TY - THES A1 - Heinrichs, Susanne Margarete T1 - Myocardial B-cell infiltration following occlusion of the left anterior descending artery in mice is driven by CXCL13 T1 - Die Infiltration des Myokards durch B-Lymphozyten nach Ligatur der linken Koronararterie im Mausmodell wird durch CXCL13 verursacht N2 - Myocardial B-cell infiltration after LAD occlusion in mice is driven by CXCL13 After myocardial infarction, the immune system is activated and regulates wound healing and remodeling processes in the heart. While the role of T cells has been elucidated already, the function of B cells in myocardial infarction remained relatively unclear until now. It is, however, already known that B cells are of importance in healing processes in other tissues, for example in the skin. Our studies therefore addressed the role and function of B cells in healing and early remodeling processes in the myocardium after infarction. Under physiological conditions, only few B cells can be found in the heart. After myocardial infarction, however, which we modelled with a permanent ligation of the left anterior descending artery (LAD) in C57BL/6J mice, we could demonstrate that B lymphocytes accumulate in the early phase after tissue injury (days one to seven) in the myocardium. To detect B cells, we performed immunofluorescence stainings on cryosections of infarcted hearts using an anti-B220 antibody. Quantitative analysis of tissue infiltration revealed that B cells peaked at day seven. In flow cytometry, we further characterized the B cells infiltrating infarcted tissue. We found that most of them were mature B cells (IgM+, IgD+). Next, we wanted to outline a potential mechanism responsible for B-cell infiltration to the site of tissue injury. We therefore performed ELISA experiments revealing that CXCL13 was upregulated in scar tissue. Antibody-mediated neutralization of CXCL13 verifiably attenuated B-cell infiltration. Treated mice also showed – in the tendency – smaller infarct sizes and an improved survival. In conclusion, we could show that B lymphocytes infiltrate the myocardium after MI in mice following a local CXCL13 gradient and that it is, most likely, beneficial to inhibit this process. N2 - Nach einem Herzinfarkt wird das Immunsystem aktiviert und bestimmt die Wundheilung sowie das Remodeling im Herzen. Während die Rolle von T-Zellen [dabei] bereits relativ gut untersucht ist, war die Funktion von B-Zellen beim Myokardinfarkt bis heute relativ unklar. Man weiß bisher allerdings, dass B-Zellen eine wichtige Rolle in Heilungsprozessen in anderen Geweben spielen, z.B. in der Haut. Unsere Untersuchungen beschäftigten sich daher mit der Rolle und Funktion von B-Zellen nach experimentellem Herzinfarkt im Mausmodell. Unter physiologischen Bedingungen finden sich nur wenige B-Zellen im Herzen. Nach Herzinfarkt, den wir mithilfe einer permanenten Ligatur der linken Herzkranzarterie in C57BL/6J-Mäusen induzierten, konnten wir jedoch zeigen, dass B-Zellen in der frühen Phase nach Gewebeschädigung (Tag eins bis sieben) im Myokard akkumulieren. Um B-Zellen zu detektieren, führten wir Immunfluoreszenz-Färbungen mit einem monoklonalen Anti-B220-Antikörper auf Gefrierschnitten des Herzens durch. Eine quantitative Auswertung der Gewebeinfiltration ergab, dass die Anzahl der B-Zellen an Tag sieben ihren Höhepunkt erreicht. In durchflusszytometrischen Untersuchungen charakterisierten wir [anschließend] die das infarzierte Gewebe infiltrierenden B-Zellen (weiter). Wir stellten dabei fest, dass es sich bei den meisten dieser Zellen um reife B-Zellen (IgM+, IgD+) handelte. Als nächsten Schritt wollten wir einen möglichen Mechanismus, der die B-Zell-Infiltration am Ort der Gewebeschädigung erklärt, umreißen. Wir führten daher ELISA-Messungen durch, die ergaben, dass CXCL13 im Narbengewebe hochreguliert war. Eine Antikörper-vermittelte Neutralisation von CXCL13 konnte nachweisbar die B-Zell-Infiltration hemmen. So behandelte Mäuse zeigten – in der Tendenz – kleinere Infarktgrößen und ein verbessertes Überleben. Zusammenfassend konnten wir somit zeigen, dass B-Lymphozyten nach Myokardinfarkt in der Maus das Myokard aufgrund eines lokalen CXCL13-Gradienten infiltrieren und dass es höchstwahrscheinlich vorteilhaft ist, diesen Prozess zu unterbinden. KW - Maus KW - CXCL13 KW - Herzinfarkt KW - B-Lymphozyt KW - LAD Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-168554 ER - TY - THES A1 - Mahmood, Zafar T1 - Effect of cytokine inhibition on peripheral memory B cells in patients with Rheumatoid arthtritis T1 - Auswirkung der Zytokinhemmung auf periphere Gedächtnis B-Zellen in Patienten mit rheumatoider Arthritis N2 - Objective: Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic, systemic, inflammatory autoimmune disease. Enhanced B cell activity has been proposed in the pathogenesis of RA along with different pro-inflammatory cytokines such as interleukin 6 (IL-6) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α), critically involved in chronic inflammation. Biological agents targeting these cytokines IL-6 and TNF-α have considerably advanced treatment of autoimmunity. Enhanced B cell activity, particularly memory B cells gained particularly interest in evaluating response during therapies from biologics. Human peripheral memory B cells can be distinguished by the phenotypic expression of CD27 and IgD defining three major B cell subpopulations: CD27+IgD+ pre-switch, CD27+IgD- post-switch and CD27-IgD- double negative (DN) memory B cells. Therefore, we analyzed different memory populations during cytokine inhibition by using tocilizumab (anti-IL-6R, TCZ) and adalimumab (anti-TNF-α, ADA), with focus on DN B cells Suspended. DN