TY - THES A1 - Blahetek, Gina T1 - The role of alternative intronic polyadenylation on microRNA biogenesis in melanoma T1 - Der Einfluss von alternativer intronischer Polyadenylierung auf die Biogenese von microRNAs im Melanom N2 - mRNA is co- or post-transcriptionally processed from a precursor mRNA to a mature mRNA. In addition to 5'capping and splicing, these modifications also include polyadenylation, the addition of a polyA tail to the 3'end of the mRNA. In recent years, alternative polyadenylation in particular has increasingly been taken into account as a mechanism for regulating gene expression. It is assumed that approximately 70-75 % of human protein coding genes contain alternative polyadenylation signals, which are often located within intronic sequences of protein-coding genes. The use of such polyadenylation signals leads to shortened mRNA transcripts and thus to the generation of C-terminal shortened protein isoforms. Interestingly, the majority of microRNAs, small non-coding RNAs that play an essential role in post-transcriptional gene regulation, are also encoded in intronic sequences of protein-coding genes and are co-transcriptionally expressed with their host genes. The biogenesis of microRNA has been well studied and is well known, but mechanisms that may influence the expression regulation of mature microRNAs are just poorly understood. In the presented work, I aimed to investigate the influence of alternative intronic polyadenylation on the biogenesis of microRNAs. The human ion channel TRPM1 could already be associated with melanoma pathogenesis and truncated isoforms of this protein have already been described in literature. In addition, TRPM1 harbors a microRNA, miR211, in its sixth intron, which is assumed to act as a tumor suppressor. Since both, TRPM1 and miR211 have already been associated with melanoma pathogenesis, the shift towards truncated transcripts during the development of various cancers is already known and it has been shown that certain microRNAs play a crucial role in the development and progression of melanoma, melanoma cell lines were used as an in vitro model for these investigations. N2 - Das Melanom, auch als schwarzer Hautkrebs bekannt, ist einer der gefährlichsten und aggressivsten Hautkrebsarten welcher aus den pigmentgebenden Zellen, den sogenannten Melanozyten, entsteht. Hauptursache dieser malignen Erkrankung ist eine starke und wiederkehrende UV-Belastung, häufig einhergehend mit Sonnenbränden, aber auch genetische Veranlagungen oder das Vorhandensein vieler Leberflecke kann das Risiko einer Melanomerkrankung erhöhen. Weltweit ist in den letzten Jahren ein starker Anstieg an jährlichen Neuerkrankungen zu beobachten. Wird das Melanom frühzeitig erkannt ist die operative Entfernung die wichtigste und effektivste Behandlungsmethode. Hat das Melanom jedoch bereits angefangen in weit entfernte Lymphknoten und in andere Organe zu streuen und Metastasen zu bilden, sinkt die 5-Jahres Überlebensrate drastisch ab. Immuntherapien mit Checkpoint-Inhibitoren, Chemotherapie oder Bestrahlung helfen dann häufig nur noch bedingt. Es ist bereits bekannt, dass TRPM1, ein Kalzium-permeabler Ionenkanal, an der Entstehung eines Melanoms beteiligt sein kann und dessen Expression invers mit der Aggressivität eines Melanoms korreliert. Interessanterweise wurden verkürzte Isoformen dieses Proteins in der Literatur beschrieben, ein Mechanismus wie diese generiert werden wurde bisher jedoch noch nicht untersucht. Ebenfalls nennenswert ist eine im sechsten Intron von TRPM1 codierte microRNA, miR211. In Melanomzellen und Melanom Patientenproben wurde bereits eine verminderte Expression dieser microRNA gezeigt. Messenger RNA (mRNA) wird von einer Vorläuferform (prä-mRNA) zu einer reifen mRNA co- oder posttranskriptionell prozessiert. Zu diesen Modifikationen gehört neben dem 5’Capping und dem Spleißen auch die Polyadenylierung, das Anbringen eines polyA Schwanzes an das 3‘Ende der mRNA. Dieser polyA Schwanz ist essentiell für den Transport der mRNA aus dem Nukleus in das Zytosol, für die Stabilität der mRNA sowie für die Effizienz der Translation. Besonders die alternative Polyadenylierung wurde in den letzten Jahren vermehrt als Mechanismus zur Regulation der Genexpression berücksichtigt. Es wird angenommen, dass etwa 70-75 % der humanen proteincodierenden Gene alternative Polyadenylierungssignale enthalten. Häufig liegen diese in intronischen Sequenzen proteincodierender Gene. Die Verwendung solcher Polyadenylierungssignale führt zu verkürzten mRNA Transkripten und somit zur Generierung C-terminal verkürzter, und im Falle von Transmembranproteinen oft löslichen, Protein Isoformen. Für diverse Krebsarten konnte bereits gezeigt werden, dass es eine Verlagerung hin zu 3’UTR verkürzten mRNA Transkripten gibt oder es im speziellen Fall der chronisch lymphatischen Leukämie zu einem globalen Trend in der Aktivierung intronischer Polyadenylierungssignale kommt. Interessanterweise ist die Mehrheit an microRNAs, kleine nicht codierenden RNAs, die eine essentielle Rolle in der post-transkriptionellen Genregulation spielen, ebenfalls in intronischen Sequenzen proteincodierender Gene codiert und werden co-transkriptionell mit ihren Wirtsgenen exprimiert. Die Biogenese der microRNA ist bereits sehr gut untersucht und bekannt, die Mechanismen hingegen, die einen Einfluss auf die Expressionsregulation reifer microRNAs haben können sind nur sehr wenig untersucht. Durch vorangegangene Studien konnte bereits gezeigt werden, dass die U1 snRNA (U1 small nuclear RNA), neben ihrer initiierenden Rolle in der Spleißreaktion durch das Binden an 5‘ Spleißstellen, auch aktiv die Verwendung intronischer Polyadenylierungssignale unterdrücken kann und dadurch frühzeitiges Schneiden und Polyadenylieren der mRNA verhindert. Die Blockierung oder ein geringeres Level an U1 snRNA führt nicht nur zu einer verminderten Spleißreaktion, sondern auch zu einer vermehrten Aktivierung intronischer Polyadenylierungssignale. Ob diese Aktivierung jedoch auch einen Einfluss auf die Expression intronischer microRNAs haben kann, wurde bisher nicht untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von alternativer intronischer Polyadenylierung auf die Biogenese von microRNAs untersucht werden. Der humane Ionenkanal TRPM1 konnte bereits mit der Pathogenese des Melanoms assoziiert werden und verkürzte Isoformen dieses Proteins wurden bereits in der Literatur beschrieben. Darüber hinaus beherbergt TRPM1 in seinem sechsten Intron eine microRNA, miR211, von der angenommen wird, dass sie als Tumorsuppressor agiert. Aus diesen Gründen war TRPM1 ein vielversprechendes Ziel die gegenseitige Verbindung zwischen alternativer intronischer Polyadenylierung und der Biogenese von microRNAs zu untersuchen. Da sowohl TRPM1 als auch miR211 bereits mit der Pathogenese des Melanoms assoziiert wurden, die Verlagerung hin zu verkürzten Transkripten während der Entstehung von unterschiedlichen Krebsarten bereits bekannt ist, und gezeigt werden konnte, dass diverse microRNAs eine entscheidende Rolle in der Entstehung und Progression des Melanoms spielen, wurden Melanomzelllinien als in vitro Modell für diese Untersuchungen verwenden. Durch 3’mRNA Sequenzierung von Melanomzelllinien und weitere molekularbiologische Analysen konnten zwei verkürzte Isoformen von TRPM1 identifizieren werden, welche durch Aktivierung alternativer Polyadenylierungssignale in Intron 3 oder Intron 10 generiert werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass in Melanomzelllinien im Vergleich zu einer Melanozyten Kontrollzelllinie, TRPM1 nicht nur vermindert exprimiert wird, sondern auch eine Verlagerung hin zu den verkürzten Isoformen, im Speziellen zur TRPM1 intron 3 Isoform, vorliegt. Durch Modulierung der Expression der unterschiedlichen TRPM1 Isoformen mittels Antisense-Oligonukleotide konnte gezeigt werden, dass speziell die Aktivierung des alternativen Polyadenylierungssignals in Intron 3 einen Einfluss auf die Biogenese der nachfolgend codierten intronischen miR211 hat, mit der Folge eines verringerten Expressionslevels. Zudem konnte eine U1 snRNA abhängige Verbindung zwischen frühzeitiger mRNA Transkriptions-Termination für TRPM1 und der Biogenese von miR211 in Melanomzelllinien gezeigt werden. Darüber hinaus wurde eine verminderte Expression der U1 snRNA in Melanomzelllinien im Vergleich zu einer Melanozyten Kontrollzelllinie gezeigt. Das Expressionslevel der U1 snRNA in Tumorgeweben oder auch anderen Krankheitsbildern im Vergleich zu gesundem Gewebe wurde bisher nur sehr wenig untersucht. Die verminderte Expression an U1 snRNA ist eine mögliche Erklärung für die Verlagerung hin zu verkürzten mRNA Transkripten während der Pathogenese und stellt somit einen vielversprechenden Ansatz für weitere Untersuchungen dar. Der in dieser Arbeit beschriebene Mechanismus zeigt eine neue, bisher nicht berücksichtigte Ebene zur Regulierung der Expression reifer microRNAs über die Aktivierung intronischer Polyadenylierungssignale. Die Möglichkeit, die Expression von mRNA Isoformen eines microRNA Wirtsgenes durch Antisense-Oligonukleotide spezifisch zu modulieren und damit zielgerichtet die Expression nachfolgend codierter microRNAs steuern zu können, bietet einen neuartigen und gezielten therapeutischen Ansatz. Dieser gezielte therapeutische Ansatz kann von TRPM1/miR211 im Melanom auch auf andere microRNA-Wirtsgene und deren intronische microRNAs übertragen werden, die mit der Entstehung von Krankheiten in Verbindung gebracht werden können. KW - Alternative polyadenylation KW - microRNA