TY  - THES
A1  - Lerch, Maike Franziska
T1  - Characterisation of a novel non-coding RNA and its involvement in polysaccharide intercellular adhesin (PIA)-mediated biofilm formation of \(Staphylococcus\) \(epidermidis\)
T1  - Charakterisierung einer neuen nicht-kodierenden RNA und deren Beteiligung an der PIA-vermittelten Biofilmbildung von \(Staphylococcus\) \(epidermidis\)
N2  - Coagulase-negative staphylococci, particularly Staphylococcus epidermidis, have been recognised as an important cause of health care-associated infections due to catheterisation, and livestock-associated infections. The colonisation of indwelling medical devices is achieved by the formation of biofilms, which are large cell-clusters surrounded by an extracellular matrix. This extracellular matrix consists mainly of PIA (polysaccharide intercellular adhesin), which is encoded by the icaADBC-operon. The importance of icaADBC in clinical strains provoking severe infections initiated numerous investigations of this operon and its regulation within the last two decades. The discovery of a long transcript being located next to icaADBC, downstream of the regulator gene icaR, led to the hypothesis of a possible involvement of this transcript in the regulation of biofilm formation (Eckart, 2006). Goal of this work was to characterise this transcript, named ncRNA IcaZ, in molecular detail and to uncover its functional role in S. epidermidis. 
The ~400 nt long IcaZ is specific for ica-positive S. epidermidis and is transcribed in early- and mid-exponential growth phase as primary transcript. The promotor sequence and the first nucleotides of icaZ overlap with the 3' UTR of the preceding icaR gene, whereas the terminator sequence is shared by tRNAThr-4, being located convergently to icaZ. Deletion of icaZ resulted in a macroscopic biofilm-negative phenotype with highly diminished PIA-biofilm. Biofilm composition was analysed in vitro by classical crystal violet assays and in vivo by confocal laser scanning microscopy under flow conditions to display biofilm formation in real-time. The mutant showed clear defects in initial adherence and decreased cell-cell adherence, and was therefore not able to form a proper biofilm under flow in contrast to the wildtype. Restoration of PIA upon providing icaZ complementation from plasmids revealed inconsistent results in the various mutant backgrounds. 
To uncover the functional role of IcaZ, transcriptomic and proteomic analysis was carried out, providing some hints on candidate targets, but the varying biofilm phenotypes of wildtype and icaZ mutants made it difficult to identify direct IcaZ mRNA targets. Pulse expression of icaZ was then used as direct fishing method and computational target predictions were executed with candidate mRNAs from aforesaid approaches. The combined data of these analyses suggested an involvement of icaR in IcaZ-mediated biofilm control. Therefore, RNA binding assays were established for IcaZ and icaR mRNA. A positive gel shift was maintained with icaR 3' UTR and with 5'/3' icaR mRNA fusion product, whereas no gel shift was obtained with icaA mRNA. From these assays, it was assumed that IcaZ regulates icaR mRNA expression in S. epidermidis. S. aureus instead lacks ncRNA IcaZ and its icaR mRNA was shown to undergo autoregulation under so far unknown circumstances by intra- or intermolecular binding of 5' UTR and 3' UTR (Ruiz de los Mozos et al., 2013). Here, the Shine-Dalgarno sequence is blocked through 5'/3' UTR base pairing and RNase III, an endoribonuclease, degrades icaR mRNA, leading to translational blockade. In this work, icaR mRNA autoregulation was therefore analysed experimentally in S. epidermidis and results showed that this specific autoregulation does not take place in this organism. An involvement of RNase III in the degradation process could not be verified here. GFP-reporter plasmids were generated to visualise the interaction, but have to be improved for further investigations.
In conclusion, IcaZ was found to interact with icaR mRNA, thereby conceivably interfering with translation initiation of repressor IcaR, and thus to promote PIA synthesis and biofilm formation. In addition, the environmental factor ethanol was found to induce icaZ expression, while only weak or no effects were obtained with NaCl and glucose. Ethanol, actually is an ingredient of disinfectants in hospital settings and known as efficient effector for biofilm induction. As biofilm formation on medical devices is a critical factor hampering treatment of S. epidermidis infections in clinical care, the results of this thesis do not only contribute to better understanding of the complex network of biofilm regulation in staphylococci, but may also have practical relevance in the future.