B cells lacking the conventional memory marker CD27, but due to their mutational Ig repertoire (IgR) considered in the memory compartment. However, only scare data are available for this DN subpopulation in RA. Methods: Phenotype analysis of activation markers (CD95 and ki-67) of B cell and their subsets were compared in RA patients (median age ~56 years) and in HD. DN memory B cells were phenotypically analyzed from RA patients during IL-6R or TNF-α inhibition at baseline week 12, week 24 and 1 year. Single B cell PCR approach was used to study Ig- receptors VH genes and isotype specific genes. Nonparametric Wilcoxon matched pair test and Mann-Whitney U test was used for statistical analysis by using GraphPadPrism 5. Univariate logistic regression was used to calculate odd ratios and correlation using Pearson r using SPSS statistics 22. Results: Surface and intracellular staining of B cells showed a significantly higher percentage of CD95 and ki-67 expressions in RA, which was highest in post-switch memory B cells followed by pre-switch and DN memory B cells. During cytokines (IL-6R & TNF-α) inhibition, both CD95 and ki-67 expression were significantly reduced at week 12 and 24 along with reduction in their clinical parameters like DAS28, CRP, ESR. Furthermore, the phenotypic analysis in 107 RA patients and 49 healthy donors (HD) showed a significantly expanded population of DN B cells in RA which contain a heterogeneous mixture of IgA, IgG and IgM expressing cells with a clear dominance of IgG+ cells. Pre-therapy analysis of rearranged IgR sequences from patients (n=9) revealed that DN B cells carry rearranged heavy chain gene sequences with a diversified mutational pattern consistent with memory B cells. In contrast to tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) inhibition, a significant reduction in mutational frequency of BCR gene rearrangements at week 12, 24 and 1 year (p < 0.0001) was observed by in vivo IL-6R inhibition. These changes were observed for all BCR isotypes IgG, IgA and IgM at week 12, 24 and 1 year (p < 0.0001). IgA-RF, IgA serum level and IgA+ DN B cells decreased significantly (p < 0.05) at week 12 and week 24 during TCZ. Patients with a good European league against rheumatism (EULAR) response to TCZ had less DN B cells at baseline as compared to moderate responders (p = 0.006). Univariate logistic regression analysis revealed that the frequency of DN B cells at baseline is inversely correlated to a subsequent good EULAR response (p = 0.024) with an odds ratio of 1.48 (95% confidence interval as 1.05-2.06). Conclusion: Both anti-TNF-α and anti-IL-6R could reduce higher B cell activity and improve disease activity tremendously in RA patients. The heterogeneous DN B cell compartment is expanded in RA and dominated by IgG isotype. TCZ can modulate the mutational status of DN Ig isotype receptors over 1 year. Interestingly, the frequency of DN B cells in RA may serve as a baseline predictor of subsequent EULAR response to TCZ. N2 - Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronische, systemische, und entzündliche Autoimmunerkrankung. Es wird angenommen, dass neben verschiedenen inflammatorischen Zytokinen wie beispielsweise Interleukin-6 (IL-6) und Tumor Nekrose Faktor alpha (TNF-α) auch eine verstärkte Aktivität von B-Zellen in chronischen Entzündungsprozessen involviert ist. Biologische Agenzien, die gezielt gegen die Zytokine IL-6 und TNF-α gerichtet sind, haben die Behandlungsmöglichkeiten der Autoimmunerkrankungen wesentlich vorangetrieben. Derzeit rückt eine verstärkte B-Zell Aktivität, insbesondere die von Gedächtnis B-Zellen, bei der Evaluierung von Reaktionen auf biologische Therapien in den Focus des Interesses. Humane periphere Gedächtnis B-Zellen können anhand der Expression von CD27 und IgD phänotypisch charakterisiert werden und lassen sich dadurch in drei Subpopulationen einteilen: CD27+IgD+ prä-switch, CD27+IgD- post-switch und CD27-IgD- doppelt negative (DN) Gedächtnis B-Zellen. Wir untersuchten die verschiedenen Gedächtnis B-Zell-Populationen während der Zytokininhibierung mittels Tocilizumab (anti-IL-6R, TCZ) und Adalimumab (anti-TNF-α, ADA), wobei der Focus auf DN B-Zellen lag. DN B-Zellen fehlt der konventionelle Gedächtniszellen-Marker CD27, sie werden aber aufgrund ihres mutierten Ig-Repertoires (IgR) den Gedächtniszellen zugeordnet. Für diese DN B-Zell Subpopulation gibt es allerdings bislang nur wenige Daten im Zusammenhang mit RA. Die B-Zell Subpopulationen von RA Patienten (durchschnittliches Alter ~56 Jahre) und gesunden Spendern (englisch: healthy donors, HD) gleichen Alters als Kontrolle, wurden hinsichtlich der Aktivierungsmarker, CD95 und ki-67, phänotypisch analysiert und verglichen. DN Gedächtnis B-Zellen von RA Patienten wurden phänotypisch zu Beginn der IL-6R oder TNF-α Inhibition, nach 12 und 24 Wochen sowie 1 Jahr nach Behandlungsbeginn bestimmt. Es wurden Einzel-PCR Analysen von B-Zellen durchgeführt, um die VH Gene der Ig-Rezeptoren und spezifische Gene zu typisieren. Für die statistischen Auswertungen wurde in GraphPad Prism 5 der‚nonparametric Wilcoxon matched pair test‘ und der‚ Mann-Whitney U test‘ verwendet. Die eindimensionale logistische Regression wurde angewandt, um Odd-Ratio und Korrelationen mittels Pearson r in SPSS Statistik 22 zu berechnen. Die phänotypische Analyse der Oberflächen und intrazellulären Färbungen der B-Zellen ergab einen signifikant erhöhten Prozentsatz der CD95 und ki-67-Expression in RA-Patienten, wobei die Expression am höchsten in post-switch Gedächtnis B-Zellen, gefolgt von prä-switch und DN Gedächtnis B-Zellen, war. Während der Zytokin-Inhibierung (IL-6R & TNF-α) war sowohl die CD95 als