KW - U1 snRNA KW - alternative intronic polyadenylation KW - microRNA biogenesis KW - Polyadenylierung KW - Biogenese KW - miRNS KW - Melanom Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-254743 ER - TY - THES A1 - Herb, Stefanie Maria T1 - Regulation of MCMV immediate early gene expression by virally encoded miRNAs T1 - Regulation der MCMV immediate early Genexpression durch viral kodierte miRNAs N2 - Gene expression in eukaryotic cells is regulated by the combinatorial action of numerous gene-regulatory factors, among which microRNAs (miRNAs) play a fundamental role at the post-transcriptional level. miRNAs are single-stranded, small non-coding RNA molecules that emerge in a cascade-like fashion via the generation of primary and precursor miRNAs. Mature miRNAs become functional when incorporated into the RNA induced silencing complex (RISC). miRNAs guide RISCs to target mRNAs in a sequence-specific fashion. To this end, base-pairs are usually formed between the miRNA seed region, spanning nucleotide positions 2 to 8 (from the 5' end) and the 3'UTR of the target mRNA. Once miRNA-mRNA interaction is established, RISC represses translation and occasionally induces direct or indirect target mRNA degradation. Interestingly, miRNAs are expressed not only in every multicellular organism but are also encoded by several viruses, predominately by herpesviruses. By controlling both, cellular as well as viral mRNA transcripts, virus-encoded miRNAs confer many beneficial effects on viral growth and persistence. Murine cytomegalovirus (MCMV) is a ß-herpesvirus and so far, 29 mature MCMV-encoded miRNAs have been identified during lytic infection. Computational analysis of previously conducted photoactivated ribonucleotide-enhanced individual nucleotide resolution crosslinking immunoprecipitation (PAR-iCLIP) experiments identified a read cluster within the 3' untranslated region (3'UTR) of the immediate early 3 (IE3) transcript in MCMV. Based on miRNA target predictions, two highly abundant MCMV miRNAs, namely miR-m01-2-3p and miR-M23-2-3p were found to potentially bind to two closely positioned target sites within the IE3 PAR-iCLIP peak. To confirm this hypothesis, we performed luciferase assays and showed that activity values of a luciferase fused with the 3'UTR of IE3 were downregulated in the presence of miR-m01- 2 and miR-M23-2. In a second step, we investigated the effect of pre-expression of miR-m01-2 and miR-M23-2 on the induction of virus replication. After optimizing the transfection procedure by comparing different reagents and conditions, plaque formation was monitored. We could demonstrate that the replication cycle of the wild-type but not of our MCMV mutant that harbored point mutations in both miRNA binding sites within the IE3-3'UTR, was significantly delayed in the presence of miR-m01-2 and miR-M23-2. This confirmed that miR-m01-2 and miR-M23-2 functionally target the major transcription factor IE3 which acts as an indispensable regulator of viral gene expression during MCMV lytic infection. Repression of the major immediate early genes by viral miRNAs is a conserved feature of cytomegaloviruses. The functional role of this type of regulation can now be studied in the MCMV mouse model. N2 - In eukaryotischen Zellen wird die Expression von Genen durch das Zusammenspiel vieler verschiedener biologischer Regulatoren, wie microRNAs (miRNAs), kontrolliert. MiRNAs sind einzelsträngige, kurze, nicht-kodierende RNA-Moleküle, die aus sogenannten primären miRNAs und Vorläufer-miRNAs entstehen und die Genexpression auf Ebene der Posttranskription beeinflussen. Um ihre Funktion ausüben zu können, werden reife miRNAs in RNA-induzierte Silencing-Komplexe (RISCs) eingebaut und zu ihren Ziel-mRNAs geführt. Durch Wechselwirkungen zwischen der miRNA "seed-Region , die die Nukleotide 2 bis 8 vom 5'-Ende überspannt und der 3'UTR (3' untranslatierte Region) der Ziel-mRNA, unterdrückt RISC die Translation der Ziel-mRNA und kann deren Abbau durch direkte sowie indirekte Mechanismen induzieren. Die Expression von miRNAs wurde nicht nur in multizellulären Organismen, sondern in bereits zahlreichen Viren, insbesondere in der Virusfamilie der Herpesviridae, nachgew- iesen. Viruskodierte miRNAs kontrollieren dabei zelluläre wie auch virale mRNA-Transkripte und verleihen dem Virus einen Selektionsvorteil bzgl. Wachstum und Persistenz. Das mur- ine Cytomegalievirus (MCMV) ist ein β-Herpesvirus, das nach aktuellem Wissensstand 29 reife miRNAs kodiert, die allesamt während der lytischen Infektion identifziert wurden. Bioinformatische Analysen eines vor dieser Arbeit durchgeführten PAR-iCLIP-Experiments (photoactivated ribonucleotide-enhanced individual nucleotide resolution crosslinking and immunoprecipitation), zeigten einen PAR-iCLIP Peak in der 3'UTR (3' untranslatierte Region) des immediate early 3-Transkripts (IE3) von MCMV. Unter Verwendung von RNAhbybrid, einem miRNA target prediction tool, fanden sich zwei virale miRNAs, näm- lich miR-m01-2-3p und miR-M23-2-3p mit potentiellen Bindestellen innerhalb der 3'UTR des MCMV IE3 Transkripts. Unsere konsekutiv durchgeführten Luciferase-Assays be- stätigten, dass sowohl miR-m01-2 als auch miR-M23-2 an die 3'UTR von IE3 binden. Beide viralen miRNAs führten zu einer verminderten Luciferaseaktivität unter Verwendung von Reportern, in denen die 3'UTR des IE3-Gens mit dem Luciferase-Transkript fusioniert war. xxiv Summary Das IE3 Protein gilt während des lytischen Zykluses als einer der wichtigsten Transkrip- tionsfaktoren von MCMV. Ebenfalls wurde der Einfluss der beiden viralen miRNAs auf die virale Reproduktion von uns untersucht. Hierfür wurden murine Zelllinien vor Infektion mit miR-m01-2 und miR- M23-2 transziert. Das Transfektionsverfahren optimierten wir zunächst durch Testung verschiedener Reagenzien und experimenteller Bedingungen. Schließlich zeigten wir mittels Plaqueassays, dass eine vor Infektion durchgeführte Transfektion mit miR-m01-2 und miR- M23-2 die Replikation von MCMV signifikant verzögerte. Unter Verwendung einer MCMV- Mutante, die durch Punktmutationen in beiden miRNA-Bindungsstellen innerhalb der IE3- 3'UTR charakterisiert war, ließ sich dieser Effekt aufheben. Unsere Experimente weisen somit stark darauf hin, dass miR-m01-2 und miR-M23-2 die Expression des IE3 Proteins regulieren und damit indirekt Einfluss auf die Genexpression während der lytischen Phase des Replikationszykluses von MCMV nehmen. Die miRNA-mediierte Repression der immediate early Genexpression stellt ein evolutionär konserviertes Merkmal von Zytomegalieviren dar. Für eine weitere Einordnung der Rolle dieser Genexpressionskontrolle bedarf es zukünftige Untersuchungen im MCMV-Tiermodell KW - miRNS KW - Cytomegalie-Virus KW - Herpes KW - Frühe Gene KW - PAR-CLIP KW - MCMV KW - miRNA KW - immediate early genes KW - lytic infection KW - IE3 KW - miRNA target KW - luciferase assay KW - CMV KW - HCMV KW - viral miRNAs Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-323314 ER - TY - THES A1 - Vardapour, Romina T1 - Mutations in the DROSHA/DGCR8 microprocessor complex in high-risk blastemal Wilms tumor T1 - Mutationen des DROSHA/DGCR8 Mikroprozessor-Komplexes in blastemreichen Hochrisiko-Wilms Tumoren N2 - Wilms tumor (WT) or nephroblastoma is the most common kidney tumor in childhood. Several genetic alterations have been identified in WT over the past years. However, a clear-cut underlying genetic defect has remained elusive. Growing evidence suggests that miRNA processing genes play a major role in the formation of pediatric tumors, including WT. We and others have identified the microprocessor genes DROSHA and DGCR8 as key players in Wilms tumorigenesis. Exome sequence analysis of a cohort of blastemal-type WTs revealed the recurrent hotspot mutations DROSHA E1147K and DGCR8 E518K mapping to regions important for catalyic activity and RNA-binding. These alterations were expected to affect processing of miRNA precursors, ultimately leading to altered miRNA expression. Indeed, mutated tumor samples were characterized by distinct miRNA patterns. Notably, these mutations have been observed almost exclusively in WT, suggesting that they play a specific role in WT formation. The aim of the present work was to first examine the mutation frequency of DROSHA E1147K and DGCR8 E518K in a larger cohort of WTs, and to further characterize these microprocessor gene mutations as potential oncogenic drivers for WT formation. Screening of additional 700 WT samples by allele-specific PCR revealed a high frequency of DROSHA E1147K and DGCR8 E518K mutations, with the highest incidence found in tumors of high-risk histology. DROSHA E1147K was heterozygously expressed in all cases, which strongly implies a dominant negative effect. In contrast, DGCR8 E518K exclusively exhibited homozygous expression, suggestive for the mutation to act recessive. To functionally assess the mutations of the microprocessor complex in vitro, I generated stable HEK293T cell lines with inducible overexpression of DROSHA E1147K, and stable mouse embryonic stem cell (mESC) lines with inducible overexpression of DGCR8 E518K. To mimic the homozygous expression observed in WT, DGCR8 mESC lines were generated on a DGCR8 knockout background. Inducible overexpression of wild-type or mutant DROSHA in HEK293T cells showed that DROSHA E1147K leads to a global downregulation of miRNA expression. It has previously been shown that the knockout of DGCR8 in mESCs also results in a significant downregulation of canonical miRNAs. Inducible overexpression of wild type