed tumour cell lysis, IFN ɣ and IL-2 production and proliferation of programmed cpCAR T cells against tumour cells expressing the respective target antigen in vitro. As a reference to cpCARs programmed against αvβ3, we further introduced novel conventional αvβ3-CARs. These CARs, based on humanised variants of monoclonal antibody LM609 (hLM609), directly bind to integrin αvβ3 via their scFv. The four αvβ3-CAR constructs comprised either an scFv with higher affinity (hLM609v7) or lower affinity (hLM609v11) against αvβ3 integrin and either a long (IgG4 hinge, CH2, CH3) or short (IgG4 hinge) extracellular spacer. We selected the hLM609v7-CAR with short spacer, which showed potent anti-tumour reactivity both in vitro and in a murine xenograft model, for comparison with the cpCAR programmed against αvβ3. Our data show specific lysis of αvβ3-positive tumour cells, cytokine production and proliferation of both hLM609-CAR T cells and cpCAR T cells in vitro. However, conventional hLM609-CAR T cells mediated stronger anti-tumour effects compared to cpCAR T cells in the same amount of time. In line with the in vitro data, complete destruction of tumour lesions in a murine melanoma xenograft model was only observed for mice treated with conventional αvβ3-CAR T cells. Collectively, we introduce a cpCAR, which can be programmed against multiple tumour antigens, and hLM609-CARs specific for the integrin αvβ3. The cpCAR technology bears the potential to counteract current limitations, e.g. antigen loss, of current monospecific CAR T cell therapy. Targeting αvβ3 integrin with CAR T cells could have clinical applications in the treatment of solid malignancies, because αvβ3 is not only expressed on a variety of solid malignancies, but also on tumour-associated vasculature and fibroblast. N2 - T Zellen können durch genetische Modifizierung zur Expression eines chimären Antigen-Rezeptors (CAR) neue Antigenspezifität erhalten. Durch adoptive Immuntherapie mit CD19-CAR T Zellen können hohe Raten von anhaltenden vollständigen Remissionen bei Patienten mit malignen B-Zell-Erkrankungen erzielt werden. In klinischen Studien mit mono-spezifischen CAR T Zellen wurden allerdings der Verlust oder eine verringerte Expression der Ziel-Antigene, z.B. CD19 oder CD22, auf Tumor-Zellen beobachtet. Außerdem sind bei soliden Krebserkrankungen tumor¬assoziierte Antigene häufig unterschiedlich stark auf Krebszellen exprimiert. Wir haben die Hypothese aufgestellt, dass CARs, die mit einem hapten-ähnlichen Molekül programmiert werden können, es ermöglichen, mehrere Antigene mit einer T-Zelle anzugreifen. In dieser Arbeit stellen wir einen neuartigen chemisch programmierbaren CAR (cpCAR) auf Basis des monoklonalen Antikörpers h38C2 vor. Unsere Daten zeigen, dass cpCARs eine reversible chemische Bindung zu Molekülen mit einer Diketongruppe bilden und daher so programmiert werden können, dass sie mehrere Spezifitäten aufweisen. Wir haben cpCAR T Zellen mit hapten-ähnlichen Molekülen gegen die Integrine αvβ3 und α4β1 sowie den Folat-Rezeptor programmiert. In vitro beobachteten wir sowohl die spezifische Lyse von Tumorzellen als auch T-Zell-Proliferation und Sekretion von IFN ɣ und IL-2 durch programmierte cpCAR T Zellen als Reaktion auf Antigen positive Tumorzellen. Als Referenz zu cpCARs, die gegen αvβ3 programmiert wurden, haben wir in dieser Arbeit zudem neue konventionelle αvβ3-CARs vorgestellt. Diese basieren auf humanisierten Varianten des monoklonalen Antikörpers LM609 (hLM609) und binden mittels ihres scFv direkt an Integrin αvβ3. Die vier αvβ3-CAR-Konstrukte enthielten entweder ein scFv mit höherer Affinität (hLM609v7) oder niedrigerer Affinität (hLM609v11) gegenüber αvβ3 und entweder einem langen (IgG4-Hinge, CH2, CH3) oder einem kurzen (IgG4-Hinge) extrazellulären „Spacer“. Für den Vergleich von konventionellem CAR und cpCAR wählten wir den hLM609v7-CAR mit kurzem „Spacer“. T Zellen, die diesen CAR exprimierten, vermittelten eine starke Anti-Tumor Reaktion sowohl in vitro als auch in einem Maus-Xenograft Modell. Unsere in vitro Daten zeigen spezifische Lyse von αvβ3-positiven Tumorzellen, Sekretion von Zytokinen und Proliferation sowohl durch hLM609-CAR T-Zellen als auch durch cpCAR T-Zellen. Konventionelle hLM609-CAR T Zellen vermittelten jedoch in gleicher Zeit eine stärkere Anti-Tumorwirkung als cpCAR T-Zellen. Zusammengefasst präsentieren wir in dieser Arbeit einen cpCAR, der gegen mehrere Tumorantigene programmiert werden kann, und hLM609-CARs, die spezifisch für das Integrin αvβ3 sind. Die cpCAR-Technologie birgt das Potenzial, aktuellen Limitationen der mono-spezifischen CAR-T-Zelltherapie, z.B. dem Antigen¬verlust, entgegenzuwirken. Zudem könnte das Integrin αvβ3 klinische Anwendung bei der Behandlung von soliden Tumoren finden, da es nicht nur auf einer Reihe von Tumor-Entitäten, sondern auch auf Tumor-assoziiertem Gewebe zu finden ist. KW - Tumorimmunologie KW - chimeric antigen receptor Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179071 ER - TY - THES A1 - Chen, Mengjia T1 - Right Ventricular Dysfunction contributes to Left Ventricular Thrombus Formation in Patients post Anterior Myocardial Infarction T1 - Rechtsventrikuläre Dysfunktion trägt zur linksventrikulären Thrombusbildung bei Patienten nach dem akuten Vorderwandinfarkt bei N2 - Our current data demonstrate that besides the known risk factors, including apical aneurysm, reduced left ventricular