auch ki-67-Expression zum Zeitpunkt Woche 12 und Woche 24 signifikant reduziert, einhergehend mit der Verringerung klinischer Parameter wie DAS28, CRP und ESR. Weiterhin zeigte die phänotypische Analyse von 86 RA-Patienten und 49 HD eine deutlich expandierte DN B-Zell Population in RA-Patienten. Diese setzte sich aus einer heterogenen Mischung von IgA, IgG und IgM exprimierenden Zellen zusammen, wobei IgG+ B-Zellen deutlich dominierten. Die Analyse von neu-gruppierten IgR Sequenzen von B-Zellen aus RA Patienten (n=9) vor Therapiebeginn zeigte, dass DN B-Zellen umgruppierte Gensequenzen der schweren Ketten mit diversen Mutationsmustern tragen, wie es bei Gedächtnis B-Zellen der Fall ist. Im Gegensatz zur TNF-α-Hemmung ist bei der in vivo IL-6R-Inhibierung eine signifikante Reduktion der Mutationsrate innerhalb der umgruppierten der Gene der B-Zell Rezeptoren (BCR) nach 12 und 24 Wochen sowie nach 1 Jahr (p<0,0001) zu beobachten. Diese Änderungen waren bei allen BCR Isotypen IgG, IgA und IgM bei Woche 12, 24 und 1 Jahr (p<0.0001) zu sehen. IgA-RF, IgA-Serum Spiegel sowie IgA+ DN B Zellen nahmen 12 und 24 Wochen nach Beginn der Behandlung mit TCZ signifikant ab (p<0,05). Patienten mit einer guten klinischen Besserung (EULAR Antwort) auf TCZ hatten weniger DN B-Zellen vor Therapiebeginn im Blut als Patienten, die eine moderate Reaktion zeigten. Univariate logistische Regressionsanalysen zeigten, dass die Frequenz von DN B-Zellen vor Therapiebeginn invers mit einer sich anschließenden guten EULAR Antwort korreliert. Die Odds Ratio war 1,48 (95% Konfidenz Intervall wie 1,05-2,06). Im Ergebnis hat die Studie Phänotypen von aktivierten Gedächtnis B-Zellen und deren Untergruppen in Patienten mit aktiver RA nachgewiesen. Die höhere Expression des Oberflächenmarker CD95 und des intrazellulären Marker ki-67 spiegelt die Krankheitsaktivität wieder und korreliert mit dieser positiv. Signifikant höhere Populationen von CD27-IgD- DN B-Zellen in der RA stehen jedoch unabhängig von der Krankheitsaktivität in Bezug zum Ansprechen auf die Therapie. Diese erhöhten DN B-Zellen sind eine Mischung aus somatisch mutierten Isotyp IgG, IgA und IgM exprimierenden Zellen, wobei IgG Isotypen dominieren. Die TCZ Therapie bewirkt insbesondere eine Abnahme der Frequenzen von IgA+ DN Gedächtnis B-Zellen, zusammen mit einer Abnahme des Serum-IgA und RF-IgA-Spiegels. Auf molekularer Ebene ist zu sehen, dass mutierte DN B Zellen geringere Mutationen aufweisen als prä-switch und post-switch B-Zellen. Interessanterweise sind IgA+ DN B-Zellen am meisten unter allen 3 Isotypen mutiert. Die TCZ Therapie reduziert die Mutationsrate, auch innerhalb der RGYW Hotspots, in allen DN B-Zell Isotypen über einen Zeitraum von einem Jahr. Eine geringe Anzahl von DN Gedächtnis B-Zellen vor Therapiebeginn mit TCZ (anti-IL-6R) war mit einer verbesserten klinischen Antwort korreliert. Auf Grundlage dieser aktuellen Ergebnisse erscheinen DN Gedächtnis B-Zellen als möglicher Biomarker Kandidaten zu sein, um eine Reaktion auf eine TCZ Therapie anzuzeigen. KW - Arthrosis deformans KW - Rheumatoid arthritis KW - Memory B cells KW - IL-6 Inhibition KW - Double Negative B cells KW - Interleukin 6 KW - B-Lymphozyt KW - Immunology Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-117334 ER - TY - THES A1 - Alrefai, Hani Gouda Alsaid T1 - Molecular Characterization of NFAT Transcription Factors in Experimental Mouse Models T1 - Molekulare Charakterisierung von NFAT-Transkriptionsfaktoren in experimentellen Mausmodellen N2 - In this work we wanted to investigate the role of NFATc1 in lymphocyte physiology and in pathological conditions (eg. psoriasis). NFATc1 is part of the signal transduction pathways that regulates B cells activation and function. NFATc1 has different isoforms that are due to different promoters (P1 and P2), polyadenylation and alternative splicing. Moreover, we tried to elucidate the points of interactions between the NFAT and the NF-κB pathways in activated B-cell fate. NFAT and NF-κB factors share several properties, such as a similar mode of induction and architecture in their DNA binding domain. We used mice which over-express a constitutive active version of NFATc1/α in their B cells with -or without- an ablated IRF4. IRF4 inhibits cell cycle progression of germinal center B cell-derived Burkitt’s lymphoma cells and induces terminal differentiation toward plasma cells. Our experiments showed that a ‘double hit’ in factors affecting B cell activation (NFATc1 in this case) and late B cell Differentiation (IRF4 in this case) alter the development of the B cells, lead to increase in their numbers and increase in stimulation induced proliferation. Therefore, the overall picture indicates a link between these 2 genes and probable carcinogenic alterations that may occur in B cells. We also show that in splenic B cells, c-Rel (of the NF-κB canonical pathway) Support the induction of NFATc1/αA through BCR signals. We also found evidence that the lack of NFATc1 affects the expression of Rel-B (of the NF-κB non-canonical pathway). These data suggest a tight interplay between NFATc1 and NF-κB in B cells, influencing the competence of B cells and their functions in peripheral tissues. We also used IMQ-induced psoriasis-like inflammation on mice which either lack NFATc1 from B cell. Psoriasis is a systemic chronic immunological disease characterized primarily by abnormal accelerated proliferation of the skin keratinocytes. In psoriasis, the precipitating event leads to immune cell activation. Our experiments showed that NFATc1 is needed for the development of psoriasis. It also showed that IL-10 is the link that enables NFAT from altering the B cell