DGCR8 rescued this processing defect. DGCR8 E518K on the other hand, only led to a partial rescue. Differentially expressed miRNAs comprised members of the ESC cell cycle (ESCC) and let-7 miRNA families whose antagonism is known to play a pivotal role in the regulation of stem cell properties. Along with altered miRNA expression, DGCR8-E518K mESCs exhibited alterations in target gene expression potentially affecting various biological processes. We could observe decreased proliferation rates, most likely due to reduced cell viability. DGCR8-E518K seemed to be able to overcome the block of G1-S transition and to rescue the cell cycle defect in DGCR8-KO mESCs, albeit not to the full extent like DGCR8-wild-type. Moreover, DGCR8-E518K appeared to be unable to completely block epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). Embryoid bodies (EBs) with the E518K mutation, however, were still able to silence the self-renewal program rescuing the differentiation defect in DGCR8-KO mESCs. Taken together, I could show that DROSHA E1147K and DGCR8 E518K are frequent events in WT with the highest incidence in high-risk tumor entities. Either mutation led to altered miRNA expression in vitro confirming our previous findings in tumor samples. While the DROSHA E1147K mutation resulted in a global downregulation of canonical miRNAs, DGCR8 E518K was able to retain significant activity of the microprocessor complex, suggesting that partial reduction of activity or altered specificity may be critical in Wilms tumorigenesis. Despite the significant differences found in the miRNA and mRNA profiles of DGCR8 E518K and DGCR8-wild-type mESCs, functional analysis showed that DGCR8 E518K could mostly restore important cellular functions in the knockout and only slightly differed from the wild-type situation. Further studies in a rather physiological environment, such as in a WT blastemal model system, may additionally help to better assess the subtle differences between DGCR8 E518K and DGCR8 wild-type observed in our mESC lines. Together with our findings, these model systems may thus contribute to better understand the role of these microprocessor mutations in the formation of WT. N2 - Der Wilms Tumor (WT), auch Nephroblastom genannt, ist der häufigste Nierentumor im Kindesalter. In den letzten Jahren wurden bereits mehrere genetische Veränderungen in Wilms Tumoren festgestellt. Bisher konnte jedoch keine eindeutige genetische Ursache gefunden werden. Immer mehr Erkenntnisse deuten darauf hin, dass miRNA Prozessierungsgene eine wichtige Rolle bei der Entstehung von pädiatrischen Tumoren, einschließlich von WT, spielen. Uns ist es gelungen die Mikroprozessor-Gene DROSHA und DGCR8 als entscheidende Faktoren in der WT-Entstehung zu identifizieren. Mit Hilfe der Exom-Sequenzierung einer Kohorte blastemreicher Wilms Tumoren konnten die wiederkehrenden Hotspot-Mutationen DROSHA E1147K and DGCR8 E518K gefunden werden. Diese Mutationen betreffen Regionen, die für die katalytische Aktivität und die Bindung von RNA wichtig sind. Diese Veränderungen beeinflussen vermutlich die Prozessierung von Vorläufer-miRNAs und führen letztendlich zu einer veränderten miRNA Expression. In der Tat waren mutierte Tumorproben durch auffällige Expressionsmuster gekennzeichnet. Bemerkenswerterweise wurden diese Mutationen fast ausschließlich in WT beobachtet, was darauf hindeutet, dass sie eine spezifische Rolle bei der Entstehung von WT spielen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zunächst die Mutationshäufigkeit von DROSHA E1147K und DGCR8 E518K in einer größeren Kohorte von Wilms Tumoren zu untersuchen und anschließend diese Mikroprozessor-Genmutationen als mögliche onkogene Treiber für die WT-Entstehung näher zu charakterisieren. Das Screening von zusätzlichen 700 WT-Proben mittels allelspezifischer PCR ergab eine hohe Häufigkeit von DROSHA E1147K und DGCR8 E518K Mutationen. Dabei traten sie vermehrt bei Tumoren mit einer Hochrisikohistologie auf. Die DROSHA E1147K Mutation wurde in allen Fällen heterozygot exprimiert, was einen dominant-negativen Effekt impliziert. Im Gegensatz dazu zeigte die DGCR8 E518K Mutation ausschließlich eine homozygote Expression, was darauf hindeutet, dass die Mutation rezessiv wirkt. Um die Mutationen des Mikroprozessorkomplexes in vitro funktionell zu untersuchen, generierte ich stabile HEK293T-Zelllinien mit induzierbarer Überexpression von DROSHA E1147K, und stabile embryonale Mausstammzelllinien mit induzierbarer Überexpression von DGCR8 E518K. Um die in WT beobachtete homozygote Expression nachzustellen, wurden für die Erzeugung der DGCR8-Zelllinien Mausstammzellen mit einem DGCR8-Knockout verwendet. Die induzierbare Überexpression von Wildtyp oder mutiertem DROSHA in HEK293T-Zellen zeigte, dass DROSHA E1147K zu einer globalen Herunterregulierung der miRNA-Expression führt. Es wurde zuvor gezeigt, dass der Knockout von DGCR8 in Mausstammzellen ebenfalls zu einer signifikanten Herunterregulierung kanonischer miRNAs führt. Die induzierbare Überexpression von Wildtyp DGCR8 konnte diesen Prozessierungsdefekt aufheben. DGCR8 E518K führte dagegen nur zu einer partiellen Behebung des Prozessierungsdefekts. Differenziell exprimierte miRNAs umfassten hierbei Mitglieder aus der stammzellspezifischen ESCC-Familie und der let-7-miRNA-Familie, deren Antagonismus bekanntermaßen eine bedeutende Rolle bei der Regulation von Stammzelleigenschaften spielt. Zusammen mit einer veränderten miRNA-Expression zeigten DGCR8-E518K-Zellen Veränderungen in der Zielgenexpression, welche möglicherweise verschiedene biologische Prozesse beeinflussen können. Wir konnten verringerte Proliferationsraten beobachten, höchstwahrscheinlich aufgrund einer verringerten Lebensfähigkeit der Zellen. DGCR8-E518K schien in der Lage zu sein, den Block des G1-S Übergangs zu überwinden und den Zellzyklusdefekt in DGCR8-KO-Zellen zu beheben, wenn auch nicht in vollem Umfang wie Wildtyp DGCR8. Darüber hinaus schien DGCR8-E518K nicht in der Lage zu sein, die epithelial-mesenchymale Transition (EMT) vollständig blockieren zu können. Embryoid-Körper (EBs) mit der E518K Mutation konnten das Selbsterneuerungsprogramm jedoch noch unterdrücken und somit den Differenzierungsdefekt in DGCR8-KO-Zellen beheben. Zusammenfassend konnte ich zeigen, dass DROSHA E1147K und DGCR8 E518K häufige Mutationen in WT sind und dabei am häufigsten in Hochrisiko-Tumoren vorkommen. Jede dieser Mutationen führte in vitro zu einer veränderten miRNA-Expression, was unsere vorherigen Befunde in Tumorproben bestätigte. Während die DROSHA E1147K Mutation zu einer globalen Herunterregulierung kanonischer miRNAs führte, konnte die DGCR8 E518K Mutation die Aktivität des Mikroprozessorkomplexes größtenteils wiederherstellen, was darauf hindeutet, dass eine teilweise Verringerung der Aktivität oder eine veränderte Spezifität bei der WT-Entstehung kritisch sein könnte. Trotz der signifikanten Unterschiede in den miRNA- und mRNA-Profilen von DGCR8-E518K- und DGCR8 Wildtyp-Zellen, ergab die Funktionsanalyse, dass DGCR8 E518K viele wichtige Zellfunktionen im Knockout wiederherstellen konnte und sich nur geringfügig von der Wildtyp-Situation unterschied. Weitere Studien unter physiologischeren Bedingungen, wie beispielsweise in einem WT-Blastem-Modellsystem, könnten zusätzlich helfen, die in unseren Mausstammzelllinien beobachteten feinen Unterschiede zwischen DGCR8 E518K und DGCR8 Wildtyp besser bewerten zu können. Zusammen mit unseren Erkenntnissen könnten diese Modellsysteme somit dazu beitragen, die Rolle dieser Mikroprozessormutationen bei der WT-Entstehung besser zu verstehen. KW - Nephroblastom KW - Genmutation KW - miRNS KW - Wilms tumor KW - miRNA KW - microprocessor complex KW - DROSHA KW - DGCR8 Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-231404 ER - TY - THES A1 - Ziegenhals, Thomas T1 - The role of the miR-26 family in neurogenesis T1 - Die Rolle der miR-26 Familie in der Neurogenese N2 - For the differentiation of a embryonic stem cells (ESCs) to neuronal cells (NCs) a complex and coordinated gene regulation program is needed. One important control element for neuronal differentiation is the repressor element 1 silencing transcription factor (REST) complex, which represses neuronal gene expression in non-neuronal cells. Crucial effector proteins of the REST complex are small phosphatases such as the CTDSPs (C-terminal domain small phosphatases) that regulate polymerase II activity by dephosphorylating the C-terminal domain of the polymerase, thereby repressing target genes. The stepwise inactivation of REST, including the CTDSPs, leads to the induction of a neuron-specific gene program, which ultimately induces the formation of neurons. The spatio-temporal control of REST and its effector components is therefore a crucial step for neurogenesis. In zebrafish it was shown that the REST-associated CTDSP2 is negatively regulated by the micro RNA (miR) -26b. Interestingly, the miR-26b is encoded in an intron of the primary transcript of CTDSP2. This gives the fundament of an intrinsic regulatory negative feedback loop, which is essential for the proceeding of neurogenesis. This feedback loop is active during neurogenesis, but inactive in non-neuronal cells. The reason for this is that the maturation of the precursor miR (pre-miR) to the mature miR-26 is arrested in non neuronal cells, but not in neurons. As only mature miRs are actively repressing genes, the regulation of miR-26 processing is an essential step in neurogenesis. In this study, the molecular basis of miR-26 processing regulation