TY - THES A1 - Wagh, Dhananjay Anil T1 - "Bruchpilot" -molecular and functional characterization of a novel active zone protein at the Drosophila synapse T1 - "Bruchpilot" - Molekulare und funktionelle Charakterisierung eines neuen Proteins der aktiven Zone der Drosophila-Synapse N2 - Chemical neurotransmission is a complex process of central importance for nervous system function. It is thought to be mediated by the orchestration of hundreds of proteins for its successful execution. Several synaptic proteins have been shown to be relevant for neurotransmission and many of them are highly conserved during evolution- suggesting a universal mechanism for neurotransmission. This process has checkpoints at various places like, neurotransmitter uptake into the vesicles, relocation of the vesicles to the vicinity of calcium channels in order to facilitate Ca2+ induced release thereby modulating the fusion probability, formation of a fusion pore to release the neurotransmitter and finally reuptake of the vesicles by endocytosis. Each of these checkpoints has now become a special area of study and maintains its own importance for the understanding of the overall process. Ca2+ induced release occurs at specialized membrane structures at the synapse known as the active zones. These are highly ordered electron dense grids and are composed of several proteins which assist the synaptic vesicles in relocating in the vicinity of Ca2+ channels thereby increasing their fusion probability and then bringing about the vesicular fusion itself. All the protein modules needed for these processes are thought to be held in tight arrays at the active zones, and the functions of a few have been characterized so far at the vertebrate active zones. Our group is primarily interested in characterizing the molecular architecture of the Drosophila synapse. Due to its powerful genetics and well-established behavioural assays Drosophila is an excellent system to investigate neuronal functioning. Monoclonal antibodies (MABs) from a hybridoma library against Drosophila brain are routinely used to detect novel proteins in the brain in a reverse genetic approach. Upon identification of the protein its encoding genetic locus is characterized and a detailed investigation of its function is initiated. This approach has been particularly useful to detect synaptic proteins, which may go undetected in a forward genetic approach due to lack of an observable phenotype. Proteins like CSP, Synapsin and Sap47 have been identified and characterized using this approach so far. MAB nc82 has been one of the shortlisted antibodies from the same library and is widely used as a general neuropil marker due to the relative transparency of immunohistochemical whole mount staining obtained with this antibody. A careful observation of double stainings at the larval neuromuscular junctions with MAB nc82 and other pre and post-synaptic markers strongly suggested an active zone localization of the nc82 antigen. Synaptic architecture is well characterized in Drosophila at the ultrastructural level. However, molecular details for many synaptic components and especially for the active zone are almost entirely unknown. A possible localization at the active zone for the nc82 antigen served as the motivation to initiate its biochemical characterization and the identification of the encoding gene. In the present thesis it is shown by 2-D gel analysis and mass spectrometry that the nc82 antigen is a novel active zone protein encoded by a complex genetic locus on chromosome 2R. By RT-PCR exons from three open reading frames previously annotated as separate genes are demonstrated to give rise to a transcript of at least 5.5 kb. Northern blots produce a prominent signal of 11 kb and a weak signal of 2 kb. The protein encoded by the 5.5 kb transcript is highly conserved amongst insects and has at its N-terminus significant homology to the previously described vertebrate active zone protein ELKS/ERC/CAST. Bioinformatic analysis predicts coiled-coil domains spread all over the sequence and strongly suggest a function involved in organizing or maintaining the structure of the active zone. The large C-terminal region is highly conserved amongst the insects but has no clear homologues in veretebrates. For a functional analysis of this protein transgenic flies expressing RNAi constructs under the control of the Gal4 regulated enhancer UAS were kindly provided by the collaborating group of S.Sigrist (Gِttingen). A strong pan-neuronal knockdown of the nc82 antigen by transgenic RNAi expression leads to embryonic lethality. A relatively weaker RNAi expression results in behavioural deficits in adult flies including unstable flight and impaired walking behavior. Due to this peculiar phenotype as observed in the first knockdown studies the gene was named “bruchpilot” (brp) encoding the protein “Bruchpilot (BRP)” (German for crash pilot). A pan-neuronal as well as retina specific downregulation of this protein results in loss of ON and OFF transients in ERG recordings