N2  - Koagulase-negative Staphylokokken besiedeln die menschliche und tierische Haut, sowie die Schleimhäute. Durch Läsionen oder das Einbringen von medizinischen Instrumenten wie Kathetern gelangen sie in tiefere Hautschichten oder die Blutbahn und können dort schwerwiegende Infektionen auslösen, vor Allem bei Risikopersonen. Besonders Staphylococcus epidermidis hat sich als Verursacher von nosokomialen Infektionen, aber auch als Pathogen in der Tierhaltung etabliert. Die Bakterien bilden bei der Besiedlung sogenannte Biofilme aus (d.h. eine Akkumulation der Keime, die von einer extrazellulären Matrix umgeben sind). Diese Matrix besteht neben Proteinen und eDNA hauptsächlich aus einem Polysaccharid, dem interzellulären Adhäsin PIA (engl.: polysaccharide intercellular adhesin). Dieses wird durch die Ica-Proteine synthetisiert, die im icaADBC-Operon (engl.: intercellular adhesin operon) kodiert sind. Das Operon hat große Bedeutung in klinischen Stämmen und wurde daher innerhalb der letzten beiden Jahrzehnte eingehend untersucht, auch im Hinblick auf seine Regulation. In der unmittelbaren Umgebung des icaADBC-Operons, stromabwärts des icaR Gens, das für den Repressor des ica-Operons (IcaR) kodiert, wurde ein großes Transkript identifiziert, von dem vermutet wird, dass es möglicherweise an der Regulation der Biofilmbildung beteiligt ist (Eckart, 2006). Ziel dieser Arbeit war es, dieses Transkript zu charakterisieren und seine Funktion in S. epidermidis aufzudecken.
Die nicht-kodierende RNA, genannt IcaZ, hat eine Länge von ~400 nt und ist spezifisch für ica-positive S. epidermidis. Sie wird in der frühen bis mittleren exponentiellen Phase temperaturabhängig exprimiert. Stromaufwärts überlappt das icaZ-Gen und dessen Promotor mit der 3' UTR vom icaR-Gen. Stromabwärts wird das icaZ-Gen vom einem Transkriptionsterminator begrenzt, der auch für das tRNAThr-4-Gen benutzt wird, das auf dem gegenüberliegenden Strang in Richtung des icaZ-Gens lokalisiert ist. Die Deletion der RNA führte zu einem makroskopisch sichtbaren Biofilm-negativen Phänotyp mit deutlich verminderter PIA Bildung. Die Biofilmzusammensetzung wurde in vitro mittels eines klassischen Kristallviolett-Assays gemessen und die Biofilmbildung in vivo in Echtzeit mittels konfokaler Mikroskopie (CLSM) betrachtet. Dabei wurde mit einer peristaltischen Pumpe ein Mediumfluss appliziert. Die Mutante zeigte klare Defekte in der initialen Adhärenz und in der Zell-Zell Adhäsion. Sie bildete im Gegensatz zum Wildtyp keinen strukturierten Biofilm aus. Zur Komplementierung des Biofilms wurde die IcaZ von einem Plasmid exprimiert und die Biofilmzusammensetzung nach 18-20 Stunden Wachstum gemessen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen in den verschiedenen Mutanten waren nicht eindeutig.