in the context of neurogenesis was addressed. The mature miR is processed from two larger precursors: First the primary transcript is cleaved by the enzyme DROSHA in the nucleus to form the pre-miR. The pre-miR is exported from the nucleus and processed further through the enzyme DICER to yield the mature miR. The mature miR can regulate gene expression in association with the RNA-induced silencing complex (RISC). Multiple different scenarios in which miR processing was regulated were proposed and experimentally tested. Microinjection studies using Xenopus leavis oocytes showed that slowdown or blockage of the nucleo-cytoplasmic transport are not the reason for delayed pre-miR-26 processing. Moreover, in vitro and in vivo miR-processing assays showed that maturation is most likely regulated through a in trans acting factor, which blocks processing in non neuronal cells. Through RNA affinity chromatographic assays using zebrafish and murine lysates I was able to isolate and identify proteins that interact specifically with pre-miR-26 and could by this influence its biogenesis. Potential candidates are FMRP/FXR1/2, ZNF346 and Eral1, whose functional characterisation in the context of miR-biogenesis could now be addressed. The second part of my thesis was executed in close colaboration with the laboratory of Prof. Albrecht Müller. The principal question was addressed how miR-26 influences neuronal gene expression and which genes are primarily affected. This research question could be addressed by using a cell culture model system, which mimics ex vivo the differentiation of ESCs to NCs via neuronal progenitor. For the functional analysis of miR-26 knock out cell lines were generated by the CRISPR/Cas9 technology. miR-26 deficient ESC keep their pluripotent state and are able to develop NPC, but show major impairment in differentiating to NCs. Through RNA deep sequencing the miR-26 induced transcriptome differences could be analysed. On the level of mRNAs it could be shown, that the expression of neuronal gene is downregulated in miR-26 deficient NCs. Interestingly, the deletion of miR-26 leads to selectively decreased levels of miRs, which on one hand regulate the REST complex and on the other hand are under transcriptional control by REST themself. This data and the discovery that induction of miR-26 leads to enrichment of other REST regulating miRs indicates that miR-26 initiates neurogenesis through stepwise inactivation of the REST complex. N2 - Für die Differenzierung von embryonalen Stammzellen (ESCs) zu Neuronen (NCs) bedarf es eines komplexen Genregulationsprogramms, welches sowohl zeitlich als auch räumlich reguliert werden muss. Ein wichtiger Faktor während der neuronalen Differenzierung ist der sogenannte „repressor element 1 silencing transcription factor“ (REST)-Komplex, welcher die Expression neuronaler Gene in nicht neuralen Zellen unterdrückt. Wichtige Effektorproteine im REST-Komplex sind kleine Phosphatasen (sog. CTDSPs), welche durch die Dephosphorylierung der C-terminalen Domäne der RNA-Polymerase II deren Aktivität an Zielgenen reprimiert. Die schrittweise Inaktivierung von REST, einschließlich der CTDSPs, führt hingegen zur Einleitung des neuronalen Genprogramms und damit zur Entwicklung von neuronalen Zellen. Die zeitliche Regulierung des REST-Komplexes und seiner assoziierten Effektor-Komponenten ist daher auf molekularer Ebene das entscheidende Ereignis in der Neurogenese. Studien in Zebrafisch haben gezeigt, dass die REST-assoziierte Phosphatase CTDSP2 von der micro-RNA (miR) -26b negativ reguliert wird, was zu einer reduzierten REST Aktivität führt. Interessanterweise liegt diese miR in einem Intron von CTDSP2, also dem Gen, welches sie selbst repremiert. Diese Konstellation stellt die Basis für eine intrinsische negative Rückkopplungsschleife dar und ist essentiell für das Voranschreiten der Neurogenese. Diese Schleife ist aktiv während der Neurogenese, jedoch inaktiv in neuronalen Stammzellen. Der Grund hierfür ist, dass die Reifung der miR-26b auf der Stufe der Prozessierung des miR-Vorläufers (pre-miR) zur reifen miR in Stammzellen, nicht aber in Neuronen, angehalten ist. Da nur reife miR funktionell aktiv sein können, ist die Regulation der miR-26 Reifung ein essentieller Schritt im Rahmen der Neurogenese. In dieser Dissertation sollte der Frage nach der molekularen Basis der regulierten Prozessierung der miR-26 im Rahmen der Neurogenese nachgegangen werden. Die Prozessierung von miR erfolgt über zwei Intermediate: Zunächst wird aus dem primären Transkript im Zellkern die pre-miR durch das Enzym DROSHA gebildet. Diese wird dann aus dem Kern exportiert und durch das Enzym DICER zur reifen miR weiterverarbeitet, die im Kontext des „RNA-Induced Silencing Complex“ (RISC) die post-transkriptionale Genexpression reguliert. Mirkoinjektionsstudien an Xenopus leavis Oocyten zeigten, dass eine Verlangsamung bzw. Blockade des nukleo-zytoplasmatischen Transports nicht Ursache für die verzögerte Prozessierung der pre-miR-26 sein kann. Stattdessen haben in vitro und in vivo Prozessierungsexperimente gezeigt, dass die Reifung der miR-26 sehr wahrscheinlich durch einen in trans agierenden Faktor gesteuert wird, der die Prozessierung in nicht-neuronalen Zellen blockiert. Durch RNA affinitätschromatographische Versuche gelang es, Proteine aus Maus- und Zebrafischlysaten zu isolieren und diese zu identifizieren, die spezifisch mit der pre-miR-26b interagieren und deren Biogenese beeinflussen könnten. Vielversprechende Kandidaten sind die Proteine FMRP/FXR1/2, ZNF346 und Eral1, deren funktionelle Charakterisierung im Kontext der miR-Biogenese nun möglich ist. In einer Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Albrecht Müller wurde im zweiten Teil der Arbeit der prinzipiellen Frage nachgegangen, wie die miR-26 die neuronale Genexpression steuert und welche Gene hiervon primär betroffen sind. Diese Untersuchungen wurden durch die Etablierung eines Zellkultur-Protokolls ermöglicht, welches ex vivo die Differenzierung von ESC über neuronal Vorläufer Zellen (NPC) zu NCs erlaubte und so eine systematische Analyse dieses Prozess erlaubte. Für die Funktionsanalyse von miR-26 wurden über die CRISPR/Cas9 Technologie Zelllinien hergestellt, welche keine miR-26 mehr im Genom haben. miR-26 defiziente ESCs behalten ihren pluripotenten Status und ließen sich zu NPCs entwickeln. Die Weiterentwicklung von NPCs zu NCs war hingegen massiv eingeschränkt. Durch RNA Hochdurchsatzsequenzierung gelang es die miR-26 induzierten Genexpressionsunterschiede geanu zu identifizieren. Auf der Ebene der mRNA konnte gezeigt werden, dass die Expression von neuronalen Genen in miR-26 defizienten NCs herunterreguliert ist und dass unter diesen Bedingungen offensichtlich kein anderer Differenzierungsweg eingeschlagen werden konnte. Interessanterweise führte die Deletion von miR-26 zu einer selektiven Verminderung von miRs, die einerseits den REST Komplex regulieren, andererseits aber auch unter dessen transkriptionaler Kontrolle stehen. Diese Daten und die Entdeckung, dass die Induktion von miR-26 zur Anreicherung anderer REST regulierender miRs führt, lässt vermuten, dass miR-26 die Neurogenese durch die schrittweise Inaktivierung des REST Komplexe initiiert. KW - miRNS KW - Neurogenese KW - miR-26 KW - REST-Complex KW - miRNA Biogenesis KW - microrna KW - neurogenesis Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156395 ER - TY - THES A1 - Chowdhury, Suvagata Roy T1 - The Role of MicroRNAs in \(Chlamydia\) Infection T1 - Die Rolle von MicroRNAs in der Chlamydien-Infektion N2 - The obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis is the causative agent of trachoma related blindness and the sexually transmitted pelvic inflammatory disease. Being an obligate intracellular pathogen, C. trachomatis has an intricate dependency on the survival of the host cell. This relationship is indispensible owing to the fact that the pathogen spends a considerable fraction of its biphasic lifecycle within a cytoplasmic vacuole inside the host cell, the so-called chlamydial inclusion. The cellular apoptotic-signalling network is governed by several finely tuned regulatory cascades composed of pro- and anti-apoptotic proteins that respond to changes in the cellular homeostasis. In order to facilitate its intracellular survival, Chlamydia has been known to inhibit the premature apoptosis of the host cell via the stabilization of several host anti-apoptotic proteins such as cIAP2 and Mcl-1. While the pro- and anti-apoptotic proteins are the major regulators of the host apoptotic signalling network, a class of the small non-coding RNAs called microRNAs (miRNAs) has increasingly gained focus as a new level of regulatory control over apoptosis. This work investigates the changes in the host miRNA expression profile post Chlamydia infection using a high throughput miRNA deep sequencing approach. Several miRNAs previously associated with the modulation for apoptotic signalling were differentially expressed upon Chlamydia infection in human endothelial cells. Of the differentially regulated miRNAs, miR-30c-5p was of particular interest since it had been previously shown to target the tumor suppressor protein p53. Our lab and others have previously demonstrated that Chlamydia can downregulate the levels of p53 by promoting its proteasomal degradation. This work demonstrates that Chlamydia infection promotes p53 downregulation by increasing the abundance of miR-30c-5p and a successful infection cycle is hindered by a loss of miR-30c-5p. Over the last