TY - THES A1 - Rumpf, Florian T1 - Optogenetic stimulation of AVP neurons in the anterior hypothalamus promotes wakefulness T1 - Optogenetische Stimulation von AVP Neuronen im vorderen Hypothalamus induziert Wachheit N2 - The mammalian central clock, located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the anterior hypothalamus, controls circadian rhythms in behaviour such as the sleep-wake cycle. It is made up of approximately 20,000 heterogeneous neurons that can be classified by their expression of neuropeptides. There are three major populations: AVP neurons (arginine vasopressin), VIP neurons (vasoactive intestinal peptide), and GRP neurons (gastrin releasing peptide). How these neuronal clusters form functional units to govern various aspects of rhythmic behavior is poorly understood. At a molecular level, biological clocks are represented by transcriptional-posttranslational feedback loops that induce circadian oscillations in the electrical activity of the SCN and hence correlate with behavioral circadian rhythms. In mammals, the sleep wake cycle can be accurately predicted by measuring electrical muscle and brain activity. To investigate the link between the electrical activity of heterogeneous neurons of the SCN and the sleep wake cycle, we optogenetically manipulated AVP neurons in vivo with SSFO (stabilized step function opsin) and simultaneously recorded an electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in freely moving mice. SSFO-mediated stimulation of AVP positive neurons in the anterior hypothalamus increased the total amount of wakefulness during the hour of stimulation. Interestingly, this effect led to a rebound in sleep in the hour after stimulation. Markov chain sleep-stage transition analysis showed that the depolarization of AVP neurons through SSFO promotes the transition from all states to wakefulness. After the end of stimulation, a compensatory increase in transitions to NREM sleep was observed. Ex vivo, SSFO activation in AVP neurons causes depolarization and modifies the activity of AVP neurons. Therefore, the results of this thesis project suggest an essential role of AVP neurons as mediators between circadian rhythmicity and sleep-wake behaviour. N2 - Die zentrale Uhr von Säugetieren, die sich im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) des vorderen Hypothalamus befindet, steuert zirkadiane Verhaltensrhythmen wie den Schlaf-Wach-Rhythmus. Sie besteht aus etwa 20.000 heterogenen Neuronen, die nach ihrer Expression von Neuropeptiden klassifiziert werden können. Es gibt drei große Populationen: AVP-Neuronen, VIP-Neuronen und GRP-Neuronen. Wie diese Neuronengruppen funktionelle Einheiten bilden, um verschiedene Aspekte des rhythmischen Verhaltens zu steuern, ist nur unzureichend bekannt. Bei Säugetieren kann der Schlaf-Wach-Zyklus durch Messung der elektrischen Muskel- und Gehirnaktivität genau vorhergesagt werden. Um den Zusammenhang zwischen der elektrischen Aktivität heterogener Neuronen des SCN und dem Schlaf-Wach-Zyklus zu untersuchen, wurden AVP-Neuronen in vivo mit SSFO optogenetisch manipuliert und gleichzeitig ein Elektroenzephalogramm (EEG) und ein Elektromyogramm (EMG) bei frei beweglichen Mäusen aufgezeichnet. Die SSFO-vermittelte Stimulation von AVP-positiven Neuronen im vorderen Hypothalamus erhöhte den Gesamtanteil der Wachheit während der Stunde der Stimulation. Interessanterweise führte dieser Effekt zu einem Ansteigen des Schlafes in der Stunde nach der Stimulation. Eine Markov-Ketten-Analyse der Schlafphasenübergänge zeigte, dass die Depolarisierung der AVP-Neuronen durch SSFO den Übergang von allen Zuständen zum Wachsein fördert. Nach dem Ende der Stimulation wurde ein kompensatorischer Anstieg der Schlafphasenübergänge zum NREM-Schlaf beobachtet. Ex vivo verursachte die SSFO-Aktivierung in AVP-Neuronen eine Depolarisation und veränderte die Aktivität der AVP-Neuronen. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit könnten auf die Rolle der AVP-Neuronen als Vermittler zwischen zirkadianer Rhythmik und Schlaf-Wach-Verhalten hinweisen. KW - Schlaf KW - Tagesrhythmus KW - Hypothalamus KW - Optogenetik KW - Sleep KW - Hypothalamus KW - Circadian KW - Optogenetics Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-315492 ER - TY - THES A1 - Yang, Shang T1 - Characterization and engineering of photoreceptors with improved properties for optogenetic application T1 - Charakterisierung und Entwicklung von Photorezeptoren mit verbesserten Eigenschaften für die optogenetische Anwendung N2 - Optogenetics became successful in neuroscience with Channelrhodopsin-2 (ChR2), a light-gated cation channel from the green alga Chlamydomonas