longitudinal systolic function (MAPSE) and advanced diastolic dysfunction, Right ventricular dysfunction as determined by reduced tricuspid annular plane systolic excursion (TAPSE) or right ventricular fractional area change (RV_FAC) is independently associated with left ventricular thrombus formation in acute anterior myocardial infarction patients, especially in the setting of anterior myocardial infarction without the formation of an apical aneurysm. This study suggests that besides left ventricular abnormalities, right ventricular dysfunction likewise contributes LVT formation in patients with acute anterior myocardial infarction. N2 - Unsere aktuellen Daten zeigen, dass neben den bekannten Risikofaktoren, einschließlich des apikalen Aneurysmas, der verminderten linksventrikulären longitudinalen systolischen Funktion (MAPSE) und der fortgeschrittenen diastolischen Dysfunktion, die durch reduzierte TAPSE oder RV_FAC bestimmte rechtsventrikuläre Dysfunktion unabhängig mit der Thrombusbildung in linkem Ventrikel bei Patienten nach dem akuten Vorderwandinfarkt, insbesondere bei denen ohne apikales Aneurysma assoziert ist. Diese Studie legt nahe, dass neben linksventrikulärer Dysfunktion die rechtsventrikuläre Dysfunktion ebenfalls zur linksventrikulären Thombusbildung bei Patienten mit akutem anteriorem Myokardinfarkt beiträgt. KW - Thrombus KW - Workshop Neue Aspekte zur Linksventrikulären Dysfunktion (1992 : Erbach, Rheingau) KW - Herzinfarkt KW - Vorderwandinfarkt KW - left ventricular thrombus KW - linksventrikulärer Thrombus KW - myocardial infarction KW - Myokardinfarkt KW - Rechtsventrikuläre Thrombusbildung KW - Right ventricular dysfunction Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204149 ER - TY - THES A1 - Heib, Tobias T1 - The role of Rho GTPases in megakaryopoiesis and thrombopoiesis T1 - Die Rolle von Rho GTPasen in der Megakaryopoese und Thrombopoese N2 - Platelets, derived from megakaryocytes (MKs) in the bone marrow (BM), are small, anucleated cells that circulate in the bloodstream and are critical for thrombosis and hemostasis. Megakaryo- and subsequent thrombopoiesis are highly orchestrated processes involving the differentiation and maturation of MKs from hematopoietic stem cells (HSCs), after which MKs are able to release platelets into the bloodstream, a process termed proplatelet formation (PPF). Here, the MK penetrates the endothelial lining and releases cytoplasmic portions (proplatelets) into the blood stream, which finally mature into platelets within the ciruculation. PPF requires an extensive crosstalk as well as a tight regulation of the MK cytoskeleton, in which small GTPases of the Rho family, such as RhoA and Cdc42 are critically involved and play opposing roles. MK and platelet specific Cdc42 or RhoA-deficiency in mice results in macrothrombocytopenia. Moreover, RhoA deficient mice displayed a frequent mislocalization of entire MKs into BM sinusoids, a finding that was reverted upon concomitant lack of Cdc42 but accompanied by an aggravated macrothrombocytopenia. Whether receptors are involved in the process of transendothelial MK migration, however, remained unclear. In the first part of this thesis, a centrifugation-based method (‘spin isolation’) to harvest murine BM cells was established, which not only reduces experimental time, costs and animals but is also highly suitable for studies on primary and in vitro cultured BM-derived cells. The spin isolation was used particularly for MK studies during the course of the thesis. In the second part of this thesis, a MK- and platelet-specific RhoA/Cdc42 double-deficiency was shown to result in reduced expression of a variety of MK-specific glycoproteins and cytoskeletal regulators of importance during MK maturation and PPF, a phenotype culminating in virtually abolished platelet biogenesis. We thus uncovered that RhoA/Cdc42-regulated gene expression is a prerequisite for cytoplasmic MK maturation, but dispensable for endomitosis. In the third part of this thesis we analyzed mice double-deficient in RhoA and prominent MK receptors which are potentially involved in the regulation of PPF in the BM environment. We were able to show that integrins as well as the inhibitory receptor G6b-B are dispensable for transendothelial migration of RhoA-deficient MKs. Surprisingly however, the myelofibrosis and concomitant osteosclerosis observed in G6b-B single-deficient mice was attenuated in RhoA/G6b B double-deficient mice, thus implying an important role of RhoA during myelofibrotic disease progression. BM transplantation experiments furthermore revealed that not only the macrothrombocytopenia but also the transmigration of RhoA-deficient MKs is due to cell-intrinsic defects and not related to possible Pf4-Cre off-target effects in non-hematopoietic cells. In the last part of this study we demonstrated that the new approach for MK- and platelet-specific gene ablatation using Gp1ba-Cre deleter mice is associated with intrinsic MK defects and in addition results in insufficient depletion of RhoA compared to the Pf4-Cre model, positioning the latter still as the gold standard for studying MK biology. N2 - Thrombozyten, die von Megakaryozyten (MKs) im Knochenmark abgeschnürt werden, sind kleine, kernlose Zellen, die im Blutkreislauf zirkulieren und in Thrombose und Hämostase eine wichtige Rolle spielen. Während der Megakaryopoese differenzieren und reifen MKs von hämatopoetischen