decade, dedicated research aimed towards a better understanding of apoptotic stimuli has greatly improved our grasp on the subject. While extrinsic stress, deprivation of survival signals and DNA damage are regarded as major proponents of apoptotic induction, a significant responsibility lies with the mitochondrial network of the cell. Mitochondrial function and dynamics are crucial to cell fate determination and dysregulation of either is decisive for cell survival and pathogenesis of several diseases. The ability of the mitochondrial network to perform its essential tasks that include ATP synthesis, anti-oxidant defense, and calcium homeostasis amongst numerous other processes critical to cellular equilibrium is tied closely to the fission and fusion of individual mitochondrial fragments. It is, thus, 8 unsurprising that mitochondrial dynamics is closely linked to apoptosis. In fact, many of the proteins involved regulation of mitochondrial dynamics are also involved in apoptotic signalling. The mitochondrial fission regulator, Drp1 has previously been shown to be transcriptionally regulated by p53 and is negatively affected by a miR- 30c mediated inhibition of p53. Our investigation reveals a significant alteration in the mitochondrial dynamics of Chlamydia infected cells affected by the loss of Drp1. We show that loss of Drp1 upon chlamydial infection is mediated by the miR-30c-5p induced depletion of p53 and results in a hyper-fused architecture of the mitochondrial network. While it is widely accepted that Chlamydia depends on the host cell metabolism for its intracellular growth and development, the role of mitochondria in an infected cell, particularly with respect to its dynamic nature, has not been thoroughly investigated. This work attempts to illustrate the dependence of Chlamydia on miR-30c-5p induced changes in the mitochondrial architecture and highlight the importance of these modulations for chlamydial growth and development. N2 - Das Gram-negative Humanpathogen Chlamydia trachomatis versursacht das Trachom, eine ansteckende follikuläre Bindehautentzündung, die letztlich zur Erblindung Infizierter führt, sowie sexuell übertragbare Entzündungen im Urogenitaltrakt. C. trachomatis ist ein obligat intrazelluläres Bakterium mit einem biphasischen Lebenszyklus, der in einer spezialisierten Vakuole innerhalb des Wirtszellzytoplasmas durchlaufen wird, der sogenannten Chlamydien-Inklusion. C. trachomatis ist daher davon abhängig, dass die infizierte Wirtszelle überlebt, bis die Entwicklung des Erregers abgeschlossen ist und moduliert dazu das apoptotische Signalnetzwerk der Wirtszelle. Dieses besteht aus mehreren fein aufeinander abgestimmten regulatorischen Kaskaden aus pro- und anti- apoptotischen Proteinen, die normalerweise auf Veränderungen in der zellulären Homöostase reagieren und als Folge den programmierten Zelltod einleiten können. Es ist jedoch bekannt, dass Chlamydia die Apoptose der Wirtszelle durch Stabilisierung mehrerer anti-apoptotischer Wirtsproteine wie cIAP2 und Mcl-1 inhibiert. Während pro- und anti-apoptotische Proteine Hauptregulatoren des Apoptosesignalnetzwerks darstellen, wurde kürzlich eine neue Ebene der Apoptose- Regulation identifiziert, die durch kleine, nicht-kodierende microRNAs (miRNAs) gesteuert wird. In der vorliegenden Arbeit untersuchte ich die Veränderungen in dem miRNA Expressionsprofil von Wirtszellen nach einer Chlamydieninfektion. Mittels miRNA deep sequencing wurden dabei mehrere miRNAs identifiziert, die abhängig von der Infektion mit Chlamydia differentiell in menschlichen Endothelzellen exprimiert werden und deren Funktion mit der Modulation der Apoptose-Signalwege assoziiert sind. Dabei war miR-30c-5p von besonderem Interesse, da deren molekulares target das Tumorsuppressorprotein p53 ist. Unter anderem durch unser Labor wurde dabei bereits gezeigt, dass Chlamydia den Proteasom-vermittelten Abbau von p53 fördert und somit die Menge des Proteins in der Wirtszelle depletieren kann. In der hier vorliegenden Arbeit zeige ich darüberhinaus, dass eine Chlamydia-Infektion die p53 Mengen in den Wirtszellen senkt, indem miR-30c-5p verstärkt produziert wird, während das intrazelluläre Wachstum von C. trachomatis durch den Verlust von miR- 30c-5p inhibiert wird. Zusammen mit den apoptotischen Regulationskaskaden entscheiden auch die Integrität der Mitochondrien sowie die Dynamik des mitochondrialen Netzwerks über das Schicksal der Zelle. Eine Dysregulation dieser Funktionen führt zur Einleitung des Zelltods und bildet die Grundlage der Pathogenese mehrerer Krankheiten. Zu den wesentlichen Aufgaben des mitochondrialen Netzwerkes gehören, neben zahlreichen anderen, die Synthese von ATP, die Detoxifizierung von reaktiven Sauerstoff-Spezies sowie die Kalziumhomöostase. Die funktionelle Integrität des mitochondrialen Netzwerks ist dabei stark von Teilungs- und Fusionsraten mitochondrialer Fragmente abhängig und diese mitochondriale Dynamik ist wiederum eng mit der Apoptose verknüpft; so sind etwa viele Proteine, welche die mitochondriale Dynamik regulieren, auch an der apoptotischen Signalgebung beteiligt. Zum Beispiel wird die Transkription des an der Mitochondrienteilung beteiligten Proteins Drp1 durch p53 reguliert und eine miR-30c-vermittelte Inhibition von p53 senkt daher die Menge an Drp1 in der Zelle. In der hier vorliegenden Arbeit demonstriere ich die signifikante Veränderung der mitochondrialen Dynamik in menschlichen Zellen nach einer Chlamydieninfektion. Die entstehende hyperkondensierte Architektur des mitochondrialen Netzwerks ist dabei auf den Verlust von Drp1 zurückzuführen, welcher durch die miR-30c-5p- induzierte Depletion von p53 vermittelt wird. Während die Abhängigkeit des intrazellulären Wachstums von Chlamydia vom Stoffwechsel der Wirtszelle weitgegen akzeptiert ist, wurde die Rolle der Mitochondrien und die Dynamik des mitochondrialen Netzwerks in infizierten Zellen bisher vernachlässigt. Innerhalb der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal die Abhängigkeit von Chlamydia auf miR- 30c-5p induzierte Veränderungen in der mitochondrialen Architektur illustriert. KW - Chlamydia KW - MicroRNAs KW - Mitochondria KW - Microscopy KW - Chlamydienkrankheit KW - miRNS KW - Mitochondrium KW - Mikroskopie Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155866 ER - TY - THES A1 - Reinhold, Ann-Kristin T1 - New players in neuropathic pain? microRNA expression in dorsal root ganglia and differential transcriptional profiling in primary sensory neurons T1 - Neue Ansätze bei neuropathischem Schmerz: microRNA-Expression in Spinalganglien und eine differenzierte Transkriptionsanalyse von primären sensorischen Neuronen N2 - Neuropathic pain, caused by neuronal damage, is a severely impairing mostly chronic condition. Its underlying molecular mechanisms have not yet been thoroughly understood in their variety. In this doctoral thesis, I investigated the role of microRNAs (miRNAs) in a murine model of peripheral neuropathic pain. MiRNAs are small, non-coding RNAs known to play a crucial role in post-transcriptional gene regulation, mainly in cell proliferation and differentiation. Initially, expression patterns in affected dorsal root ganglia (DRG) at different time points after setting a peripheral nerve lesion were studied. DRG showed an increasingly differential expression pattern over the course of one week. Interestingly, a similar effect, albeit to a smaller extent, was observed in corresponding contralateral ganglia. Five miRNA (miR-124, miR-137, miR-183, miR-27b, and miR-505) were further analysed. qPCR, in situ hybridization, and bioinformatical analysis point towards a role for miR-137 and -183 in neuropathic pain as both were downregulated. Furthermore, miR-137 is shown to be specific for non-peptidergic non-myelinated nociceptors (C fibres) in DRG. As the ganglia consist of highly heterocellular tissue, I also developed a neuron-specific approach. Primarily damaged neurons were separated from intact adjacent neurons using fluorescence-activated cell-sorting and their gene expression pattern was analysed using a microarray. Thereby, not only were information obtained about mRNA expression in both groups but, by bioinformatical tools, also inferences on miRNA involvement. The general expression pattern was consistent with previous findings. Still, several genes were found differentially expressed that had not been described in this context before. Among these are corticoliberin or cation-regulating proteins like Otopetrin1. Bioinformatical data conformed, in part, to results from whole DRG, e.g. they implied a down-regulation of miR-124, -137, and -183. However, these results were not significant. In summary, I found that a) miRNA expression in DRG is influenced by nerve lesions typical of neuropathic pain and that b) these changes develop simultaneously to over-expression of galanin, a marker for neuronal damage. Furthermore, several miRNAs (miR-183, -137) exhibit distinct expression patterns in whole-DRG as well as in neuron-specific approaches. Therefore, further investigation of their possible role in initiation and maintenance of neuropathic pain seems promising. Finally, the differential expression of genes like Corticoliberin or Otopetrin 1, previously not described in neuropathic pain, has already resulted in follow-up projects. N2 - Neuropathischer Schmerz, d.h. Schmerz durch neuronale Schäden, ist eine stark beeinträchtigendes, oft chronisches Leiden. Die hierfür verantwortlichen molekularen Geschehen sind in ihrer Breite bislang nur unzureichend