reinhardtii, as an easy applicable tool. The success of ChR2 inspired the development of various photosensory proteins as powerful actuators for optogenetic manipulation of biological activity. However, the current optogenetic toolbox is still not perfect and further improvements are desirable. In my thesis, I engineered and characterized several different optogenetic tools with new features. (i) Although ChR2 is the most often used optogenetic actuator, its single-channel conductance and its Ca2+ permeability are relatively low. ChR2 variants with increased Ca2+ conductance were described recently but a further increase seemed possible. In addition, the H+ conductance of ChR2 may lead to cellular acidification and unintended pH-related side effects upon prolonged illumination. Through rational design, I developed several improved ChR2 variants with larger photocurrent, higher cation selectivity, and lower H+ conductance. (ii) The light-activated inward chloride pump NpHR is a widely used optogenetic tool for neural silencing. However, pronounced inactivation upon long time illumination constrains its application for long-lasting neural inhibition. I found that the deprotonation of the Schiff base underlies the inactivation of NpHR. Through systematically exploring optimized illumination schemes, I found illumination with blue light alone could profoundly increase the temporal stability of the NpHR-mediated photocurrent. A combination of green and violet light eliminates the inactivation effect, similar to blue light, but leading to a higher photocurrent and therefore better light-induced inhibition. (iii) Photoactivated adenylyl cyclases (PACs) were shown to be useful for light-manipulation of cellular cAMP levels. I developed a convenient in-vitro assay for soluble PACs that allows their reliable characterization. Comparison of different PACs revealed that bPAC from Beggiatoa is the best optogenetic tool for cAMP manipulation, due to its high efficiency and small size. However, a residual activity of bPAC in the dark is unwanted and the cytosolic localization prevents subcellular precise cAMP manipulation. I therefore introduced point mutations into bPAC to reduce its dark activity. Interestingly, I found that membrane targeting of bPAC with different linkers can remarkably alter its activity, in addition to its localization. Taken together, a set of PACs with different activity and subcellular localization were engineered for selection based on the intended usage. The membrane-bound PM-bPAC 2.0 with reduced dark activity is well-tolerated by hippocampal neurons and reliably evokes a transient photocurrent, when co-expression with a CNG channel. (iv) Bidirectional manipulation of cell activity with light of different wavelengths is of great importance in dissecting neural networks in the brain. Selection of optimal tool pairs is the first and most important step for dual-color optogenetics. Through N- and C-terminal modifications, an improved ChR variant (i.e. vf-Chrimson 2.0) was engineered and selected as the red light-controlled actuator for excitation. Detailed comparison of three two-component potassium channels, composed of bPAC and the cAMP-activated potassium channel SthK, revealed the superior properties of SthK-bP. Combining vf-Chrimson 2.0 and improved SthK-bP “SthK(TV418)-bP” could reliably induce depolarization by red light and hyperpolarization by blue light. A residual tiny crosstalk between vf-Chrimson 2.0 and SthK(TV418)-bP, when applying blue light, can be minimized to a negligible level by applying light pulses or simply lowering the blue light intensity. N2 - Die Optogenetik wurde in den Neurowissenschaften mit Channelrhodopsin-2 (ChR2), einem lichtgesteuerten Kationenkanal aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, als leicht anwendbares Werkzeug erfolgreich. Der Erfolg von ChR2 inspirierte die Entwicklung verschiedener photosensorischer Proteine als leistungsstarke Aktuatoren für die optogenetische Manipulation der biologischen Aktivität. Die derzeitige optogenetische Toolbox ist jedoch immer noch nicht perfekt und weitere Verbesserungen sind wünschenswert. In meiner Arbeit habe ich verschiedene optogenetische Werkzeuge mit neuen Funktionen entwickelt und charakterisiert. (i) Obwohl ChR2 der am häufigsten verwendete optogenetische Aktuator ist, sind seine Einzelkanal-Leitfähigkeit und seine Ca2 + -Permeabilität relativ gering. Kürzlich wurden ChR2-Varianten mit erhöhter Ca2 + -Leitfähigkeit beschrieben, eine weitere Verbesserung schien jedoch möglich. Darüber hinaus kann die H+-Leitfähigkeit von ChR2 bei längerer Beleuchtung zu einer Ansäuerung der Zellen und zu