compartment (eg Bregs) in order to affect inflammation. The important role of B cell in psoriasis is supported by the flared up psoriasis-like inflammation in mice that lack B cells. Bregs is a special type of B cells that regulate other B cells and T cells; tuning the immunological response through immunomodulatory cytokines. N2 - Diese Arbeit befasst sich mit der Regulation und der Funktion des Transkriptionsfaktors NFATc1 (“nuclear factor of activated T-cells c1) in B-Lymphozyten. Hierzu wurde zum einen die transkriptionelle Kontrolle des Nfatc1-Gens in aktivierten B-Lymphozyten und zum anderen die Bedeutung dieses Faktors für die Wachstumskontrolle und Autoimmunität anhand verschiedener Modellsysteme analysiert. Sechs verschiedene NFATc1-Isoformen können in B-Lymphozyten durch die Nutzung zweier verschiedener Promotoren, zweier Polyadenylierungsstellen und eines alternativen Splicings generiert werden. Wir zeigen hier, dass insbesondere die NF-kB Faktoren c-Rel und p50 eine essentielle Bedeutung für die starke Induktion des Promoters P1 und damit der Expression der kurzen Isoform NFATc1A in B-Zell-Rezeptor-stimulierten B-Zellen spielen. Interessanterweise zeigen NFATc1-defiziente B-Lymphozyten eine geschwächte Aktivierung der NF-kB-Faktoren, was auf eine enge Verknüpfung dieser zwei Signalwege hindeutet. NFATc1-defiziente B-Lymphozyten weisen eine Aktivierungs- und Wachstumsschwäche auf (Bhattacharyya S., et.al.). Hier zeigen wir, dass die Überexpression von konstitutiv aktivem NFATc1A in B-Lymphozyten, insbesondere wenn dies im Kontext einer IRF4-Defizienz geschieht, zu einer verstärkten Expansion der B-Zellpopulation, insbesondere nach deren Aktivierung, führt. Dies belegt die kritische Bedeutung, die der wohldosierten Expressions- und Aktivierungskontrolle der NFATc1-Faktoren in B-Lymphozyten zukommt. Dies zeigt sich auch in einem Imiquimod-induziertem Psoriasis Mausmodell. Hier wird durch Applikation von Imiquimod auf die Haut eine der Schuppenflechte ähnelnde entzündliche Reaktion ausgelöst, die insbesondere durch eine stark verstärkte Proliferation der Keratinozyten gekennzeichnet ist. Wir können zeigen, dass die NFATc1-Faktoren in B-Lymphozyten kritisch an dieser Reaktion beteiligt sind. Fehlt den B-Lymphozyten das NFATc1-Gen, so produziert eine Subpopulation, die sogenannten regulatorischen B-Zellen, verstärkt das immunmodulatorischen Zytokins IL-10, wodurch die entzündliche Reaktion fast komplett unterdrückt wird. Dies ähnelt vorhergehenden Beobachtungen, in denen wir zeigen konnten, dass auch in einem Mausmodell der Multiplen Sklerose (EAE) die Immunreaktion durch den Verlust von NFATc1 in B-Zellen erheblich gelindert werden kann (Bhattacharyya S., et.al.). KW - Schuppenflechte KW - Maus KW - Transkriptionsfaktor KW - B-Lymphozyt KW - NFAT KW - NF-kB KW - Transgenic mice KW - Psoriasis KW - Cancer KW - B cells Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97905 ER - TY - THES A1 - Duttu, Vallabhapurapu Subrahmanya T1 - Regulation of B lymphocyte terminal differentiation and death by the transcription factor Blimp-1 T1 - Regulation von B zell terminalen differenzierung und death by transcriptionfaktor Blimp-1 N2 - B lymphocyte induced maturation protein-1 (Blimp-1) und X-box-binding protein-1” (XBP-1) sind als Transkriptionsfaktoren unverzichtbar für die terminale Differenzierung von B-Lymphozyten zu Immunglobulin (Ig)-sezernierenden Plasmazellen. Ebenso stellen die unfolded protein response (UPR) und das Spleißen von XBP-1, beides ausgelöst durch erhöhte Ig-Produktion, entscheidende Schritte auf dem Weg zur Plasmazellentstehung dar. Allerdings ist das Molekül/ sind die Moleküle nach wie vor unbekannt, die diesen beiden Ereignissen in der Signalkaskade vorgeschaltet sind. Da die ektope Expression von Blimp-1 in B-Zellen hinreicht, diese zu Plasmazellen zu differenzieren, erscheint es plausibel, dass Blimp-1 das Molekül sein könnte, das die Auslösung einer UPR und das Spleißen von XBP-1 steuert. Dieser Möglichkeit wurde durch ektope Expression von Blimp-1 in der Maus-B-Zell-Lymphomlinie WEHI 231 und in primären B-Zellen aus der Milz von Mäusen nachgegangen. Die ektope Expression von Blimp-1 führte in beiden Zelltypen zur Erhöhung der Ig Produktion, zum Spleißen von XBP-1 und zur Sekretion von Immunglobulinen. Interessanterweise war der N-terminale Anteil von Blimp-1, bestehend aus den Aminosäuren 1-751, hinreichend, um diese Effekte auszulösen, während der C-Terminus, der die Aminosäuren 465-856 umfaßte, keinen Effekt hatte. Darüberhinaus, wurde die Expression von BIP, dessen Gen ein UPR-Zielgen ist, durch ektope Expression von Blimp-1 bzw. dessen N-Terminus in primären B-Zellen erhöht. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass Blimp-1, speziell dessen N-terminale Domäne, hinreichend ist, um eine UPR und die Prozessierung von XBP-1 auszulösen, was zur Ig-Sekretion von B-Zellen führt. N2 - B lymphocyte induced maturation protein-1 (Blimp-1) and X-box-binding protein-1 (XBP-1) are indispensible transcription factors required for B lymphocyte terminal differentiation into Ig secreting plasma cells. Occurrence of an unfolded protein response (UPR) and XBP-1 splicing, due to elevated Ig levels, are critical events during plasma cell generation. However, the upstream molecule sufficient to trigger these events remain elusive. Because ectopic expression of Blimp-1 in B cells is sufficient to generate plasma cells, it is plausible that Blimp-1 might be the upstream molecule, sufficient for the induction of UPR and XBP-1 splicing. The results from the current study indicate that ectopic expression of Blimp-1 or its N-terminal domain, in B cells, is sufficient to induce XBP-1 splicing, UPR