Stammzellen heran, um anschließend Thrombozyten in die Sinusoide des Knochenmarks zu entlassen. Dabei durchdringt der MK das Endothel und setzt zytoplasmatische Fragmente in den Blutstrom frei, die schließlich im Blutkreislauf zu Thrombozyten reifen. Der Prozess der Thrombozytenbildung erfordert eine umfangreiche Organisation des MK-Zytoskeletts, an der kleine GTPasen der Rho-Familie wie RhoA und Cdc42 kritisch beteiligt sind, wobei sie dabei gegensätzliche Rollen spielen. Der MK- und Thrombozyten-spezifische Verlust von Cdc42 oder RhoA in Mäusen führte zu einer Makrothrombozytopenie. Darüber hinaus wurde bei RhoA-defizienten Mäusen eine Fehllokalisation ganzer MKs in den Knochenmarkssinusoiden beobachtet, die bei gleichzeitigem Mangel von Cdc42, jedoch auf Kosten einer verschlimmerten Makrothrombozytopenie, wieder rückgängig gemacht wurde. Ob Rezeptoren am Prozess der transendothelialen MK Migration beteiligt sind, blieb bisher jedoch unklar. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde eine zentrifugationsbasierte Methode namens “Spin-Isolation” zur Gewinnung muriner Knochenmarkszellen etabliert, die nicht nur die Versuchszeit, Kosten und Anzahl der benötigten Versuchstiere reduziert, sondern sich auch sehr gut für Studien an primären und in vitro kultivierten Knochenmarkszellen eignet. Die Spin-Isolation wurde insbesondere für MK Studien im Rahmen der Dissertation eingesetzt. Im zweiten Teil dieser Arbeit zeigten wir, dass der gleichzeitige Verlust von RhoA und Cdc42 in MKs zu einer reduzierten Expression MK-spezifischer Glykoproteine und Zytoskelettregulatoren von Bedeutung für MK Reifung führte, wodurch die Thrombozytenbildung stark beinträchtigt war. Dadurch konnten wir aufzeigen, dass RhoA/Cdc42-regulierte Genexpression eine Voraussetzung für die zytoplasmatische MK-Reifung, nicht aber für die Endomitose, ist. Im dritten Teil dieser Arbeit analysierten wir Mäuse mit einer Doppeldefizienz in RhoA und prominenten MK-Rezeptoren, die möglicherweise mit der Regulation der Thrombozytenbildung im Knochenmark assoziiert sein könnten. Wir zeigten, dass sowohl Integrine als auch der inhibitorische Rezeptor G6b-B für die transendotheliale Migration von RhoA-defizienten MKs entbehrlich sind. Die bei G6b-B-defizienten Mäusen beobachtete Myelofibrose und Osteosklerose wurde jedoch bei RhoA/G6b-B doppelt defizienten Mäusen abgeschwächt, was eine wichtige Rolle von RhoA in myelofibrotischen Krankheitszuständen impliziert. Knochenmarktransplantationen zeigten darüber hinaus, dass nicht nur die Makrothrombozytopenie, sondern auch die Transmigration von RhoA-defizienten MKs auf zellintrinsische Defekte zurückzuführen ist und nicht mit den berichteten unspezifischen Effekten des Pf4-Cre Systems in nicht-hämatopoetischen Zellen einhergeht. Im letzten Teil dieser Studie zeigten wir, dass der neue Ansatz für die MK/Thrombozyten-spezifische Gendeletion mithilfe der Gp1ba-Cre Maus mit intrinsischen megakaryozytären Defekten assoziiert ist und darüber hinaus im Vergleich zum Pf4-Cre Modell zu einer unzureichenden Deletion von RhoA führte, wodurch Pf4-Cre immer noch der Goldstandard für Studien zu Megakaryozytenbiologie bleibt. KW - Megakaryozyt KW - Rho-Proteine KW - megakaryocyte KW - rho gtpases KW - thrombopoiesis KW - megakaryopoiesis Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216645 ER - TY - THES A1 - Güntzel, Paul Mathias T1 - Bioinspired Ion Pairs Transforming Poorly Water-soluble Compounds into Protic Ionic Liquids and Deep Eutectic Solvents T1 - Bioinspirierte Ionenpaare Wandeln Schlecht-wasserlösliche Verbindungen in Protische Ionische Flüssigkeiten und Tiefe Eutektische Lösungsmittel N2 - Microbial, mammalian and plant cells produce and contain secondary metabolites, which typically are soluble in water to prevent cell damage by crystallization. The formation of ion pairs, e.g. with carboxylic acids or mineral acids, is a natural blueprint to keep basic metabolites in solution. It was aimed at showing whether the mostly large carboxylates form soluble protic ionic liquids (PILs) with basic natural products resulting in enhanced aqueous solubility. Furthermore, their supramolecular pattern in aqueous solution was studied. Thereby, naturally occurring carboxylic acids were identified being appropriate counterions for natural basic compounds and facilitate the formation of PILs with their beneficial characteristics, like improved dissolution rate and enhanced apparent solubility. N2 - Mikrobielle, Säugetier- und Pflanzenzellen produzieren und enthalten Sekundärmetaboliten, welche in Wasser gelöst vorliegen, um Zellschäden (z.B. durch Kristallisation) zu vermeiden. Die Bildung von Ionenpaaren, beispielsweise mit Carbonsäuren oder Mineralsäuren, ist eine natürliche Strategie, um basische Metaboliten in Lösung zu halten. Es sollte gezeigt werden, dass die vergleichsweise großen Carboxylate lösliche protische ionische Flüssigkeiten (PILs) mit basischen Naturstoffen bilden, was zu einer verbesserten Wasserlöslichkeit führt. Weiterhin wurde das supramolekulare Verhalten der PILs in wässriger Lösung untersucht. Dabei wurden natürlich vorkommende Carbonsäuren als geeignete Gegenionen für natürliche basische Verbindungen identifiziert. Die resultierenden PILs zeigten eine verbesserte Auflösungsrate und verbesserte scheinbare Löslichkeit. KW - Ionic Liquids KW - Carboxylates KW - Deep Eutectics KW - Ion Pairs KW - Protic Ionic