verstanden. In meiner Promotion habe ich die Rolle von microRNAs (miRNAs) in einem Mäusemodell des peripheren neuropathischen Schmerzes untersucht. MiRNAs sind kleine, nicht kodierende RNAs, die für posttranskriptionelle Genregulation, besonders Zellproliferation und –differenzierung verantwortlich sind. Im Experiment wurde zunächst ihre Expression in den Dorsalganglien geschädigter Nerven analysiert. Hier zeigte sich im Verlauf einer Woche ein zunehmend differentielles Expressionsmuster. Bemerkenswert war ein ähnlicher, wenn auch geringerer Effekt in kontralateralen Ganglien. In einem weiteren Schritt wurden fünf ausgewählte miRNAs (miR-124, miR-137, miR-183, miR-27b und miR-505) weiter analysiert. qPCR, In-situ-Hybridisierung und bioinformatische Untersuchungen deuteten auf Minderexpression von miR-137 und -183 bei neuropathischem Schmerz hin. Weiterhin stellte sich miR-137 als spezifisch für nicht-peptiderge nicht-myelinisierte Nozizeptoren in Dorsalganglien heraus. Da Dorsalganglien aus äußerst heterozellulärem Gewebe bestehen, entwickelte ich im Folgenden einen neuronenspezifischen Ansatz: Primär geschädigte sowie intakte benachbarte Neuronen wurden durch fluoreszenz¬aktivierte Zellsortierung (FACS) selektiert und ihre Genexpression jeweils in einem Microarray analysiert. Hierdurch konnten nicht nur direkte Informationen über mRNA-Expression in beiden Gruppen gewonnen, sondern durch bioinformatische Techniken auch Rückschlüsse auf miRNA-Expression gezogen werden. Das generelle Expressionsmuster entsprach der einschlägigen Literatur, allerdings zeigten sich auch bislang nicht beschriebene Veränderungen. Hierzu gehören Corticoliberin sowie Otopetrin1. Die bioinformatische Analyse bestätigte teilweise die Ergebnisse aus der ersten, ganglienweiten Untersuchung: Sie wiesen auf eine Minderexpression von miR-124, -137 und -183 hin, allerdings waren diese Ergebnisse nicht signifikant. Zusammengefasst zeigte sich, dass sich a) die Expression von miRNA in Dorsalganglien nach neuropathischen Läsionen ändert, und b) diese Veränderungen parallel zum neuropathischen Phänotyp entwickeln. Weiterhin wiesen mehrere miRNAs markante Expressionsmuster sowohl in ganglienweiten wie in neuronenspezifischen Untersuchugen auf. Daher scheint die weitere Untersuchung ihrer Rolle in Entwicklung und Aufrechterhaltung von neuropathischem Schmerz vielversprechend. Schließlich hat die Entdeckung von Expressionsveränderungen bei Genen wie Corticoliberin und Otopetrin1, bislang nicht im Zusammenhang mit neuropathischem Schmerz beschrieben, bereits zu Nachfolgeprojekten geführt. KW - Schmerzforschung KW - miRNS KW - Neuralgie KW - Neuropathic pain KW - microRNA KW - Neuropathischer Schmerz KW - Axonschaden KW - axonal damage KW - neuronal tracing Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140314 ER - TY - THES A1 - Leinders, Mathias T1 - microRNAs in chronic pain T1 - microRNAs bei chronischen Schmerzen N2 - Chronic pain is a common problem in clinical practice, not well understood clinically, and frequently tough to satisfactorily diagnose. Because the pathophysiology is so complex, finding effective treatments for people with chronic pain has been overall less than successful and typically reduced to an unsatisfactory trial-and-error process, all of which translates into a significant burden to society. Knowledge of the mechanisms underlying the development of chronic pain, and moreover why some patients experience pain and others not, may aid in developing specific treatment regimens. Although nerve injuries are major contributors to pain chronification, they cannot explain the entire phenomenon. Considerable research has underscored the importance of the immune system for the development and maintenance of chronic pain, albeit the exact factors regulating inflammatory reactions remain unclear. Understanding the putative molecular and cellular regulator switches of inflammatory reactions will open novel opportunities for immune modulatory analgesics with putatively higher specificity and less adverse effects. It has become clear that small, non- coding RNA molecules known as microRNAs are in fact potent regulators of many thousands of genes and possibly cross-communicate between cellular pathways in multiple systems acting as so-called “master-switches”. Aberrant expression of miRNAs is now implicated in numerous disorders, including nerve injuries as well as in inflammatory processes. Moreover, compelling evidence supports the idea that miRNAs also regulate pain, and in analogy to the oncology field aid in the differential diagnosis of disease subtypes. In fact, first reports describing characteristic miRNA expression profiles in blood or cerebrospinal fluid of patients with distinct pain conditions are starting to emerge, however evidence linking specific miRNA expression profiles to specific pain disorders is still insufficient. The present thesis aimed at first, identifying specific miRNA signatures in two distinct chronic pain conditions, namely peripheral neuropathies of different etiologies and fibromyalgia syndrome. Second, it aimed at identifying miRNA profiles to better understand potential factors that differentiate painful from painless neuropathies and third, study the mechanistic role of miRNAs in the pathophysiology of pain, to pave the way for new druggable targets. Three studies were conducted in order to identify miRNA expression signatures that are characteristic for the given chronic pain disorder. The first study measured expression of miR-21, miR-146a and miR-155 in white blood cells, skin and nerve biopsies of patients with peripheral neuropathies. It shows that peripheral neuropathies of different etiologies are associated with increased peripheral miR-21 and miR-146a, but decreased miR-155 expression. More importantly, it was shown that painful neuropathies have increased sural nerve miR-21 and miR-155 expression, but reduced miR-146a and miR-155 expression in distal skin of painful neuropathies. These results point towards the potential use of miRNAs profiles to stratify painful neuropathies. The seconds study extends these findings and first analyzed the role of miR-132-3p in patients and subsequently in an animal model of neuropathic pain. Interestingly, miR-132-3p was upregulated in white blood cells and sural nerve biopsies of patients with painful neuropathies and in animals after spared nerve injury. Pharmacologically modulating the expression of miR-132-3p dose-dependently reversed pain behavior and pain aversion, indicating the pro-nociceptive effect of miR-132-3p in chronic pain. This study thus demonstrates the potential analgesic impact by modulating miRNA expression. Fibromyalgia is associated with chronic widespread pain and, at least in a subgroup, impairment in small nerve fiber morphology and function. Interestingly, the disease probably comprises subgroups with different underlying pathomechanisms. In accordance with this notion, the third study shows that fibromyalgia is associated with both aberrant white blood cell and cutaneous miRNA expression. Being the first of its kind, this study identified miR-let-7d and its downstream target IGF-1R as potential culprit for impaired small nerve fiber homeostasis in a subset of patients with decreased intra-epidermal nerve fiber density. The work presented in this thesis is a substantial contribution towards the goal of better characterizing chronic pain based on miRNA expression signatures and thus pave the way for new druggable targets. N2 - Chronische Schmerzen sind in der klinischen Praxis ein häufiges Problem, die Ätiologie und Pathogenese jedoch oftmals unklar. Aufgrund der Komplexität des pathophysiologischen Ursprunges chronischer Schmerzen, ist bei einem Teil der Patienten Schmerzfreiheit oder Schmerzreduktion mit gängigen Analgetika nur insuffizient zu erreichen. Dies führt zu einer enormen sozio-ökonomischen Belastung für die Gesellschaft. Daher können Kenntnisse über die Mechanismen, die der Entwicklung von chronischen Schmerzen zugrunde liegen, und darüber hinaus, warum einige Patienten Schmerzen entwickeln und andere nicht, bei der Entwicklung spezifischer und individueller Behandlungsschemata helfen. Eine Vielzahl an Studien belegen die Bedeutung des Immunsystems für die Entwicklung und Aufrechterhaltung chronischer Schmerzen, wenngleich die genauen Faktoren, die entzündliche Reaktionen regulieren, noch unklar bleiben. Rezente Entdeckungen der hochkonservierten, nicht-kodierenden RNA-Moleküle, sogenannten microRNAs, lassen in der Tat darauf schließen, dass diese eine wichtige Rolle im Netzwerk der Genregulation spielen. microRNAs regulieren die hochspezifische „cross-communication“ mehrerer simultaner Signaltransduktionsvorgänge zellulärer Prozesse, und werden daher auch "master-switches" genannt. Interessanterweise, wurden aberrante Expressionen spezifischer miRNAs in zahlreichen Krankheiten, einschließlich Nervenverletzungen, sowie in entzündlichen Prozessen nachgewiesen. Darüber hinaus belegen stichhaltige Beweise nicht nur die Idee, dass miRNAs auch bei der Regulierung von Schmerzen eine wichtige Rolle spielen, sondern auch hilfreich bei der Differentialdiagnose von Krankheits- Subtypen sein können. Dies wurde bei rezenten onkologischen Studien deutlich. Tatsächlich weisen erste Berichte auf ein charakteristisches miRNA- Expressionsprofil in Blut oder Zerebrospinalflüssigkeit von Patienten mit verschiedenen Schmerztypen hin. Jedoch ist die Assoziation spezifischer miRNA-Expressionsprofile mit spezifischen Schmerzstörungen noch unzureichend. Die