Um die Funktion von IcaZ aufzudecken, wurden Transkriptom- und Proteomvergleiche zwischen Wildtyp und Mutante gemacht. Diese lieferten einige Hinweise, aber da der metabolische Unterschied eines Biofilmbildners zu einem Nicht-Biofilmbildner zu groß war, wurde eine direktere Methode angewandt, die induzierte Expression (Pulsexpression). Zudem wurden potentielle Interaktionspartner der IcaZ mittels computer-basierter Bindungsvorhersagen analysiert. Die icaR mRNA kristallisierte sich dabei als Target heraus und die Interaktion zwischen IcaZ und icaR mRNA wurde mit Gelshift-Assays (EMSA) untersucht. Eine Bandenverschiebung wurde mit icaR 3' UTR und mit dem icaR-5'-3' UTR-Fusionsprodukt detektiert, wohingegen keine Interaktion zwischen IcaZ und icaA mRNA stattfand. Aufgrund dieser Assays wurde vermutet, dass IcaZ die Translation von icaR in S. epidermidis reguliert. In S. aureus fehlt die nicht-kodierende RNA IcaZ und für icaR mRNA wurde eine Autoregulation gezeigt, bei der die icaR 5' UTR mit der icaR 3' UTR intramolekular oder intermolekular durch Basenpaarung interagiert, wodurch die Shine-Dalgarno Sequenz blockiert wird und es aufgrund dessen zu einer Hemmung der Translation kommt. Die Umweltfaktoren, die dazu führen sind bisher unbekannt. Der Komplex wird durch eine Endoribonuklease, RNase III, abgebaut (Ruiz de los Mozos et al., 2013). In S. epidermidis wurde eine solche Interaktion theoretisch ausgeschlossen. Experimentelle Analysen dieser Arbeit haben gezeigt, dass diese Autoregulation in S. epidermidis nicht stattfinden kann und es wird angenommen, dass IcaZ diese Regulation übernimmt. Um die Interaktion zu visualisieren wurden GFP-Reporter Plasmide generiert, die aber für weitere Experimente noch zu verbessern sind.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass IcaZ mit der icaR mRNA interagiert, was höchstwahrscheinlich zu einer Hemmung der Translation des Repressors IcaR führt und damit letztlich PIA-Synthese und Biofilmbildung positiv reguliert. Zusätzlich wurde gefunden, dass Ethanol die Expression der IcaZ-RNA induziert, während NaCl nur schwache Effekte zeigte und Glucose keinen Einfluss auf die Expression von icaZ hatte. Ethanol ist ein Bestandteil von Desinfektionsmitteln, die in Krankenhäusern verwendet werden und ist bekannt dafür Biofilmbildung auszulösen. Da die Bildung von Biofilmen auf medizinischen Geräten kritisch ist und diese die Behandlung von S. epidermidis Infektionen erschweren, tragen die Ergebnisse dieser Arbeit nicht nur zu einem besseren Verständnis des komplexen Netzwerks der Biofilmregulation bei, sondern haben möglicherweise auch praktischen Nutzen in der Zukunft.
KW  - Biofilm
KW  - Staphylococcus epidermidis
KW  - Non-coding RNA
KW  - Hospitalismus <Hygiene>
KW  - icaADBC
KW  - Nosocomial Infections
KW  - Polysaccharide intercellular adhesin (PIA)
KW  - Biofilm formation
KW  - non-coding RNA
KW  - ncRNA
KW  - Nosokomiale Infektionen
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155777
ER  - 
TY  - THES
A1  - Rachid, Shwan
T1  - Molecular investigation of the influence of environmental factors and subinhibitory antibiotic concentrations on the biofilm formation in Staphylococcus epidermidis
T1  - Molekulare Untersuchungen zum Einfluß von Umweltfaktoren und subinhibitorischen Antibiotikakonzentrationen auf die Biofilmbildung in Staphylococcus epidermidis
N2  - Biofilm production is an important step in the pathogenesis of S. epidermidis polymer-associated infections and depends on the expression of the icaADBC operon leading to the synthesis of a polysaccharide intercellular adhesin (PIA). The PIA represents a sugar polymer consisting of ß-1,6 linked N-acetyl glucosaminoglycans and mediates the intercellular adherence of the bacteria to each other and the accumulation of a multilayered biofilm. Epidemiological and experimental studies strongly suggest that PIA-production and subsequently biofilm formation contributes significantly to the virulence of specific S. epidermidis strains. This work aimed on the investigation of external factors regulating the ica expression in S. epidermidis. For this purpose, a reporter gene fusion between the ica promoter and the beta-galactosidase gene lacZ from E. coli was constructed and integrated into the chromosome of an ica positive S. epidermidis