Liquids Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219806 ER - TY - THES A1 - Toksabay, Sinem T1 - Synthesis and on surface self assembly properties of pi extended tribenzotriquinacenes T1 - Synthese und selbstorganisierende Eigenschaften von pi-erweitertem Tribenzotriquinacenen an der Oberfläche N2 - Tribenzotriquinacene (TBTQ) is a polycyclic aromatic framework with a particularly rigid, C3v symmetrical, bowl-shaped core bearing three mutually fused indane wings. It has been discussed as a defect center for a nanographene by Kuck and colleagues. Therefore, extended TBTQ structures are promising models for saturated defect structures in graphene and graphene like molecules and could be used to investigate the role of defects for the electronic properties of graphene. With this motivation, three different pi-extended TBTQ derivatives have been synthesized in this work. Several different Scholl reaction conditions were tried to obtain fully annulated product of hexaphenyl substituted TBTQ. The desired benzannulated TBTQ derivative could not be obtained due to unfavourable electron density in the respective positions of the molecule and increased reactivity of the bay position of the precursor. As an another method for benzannulation is the on-surface synthesis of graphene flakes and can be carried out using electron beams e.g. in a tunneling microscope (STM). According to our previous research, the parent system TBTQ and centro-methyl TBTQ on silver and gold surfaces showed that the gas phase deposition of these molecules gives rise to the formation of highly ordered two-dimensional assemblies with unique structural features. This shows the feasibility for the formation of defective graphene networks starting from the parent structures. Therefore, the same deposition technique was used to deposit Me-TBTQ(OAc)3Ph6, and investigate the molecular self-assembly properties directly on the surface of Cu (111). In summary, the substrate temperature dependent self-assembly of Me-TBTQ(OAc)3Ph6 molecules on Cu(111), shows the following evolution of orientations. At room temperature, molecules form dimers, which construct a higher-coverage honeycomb lattice. Furthermore, one of the acetyl group located in the bay positions of the TBTQ core is cleaved and the remaining two induce the metal-molecule interaction. It was presumed that by increasing the temperature to 393 K, the remaining acetyl and methyl groups would beeliminated from the molecular structure.In addition, the smaller TBTQ-Ph6 molecules preferably lie flat on Cu(111) crystal and allowing the molecules to settle into a C3-symmetry and form a dense hexagonal structure. N2 - Tribenzotriquinacen (TBTQ) ist eine polyzyklische aromatische Verbindung mit einem besonders starren, C3v-symmetrischen, schalenförmigen Kern, der drei anellierte Indan-Flügel trägt. Es wurde von Kuck und Kollegen als Defektzentrum für Nanographen untersucht. Daher sind erweiterte TBTQ-Strukturen vielversprechende Modelle für gesättigte Defektstrukturen in Graphen und graphenähnlichen Molekülen, die dazu verwendet werden können, um die Rolle Defekten auf die Ausprägung der elektronischen Eigenschaften von Graphen zu untersuchen. Mit dieser Motivation wurden in dieser Arbeit drei verschiedene TBTQ-Derivate mit erweitertem -System synthetisiert. Um im Anschluss eine vollständige Annellierung und damit Konjugation des p-Systems zu erreichen, wurden verschiedene Scholl-Reaktionen getestet, um das dreifach anellierte Produkt aus hexaphenylsubstituiertem TBTQ zu erhalten. Das gewünschte benzannulierte TBTQ-Derivat konnte aufgrund der relativ geringen Elektronendichte an den Annellierungspositionen und der erhöhten Reaktivität der Bay-Positionen des Moleküls nicht erhalten werden. Eine weitere Möglichkeit zur Annellierung von Nanographenen besteht in der On-Surface-Synthese. Diese kann mit Elektronenstrahlen z.B. in einem Rastertunnelmikroskop (STM) durchgeführt werden. Nach unseren früheren Untersuchungen, hochauflösende STM-Experimente mit dem Stammsystem TBTQ und centro-methyl TBTQ auf Silber- und Goldoberflächen, dass die Gasphasenabscheidung dieser Moleküle zur Bildung hochgeordneter zweidimensionaler Assemblierte mit einzigartigen strukturellen Eigenschaften führt. Dies zeigt die Möglichkeit zur Bildung von defekthaltigen Graphen-Netzwerken ausgehend von den Stammsystemen. Daher wurde hier die gleiche Abscheidungstechnik verwendet, um für Me-TBTQ(OAc)3Ph6 die molekulare Selbstanordnung auf der Oberfläche von Cu(111) untersuchen. Zusammenfassend zeigt die Selbstorganisation von Me-TBTQ(OAc)3Ph6 auf Cu(111) eine ausgeprägte Temperaturabhängigkeit. Die Moleküle bilden bei 363 K ein höheres Wabengitter aus. Außerdem wird eine der Acetylgruppen, die sich in den Bay-Positionen des TBTQ-Kerns befinden, abgespalten und die verbleibenden Gruppen wechselwirken mit der Metalloberfläche. Daher stehen sich die Molekülschalen als einander zugewandte Halbkugeln gegenüber. Es wird vermutet, dass durch die Erhöhung der Temperatur auf 393 K die verbleibenden Acetyl- und Methylgruppen aus der Molekülstruktur eliminiert werden. Außerdem liegen die kleineren TBTQ-Ph6-Moleküle bevorzugt flach auf dem Cu (111) -Kristall, so dass sich die Moleküle in der C3-Symmetrie anordnen und eine dichte hexagonale Struktur bilden KW - Triquinacenderivate KW - Aromatisch anellierte Triquinacene KW - Aromatically annulated triquinacenes KW - Chemische Synthese