indicating dysfunctional synapses. Retina specific downregulation also shows severely impaired optomotor behaviour. Finally, at an ultrastructural level BRP downregulation seems to impair the formation of the characteristic T-shaped synaptic ribbons at the active zones without significantly altering the overall synaptic architecture (in collaboration with E.Asan). Vertebrate active zone protein Bassoon is known to be involved in attaching the synaptic ribbons to the active zones as an adapter between active zone proteins RIBEYE and ERC/CAST. A mutation in Bassoon results in a floating synaptic ribbon phenotype. No protein homologous to Bassoon has been observed in Drosophila. BRP downregulation also results in absence of attached synaptic ribbons at the active zones. This invites the speculation of an adapter like function for BRP in Drosophila. However, while Bassoon mutant mice are viable, BRP deficit in addition to the structural phenotype also results in severe behavioural and physiological anomalies and even stronger downregulation causes embryonic lethality. This therefore suggests an additional and even more important role for BRP in development and normal functioning of synapses in Drosophila and also in other insects. However, how BRP regulates synaptic transmission and which other proteins are involved in this BRP dependant pathway remains to be investigated. Such studies certainly will attract prominent attention in the future. N2 - Die chemische Signalübertragung an Synapsen ist ein komplexer Prozess mit zentraler Bedeutung für die Funktion von Nervensystemen. Man nimmt an, dass er auf einem Zusammenspiel hunderter verschiedener Proteine beruht. Diverse Synopsenproteine haben sich für die Neurotransmission als relevant erwiesen und viele davon sind in der Evolution hoch konserviert, was einen universalen Mechanismus der Neurotransmission wahrscheinlich macht. Dieser Prozess ist in zahlreiche aufeinander folgende Schritte unterteilt, wie die Neurotransmitteraufnahme in Vesikel, den Transport von Vesikeln in die Nنhe von Calciumkanنlen, die Ausbildung einer Fusionspore zur Transmitterausschüttung und schlieكlich die Wiederaufnahme von Vesikeln durch Endozytose. Jeder dieser Teilschritte wird momentan gezielt erforscht und spielt für sich genommen eine zentrale Rolle für das Verstنndnis des gesamten Prozesses. Die Calcium-induzierte Transmitterausschüttung findet an spezialisierten Membranstrukturen der Synapsen statt, den aktiven Zonen. Diese sind hoch organisierte, elektronendichte Gitterstrukturen und bestehen aus verschiedenen Proteinen, die den synaptischen Vesikeln bei der Verlagerung in die Nنhe von Calciumkanنlen behilflich sind. Alle Proteinmodule, die für diese Prozesse nِtig sind, scheinen eng aneinandergereiht an den aktiven Zonen vorzuliegen. Nur von wenigen konnte bisher bei Vertebraten die Funktion an der aktiven Zone charakterisiert werden. Ein Fokus der Arbeitsgruppe, an der diese Doktorarbeit durchgeführt wurde, besteht in der Charakterisierung des molekularen Aufbaus der Synapse von Drosophila. Die Taufliege ist aufgrund eines reichen Angebots hِchsteffektiver genetischer Methoden und vielfنltiger Verhaltensparadigmen ein exzellentes Modellsystem, um die neuronale Signalübertragung zu untersuchen. Monoklonale Antikِrper (MAKs) aus einer Hybridomabank gegen das Drosophila Gehirn werden standardmنكig verwendet, um neue Gehirnproteine mittels der „reverse genetics“- Methode zu identifizieren. Dazu wird der entsprechende genetische Lokus charakterisiert und eine detaillierte Untersuchung der Proteinfunktion initiiert. Diese Vorgehensweise war besonders hilfreich bei der Identifizierung von Synapsenproteinen, die bei der „forward genetics“-Methode aufgrund des Fehlens eines beobachtbaren Phنnotyps übersehen würden. Proteine wie CSP, Synapsin und Sap47 wurden so gefunden und charakterisiert. I MAK nc82 stammt aus dieser Hybridomabank und wird in vielen Labors als allgemeiner Neuropilmarker aufgrund seiner hervorragenden Fنrbungseigenschaften in Gehirnprنparaten verwendet. Doppelfنrbungen der larvalen neuromuskulنren Synapse mit dem Antikِrper nc82 in Kombination mit anderen prن- und postsynaptischen Markern deuteten stark auf eine Lokalisierung des Antigens an der aktiven Zone hin. Die Synapsenarchitektur von Drosophila ist auf der ultrastrukturellen Ebene gut verstanden. Jedoch sind die molekularen Details vieler Synapsenkomponenten, besonders die der aktiven Zone, nicht bekannt. Die vermutete Lokalisierung des nc82 Antigens an der aktiven Zone war daher der Ansatzpunkt, eine biochemische Charakterisierung zu initiieren und das entsprechende Gen zu identifizieren. In der vorliegenden Arbeit wird durch 2-D Gelelektrophorese und Massenspektrometrie gezeigt, das das nc82 Antigen ein neues Protein der aktiven Zone ist, welches von einem komplexen Genlokus auf Chromosom 2R kodiert wird. Durch RT-PCR wurde gezeigt, dass die Exons von drei offenen Leserastern, die bisher als getrennte Gene annotiert wurden, ein Transkript von mindestens 5,5 kb Lنnge