and Ig (immunoglobulin) secretion. Further more Blimp-1 is able to directly repress the antiapoptotic gene A1, by binding to specific DNA elements in A1 promoter. This repression of A1 by Blimp-1 seems to be an important prerequisite for Plasma cell differentiation because ectopic expression of A1 in primary B cells resulted in reduced immunoglobulin secretion. KW - B-Lymphozyt KW - Zelldifferenzierung KW - Transkriptionsfaktor KW - Blimp-1 KW - B-zells KW - Immunologie KW - Blimp-1 KW - B-cells KW - Immunology Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17158 ER - TY - THES A1 - Rouzière, Anne-Sophie T1 - MODULATION OF THE B-CELL REPERTOIRE IN RHEUMATOID ARTHRITIS BY TRANSIENT B-CELL DEPLETION T1 - Veränderung des B-Zell-Repertoirs nach B-Zelldepletion mit Anti-CD20-Antikörpen N2 - Although the role of B-cells in autoimmunity is not completely understood, their importance in the pathogenesis of autoimmune diseases has been more appreciated in the past few years. It is now well known that they have roles in addition to (auto) antibody production and are involved by different mechanisms in the regulation of T-cell mediated autoimmune disorders. The evolution of an autoimmune disease is a dynamic process, which takes a course of years during which complex immunoregulatory mechanisms shape the immune repertoire until the development of clinical disease. During this course, the B-cell repertoire itself is influenced and a change in the distribution of immunoglobulin heavy and light chain genes can be observed. B-cell depletive therapies have beneficial effects in patients suffering from rheumatoid arthritis (RA), highlighting also the central role of B-cells in the pathogenesis of this disease. Nevertheless, the mechanism of action is unclear. It has been hypothesised that B-cell depletion is able to reset deviated humoral immunity. Therefore we wanted to investigate if transient B-cell depletion results in changes of the peripheral B-cell receptor repertoire. To address this issue, expressed immunoglobulin genes of two patients suffering from RA were analysed; one patient for the heavy chain repertoire (patient H), one patient for the light chain repertoire (patient L). Both patients were treated with rituximab, an anti-CD20 monoclonal antibody that selectively depletes peripheral CD20+ B-cells for several months. The B-cell repertoire was studied before therapy and at the earliest time point after B-cell regeneration in both patients. A longer follow-up (up to 27 months) was performed in patient H who was treated a second time with rituximab after 17 months. Heavy chain gene analysis was carried out by nested-PCR on bulk DNA from peripheral B-cells using family-specific primers, followed by subcloning and sequencing. During the study, patient H received two courses of antibody treatment. B-cell depletion lasted 7 and 10 months, respectively and each time was accompanied by a clinical improvement. Anti-CD20 therapy induced two types of changes in this patient. During the early phase of B-cell regeneration, we noticed the presence of an expanded and recirculating population of highly mutated B-cells. These cells expressed very different immunoglobulin VH genes compared before therapy. They were class-switched and could be detected for a short period only. The long-term changes were more subtle. Nevertheless, characteristic changes in the VH2 family, as well as in specific mini-genes like VH3-23, 4-34 or 1-69 were noticed. Some of these genes have already been reported to be biased in autoimmune diseases. Also in autoimmune diseases, in particular in RA, clonal B-cells have been frequently found in the repertoire. B-cell depletion with anti-CD20 antibody resulted in a long term loss of clonal B-cells in patient H. Thus, temporary B-cell depletion induced significant changes in the heavy chain repertoire. For the light chain gene analysis, the repertoire changes were analysed separately for naive (CD27-) and memory (CD27+) B-cells. Individual CD19+ B-cells were sorted into CD27- and CD27+ cells and single cell RT-PCR was performed, followed by direct sequencing. During the study, patient L received one course of antibody treatment. B-cell depletion lasted 10 months and the light chain repertoire was studied before and after therapy. Before therapy, some differences in the distribution of VL and JL genes were observed between naive and memory B-cells. In particular, the predominant usage of Jk-proximal Vk genes by the CD27- naive B-cells indicated that the receptor editing was less frequent in this population compared to memory cells. In VlJl rearrangements also, some evidence for decreased receptor editing was noticed, with the overrepresentation of the Jl2/3 gene segments. The CDR3 regions of naive and memory cells showed different characteristics: the activity of the terminal deoxynucleotidyl transferase and exonuclease in Vl(5’) side was greater in memory cells. Also in the light chain repertoire, we observed some changes induced by the B-cell depletive therapy. There was a tendency of a less frequent usage of Jk-proximal Vk genes in the naive population. Some Vl genes, previously described in autoimmune diseases and connected to rheumatoid factor activity, such as 3p, 3r, 1g, were not found after therapy. The different characteristics of the CDR3 regions of VlJl rearrangements were not observed anymore. Very significantly, the ratio Vk to Vl was shifted toward a greater usage of Vk genes in the naive population after therapy. Taken together, these results indicate that therapeutic transient B-cell depletion by anti-CD20 antibody therapy modulates the immunoglobulin gene repertoire in the two