KW - gekrümmte Kohlenwasserstoffe KW - curved hydrocarbons KW - triquinacene derivatives KW - on surface self-assembly Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-245734 ER - TY - THES A1 - Fey, Christina T1 - Establishment of an intestinal tissue model for pre-clinical screenings T1 - Etablierung eines Darmgewebemodells für Präklinische Screenings N2 - The small intestine represents a strong barrier separating the lumen from blood circulation thereby playing a major role in the absorption and the transport of pharmacological agents prior to their arrival on the respective target site. In order to gain more knowledge about specialized uptake mechanisms and risk assessment for the patient after oral admission of drugs, intestinal in vitro models demonstrating a close similarity to the in vivo situation are needed. In the past, cell line-based in vitro models composed of Caco-2 cells cultured on synthetic cell carriers represented the “gold standard” in the field of intestinal tissue engineering. Expressive advantages of these models are a reproducible, cost-efficient and standardized model set up, but cell function can be negatively influenced by the low porosity or unwanted molecular adhesion effects of the artificial scaffold material. Natural extracellular matrices (ECM) such as the porcine decellularized small intestinal submucosa (SIS) are used as alternative to overcome some common drawbacks; however, the fabrication of these scaffolds is time- and cost-intensive, less well standardized and the 3Rs (replacement, reduction, refinement) principle is not entirely fulfilled. Nowadays, biopolymer-based scaffolds such as the bacterial nanocellulose (BNC) suggest an interesting option of novel intestinal tissue engineered models, as the BNC shows comparable features to the native ECM regarding fiber arrangement and hydrophilic properties. Furthermore, the BNC is of non-animal origin and the manufacturing process is faster as well as well standardized at low costs. In this context, the first part of this thesis analyzed the BNC as alternative scaffold to derive standardized and functional organ models in vitro. Therefore, Caco-2 cells were cultured on two versions of BNC with respect to their surface topography, the unmodified BNC as rather smooth surface and the surface-structured BNC presenting an aligned fiber arrangement. As controls, Caco-2 in vitro models were set up on PET and SIS matrices. In this study, the BNC-based models demonstrated organ-specific properties comprising typical cellular morphologies, a characteristic tight junction protein expression profile, representative ultrastructural features and the formation of a tight epithelial barrier together with a corresponding transport activity. In summary, these results validated the high quality of the BNC-based Caco-2 models under cost-efficient conditions and their suitability for pre-clinical research purposes. However, the full functional diversity of the human intestine cannot be presented by Caco-2 cells due to their tumorigenic background and their exclusive representation of mature enterocytes. Next to the scaffold used for the setup of in vitro models, the cellular unit mainly drives functional performance, which demonstrates the crucial importance of mimicking the cellular diversity of the small intestine in vitro. In this context, intestinal primary organoids are of high interest, as they show a close similarity to the native epithelium regarding their cellular diversity comprising enterocytes, goblet cells, enteroendocrine cells, paneth cells, transit amplifying cells and stem cells. In general, such primary organoids grow in a 3D Matrigel® based environment and a medium formulation supplemented with a variety of growth factors to maintain stemness, to inhibit differentiation and to stimulate cell migration supporting long term in vitro culture. Intestinal primary spheroid/organoid cultures were set up as Transwell®-like models on both BNC variants, which resulted in a fragmentary cell layer and thereby unfavorable properties of these scaffold materials under the applied circumstances. As the BNC manufacturing process is highly flexible, surface properties could be adapted in future studies to enable a good cell adherence and barrier formation for primary intestinal cells, too. However, the application of these organoid cultures in pre-clinical research represents an enormous challenge, as the in vitro culture is complex and additionally time- and cost-intensive. With regard to the high potential of primary intestinal spheroids/organoids and the necessity of a simplified but predictive model in pre-clinical research purposes, the second part of this thesis addressed the establishment of a primary-derived immortalized intestinal cell line, which enables a standardized and cost-efficient culture (including in 2D), while maintaining the cellular diversity of the organoid in vitro cultures. In this study, immortalization of murine and human intestinal primary organoids was induced by ectopic expression of a 10- (murine) or 12 component (human) pool of genes regulating stemness and the cell cycle, which was performed in cooperation with the InSCREENeX GmbH in a 2D- and 3D-based transduction strategy. In first line, the established cell lines (cell clones) were investigated for their cell culture prerequisites to grow under simplified and cost-efficient conditions. While