Zielvorgabe der vorliegenden Arbeit war daher zunächst, spezifische miRNA-Signaturen in zwei verschiedenen chronischen Schmerzzuständen zu identifizieren, nämlich peripheren Neuropathien verschiedener Ätiologien und dem Fibromyalgie-Syndrom. Zweitens wurden die erarbeiteten Ergebnisse dazu verwendet, bestimmte miRNA-Profile zu identifizieren, die schmerzhafte von schmerzlosen Neuropathien unterscheiden lassen und einen Hinweis auf die Pathologie der kleinkalibrigen Fasern bei der Fibromyalgie geben. Darüber hinaus wurde die mechanistische Rolle von miRNAs in der Pathophysiologie von Schmerzen Tierexperimentell untersucht, um künftig neuartige Therapien entwickeln zu können. Die erste Studie untersuchte die Expression von miR-21, miR-146a und miR-155 in weißen Blutkörperchen, Haut- und Nervenbiopsien bei Patienten mit peripheren Neuropathien. Sie zeigt, dass periphere Neuropathien verschiedener Ätiologien mit erhöhten peripheren miR-21 und miR-146a und verminderter miR- 155 Expression assoziiert sind. Wichtiger jedoch, dass Patienten mit schmerzhaften Neuropathien erhöhte miR-21 und miR-155-Expression im Suralis und verminderte miR-146a- und miR-155-Expression in distalen im Vergleich zu proximalen Hautbiopsien aufweisen. Diese Ergebnisse weisen auf die potenzielle Verwendung von miRNA-Profilen zur Stratifizierung schmerzhafter Neuropathien hin. Die zweite Studie baut dieses Ergebnis aus und untersuchte zunächst die Rolle von miR-132-3p im humanen und anschließend bei tierexperimentellen neuropathischen Schmerzen. Interessanterweise war miR-132-3p sowohl in weißen Blutkörperchen und Suralis-Nervenbiopsien von Patienten mit schmerzhaften Neuropathien als auch bei Tieren nach Läsion eines peripheren Nervens hochreguliert. Nach pharmakologischer Intervention gab es eine dosisabhängige Schmerzreduktion und Schmerzaversion, was somit auf den pro- nozizeptiven Effekt von miR-132-3p hinweist. Diese Studie zeigt somit die potenzielle analgetische Wirksamkeit microRNA-gerichteter pharmakologischer Interventionen. Das Fibromyalgie Syndrome ist eine chronische Erkrankung, die von einem multilokulären Schmerzbild und Beeinträchtigungen in kleinen Nervenfasern dominiert wird. Es wird angenommen, dass die Erkrankung wahrscheinlich aus Subgruppen mit unterschiedlichen zugrunde liegenden Pathomechanismen besteht. Die hierzu durchgeführte Studie zeigt, dass Fibromyalgie-Patienten veränderte microRNA Expression sowohl in weißen Blutkörperchen als auch in der Haut aufweisen. Erstmals identifiziert diese Studie miR-let-7d und ihr „downstream-target“ IGF-1R als potentiellen Schädigungsmechanismus kleiner Nervenfaserfunktionen, in einer Subgruppe von Patienten mit verminderter intra-epidermalen Nervenfaserdichte. Die Ergebnisse, die in dieser Arbeit vorgestellt werden, liefern einen wesentlichen Beitrag, die Pathophysiologie chronischer Schmerzen, aufgrund von miRNA-Expressions-Signaturen zu charakterisieren. KW - chronic pain KW - microRNA KW - miRNS KW - Chronischer Schmerz Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-144395 ER - TY - THES A1 - Premachandran Nair, Anoop Chandran T1 - Identification and functional characterization of TGF-β inducible, immunosuppressive miRNAs in human CD8+ T cells T1 - Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von TGF-β induzierbaren, immunsuppressiven miRNAs in humanen CD8+ T Zellen N2 - While TGF-β is able to regulate miRNA expression in numerous cell types, TGF-β-dependent changes in the miRNA profile of CD8+ T cells had not been studied before. Considering that TGF-β suppresses CD8+ T cell effector functions in numerous ways, we wondered whether induction of immune-regulatory miRNAs could add to the known transcriptional effects of TGF-β on immune effector molecules. In this study, we used miRNA arrays, deep sequencing and qRT-PCR to identify miRNAs that are modulated by TGF-β in human CD8+ T cells. Having found that the TGF-β-dependent downregulation of NKG2D surface expression in NK cells and CD8+ T cells does not go along with a corresponding reduction in mRNA levels, this pathway appeared to be a possible target of TGF-β-inducible miRNAs. However, this hypothesis could not be confirmed by miRNA reporter assays. Instead, we observed that DAP10 transcription is suppressed by TGF-β which in turn negatively affects NKG2D surface expression. In spite of promising preliminary experiments, technical difficulties associated with the transfection of primary NK cells and NK cell lines unfortunately precluded the final proof of this hypothesis. Instead, we focused on the TGF-β-induced changes in the miRNome of CD8+ T cells and confirmed the induction of the miR-23a cluster members, namely miR-23a, miR-27a and miR-24 by three different techniques. Searching for potential targets of these miRNAs which could contribute to the immunosuppressive action of TGF-β in T cells, we identified and confirmed a previously unknown regulation of IFN-γ mRNA by miR-27a and miR-24. Newly generated miRNA reporter constructs further revealed that LAMP1 mRNA is a target of miR-23a. Upon modulation of the miR-23a cluster in CD8+ T cells by the respective miRNA antagomirs and mimics, significant changes in IFN-γ expression confirmed the functional relevance of our findings. Effects on CD107a/LAMP1 expression were, in contrast, rather minimal. Still, overexpression of the miR-23a cluster attenuated the cytotoxic activity of antigen-specific CD8+ T cells. Taken together, these functional data reveal that the miR-23a cluster not only is induced by TGF-β, but also exerts a suppressive effect on CD8+ T-cell effector functions, even in the absence of TGF-β signaling. N2 - Obwohl bekannt war, dass TGF- die miRNA Expression in zahlreichen Zelltypen moduliert, waren TGF- abhängige Veränderung des miRNA Profils in CD8+ T Zellen noch nicht untersucht worden. Da TGF-β die Effektorfunktionen von CD8+ T Zellen aber in vielfältiger Weise inhibiert, fragten wir uns, ob die transkriptionellen Effekte, die TGF-β bekanntermaßen auf Immuneffektormoleküle ausübt, noch durch die Induktion immunregulatorischer miRNAs ergänzt werden. Daher nutzten wir miRNA Arrays, Genomsequenzierungstechniken und Echtzeit-PCR um miRNAs zu identifizieren, welche in humane CD8+ T Zellen von TGF- moduliert werden. Die Beobachtung, dass die TGF--abhängige Herunterregulation der NKG2D Oberflächenexpression in Natürlichen Killerzellen und CD8+ T Zellen nicht mit einer entsprechenden Verringerung der mRNA Menge einhergeht, ließ zudem vermuten, dass dieser Signalweg über miRNAs reguliert werden könnte. Nach verschiedenen miRNA Reporterassays musste diese Hpothese jedoch verworfen werden. Stattdessen zeigte sich, dass TGF- die Transkription von DAP10 inhibiert was wiederum die Oberflächenexpression von NKG2D limitieren sollte. Trotz viel versprechender initialer Experimente scheiterte der letzgültige Beweis dieser Hypothese aber an der ungenügenden Transfizierbarkeit von primären NK Zellen sowie von NK Zelllinien. Daher konzentrierten wir uns im Weiteren auf die durch TGF- induzierten Veränderungen im miRNom von CD8+ T Zellen und konnten mit drei verschiedenen Techniken die Induktion des miR-23a Clusters (mit den einzelnen miRNAs miR-23a, miR-27a und miR-24) bestätigen. Auf der Suche nach potentiellen immunregulatorisch relevanten Zielgenen dieser miRNAs konnten wir erstmals eine Regulation von IFN- durch miR-27a und miR-24 nachweisen. Zu diesem Zweck generierte miRNA Reporterkonstrukte zeigten zudem, dass LAMP1 durch miR-23a reguliert wird. Nach Modulation des miR-23a Clusters durch die entsprechenden miRNA Antagomir und Surrogat-Konstrukte konnten wir auch in CD8+ T Zellen signifikante Veränderungen der IFN-γ Expression nachweisen und somit die funktionelle Relevanz unserer Befunde bestätigen. Die Effekte auf die Expression von CD107a/LAMP1 waren hingegen nur minimal. Trotzdem führte die Überexpression des miR-23a Clusters zu einer Verringerung der zytotoxischen Aktivität von antigenspezifischen CD8+ T Zellen. Zusammen genommen belegen diese funktionellen Untersuchungen, dass das miRNA-23a Cluster, welches durch TGF-β induziert wird, zur Hemung der Effektorfunktionen in CD8+ T Zellen beiträgt, und zwar sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von TGF-β. KW - Transforming Growth Factor beta KW - Antigen CD8 KW - miRNS KW - Interferon KW - Immunsystem KW - miR-23a cluster KW - T cell cytotoxicity KW - Regulation Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109741 ER - TY - THES A1 - Ganesan, Jayavarshni T1 - The role of microRNA-378 in cardiac hypertrophy T1 - Untersuchungen zur Rolle der MikroRNA-378 bei kardialer Hypertrophie N2 - MicroRNAs are endogenous ≈22 nt long non coding RNA molecules that modulate gene expression at the post transcriptional level by targeting mRNAs for cleavage or translational repression. MicroRNA-mRNA interaction involves a contiguous and perfect pairing within complementary sites usually in the 3’ UTR of the target mRNA. Heart failure is associated with myocyte hypertrophy and death, due to compensatory pathological remodeling and minimal functional repair along with microRNA deregulation. In this study, we identified candidate microRNAs based on their expression strength in cardiomyocytes and by their ability to regulate hypertrophy. Expression profiling from early and late stages of heart failure showed several deregulated microRNAs. Of these microRNAs, miR-378 emerged as a potentially interesting microRNA that was highly expressed in the mouse heart and downregulated in the failing heart. Antihypertrophic