unbeabsichtigten Nebenwirkungen im Zusammenhang mit dem pH-Wert führen. Durch rationales Design entwickelte ich mehrere verbesserte ChR2-Varianten mit größerem Photostrom, höherer Kationenselektivität und geringerer H+-Leitfähigkeit. (ii) Die lichtaktivierte Chloridpumpe NpHR ist ein weit verbreitetes optogenetisches Werkzeug für die neuronale Inhibierung. Eine ausgeprägte Inaktivierung bei längerer Beleuchtung schränkt jedoch die Anwendung für eine lang anhaltende neuronale Hemmung ein. Ich konnte zeigen, dass die Deprotonierung der Schiffschen Base der Inaktivierung von NpHR zugrunde liegt. Durch die systematische Untersuchung optimierter Beleuchtungsschemata fand ich heraus, dass die Beleuchtung mit blauem Licht allein die zeitliche Stabilität des NpHR-vermittelten Photostroms erheblich verbessern kann. Eine Kombination aus grünem und violettem Licht eliminiert den Inaktivierungseffekt, ähnlich wie blaues Licht, führt jedoch zu einem höheren Photostrom und deswegen effektiverer Licht-induzierter Inhibierung. (iii) Photoaktivierte Adenylylcyclasen (PACs) erwiesen sich als nützlich für die Lichtmanipulation der zellulären cAMP-Spiegel. Ich habe einen praktischen in-vitro-Test für lösliche PACs entwickelt, der deren zuverlässige Charakterisierung ermöglicht. Ein Vergleich verschiedener PACs ergab, dass bPAC von Beggiatoa aufgrund seiner hohen Effizienz und geringen Größe das beste optogenetische Werkzeug für die cAMP-Manipulation ist. Eine Restaktivität von bPAC im Dunkeln ist jedoch unerwünscht und die cytosolische Lokalisierung verhindert eine subzellulär präzise cAMP-Manipulation. Ich habe daher Punktmutationen in bPAC eingeführt, um dessen Dunkelaktivität zu reduzieren. Interessanterweise fanden Ich heraus, dass das Membrantargeting von bPAC mit verschiedenen „Linkern“ zusätzlich zu seiner Lokalisierung seine Aktivität erheblich verändern kann. Zusammengenommen wurde eine Reihe von PACs mit unterschiedlicher Aktivität und subzellulärer Lokalisation für unterschiedliche Anwendungen konstruiert. Das membrangebundene PM-bPAC 2.0 mit reduzierter Dunkelaktivität wird von Hippocampus-Neuronen gut vertragen und erlaubt, bei gleichzeitiger Expression mit einem CNG-Kanal, zuverlässig einen Licht-induzierten Strom auszulösen. (iv) Die bidirektionale Manipulation der Zellaktivität mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge ist für die Dissektion neuronaler Netze im Gehirn von großer Bedeutung. Die Auswahl der optimalen Werkzeugpaare ist der erste und wichtigste Schritt für die zweifarbige Optogenetik. Durch N- und C-terminale Modifikationen wurde eine verbesserte ChR-Variante (d. h. Vf-Chrimson 2.0) entwickelt und als Rotlicht-gesteuerter Aktuator zur Anregung ausgewählt. Ein detaillierter Vergleich von drei Zweikomponenten-Kaliumkanälen, bestehend aus bPAC und dem cAMP-aktivierten Kaliumkanal SthK, ergab die überlegenen Eigenschaften von SthK-bP. Die Kombination von vf-Chrimson 2.0 und verbessertem SthK-bP „SthK(TV418)-bP“ konnte zuverlässig eine Depolarisation durch rotes Licht und eine Hyperpolarisation durch blaues Licht induzieren. Ein restliches, kleines Übersprechen zwischen vf-Chrimson 2.0 und SthK(TV418)-bP kann beim Anlegen von blauem Licht durch Anlegen von Lichtimpulsen oder durch einfaches Verringern der Intensität von blauem Licht auf ein vernachlässigbares Maß minimiert werden. KW - Optogenetics KW - ChR2 KW - NpHR KW - PAC KW - Bidirectional manipulation Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-205273 ER - TY - JOUR A1 - Tang, Ruijing A1 - Yang, Shang A1 - Nagel, Georg A1 - Gao, Shiqiang T1 - mem-iLID, a fast and economic protein purification method JF - Bioscience Reports N2 - Protein purification is the vital basis to study the function, structure and interaction of proteins. Widely used methods are affinity chromatography-based purifications, which require different chromatography columns and harsh conditions, such as acidic pH and/or adding imidazole or high salt concentration, to elute and collect the purified proteins. Here we established an easy and fast purification method for soluble proteins under mild conditions, based on the light-induced protein dimerization system improved light-induced dimer (iLID), which regulates protein binding and release with light. We utilize the biological membrane, which can be easily separated by centrifugation, as the port to anchor the target proteins. In Xenopus laevis oocyte and Escherichia coli, the blue light-sensitive part of iLID, AsLOV2-SsrA, was targeted to the plasma membrane by different membrane anchors. The other part of iLID, SspB, was fused with the protein of interest (POI) and expressed in the cytosol. The