RA patients studied. Measurable changes were observed in the heavy chain as well as in the light chain repertoire, which may be relevant to the course of the disease. This also supports the notion that the composition of the B-cell repertoire is influenced by the disease and that B-cell depletion can reset biases that are typically found in autoimmune diseases. N2 - Obwohl die Rolle der B-Zellen für den Verlauf einer Autoimmunerkrankung noch nicht vollständig klar ist, so hat ihre Bedeutung für die Autoimmunpathogenese in den letzten Jahren zugenommen. Man weiß mittlerweile sehr wohl, dass ihre Rolle über die reine Produktion von (Auto-)antikörpern hinausgeht und sie z.B. an der Regulation T-Zellvermittelter Autoimmunstörungen beteiligt sind. Das B-Zellrepertoire selbst wird im Laufe einer autoimmunen Erkrankung durch solche immunregulatorische Prozesse beeinflusst. B-Zelldepletive Therapien zeigen vorteilhafte Effekte bei Patienten mit Rheumatoider Arthritis, was wiederum die zentrale Rolle von B-Zellen in der Pathogenese unterstreicht. Nichtsdestotrotz bleibt der genaue Mechanismus unklar. So wird z.B. spekuliert, dass mittels B-Zell-Depletion eine Neugenerierung der humoralen Immunität erreicht wird. Vor diesem Hintergrund untersuchten wir, ob eine vorübergehende B-Zell-Depletion zu Veränderungen im peripheren B-Zellrepertoire führt. Hierfür wurde das B-Zell-Rezeptorrepertoire von zwei Patienten mit Rheumatoider Arthritis im einen Fall bezüglich der schweren Kette (Patient H) und im anderen Fall bezüglich der leichten Kette (Patient L) analysiert. Beide Patienten wurden mit Rituximab, einem monoklonalen anti-CD20 Antikörper, der zu einer selektiven und über mehrere Monate anhaltenden Depletion peripherer CD20+-B-Zellen führt, behandelt. Das B-Zellrepertoire wurde für beide Patienten unmittelbar vor Therapie sowie in der frühen B-Zellregeneration untersucht. Bei Patient H erfolgte eine zweite Behandlung mit Rituximab nach 17 Monaten. Das Follow-up erfolgte in diesem Fall bis Monat 27. Die Analyse der Schwerketten erfolgte mittels nested-PCR mit DNA aus peripheren B-Zellen unter Verwendung familienspezifischer Primer und anschließendem Subklonieren und Sequenzieren. Während der Studie erhielt Patient H zwei Zyklen der Antikörperbehandlung. Die B-Zell-Depletion hielt 7 bzw. 10 Monate an und war zu jedem Zeitpunkt mit einer klinischen Besserung des Patienten verbunden. Die Anti-CD20 Therapie bewirkte zwei Arten von Veränderungen in diesem Patienten. Während der frühen Phase der B-Zellregeneration konnten wir eine ausgedehnte und rezirkulierende Population hochmutierter B-Zellen nachweisen. Diese Zellen exprimierten verglichen mit dem Zeitpunkt vor Therapie sehr unterschiedliche VH Gene. Es handelte sich hierbei um „class-switched“ Zellen, welche nur für kurze Zeit nachweisbar waren. Die Langzeit Veränderungen dagegen waren eher diskret. Nichtsdestotrotz konnten Veränderungen sowohl in der Familie VH2 als auch in spezifischen Mini-Genen wie VH3-23, 4-34 oder 1-69 festgestellt werden. Eine Häufung einiger dieser Gene wurde bereits im Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen berichtet. Zusätzlich bewirkte die Rituximabtherapie ein Verschwinden klonaler B-Zellen für die gesamte Periode. Folglich bewirkte die vorübergehende B-Zell-Depletion signifikante Veränderungen im Schwerkettenrepertoire. Für die Genanalyse der leichten Kette wurden die Veränderungen getrennt für naive (CD27-) und Gedächtnis- (CD27+) B-Zellen untersucht. Einzelne CD19+ B-Zellen wurden in CD27- und CD27+-Zellen sortiert und anschließend eine Single-cell-RT-PCR mit direkter Sequenzierung der Produkte durchgeführt. Während der Studie erhielt Patient L eine Behandlung. Die B-Zell-Depletion dauerte 10 Monate und das Leichtkettenrepertoire wurde vor und nach Therapie analysiert. Gewisse Unterschiede bezüglich der Verteilung von VL und JL Genen zwischen den Populationen naiver und Gedächtnis-B-Zellen konnten vor Therapie nachgewiesen werden. Insbesondere die bevorzugte Nutzung von Vκ Genen Jκ-proximal in CD27- naive B-Zellen spricht für ein vermindertes „receptor editing“ in dieser Population. Ferner fanden sich in VλJλ-Rearrangements Hinweise für ein vermindertes „receptor editing“ mit einer Überrepräsentation der Jλ2/3 Gensegmente. Die CDR3-Regionen der naiven und Gedächtnis-B-Lymphozyten zeigten unterschiedliche Eigenschaften: die Aktivität der Terminalen-Deoxynucleotidyl-Transferase und Exonuklease im Vλ-Abschnitt (5´) war höher als in Gedächtniszellen. Die B-Zelldepletive Therapie führtete zu signifikanten Veränderungen. So fand sich die Tendenz einer weniger häufigen Nutzung von Jκ-proximal gelegenen Vκ Gensegmenten in der naiven B-Zellpopulation. Einige Vλ Gene, wie z.B. 3p, 3r oder 1g, welche kürzlich in Verbindung mit Rheumafaktor bei Autoimmunerkränkungen beschrieben wurden, waren nach der Therapie nicht mehr nachweisbar. Ebenso verschwanden die unterschiedlichen Eigenschaften der CDR3-Regionen von VλJλ-Rearrangements. Besonders auffällig war das Verhältnis Vκ zu Vλ zugunsten einer häufigeren Nutzung von Vκ Genen in der naiven Population nach Therapie verschoben. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass mittels therapeutischer und vorüber- gehender B-Zell-Depletion durch anti-CD20-Antikörper das Immunglobulingenrepertoire in den beiden untersuchten Patienten moduliert wurde. Messbare Unterschiede fanden sich sowohl im Schwerketten- als auch im Leichtkettenrepertoire. Es erscheint wahrscheinlich, dass diese Veränderungen mit dem beobachteten therapeutischen Ansprechen in Verbindung stehen. Die Ergebnisse stützen die Annahme, dass die Zusammensetzung des B-Zellrepertoires durch die Krankheit beeinflusst wird und für Autoimmunerkrankungen charakteristische Veränderungen mittels B-Zell-Depletion aufgehoben werden können. KW - Rheumatoide Arthritis KW - B-Lymphozyt KW - Abreicherung KW - B-Zellrepertoire KW - Ig-Gene KW - Rituximab KW - B-Zelldepletive Therapie KW - B-cell repertoire KW - Ig genes KW - rituximab KW - anti-CD20 antibody therapy Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9290 ER - TY - THES A1 - Souto-Carneiro, Maria Margarida T1 - Molecular and functional analyses of human synovial B-lymphocytes in rheumatoid arthritis T1 - Molekularen und funktionellen Analysen humanen synovialen B-Lymphozyten in rheumatoiden Arthritis N2 - B-cells of the rheumatoid synovial tissue are a constant part of and, in some histopathological subtypes, the dominant population of the inflammatory infiltrate, located in the region of tissue destruction. The pattern of B-cell distribution and the relationship to the corresponding antigen-presenting cells (follicular dendritic reticulum cells: FDCs) show a great variety. B-cells may exhibit (i) a follicular organization forming secondary follicles; (ii) follicle-like patterns with irregularly formed FDC networks, and (iii) a diffuse pattern of isolated FDCs. Molecular analysis of immunoglobulin VH and VL genes from human synovial B-cell hybridomas and synovial tissue demonstrates somatic mutations due to antigen activation. The FDC formations in the synovial tissue may therefore serve as an environment for B-cell maturation, which is involved in the generation of autoantibodies. An autoantibody is defined as "pathogenic" if it fulfills the Witebsky-Rose-Koch criteria for classical autoimmune diseases: definition of the autoantibody; induction of the disease by transfer of the autoantibody; and isolation of the autoantibody from the disease-specific lesion. B-cells from rheumatoid synovial tissue show specificity for FcIgG, type II collagen, COMP, sDNA, tetanus toxoid, mitochondrial antigens (M2), filaggrin and bacterial HSPs. The contributions of these antigens to the pathogenesis of RA are still hypothetical. A possible contribution could derive from crossreactivity and epitope mimicry: due to crossreaction, an antibody directed originally against a foreign infectious agent could react with epitopes from articular tissues, perpetuating the local inflammatory process. The characteristic distribution pattern, the localisation within the area of tissue destruction, the hypermutated IgVH and IgVL genes, and their exclusive function to recognize conformation-dependent antigens suggest a central role for B-cells in the inflammatory process of rheumatoid arthritis. Therefore, the analysis of synovial B-cell hybridomas and experimental expression of synovial IgVH and IgVL genes will help to characterise the antigens responsible for the pathogenesis of rheumatoid arthritis. In the present study 55 IgVH genes amplified from 3 different anatomical regions of a RA patient were analysed adding further information on synovial B-cell maturation and recirculation in RA. This analysis demonstrated somatically mutated IgVh genes in all different regions with amino acid deletions and mixed IgVh molecules, suggesting the existence of a novel pathway to generate (auto)antibody specificities. The comparison of amino acid sequences of amplified genes belonging to the VH1 family (with predominantly the same germline counterpart) exhibited a strong homology, indicating an apparently conserved mutational pattern. This suggests that the number of antigens activating B-cells in the different locations is restricted. The most striking result was the finding of clonally related sequences in different anatomical regions indicating a recirculation of activated B-cells between the different affected joints. Also in the present study a synovial B-cell hybridoma was analyzed for its specific recognition of cartilage antigens. A heptameric peptide of cartilage oligomeric protein (COMP) could be defined as the target structure. The IgVH-gene (IgHV4-59*01) of the IgG2l hybridoma has somatically mutated genes with high R/S values in the CDR regions (9:2). Thus, indicating that this hybridoma originates from a synovial B-cell which has been antigen activated/selected for its affinity. To analyse the presence of the clonotypic IgHV4-59*01 sequences in other cases of RA and osteoarthritis (OA) synovitis, primers specific for the CDR3 rearrangement of this hybridoma were used. The clonotypic and clone related sequences (98 per cent ± 1 per cent homology) could only be detected in synovitis of RA cases but not in OA cases indicating that this B-cell is specific to RA synovitis. The identified heptameric peptide of COMP was used in a peptide ELISA to analyse whether there is a specific binding in RA serum samples. Serum samples (IgG) from RA patients (n=22) showed a significant higher efficiency to the COMP heptamer than the OA sera (n=24) and the age matched healthy controls (n=20) (for both p<1x10-4, Students t-test). The specificity of this B-cell hybridoma may therefore be defined as RA specific. Since COMP is restricted to cartilage and tendons which are organs specifically affected in RA this COMP specific autoantibody represents the first organ specific autoantibody in RA. The IgG2 COMP specific autoantibody with somatically mutated IgVH genes is different from germline encoded, antigen clearing IgM autoantibodies and may therefore be directly involved as an "arthritogenic autoantibody" in cartilage and tendons destruction by complement activation. N2 - B-Zellen des rheumatoiden Synovialgewebes sind einerseits ein konstanter Bestandteil und andererseits in einigen histopathologischen Subtypen