murine cell clones grew on uncoated plastic in a medium formulation supplemented with EGF, Noggin, Y-27632 and 10% FCS, the human cell clones demonstrated the necessity of a Col I pre coating together with the need for a medium composition commonly used for primary human spheroid/organoid cultures. Furthermore, the preceding analyses resulted in only one human cell clone and three murine cell clones for ongoing characterization. Studies regarding the proliferative properties and the specific gene as well as protein expression profile of the remaining cell clones have shown, that it is likely that transient amplifying cells (TACs) were immortalized instead of the differentiated cell types localized in primary organoids, as 2D, 3D or Transwell®-based cultures resulted in slightly different gene expression profiles and in a dramatically reduced mRNA transcript level for the analyzed marker genes representative for the differentiated cell types of the native epithelium. Further, 3D cultures demonstrated the formation of spheroid-like structures; however without forming organoid-like structures due to prolonged culture, indicating that these cell populations have lost their ability to differentiate into specific intestinal cell types. The Transwell®-based models set up of each clone exhibit organ-specific properties comprising an epithelial-like morphology, a characteristic protein expression profile with an apical mucus-layer covering the villin-1 positive cell layer, thereby representing goblet cells and enterocytes, together with representative tight junction complexes indicating an integer epithelial barrier. The proof of a functional as well as tight epithelial barrier in TEER measurements and in vivo-like transport activities qualified the established cell clones as alternative cell sources for tissue engineered models representing the small intestine to some extent. Additionally, the easy handling and cell expansion under more cost-efficient conditions compared to primary organoid cultures favors the use of these newly generated cell clones in bioavailability studies. Altogether, this work demonstrated new components, structural and cellular, for the establishment of alternative in vitro models of the small intestinal epithelium, which could be used in pre-clinical screenings for reproducible drug delivery studies. N2 - Der Dünndarm bildet eine starke Barriere aus, welche das Lumen vom Blutkreislauf trennt, und dadurch maßgeblich an der Absorption und dem Transport von pharmakologischen Wirkstoffen beteiligt ist, bevor diese ihren Wirkort erreichen. Um ein detaillierteres Wissen über die speziellen Aufnahmemechanismen zu erlangen und zur Risikoabschätzung für den Patienten nach oraler Aufnahme dieser Medikamente, sind intestinale in vitro Modelle erforderlich, die eine große Ähnlichkeit mit der Situation in vivo aufweisen. In der Vergangenheit stellten Caco-2 Zelllinien-basierte in vitro Modelle, die auf synthetischen Trägerstrukturen aufgebaut sind, den „Goldstandard“ auf dem Gebiet der intestinalen Geweberekonstruktion dar. Bedeutende Vorteile dieser Modelle sind der reproduzierbare, kosteneffiziente und standardisierte Modellaufbau, jedoch können die zellulären Funktionen durch die geringe Porosität oder die unerwünschten molekularen Adhäsionseffekte des künstlichen Trägermaterials negativ beeinflusst werden. Um einige häufige Nachteile zu überwinden werden natürliche extrazelluläre Matrizen (ECM) wie die porzine dezellularisierte Dünndarm-submukosa (SIS) verwendet, jedoch ist die Herstellung dieser Trägerstrukturen zeit- und kostenintensiv, weniger gut standardisiert und entspricht nicht ganzheitlich dem 3R-Prinzip (Replace = Vermeiden, Reduce = Verringern, Refine = Verbessern). Heutzutage ermöglichen biopolymer-basierte Trägerstrukturen wie die bakterielle Nanozellulose (BNC) die Entwicklung von neuartigen intestinalen Gewebemodellen, da die BNC eine große Ähnlichkeit hinsichtlich der Faseranordnung und der hydrophilen Eigenschaften mit der nativen ECM aufweist. Darüber hinaus ist die BNC nicht tierischen Ursprungs und der Herstellungsprozess schneller, gut standardisiert als auch kostengünstig. In diesem Zusammenhang wurde im ersten Teil dieser Arbeit nachgewiesen, dass die BNC als alternative Trägerstruktur für standardisierte und funktionelle Organmodelle in vitro geeignet ist. Dafür wurden Caco-2 Zellen auf zwei Varianten der BNC kultiviert, die sich in ihrer Oberflächentopographie unterscheiden, wobei die nicht-modifizierte BNC eine glatte Oberfläche und die oberflächen-strukturierte BNC eine ausgerichtete Faseranordnung aufweist. Als Kontrollen dienten Caco 2 zellbasierte in vitro Modelle, die auf PET- oder SIS Matrizes aufgebaut wurden. In dieser Studie wiesen die BNC-basierten Modelle die wichtigsten organ-spezifischen Eigenschaften auf, darunter eine typische zelluläre Morphologie, ein charakteristisches Expressionsprofil der Tight Junction Proteine, repräsentative ultrastrukturelle Merkmale und die Bildung einer dichten epithelialen Barriere verbunden mit einer entsprechenden Transportaktivität. Zusammenfassend bestätigten diese Ergebnisse die hohe Qualität der BNC-basierten Caco-2 Modelle unter kosteneffizienten Herstellbedingungen und ihre Eignung für präklinische Forschungszwecke. Allerdings kann die volle Funktionsvielfalt des menschlichen Darms durch Caco-2 Zellen aufgrund ihres kanzerogenen Ursprungs und der exklusiven