SspB-POI can be captured to the membrane fraction through light-induced binding to AsLOV2-SsrA and then released purely to fresh buffer in the dark after simple centrifugation and washing. This method, named mem-iLID, is very flexible in scale and economic. We demonstrate the quickly obtained yield of two pure and fully functional enzymes: a DNA polymerase and a light-activated adenylyl cyclase. Furthermore, we also designed a new SspB mutant for better dissociation and less interference with the POI, which could potentially facilitate other optogenetic manipulations of protein–protein interaction. KW - light-induced dimerization KW - membrane anchor KW - Optogenetics KW - protein purification Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-261420 VL - 41 IS - 7 ER - TY - THES A1 - Tang, Ruijing T1 - Optogenetic Methods to Regulate Water Transport and Purify Proteins T1 - Optogenetische Methoden zur Regulierung des Wassertransports und zur Reinigung von Proteinen N2 - Water transport through the water channels, aquaporins (AQPs), is involved in epithelial fluid secretion and absorption, cell migration, brain edema, adipocyte metabolism, and other physiological or pathological functions. Modulation of AQP function has therapeutic potential in edema, cancer, obesity, brain injury, glaucoma, etc. The function of AQPs is in response to the osmotic gradient that is formed by the concentration differences of ions or small molecules. In terms of brain edema, it is a pathophysiological condition, resulting from dysfunction of the plasma membrane that causes a disorder of intracellular ion homeostasis and thus increases intracellular fluid content. Optogenetics can be used to regulate ion transport easily by light with temporal and spatial precision. Therefore, if we control the cell ion influx, boosting the water transport through AQPs, this will help to investigate the pathological mechanisms in e.g. brain edema. To this end, I investigated the possibility for optogenetic manipulating water transport in Xenopus oocytes. The main ions in Xenopus oocyte cytoplasm are ~10 mM Na+, ~50 mM Cl- and ~100 mM K+, similar to the mammalian cell physiological condition. Three light-gated channels, ChR2-XXM 2.0 (light-gated cation channel), GtACR1 (light-gated anion channel) and SthK-bPAC (light-gated potassium channel), were used in my study to regulate ion transport by light and thus manipulate the osmotic gradient and water transport. To increase water flow, I also used coexpression of AQP1. When expressing ChR2-XXM 2.0 and GtACR1 together, mainly Na+ influx was triggered by ChR2-XXM2.0 under blue light illumination, which then made the membrane potential more positive and facilitated Cl- influx by GtACR1. Due to this inward movement of Na+ and Cl-, the osmotic gradient was formed to trigger water influx through AQP1. Large amounts of water uptake can speedily increase the oocyte volume until membrane rupture. Next, when co-expressing GtACR1 and SthK-bPAC, water efflux will be triggered with blue light because of the light-gated KCl efflux and then oocyte shrinking could be observed. I also developed an optogenetic protein purification method based on a light-induced protein interactive system. Currently, the most common protein purification method is based on affinity chromatography, which requires different chromatography columns and harsh conditions, such as acidic pH 4.5 - 6 and/or adding imidazole or high salt concentration, to elute and collect the purified proteins. The change in conditions could influence the activity of target proteins. So, an easy and flexible protein purification method based on the photo-induced protein interactive system iLID was designed, which regulates protein binding with light in mild conditions and does not require a change of solution composition. For expression in E. coli, the blue light-sensitive part of iLID, the LOV2 domain, was fused with a membrane anchor and expressed in the plasma membrane, and the other binding partner, SspB, was fused with the protein of interest (POI), expressed in the cytosol. The plasma membrane fraction and the soluble cytosolic fraction of E. coli can be easily separated by centrifugation. The SspB-POI can be then captured to the membrane fraction by light stimulation and released to clean buffer in the dark after washing. This method does not require any specific column and functions in mild conditions, which are very flexible at scale and will facilitate extensive protein engineering and purification of proteins, sensitive to changed buffer conditions. N2 - Der Wassertransport durch die Wasserkanäle, Aquaporine (AQPs), ist unter anderem an der Sekretion