clinical isolate. The reporter gene fusion was used to investigate the influence of external factors and of sub-MICs of different antibiotics on the ica expression. It was shown that the S. epidermidis biofilm formation is growth phase dependent with a maximum expression in the late logarithmic and early stationary growth phase. The optimal expression was recorded at 42 °C at a neutral pH ranging from 7.0 to 7.5. The glucose content of the medium was found to be essential for biofilm formation, since concentrations of 1.5 to 2 per cent glucose induced the ica expression. In addition, external stress factors as high osmolarity (mediated by 3 to 5 per cent sodium chloride), and sub-lethal concentrations of detergents, ethanol, hydrogene peroxide, and urea significantly enhanced the biofilm production. Subinhibitory concentrations of tetracyline, the semisynthetic streptogramin quinupristin/dalfopristin and the streptogramin growth promoter virginiamycin were found to enhance the ica expression 8 to 11-fold, respectively, whereas penicillin, oxacillin, gentamicin, clindamycin, vancomycin, teicoplanin, ofloxacin, and chloramphenicol had no effects. A weak induction was recorded for sub-MICs of erythromycin. Both quinupristin/ dalfopristin and tetracyline exhibited a strong postexposure effect on the S. epidermidis ica expression, respectively, even when the substances were immediately removed from the growth medium. The results were confirmed by Northern blot analysis of the ica transcription and quantitative analysis of biofilm formation in a colorimetric assay. Expression of the icaprom::lacZ reporter gene plasmid in Bacillus subtilis and S. epidermidis revealed that the ica induction by sub-MICs of streptogramins and tetracycline might depend on unidentified regulatory elements which are specific for the staphylococcal cell. In contrast, the activation by external stress signals seems to be mediated by factors which are present both in Staphylococci and in Bacillus subtilis. Construction and analysis of an agr-mutant in a biofilm-forming S. epidermidis strain excluded the possibility that the Agr-quorum-sensing system significantly contributes to the ica expression in the stationary growth phase. However, clear evidence was provided that in S. aureus the ica transcription depends on the expression of the alternative transcription factor sigmaB, which represents a global regulator of the stress response in S. aureus as well as in B. subtilis. For this purpose, a sigB knockout mutant had been constructed in a biofilm-forming S. aureus. This mutant showed a markedly decrease of the ica transcription and biofilm-production, whereas a complement strain carrying the sigB gene on an expression vector completely restored the biofilm-forming phenotype of the S. aureus wild type. Southern blot analysis indicated that the the sigB gene is also present in S. epidermidis and Northern analyses of the sigB and the ica transcription revealed that both genes are activated under identical conditions (i. e. in the stationary growth phase and by external stress factors) suggesting a similar regulatory pathway as in S. aureus. However, since neither in S. aureus nor in S. epidermidis the ica promoter has obvious similiarities to known SigB-dependent promotoer sequences it is tempting to speculate that the ica activation is not directely mediated by SigB, but might be indirectely controlled by other SigB-dependent regulatory elements which remain to be elucidated.
N2  - Die Ausbildung von Biofilmen ist ein wichtiger Schritt in der Pathogenense von Polymer-assoziierten Infektionen durch S. epidermidis. Sie hängt von der Expression des icaADBC-Operons ab, das die Syntheseenzyme für die Produktion eines extrazellulären Polysaccharids (PIA) kodiert. PIA steht für Polysaccharid-Interzelluläres-Adhäsin. Diese Substanz stellt ein beta-1,6 verknüpftes N-Acetyl-Glukosaminoglycan dar, das den Bakterien extrazellulär aufliegt, die Adhärenz der Zellen untereinander vermittelt und so die Akkumulation eines Biofilms wesentlich fördert. Epidemiologische und experimentelle Studien haben gezeigt, daß die PIA-Produktion und damit die Biofilmbildung wesentlich zur Virulenz bestimmter S. epidermidis Stämme beiträgt. Die vorliegende Arbeit zielte auf die Untersuchung