Repräsentanz von Enterozyten nicht abgebildet werden. Neben der Trägerstruktur die für den Aufbau der in vitro Modelle verwendet wird, trägt auch die zelluläre Einheit zur Etablierung von funktionalen Modellen bei, weshalb es von großer Bedeutung ist, die zelluläre Vielfalt des Dünndarms in diesen Modellen in vitro nachzuahmen. In diesem Zusammenhang sind die primären intestinalen Organoide, die sich hauptsächlich aus Enterozyten, Becherzellen, enteroendokrinen Zellen, Paneth Zellen, Vorläuferzellen und Stammzellen zusammensetzen, von großem Interesse, da die zelluläre Komponente eine große Ähnlichkeit zum nativen Epithel aufweist. Derartige primäre Organoide werden üblicherweise in einer 3D-Matrigel® Umgebung und einer speziellen Formulierung des Mediums, die mit einer Vielzahl an Wachstumsfaktoren ergänzt wird, um das Stammzellpotenzial zu erhalten, die Differenzierung zu hemmen, die Zellmigration zu stimulieren und somit eine langfristige in vitro-Kultivierung zu unterstützt. Intestinale primäre Sphäroid-/Organoidkulturen wurden auf beiden BNC Varianten als Transwell®-ähnliche Modelle aufgebaut. Dabei zeigte sich eine fragmentierte Zellschicht was darauf schließen lässt, dass die Matrix unter diesen Bedingungen für den Modellaufbau ungeeignet ist. Da der BNC-Herstellungsprozess sehr flexibel ist, könnten die Oberflächen-eigenschaften in zukünftigen Studien angepasst werden, um so eine gute Zelladhäsion auch für primäre Darmzellen zu ermöglichen. Die Anwendung dieser Organoid-basierten Kulturen stellt jedoch für die präklinische Forschung eine enorme Herausforderung dar, da die Kultivierung komplex und zudem sehr zeit- und kosten-intensiv ist. Im Hinblick auf das hohe Potenzial der primären intestinalen Sphäroide/Organoide und der Notwendigkeit eines vereinfachten aber prädiktiven Modells für präklinische Forschungs-zwecke, befasste sich der zweite Teil der Arbeit mit der Etablierung einer primären immortalisierten intestinalen Zelllinie, die eine standardisierte und kosteneffiziente Kultur ermöglicht, wobei die zelluläre Vielfalt der in vitro Organoid-Kulturen erhalten bleibt. In dieser Studie wurden primäre Organoide aus dem murinen und dem menschlichen Dünndarm durch die ektopische Expression eines 10- (murin) bzw. 12 Komponenten (human) Pools von Genen, welche im Hinblick auf die Regulation der Stammzellen und dem Zellzyklus bekannt sind, in Zusammenarbeit mit der InSCREENeX GmbH in einer 2D- und 3D-basierten Transduktionsstrategie immortalisiert. In erster Linie wurden die etablierten Zelllinien (Zellklone) auf ihren Bedarf an Wachstumsfaktoren für die Kultivierung unter vereinfachten und kosteneffizienten Bedingungen hin untersucht. Während die murinen Zellklone auf unbeschichteten Kunststoff in einer Mediumformulierung mit hEGF, mNoggin, Y-27632 und 10% FCS wuchsen, zeigten die humanen Zellklone eine Notwendigkeit für eine Col I-Vorbeschichtung zusammen mit einer Zusammensetzung des Mediums, wie sie üblicherweise für primäre humane Sphäroide/Organoide verwendet wird. Darüber hinaus führten diese vorangegangenen Analysen dazu, dass nur ein humaner Zellklon und drei murine Zellklone umfänglich charakterisiert wurden. Studien zu proliferativen Eigenschaften und spezifischen Gen- sowie Proteinexpressionsprofilen dieser Klone haben gezeigt, dass vermutlich Vorläuferzellen (TACs) anstelle der differenzierten Zelltypen der primären Organoide immortalisiert wurden, da die Kultivierung in 2D, 3D oder in Transwell®-basierten Modellen zu einem geringfügig veränderten Genexpressionsprofil im Vergleich untereinander und zudem zu einem stark reduzierten mRNA-Transkriptionswert für die analysierten Markergene, welche die differenzierten Zelltypen des nativen Epithels repräsentieren, die Folge war. Weiterhin zeigte die 3D-Kultivierung die Bildung von Sphäroid-ähnlichen Strukturen, jedoch keine Organoid-ähnlichen Strukturen unter verlängerten Kultur-bedingungen, was darauf hinweist, dass diese Zellpopulationen ihre Eigenschaft zur Differenzierung hin zu spezifischen intestinalen Zelltypen eingebüßt haben. Die Transwell®-basierten Modelle, welche für jeden Klon etabliert wurden, weisen zudem Organ-spezifische Eigenschaften auf, wie eine epitheliale Morphologie, ein charakteristisches Protein-expressionsprofil mit einer apikalen Schleimschicht, welche den Villin-1 positiven Zelllayer bedeckt und somit den Nachweis erbringt, dass die entstandenen immortalisierten Zellpopulationen zu einem gewissen Anteil aus Becherzellen und Enterozyten bestehen. Zudem konnten repräsentative Tight-Junction Komplexe, die auf eine dichte epitheliale Barriere hinweisen, in entsprechenden Proteinexpressionsprofilanalysen nachgewiesen werden. Der Nachweis einer sowohl dichten als auch funktionellen epithelialen Barriere konnte weitergehend durch TEER-Messungen und in vivo-ähnliche Transportmechanismen für die etablierten Zellklone qualifiziert werden, wodurch diese Zellen als alternative Zellquelle für in vitro Modelle des Dünndarms verwendet werden können. Darüber hinaus begünstigt die einfache Handhabung und Zellexpansion unter kostengünstigeren Bedingungen im Vergleich zu primären Organoidkulturen den Einsatz dieser neu-generierten Zellklone für Bioverfügbarkeits-Studien. Zusammenfassend zeigte diese Arbeit neue Komponenten, strukturelle und zelluläre, für die Etablierung alternativer in vitro-Modelle des Dünndarmepithels, die in präklinischen Screenings für