und Absorption der Epithelflüssigkeit, der Zellmigration, dem Hirnödem und dem Adipozytenstoffwechsel beteiligt. Die Modulation der AQP-Funktion hat therapeutisches Potenzial bei Ödemen, Krebs, Fettleibigkeit, Hirnverletzungen, Glaukom usw. Die Funktion von AQPs reagiert auf den osmotischen Gradienten, der durch Konzentrationsunterschiede von Ionen oder kleinen Molekülen gebildet wird. In Bezug auf das Hirnödemhandelt es sich um einen pathophysiologischen Zustand, der aus einer Funktionsstörung der Plasmamembran resultiert und eine Störung der intrazellulären Ionenhomöostase verursacht und somit den intrazellulären Wassergehalt erhöht. Die Optogenetik kann verwendet werden, um den Ionentransport durch Licht mit zeitlicher und räumlicher Präzision leicht zu regulieren. Wenn wir also den Ioneneinstrom in die Zelle erhöhen, wird dies den Wasserimport durch AQPs fördern. ... KW - Optogenetics KW - Aquaporin KW - ChR2 KW - GtACR1 KW - SthK-bPAC KW - Protein Purification KW - iLID Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-231736 ER - TY - THES A1 - Beck, Sebastian T1 - Using optogenetics to influence the circadian clock of \(Drosophila\) \(melanogaster\) T1 - Die Verwendung der Optogenetik zur Beeinflussung der circadianen Uhr von \(Drosophila\) \(melanogaster\) N2 - Almost all life forms on earth have adapted to the most impactful and most predictable recurring change in environmental condition, the cycle of day and night, caused by the axial rotation of the planet. As a result many animals have evolved intricate endogenous clocks, which adapt and synchronize the organisms’ physiology, metabolism and behaviour to the daily change in environmental conditions. The scientific field researching these endogenous clocks is called chronobiology and has steadily grown in size, scope and relevance since the works of the earliest pioneers in the 1960s. The number one model organism for the research of circadian clocks is the fruit fly, Drosophila melanogaster, whose clock serves as the entry point to understanding the basic inner workings of such an intricately constructed endogenous timekeeping system. In this thesis it was attempted to combine the research on the circadian clock with the techniques of optogenetics, a fairly new scientific field, launched by the discovery of Channelrhodopsin 2 just over 15 years ago. Channelrhodopsin 2 is a light-gated ion channel found in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. In optogenetics, researches use these light-gated ion channels like Channelrhodopsin 2 by heterologously expressing them in cells and tissues of other organisms, which can then be stimulated by the application of light. This is most useful when studying neurons, as these channels provide an almost non-invasive tool to depolarize the neuronal plasma membranes at will. The goal of this thesis was to develop an optogenetic tool, which would be able to influence and phase shift the circadian clock of Drosophila melanogaster upon illumination. A phase shift is the adaptive response of the circadian clock to an outside stimulus that signals a change in the environmental light cycle. An optogenetic tool, able to influence and phase shift the circadian clock predictably and reliably, would open up many new ways and methods of researching the neuronal network of the clock and which neurons communicate to what extent, ultimately synchronizing the network. The first optogenetic tool to be tested in the circadian clock of Drosophila melanogaster was ChR2-XXL, a channelrhodopsin variant with dramatically increased expression levels and photocurrents combined with a prolonged open state. The specific expression of ChR2-XXL and of later constructs was facilitated by deploying the three different clock-specific GAL4-driver lines, clk856-gal4, pdf-gal4 and mai179-gal4. Although ChR2-XXL was shown to be highly effective at depolarizing neurons, these stimulations proved to be unable to significantly phase shift the circadian clock of Drosophila. The second series of experiments was conducted with the conceptually novel optogenetic tools Olf-bPAC and SthK-bPAC, which respectively combine a cyclic nucleotide-gated ion channel (Olf and SthK) with the light-activated adenylyl-cyclase bPAC. These tools proved to be quite useful when expressed in the motor neurons of instar-3 larvae of Drosophila, paralyzing the larvae upon illumination, as well as affecting body length. This way, these new tools could be precisely characterized, spawning a successfully published research paper, centered around their electrophysiological characterization and their applicability in model organisms like Drosophila. In the