activity of miR-378 was first observed by screening a synthetic miR library for morphologic effects on cardiomyocytes, and validated in vitro proving the tight control of hypertrophy by this miR. We combined bioinformatic target prediction analysis and microarray analysis to identify the targets of miR-378. These analyses suggested that factors of the MAP kinase pathway were enriched among miR-378 targets, namely MAPK1 itself (also termed ERK2), the insulin-like growth factor receptor 1 (IGF1R), growth factor receptor bound protein 2 (GRB2) and kinase suppressor of ras 1 (KSR1). Regulation of these targets by miR-378 was then confirmed by mRNA and protein expression analysis. The use of luciferase reporter constructs with natural or mutated miR-378 binding sites further validated these four proteins as direct targets of miR-378. RNA interference with MAPK1 and the other three targets prevented the prohypertrophic effect of antimiR-378, suggesting that they functionally relate to miR-378. In vivo restoration of disease induced loss of miR-378 in a pressure overload mouse model of hypertrophy using adeno associated virus resulted in partial attenuation cardiac hypertrophy and significant improvement in cardiac function along with reduced expression of the four targets in heart. We conclude from these findings that miR-378 is an antihypertrophic microRNA in cardiomyocytes, and the main mechanism underlying this effect is the suppression of the MAP kinase-signaling pathway on four distinct levels. Restoration of disease-associated loss of miR-378 through cardiomyocyte-targeted AAV-miR-378 may prove as an effective therapeutic strategy in myocardial disease. N2 - MicroRNAs sind ca. 22 Nukleotide lange endogene, nicht-kodierende RNA-Moleküle, die die Expression von Genen posttranskriptionell regulieren, indem sie den Abbau der Ziel-mRNA herbeiführen oder deren Translation hemmen. Die Interaktion von microRNA und mRNA erfolgt durch perfekt komplementäre Bindung in der 3’-untranslatierten Region der Ziel-mRNA. Eine Deregulation der Expression verschiedener microRNAs lässt sich bei Herzinsuffizienz beobachten. Im insuffizienten Herzen laufen kompensatorische pathologische Remodellingprozesse ab und es kommt unter anderem zu Hypertrophie und Apoptose von Kardiomyozyten. Im Rahmen dieser Arbeit haben wir Kandidaten-microRNAs nach folgenden Kriterien identifiziert: 1) Expr e s s ions s t ä rke in Ka rdiomyozyt en, 2) Fähigke i t zur Regul a t ion von Kardiomyozytenhypertrophie im Screening einer synthetischen microRNA-Bibliothek auf Kardiomyozytengröße und 3) Regulation ihrer Expression in frühem und späten Stadium eines murinen Herzinsuffizienzmodells. Aus den resultierenden Kandidaten-microRNAs wurde im folgenden miR-378 näher untersucht. MiR-378 war im gesunden Mausherz stark exprimiert. Die Expression nahm bei Herzinsuffizienz ab. Weiterhin hatte die Überexpression von miR-378 in neonatalen Kardiomyozyten einen antihypertrophen Effekt. Im Gegenzug führte die Expression von antimiR-378 zu einer verstärkten Hypertrophie. Zur Target-Suche wurden zum einen bioinformatische Vorhersage-Datenbanken verwendet und zum anderen ein Microarray durchgeführt. Diese Analysen zeigten eine Anreicherung von Faktoren des MAP-Kinase- Signalweges: Mitogen-aktivierte Proteinkinase 1 (MAPK1, auch als ERK2 bezeichnet), Insulinähnlicher Wachstumsfaktorrezeptor 1 (IGF1R), Wachstumsfaktorbindeprotein 2 (GRB2) und Kinasesuppressor von Ras 1 (KSR1). Die Regulation dieser Targets durch miR-378 wurde durch Bestimmung der mRNA- und Proteinexpression nach Überexpression bzw. Inhibition von miR-378 bestätigt. Durch Luziferaseassays mit Reporterkonstrukten, die jeweils die exakten oder mutierte Bindungsstellen der vier Targets enthielten, konnte gezeigt werden, dass die mRNAs der vier Faktoren direkte Targets von miR-378 darstellen. Durch siRNA-mediierte Herabregulation der Zielproteine konnte der prohypertrophe Effekt von antimiR-378 inhibiert werden. Daraus lässt sich schließen, dass der Hypertrophie-Phänotyp direkt auf miR-378 zurückzuführen ist. Schließlich wurde der Effekt von miR-378 im murinen Herzinsuffizienzmodell (Konstriktion der Aorta, TAC) untersucht. TAC führte zu einer Abnahme der Expression von miR-378 im Herzen. Durch Adenoassoziierten Virus (AAV) vermittelte exogene Expression von miR-378 wurde das Expressionslevel des gesunden Herzens im TAC-Modell wiederhergestellt und die Expression der vier Targets herabgesetzt. Dies resultierte in weniger ausgeprägten Kardiomyozytenhypertrophie sowie in einer signifikanten Verbesserung der Herzfunktion. Aus diesen Daten schließen wir, dass miR-378 einen antihypertrophen Effekt auf Kardiomyozyten hat, der wesentlich durch die Suppression des MAP-Kinase-Signalweges an vier Angriffspunkten vermittelt wird. Die Wiederherstellung des “gesunden” Expressionsniveaus von miR-378 im kranken Herzen durch Kardiomyozyten-spezifische Expression mit AAV-miR-378 könnte eine Therapieoption bei Herzerkrankungen sein. KW - Hypertrophie KW - Herzinsuffizienz KW - miRNS KW - Herzmuskelzelle KW - Cardiomyocytes KW - Gene therapy KW - MicroRNA KW - Cardiac hypertrophy KW - Hypertrophy Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-100918 ER - TY - THES A1 - Zeeshan [geb. Majeed], Saman T1 - Implementation of Bioinformatics Methods for miRNA and Metabolic Modelling T1 - Die Umsetzung der Bioinformatik-Methoden für miRNA-und der Metabolischen Modellierung N2 - Dynamic interactions and their changes are at the forefront of current research in bioinformatics and systems biology. This thesis focusses on two particular dynamic aspects of cellular adaptation: miRNA and metabolites. miRNAs have an established role in hematopoiesis and megakaryocytopoiesis, and platelet miRNAs have potential as tools for understanding basic mechanisms of platelet function. The thesis highlights the possible role of miRNAs in regulating protein translation in platelet lifespan with relevance to platelet apoptosis and identifying involved pathways and potential key regulatory molecules. Furthermore, corresponding miRNA/target mRNAs in murine platelets are identified. Moreover, key miRNAs involved in aortic aneurysm are predicted by similar techniques. The clinical relevance of miRNAs as biomarkers, targets, resulting later translational therapeutics, and tissue specific restrictors of genes expression in cardiovascular diseases is also discussed. In a second part of thesis we highlight the importance of scientific software solution development in metabolic modelling and how it can be helpful in bioinformatics tool development along with software feature analysis such as performed on metabolic flux analysis applications. We proposed the “Butterfly” approach to implement efficiently scientific software programming. Using this approach, software applications were developed for quantitative Metabolic Flux Analysis and efficient Mass Isotopomer Distribution Analysis (MIDA) in metabolic modelling as well as for data management. “LS-MIDA” allows easy and efficient MIDA analysis and, with a more powerful algorithm and database, the software “Isotopo” allows efficient analysis of metabolic flows, for instance in pathogenic bacteria (Salmonella, Listeria). All three approaches have been published (see Appendices). N2 - Dynamische Wechselwirkungen und deren Veränderungen sind wichtige Themen der aktuellen Forschung in Bioinformatik und Systembiologie. Diese Promotionsarbeit konzentriert sich auf zwei besonders dynamische Aspekte der zellulären Anpassung: miRNA und Metabolite. miRNAs spielen eine wichtige Rolle in der Hämatopoese und Megakaryozytopoese, und die Thrombozyten miRNAs helfen uns, grundlegende Mechanismen der Thrombozytenfunktion besser zu verstehen. Die Arbeit analysiert die potentielle Rolle von miRNAs bei der Proteintranslation, der Thrombozytenlebensdauer sowie der Apoptose von Thrombozyten und ermöglichte die Identifizierung von beteiligten Signalwegen und möglicher regulatorischer Schlüsselmoleküle. Darüber hinaus wurden entsprechende miRNA / Ziel-mRNAs in murinen Thrombozyten systematisch gesammelt. Zudem wurden wichtige miRNAs, die am Aortenaneurysma beteiligt sein könnten, durch ähnliche Techniken vorhergesagt. Die klinische Relevanz von miRNAs als Biomarker, und resultierende potentielle Therapeutika, etwa über eine gewebsspezifische Beeinflussung der Genexpression bei Herz-Kreislauf Erkrankungen wird ebenfalls diskutiert. In einem zweiten Teil der Dissertation wird die Bedeutung der Entwicklung wissenschaftlicher Softwarelösungen für die Stoffwechselmodellierung aufgezeigt, mit einer Software-Feature-Analyse wurden verschiedene Softwarelösungen in der Bioinformatik verglichen. Wir vorgeschlagen dann den "Butterfly"-Ansatz, um effiziente wissenschaftliche Software-Programmierung zu implementieren. Mit diesem Ansatz wurden für die quantitative Stoffflussanalyse mit Isotopomeren effiziente Software-Anwendungen und ihre Datenverwaltung entwickelt: LS-MIDA ermöglicht eine einfache und effiziente Analyse, die Software "Isotopo" ermöglicht mit einem leistungsfähigeren Algorithmus und einer Datenbank, eine noch effizientere Analyse von Stoffwechselflüssen, zum Beispiel in pathogenen Bakterien (Salmonellen, Listerien). Alle drei Ansätze wurden bereits veröffentlicht (siehe Appendix). KW - miRNS KW - Bioinformatics KW - miRNA KW - Metabolic Modelling KW - Spectral Data Analysis KW - Butterfly KW - Thrombozyt KW - Bioinformatik KW - Stoffwechsel KW - Modellierung KW - Metabolischen Modellierung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-102900 ER -