reproduzierbare Studien hinsichtlich der Medikamententestung verwendet werden können. KW - Dünndarm KW - In vitro KW - Tissue Engineering KW - intestinal in vitro model KW - bacterial nanocellulose KW - primary-cell-derived immortalized cell line KW - in vitro Modelle KW - Bakterielle Nanocellulose KW - Primär-basierte immortalisierte Zelllinie Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-244107 ER - TY - THES A1 - Müller, Stefan T1 - Coherent Multiple-Quantum Multidimensional Fluorescence Spectroscopy T1 - Kohärente multidimensionale Multiquanten-Fluoreszenzspektroskopie N2 - This thesis describes novel concepts for the measurement of the static and dynamic properties of the electronic structure of molecules and nanocrystals in the liquid phase by means of coherent fluorescence-detected spectroscopy in two and three frequency dimensions. These concepts are based on the systematic variation ("phase cycling") of a sequence of multiple time-delayed femtosecond excitation pulses in order to decode a multitude of novel nonlinear signals from the resulting phase-dependent fluorescence signal. These signals represent any permutation of correlations between zero-, one-, two-, and three-quantum coherences. To this end, two new phase-cycling schemes have been developed which can simultaneously resolve and discriminate several nonlinear signals of sixth order, including those of the fourth order of nonlinearity. By means of the sixth-order signals recorded in this work, static properties of highly excited electronic states in molecules such as their energies, transition dipole moments, and relative displacement of electronic potential surfaces, as well as dynamic properties in terms of their relaxation kinetics, can be ascertained. Furthermore, it was shown that these signals are suitable for the characterization of exciton-exciton correlations in colloidal quantum dots and for the measurement of ultrafast exciton-exciton annihilation in molecular aggregates. The experiments performed in this thesis mark an important step towards the complete characterization of the nonlinear response of quantum systems. In view of this, the concept of fluorescence-detected multiple-quantum coherence multidimensional spectroscopy introduced here offers a unified, systematic approach. In virtue of the technical advantages such as the use of a single excitation beam and the absence of nonresonant contributions, the measurement protocols developed here can be directly transferred to other incoherent observables and to sample systems in other states of matter. Furthermore, the approaches presented here can be systematically extended to higher frequency dimensions and higher orders of nonlinearity. N2 - Diese Arbeit beschreibt neuartige Konzepte zur Messung der statischen und dynamischen Eigenschaften der elektronischen Stuktur von Molekülen und Nanokristallen in der flüssigen Phase mittels kohärenter Fluoreszenz-detektierter Spektroskopie in zwei und drei Frequenzdimensionen. Diese Konzepte beruhen auf der systematischen Phasenvariation ("Phase Cycling") einer Sequenz mehrerer zeitverzögerter Femtosekunden-Anregepulse, um aus dem resultierenden phasenabhängigen Fluoreszenzsignal eine Vielzahl von neuartigen nichtlinearen Signalen zu dekodieren. Diese Signale stellen jegliche Permutationen von Korrelationen zwischen Null-, Ein-, Zwei- und Drei-Quantenkohärenzen dar. Hierzu wurden zwei neue Phase-Cycling Schemata entwickelt, welche gleichzeitig mehrere nichtlineare Signale der sechsten Ordnung auflösen und voneinander unterscheiden können, inklusive der Signale der vierten nichtlinearen Ordnung. Mit den in dieser Arbeit aufgenommenen Signalen der sechsten Ordnung können statische Eigenschaften hoch-angeregter elektronischer Zustände in Molekülen wie deren Energien, Übergangsdipolmomente, relative Verschiebung elektronischer Potentialflächen zueinander, sowie dynamische Eigenschaften in Bezug auf deren Relaxationskinetik ermittelt werden. Ferner wurde gezeigt, dass diese Signale zur Charakterisierung von Exziton-Exziton-Korrelationen in kolloidalen Quantenpunkten sowie zur Messung ultraschneller Exziton-Exziton-Annihilierung in molekularen Aggregaten geeignet sind. Die Experimente dieser Arbeit markieren einen wichtigen Schritt in Richtung der vollständigen Charakterisierung der nichtlinearen Antwort von Quantensystemen. Das hier eingeführte Konzept der Fluoreszenz-detektierten multidimensionalen Multiquantenkohärenz-Spektroskopie bietet hierfür einen vereinheitlichten, systematischen Ansatz. In Hinblick auf technische Vorteile wie der Verwendung eines einzigen Anregestrahls und der Abwesenheit von nichtresonanten Beiträgen lassen sich die hier entwickelten Messprotokolle direkt auf andere inkohärente Observablen und auf Probesysteme in anderen Aggregatszuständen übertragen. Ferner lassen sich die vorgestellten Ansätze systematisch auf höhere Frequenzdimensionen und nichtlineare Ordnungen erweitern. KW - Coherent Multidimensional Spectroscopy KW - Ultrakurzzeitspektroskopie KW - Angeregter Zustand KW - Kohärente Anregung KW - Electronic spectroscopy KW - Time-resolved spectroscopy KW - Laser pulse shaping KW - Phase cycling KW - High-excited electronic states KW - Elektronische Spektroskopie KW - Zeitaufgelöste Spektroskopie KW - Laserimpulsformung KW - Phasenmodulation KW - Hochangeregte elektronische Zustände Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-244113 ER -