circadian clock however, these tools caused substantial damage, producing severe arrhythmicity and anomalies in neuronal development. Using a temperature-sensitive GAL80-line to delay the expression until after the flies had eclosed, yielded no positive results either. The last series of experiments saw the use of another new series of optogenetic tools, modelled after the Olf-bPAC, with bPAC swapped out for CyclOp, a membrane-bound guanylyl-cyclase, coupled with less potent versions of the Olf. This final attempt however also ended up being unsuccessful. While these tools could efficiently depolarize neuronal membranes upon illumination, they were ultimately unable to stimulate the circadian clock in way that would cause it to phase shift. Taken together, these mostly negative results indicate that an optogenetic manipulation of the circadian clock of Drosophila melanogaster is an extremely challenging subject. As light already constitutes the most impactful environmental factor on the circadian clock, the combination of chronobiology with optogenetics demands the parameters of the conducted experiments to be tuned with an extremely high degree of precision, if one hopes to receive positive results from these types of experiments at all. N2 - Nahezu alle Lebewesen der Erde haben sich an den Tag-Nacht-Zyklus angepasst, die einflussreichste und verlässlichste wiederkehrende Veränderung der Umwelt-bedingungen, verursacht durch die axiale Rotation des Planeten. Daraus resultierend haben viele Tiere komplizierte innere Uhren entwickelt, welche ihre Physiologie, ihren Stoffwechsel und ihr Verhalten an die tägliche Veränderung der natürlichen Bedingungen anpassen. Das Wissenschaftsfeld, das sich der Erforschung dieser inneren Uhren widmet, wird Chronobiologie genannt und hat seit der Arbeit der ersten Pioniere ab 1960 stetig an Größe und Relevanz gewonnen. Der prominenteste Modellorganismus für die Erforschung der circadianen Uhr ist Drosophila melanogaster, deren Uhr als Ansatzpunkt dient, die grundlegenden Vorgänge eines derart komplexen, endogenen Taktsystems zu verstehen. In dieser Thesis wurde versucht die Forschung an der circadianen Uhr mit den Techniken der Optogenetik zu kombinieren, eines jungen Forschungsfeldes, welches durch die Entdeckung von Channelrhodpsin 2 vor über 15 Jahren eröffnet wurde. Channelrhodopsin 2 ist ein Licht-gesteuerter Ionenkanal, der in der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii entdeckt wurde. In der Optogenetik nutzen Forscher diese Licht-gesteuerten Ionenkanäle, indem sie sie in den Zellen anderer Organismen exprimieren, welche dann durch Licht stimuliert werden können. Dies ist besonders nützlich bei der Untersuchung von Neuronen, da diese Kanäle ein nahezu nicht-invasives Werkzeug zur Depolarisation neuronaler Membranen bieten. Das Ziel dieser Thesis war es, ein optogenetisches Werkzeug zu entwickeln, welches die circadiane Uhr von Drosophila melanogaster durch Licht manipulieren und deren Phase verschieben kann. Eine Phasenverschiebung ist die adaptive Antwort der circadianen Uhr auf einen äußeren Reiz, welcher eine Veränderung des natürlichen Lichtzyklus signalisiert. Ein optogenetisches Werkzeug, das die Phase der inneren Uhr verlässlich verschieben kann, würde viele neue Möglichkeiten zur Erforschung des neuronalen Uhrnetzwerks eröffnen und wie die Neuronen miteinander kommunizieren um das Netzwerk zu synchronisieren. Das erste optogenetische Werkzeug das in der circadianen Uhr von Drosophila melanogaster getestet wurde war „ChR2-XXL“, eine Channelrhodopsin-Variante mit erhöhter Expression und Photoströmen, gepaart mit einem verlängerten geöffneten Zustand. Die spezifische Expression von ChR2-XXL und auch die späterer Konstrukte wurde durch die Verwendung der drei Uhr-spezifischen GAL4-Treiberlinien clk856-gal4, pdf-gal4 und mai179-gal4 bewerkstelligt. Obwohl bereits gezeigt wurde, dass ChR2-XXL höchst effektiv die Depolarisierung von Neuronen bewirkt, waren diese Stimulationen jedoch nicht in der Lage die Phase der circadianen Uhr von Drosophila signifikant zu verschieben. Die zweite Serie an Versuchen wurde mit den konzeptionell neuartigen optogenetischen Werkzeugen Olf-bPAC und SthK-bPAC durchgeführt, welche jeweils einen durch zyklische Nukleotide gesteuerten Ionenkanal (Olf und SthK) mit der Licht-gesteuerten Adenylatcyclase bPAC kombinieren. Diese Werkzeuge erwiesen sich als äußert nützlich, solange sie in den Motoneuronen von Drosophila-Larven im dritten Larvenstadium exprimiert wurden, wo sie bei Beleuchtung die Larven sowohl paralysierten, als auch deren Körperlänge beeinflussten. Auf diese Weise konnten diese neuen Werkzeuge präzise charakterisiert