sogar die dominante Bevölkerung des entzündlichen Infiltrates, welches sich in direkter Nähe des zerstörten Gewebes befindet. Das Strickmuster der B-Zellen-Verbreitung und die Verbindung zu den korrespondierenden antigenerzeugenden Zellen (follikuläre dendritische Zellen, sprich: FDC) zeigen eine große Vielfalt. B-Zellen können a) in der Form eines follikulären Verbandes sich bildender Sekundärfollikel; b) als follikelähnliche Muster mit unregelmäßig geformten FDC-Netzwerken und c) als ein diffuses Muster isolierter FDCs auftreten. Molekularanalysen der immunglobulinen VH- und VL-Gene von menschlichen synovialen B-Zell-Hybridomen und Synovialgewebe zeigen somatische Mutationen aufgrund von Antigenaktivierung auf. Die FDC-Schichten im Synovialgewebe dürften daher als ein Nährboden für B-Zell-Reifung dienen, welche wiederum in den Prozeß der Autoantikörperbildung eingreift. Ein Autoantikörper wird als "pathogenisch" bezeichnet, wenn er das Witebsky-Rose-Koch-Kriterium für klassische Autoimmunkrankheiten erfüllt: Bildung des Autoantikörpers; Einleitung der Krankheit durch Übertragung des Autoantikörpers und Isolation des Autoantikörpers vom krankheitsspezifischen Entzündungskomplex. B-Zellen aus rheumatoidem Synovialgewebe zeigen Spezifität für die Fc-Region von lgG; Typ II Kollagen; COMP; sDNA; Tetanustoxin; mitochondrische Antigene (M2); Fillaggrin und bakterielle HSPs. Der Beitrag dieser Antigene zur Pathogenese in der RA ist weiterhin hypothetisch. Ein möglicher Beitrag könnte aus der Kreuzreaktion und Epitopähnlichkeit aufgrund dieser Kreuzreaktion herrühren. Ein Antikörper, der ursprünglich gegen einen fremden Infektionsherd gerichtet war, könnte mit Epitopen aus Gelenkgewebe reagieren und somit den lokalen Entzündungsprozeß aufrechterhalten. Das charakteristische Verteilungsmuster, die Lokalisierung inmitten des zerstörten Gewebes, die hypermutierten IgVH- und IgVL-Gene und ihre ausschließliche Funktion, strukturabhängige Antigene zu erkennen, läßt auf eine zentrale Bedeutung der B-Zellen im Bezug auf den Entzündungsverlauf in der rheumatoiden Arthritis schließen. Deswegen wird die Analyse synovialer B-Zellen-Hybridome und die experimentelle Erkundung synovialer IgVH- und IgVL-Gene eine große Hilfe zur Charakterisierung der Antigene sein, welche verantwortlich für die Pathogenese in der RA sind. In dieser Studie wurden 55 IgVH-Gene analysiert, die von 3 verschiedenen anatomischen Regionen eines RA-Patienten amplifiziert wurden, wodurch man zusätzliche Informationen über synoviale B-Zellen-Reifung und -Rezirkulation in der RA erhielt. Diese Analyse zeigte somatisch mutierte IgVH-Gene in allen verschiedenen Regionen auf, mit Aminosäuredeletionen und gemischten IgVH-Molekülen, die Grund zur Annahme geben, daß eine neue Möglichkeit existiert, (Auto-) Antikörperspezifizierungen zu generieren. Der Vergleich von Aminosäuresequenzen amplifizierter Gene, die zur VH1-Familie gehören (mit überwiegend denselben Keimbahngenen) zeigten eine starke Homologie auf und wiesen auf ein scheinbar erhaltenes Mutationsmuster hin. Dieses läßt annehmen, daß die Anzahl der Antigene begrenzt ist, die B-Zellen in den verschiedenen Regionen aktivieren. Das markanteste Ergebnis war das Auffinden klonal verwandter Sequenzen in verschiedenen anatomischen Regionen, die darauf hinweisen, daß aktivierte B-Zellen zwischen den verschiedenen befallenen Gelenken rezirkulieren. Desweiteren wurde in dieser Studie ein synoviales B-Zellen-Hybridom analysiert bezüglich seiner spezifischen Erkennung von Knorpelantigenen. Ein heptameres Peptid des COMP könnte als eine mögliche Zielstruktur definiert werden. Die IgVH-Gene (IgHV4-59*01) des IgG2?-Hybridomes besitzt somatisch mutierte Gene mit hohen R/S-Werten in den CDR-Regionen (9.2). Somit weist dies darauf hin, daß dieses Hybridom aus einer synovialen B-Zelle stammt, welche aufgrund ihrer Affinität antigen-aktiviert wurde. Um das Vorkommen der klonotypischen IgHV4-59*01-Sequenzen in anderen Fällen der RA und Osteoarthritis (OA)-Synovitis zu analysieren, wurden Primer benutzt, die spezifisch für die CDR3 dieses Hybridomes sind. Die klonotypischen und klonal verwandten Sequenzen (98 Prozent ± 1 Prozent Homologie) konnte nur in Fällen der RA-Synovitis erkannt werden, jedoch nicht bei OA-Fällen, was darauf hinweist, daß diese B-Zelle spezifisch für die RA-Synovitis ist. Das identifizierte heptamere COMP-Peptid wurde in einer Peptid-ELISA verwendet, um festzustellen, ob es eine spezifische Bindung in RA-Seren gibt. Seren (IgG) von RA-Patienten (n=22) zeigten eine bedeutend höhere Wirksamkeit des COMP-Heptamers an als in OA-Seren (n=24) und den altersabhängigen gesunden Kontrollen (n=20); (für beide p<1x10-4; Students t-Test). Die Spezifizierung dieses B-Zellen-Hybridomes könnte daher als RA-spezifisch angesehen werden. Da COMP sich auf Knorpel und Sehnen beschränkt - welches hauptsächlich in der RA betroffene Organe sind - repräsentiert dieser COMP-spezifische Autoantikörper den ersten organspezifischen Autoantikörper in der RA. Der IgG2-COMP-spezifische Autoantikörper mit somatisch mutierten IgVH-Genen unterscheidet sich von dem der antigenvernichtenden IgM Autoantikörper und könnte daher direkt in die Knorpel- und Sehnenzerstörung durch Komplementaktivierung miteinbezogen sein, als ein "arthritogener Autoantikörper". KW - Rheumatoide Arthritis KW - B-Lymphozyt KW - Synovialmembran KW - Molekularbiologie KW - rheumatoiden Arthritis KW - B-Lymphozyten KW - Autoantikörper KW - Antigen KW - Cartilage Oligomeric Matrix Protein KW - rheumatoid arthritis KW - B-lymphocytes KW - autoantibody KW - antigen KW - cartilage oligomeric matrix protein Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2308 ER -