äußerer Faktoren ab, die die PIA-Expression in S. epidermidis regulieren. Dazu wurde eine Genfusion zwischen dem ica-Promotor und dem beta-Galaktosidasegen aus E. coli hergestellt und stabil in das Chromosom eines ica-positiven S. epidermidis Klinikisolates integriert. Das Reportergenkonstrukt wurde benutzt, um den Einfluß verschiedener Umweltfaktoren und die Wirkung subinhibitorischer Antibiotikadosen auf die Expression des ica-Operons zu bestimmen. Es konnte gezeigt werden, daß die ica-Expression wachstumsphasenabhängig ist und ihr Maximum in der späten logarhitmischen und frühen stationären Phase erreicht. Die optimale Expressionstemperatur liegt bei 42 °C und einem neutralen pH-Wert in einem Bereich zwischen 7,0 und 7,5. Die Biofilmbildung hängt stark vom Glukosegehalt des Wachstumsmediums ab. So wurde gezeigt, daß 1,5 bis 2 Prozent im Kulturmedium die ica-Expression in der logarhitmischen Phase induzieren. Externe Stressfaktoren wie erhöhte Osmolarität durch 3 bis 5 Prozent NaCl oder sublethale Dosen von Detergenzien, Äthanol, Wasserstoffperoxid und Harnstoff begünstigen ebenfalls die ica-Expression und damit die Biofilmbildung. Subinhibitorische Dosen von Tetrazyklin, des Streptogramingemisches Quinupristin/Dalfopristin (Synercid?) sowie des Streptogramin-Leistungsförderers Virginiamycin führten zu einer Erhöhung der ica-Expression um das 8 bis 11-fache. Eine kurzzeitige Exposition der Bakterien zu hohen Konzentrationen dieser Antibiotika führte ebenfalls zu einer langanhaltenden Induktion der Biofilmexpression, auch wenn die Stoffe aus dem Wachstumsmedium sofort wieder entfernt worden waren. Andere Antibiotika wie Penicillin, Oxacillin, Gentamicin, Clindamycin, Vancomycin, Teicoplanin und Chloramphenicol zeigten keinerlei Effekt auf die ica-Expression. Eine schwache Induktion wurde dagegen für Erythromycin verzeichnet. Die Daten wurden durch Northernblotanalysen der ica–Transkription und durch einen quantitativen Biofilmassay in Polystyrol-Mikrotiterplatten bestätigt. Die Propagierung des Reportergenkonstruktes als Plasmid sowohl in einem B. subtili- Hintergrund als auch in einem ica-negativen S. epidermidis-Stamm ergab, daß die Induktion des ica-Operons durch niedrige Tetrazyklin- oder Streptograminkonzentrationen möglicherweise von spezifischen Regulatoren abhängt, die nur in Staphylokokken vorkommen. Im Gegensatz dazu ist die Induktion durch externe Sressfaktoren sowohl in B. subtilis als auch in S. epidermidis möglich. Durch die Herstellung und Untersuchung einer agr-Mutante in einem Biofilm-bildenden S. epidermidis-Stamm konnte ausgeschlossen werden, daß das Agr-Quorum-Sensing-System einen wesentlichen Einfluß auf die ica-Expression in der stationären Phase ausübt. Dagegen wurde klar gezeigt, daß die ica-Transkription in S. aureus von der Expression des alternativen Transkriptionsfaktors SigmaB abhängt, der einen globalen Regulator für die Stressantwort in Staphylokokken und in B. subtilis darstellt. Zu diesem Zweck war eine sigB-Deletionsmutante in einem Biofilm-bildenden S. aureus-Stamm hergestellt worden. Diese Mutante zeigte eine deutlich verminderte ica Transkription und Biofilmbildung. Dagegen wies die Komplementante, die das sigB-Gen auf einem Expressionsvektor trug, wieder alle Merkmale des Biofilm-bildenden S. aureus Wildtyps auf. Southernblot-Analysen zeigten, daß das sigB-Gen auch in S. epidermidis nachweisbar ist und unter denselben Bedingungen (d. h. in der stationären Phase und durch externen Stress) wie das ica Gen transkribiert wird. Das läßt vermuten, daß die Regulation des ica-Operons in S. epidermidis ähnlich abläuft wie in S. aureus und durch SigB beeinflußt wird. Da jedoch weder in S. aureus noch in S. epidermidis der ica-Promotor Ähnlichkeiten zu den bekannten SigB-abhängigen Promotor-Strukturen aufweist, ist anzunehemen, daß dieses Operon nicht direkt durch diesen alternativen Transkriptionsfaktor kontrolliert wird. Wahrscheinlich existieren noch weitere regulatorische Elemente, die hieran beteiligt sind und die noch zu identifizieren sind.
KW  - Staphylococcus epidermidis
KW  - Biofilm
KW  - Umweltfaktor
KW  - Antibiotikum
KW  - Staphylococcus
KW  - epidermidis
KW  - Biofilm
KW  - Staphylococcus
KW  - epidermidis
KW  - Biofilm
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1882
ER  -