werden, was in der erfolgreichen Veröffentlichung eines Forschungsartikels mündete, welcher hauptsächlich von der elektrophysiologischen Charakterisierung der Werkzeuge handelte und von deren Anwendungsmöglichkeiten in Modellorganismen wie Drosophila. In der circadianen Uhr verursachten diese Werkzeuge jedoch substantielle Schäden und produzierten schwere Arrhythmie und Anomalien in der neuronalen Entwicklung. Die Verwendung einer temperatur-sensitiven GAL80-Linie um die Expression zu verzögern, erzeugte ebenfalls keinerlei positive Ergebnisse. Für die letzte Serie an Experimenten wurde eine weitere Reihe neuer optogenetischer Werkzeuge verwendet, orientiert an Olf-bPAC und SthK-bPAC, wobei bPAC durch die membrangebundene Guanylatcyclase „CyclOp“ ausgetauscht wurde, welche wiederrum mit weniger wirkstarken Olf-Varianten kombiniert wurde. Dieser letzte Ansatz scheiterte jedoch ebenfalls. Obwohl diese neuen Werkzeuge in der Lage waren die Neuronenmembran bei Beleuchtung effektiv zu depolarisieren, vermochten sie es letztendlich nicht eine Phasenverschiebung zu bewirken. Zusammengenommen zeigen diese überwiegend negativen Ergebnisse, dass die optogenetische Manipulation der circadianen Uhr von Drosophila melanogaster ein extrem anspruchsvolles Thema ist. Da Licht bereits ohnehin den einflussreichsten Umweltfaktor für die circadiane Uhr darstellt, verlangt die Kombination von Chronobiologie und Optogenetik eine extrem präzise Feinabstimmung der Versuchsparameter, um überhaupt darauf hoffen zu dürfen, positive Ergebnisse mit derlei Versuchen zu erzeugen. KW - Chronobiologie KW - Optogenetik KW - Taufliege KW - Optogenetics KW - Chronobiology KW - Channelrhodopsin KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184952 ER - TY - THES A1 - Gao, Shiqiang T1 - Characterizing new photoreceptors to expand the Optogenetic toolbox T1 - Charakterisierung neuer Photorezeptoren zur Erweiterung der Optogenetik N2 - Optogenetics is a method to control the cell activity with light by expression of a natural or engineered photoreceptor via genetic modification technology. Optogenetics early success came with the light-gated cation channel "Channelrhodopsin-2" in neurons and expanded from neuroscience to other research fields such as cardiac research and cell signaling, also due to the enrichment by new photoreceptors. In this study, I focus on searching and characterizing new photoreceptors to expand the optogenetic tool box. In this work I characterize three newly discovered microbial rhodopsins and some engineered mutants of them. The first rhodopsin is a proton pump from the diatom Fragilariopsis cylindrus, Fragilariopsis Rhodopsin or abbreviated: FR. I cloned the full-length FR and proved it to be a light-activated proton pump with high efficacy in comparison to Bacteriorhodopsin (BR). During this study, I also developed a new method to improve the plasma membrane targeting of several microbial rhodopsins. I also obtained a FR mutant (channel-like FR or chFR) which behaves like a light-gated proton channel. FR can be used for optogenetic hyperpolarization or alkalization of a cell while the chFR could be used for depolarization or lowering of the cellular pH. The induction of FR expression under iron-limited conditions in the diatom indicated an alternative energy generation mechanism of F. cylindrus when iron-containing enzymes are scarce. I then characterized a new microbial rhodopsin with novel light-regulated Guanylyl Cyclase (GC) activity. This rhodopsin guanylyl cyclase from the fungus Blastocladiella emersonii (B.e. CyclaseOpsin or BeCyclOp) has been proven by me to be an efficient light-gated GC with high specificity and fast kinetics. BeCyclOp also has a novel structure with eight transmembrane helices, containing a long cytosolic N-terminus which participates in the tight regulation of the GC activity. In collaboration with Prof. Alexander Gottschalk (Univ. Frankfurt/M.), BeCyclOp has been tested in muscle cells and sensory neurons of Caenorhabditis elegans and proven to be a powerful optogenetic tool in a living animal. I also generated a BeCyclOp mutant with enhanced light sensitivity. Already more than ten years ago, guanylyl cyclase rhodopsins were suggested to exist in Chlamydomonas reinhardtii by analyzing genomic sequence data. But until now no functional proof existed. By further cloning and sequencing I discovered such a rhodopsin with light-regulated guanylyl cyclase activity. This functional Cyclaseopsin (COP6c) is quite different to BeCyclOp, as it was proven to be a light-inhibited GC. Cop6c is much larger than BeCyclOp with a His-Kinase and a response regulator domain between the rhodopsin and the cyclase domain. I also introduced a new strategy for generating optogenetic tools by fusing the photoactivated adenylyl cyclase bPAC to two different CNG channels. These new tools function via light-gated cAMP production and subsequent CNG channel activation. These tools combined the properties of bPAC (highly sensitive to blue light) and CNG channels (high single-channel conductance and high Ca2+ permeability), as demonstrated by expression in Xenopus oocytes. As a further benefit the fusing of bPAC to CNG channels leads to a bPAC with a more than tenfold reduced dark activity which is a valuable improvement for bPAC itself as an optogenetic tool. N2 - Als Optogenetik wird die Technik bezeichnet, durch genetische Veränderung Photorezeptoren in Zellen einzubringen, um die Zellaktivität mit Licht zu steuern. Frühe Erfolge der Optogenetik wurden mit dem Licht-gesteuerten Kationenkanal "Channelrhodopsin-2" in Neuronen von lebenden Tieren erzielt. Die Anwendung erweiterte sich von den Neurowissenschaften zu anderen Forschungsfeldern, wie Herzforschung und Zellbiologie, auch durch die Bereicherung mit neuen Photorezeptoren. Hier konzentriere ich mich auf die Suche und Charakterisierung neuer Photorezeptoren. In dieser Arbeit werden drei neu entdeckte, natürliche mikrobielle Rhodopsine, sowie ausgewählte Mutanten, charakterisiert. Das erste Rhodopsin ist eine Protonenpumpe aus der Kieselalge (Diatomee) Fragilariopsis cylindrus, Fragilariopsis-Rhodopsin, abgekürzt FR. Ich klonierte FR und bewies, dass FR eine Licht-aktivierte Protonenpumpe mit hoher Wirksamkeit ist. In dieser Studie zeige ich auch eine Methode, um die Plasmamembran-Lokalisation von FR und mehreren anderen Rhodopsinen zu verbessern. Ich identifizierte eine FR-Mutante (chFR), die sich wie ein Licht-gesteuerter Protonenkanal verhält. FR kann für die Licht-gesteuerte Hyperpolarisation oder Alkalisierung der Zelle verwendet werden, während chFR möglicherweise verwendet werden könnte, um den zellulären pH Licht-gesteuert abzusenken. Die Induktion der FR-Expression unter Eisenmangel-Bedingungen legt einen neuen Energieerzeugungsmechanismus von F. cylindrus nahe, wenn Eisen-haltige Enzyme in den Chloroplasten fehlen. Ich habe dann ein neues mikrobielles Rhodopsin mit Licht-geregelter Guanylylcyclase (GC) Aktivität untersucht. Für dieses Cyclaseopsin aus dem Pilz Blastocladiella emersonii (BeCyclOp) konnte ich zeigen, dass es sich um eine effiziente lichtgesteuerte GC mit hoher Spezifität und schneller Kinetik handelt. BeCyclOp hat eine für ein Opsin neuartige Struktur mit acht Transmembranhelices. Für den langen cytosolischen N-Terminus zeigte ich eine Beteiligung an der Regulierung der GC-Aktivität. BeCyclOp wurde im Labor von Prof. A. Gottschalk (Univ. Frankfurt/M.) in den Muskelzellen und sensorischen Neuronen von Caenorhabditis elegans getestet und erwies sich als ein leistungsfähiges Werkzeug in optogenetisch veränderten, lebenden Tieren. Ich habe dann auch eine BeCyclOp Mutante mit verbesserter Lichtempfindlichkeit hergestellt. Bereits vor über zehn Jahren wurden anhand genomischer Daten Guanylylcyclase-Rhodopsine in Chlamydomonas reinhardtii postuliert, konnten aber funktionell bisher nicht nachgewiesen werden. Durch Klonieren von verschiedenen Chlamydomonas reinhardtii Stämmen gelang es mir, solch ein Opsin (Cop6c) zu entdecken, dessen Guanylylcyclase-Aktivität eindeutig Licht-reguliert ist. COP6c ist ganz anders als BeCyclOp, nicht nur weil die GC-Aktivität durch Licht inhibiert wird. Außerdem ist Cop6c ein viel größeres Protein mit einer zusätzlichen His-Kinase-, sowie einer Transducer-Domäne zwischen der Rhodopsin- und der Cyclase-Domäne. Schlussendlich zeige ich auch eine neue Strategie zur Erzeugung von optogenetischen Werkzeugen durch Fusion der Licht-aktivierten Adenylyl-Cyclase (AC) bPAC mit CNG-Kanälen. Diese neuen "Werkzeuge" funktionieren über Licht-gesteuerte cAMP-Produktion und die anschließende Aktivierung eines cAMP-sensitiven Kationen-(CNG-) Kanals. Hierbei werden die positiven Eigenschaften von bPAC (sehr empfindlich auf blaues Licht) und CNG-Kanälen (hohe Leitfähigkeit bei hoher Ca2+-Durchlässigkeit) kombiniert. Darüber hinaus konnte ich demonstrieren, dass die Fusion der bPAC an den CNG-Kanal zu einer bPAC mit stark reduzierter AC-Aktivität im Dunkeln führte, was allein schon eine gute Verbesserung der bPAC als optogenetische Werkzeug ist. KW - Photorezeptor KW - Optogenetik KW - Optogenetics KW - photoreceptors KW - microbial rhodopsin KW - Characterizing New Photoreceptors to Expand the Optogenetic Toolbox KW - Guanylyl Cyclase KW - proton pump Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-112941 ER -