kodieren. Northern Blots ergaben ein deutliches Signal bei 11 kb und ein schwنcheres bei 2 kb. Das von dem 5,5 kb Transkript resultierende Protein ist hoch konserviert in der Gruppe der Insekten und weist an seiner N-terminalen Domنne eine signifikante Homologie zu den bisher beschriebenen Vertebratenproteinen der aktiven Zone ELKS/ERC/CAST auf. Bioinformatische Analysen sagen „coiled-coil“ Domنnen vorher, die über die gesamte Sequenz verteilt sind. Dies deutet stark auf eine Funktion bei der Organisation oder der Aufrechterhaltung der prنsynaptischen Struktur hin. Die groكe C-terminale Region ist zwar bei Insekten hoch konserviert, zeigt aber keine eindeutige Homologie zu Proteinen von Vertebraten. Für die Funktionsanalyse dieses Proteins wurden transgene Fliegen, die UAS-RNAi Konstrukte in ihrem Genom tragen und durch entsprechende GAL4-Linien getrieben werden kِnnen, freundlicherweise von der kollaborierenden Arbeitsgruppe von S. Sigrist (Gِttingen) zur Verfügung gestellt. Der pan-neuronale „knock-down“ des nc82 Antigens durch transgene RNAi-Expression führt zu embryonaler Letalitنt. Eine schwنchere RNAi-Expression führt bei adulten Fliegen zu Verhaltensdefekten, wie instabilem Flug und beeintrنchtigtem Laufverhalten. Aufgrund dieser Phنnotypen, die in den ersten „knock-down“ Studien beobachtet wurden, wurde das Gen „bruchpilot“ (brp) und das zugehِrige Protein „Bruchpilot“ (BRP) genannt. Die pan-neuronale, sowie die retinaspezifische Reduktion des Proteins führt zu einem Verlust der ON und OFF Transienten des Elektroretinogramms, was auf nichtfunktionelle Synapsen hindeutet. Die retinaspezifische Reduktion des Proteins hat eine Beeintrنchtigung der optomotorischen Reaktion zur Folge. Auكerdem scheint auf der ultrastrukturellen Ebene die Bildung der charakteristischen T-fِrmigen „ribbons“ der aktiven Zonen beeintrنchtigt zu sein, jedoch ohne signifikante Verنnderungen der Gesamtarchitektur der Synapse (in Kollaboration mit E. Asan). Von Basson, einem Protein der aktiven Zone bei Vertebraten, ist bekannt, dass es an der Anheftung der synaptischen „ribbons“ an den aktiven Zonen beteiligt ist. Es fungiert als Adapter zwischen RIBEYE und ELKS/ERC/CAST, zwei weiteren Proteinen der aktiven Zone. Die Mutation von Bassoon hat zur Folge, dass die synaptischen „ribbons“ frei im Zytoplasma treiben. Für Bassoon ist kein homologes Drosophila-Protein bekannt. Die Reduktion von BRP bedingt ebenfalls ein Fehlen befestigter „ribbons“ an der aktiven Zone. Dies kِnnte auf eine Art Adapterfunktion von BRP hindeuten. Jedoch hat das Fehlen von BRP zusنtzlich zum strukturellen Phنnotyp auch deutliche Verhaltensabnormalitنten und starke physiologische Beeintrنchtigungen zur Folge. Eine noch stنrkere Reduktion bedingt auكerdem embryonale Lethalitنt, wohingegen Mausmutanten ohne Bassoon lebensfنhig sind. Daraus ergibt sich, dass BRP eine weitere, wichtige Rolle wنhrend der Entwicklung und für die Funktion von Synapsen bei Drosophila und mِglicherweise auch bei anderen Insekten einnimmt. Es muss aber noch geklنrt werden, auf welche Weise BRP die synaptische Signalübertragung reguliert und welche anderen Proteine in diesem BRP-abhنngigen Pfad involviert sind. Derartige Studien werden mit Sicherheit in der Zukunft eine bedeutende Rolle spielen. KW - Taufliege KW - Synapse KW - Proteine KW - Molekulargenetik KW - Bruchpilot KW - Drosophila-Synapse KW - Bruchpilot KW - Drosophila synapse Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14989 ER - TY - THES A1 - Beer, Katharina T1 - A Comparison of the circadian clock of highly social bees (\(Apis\) \(mellifera\)) and solitary bees (\(Osmia\) \(spec.\)): Circadian clock development, behavioral rhythms and neuroanatomical characterization of two central clock components (PER and PDF) T1 - Ein Vergleich der Inneren Uhr von sozialen Bienen (\(Apis\) \(mellifera\)) und solitären Bienen (\(Osmia\) \(spec.\)): Entwicklung der circadianen Uhr, Verhaltensrhythmen und neuroanatomische Beschreibung von zwei zentralen Uhr Komponenten (PER und PDF) N2 - Summary Bees, like many other organisms, evolved an endogenous circadian clock, which enables them to foresee daily environmental changes and exactly time foraging flights to periods of floral resource availability. The social lifestyle of a honey bee colony has been shown to influence circadian behavior in nurse bees, which do not exhibit rhythmic behavior when they are nursing. On the other hand, forager bees display strong circadian rhythms. Solitary bees, like the mason bee, do not nurse their offspring and do not live in hive communities, but face the same daily environmental changes as honey bees. Besides their lifestyle mason and honey bees differ in their development and life history, because mason bees overwinter after eclosion as adults in their cocoons until they emerge in spring. Honey bees do not undergo diapause and have a relatively short development of a few weeks until they emerge. In my thesis, I present a comparison of the circadian clock of social honey bees (Apis mellifera) and solitary mason bees (Osmia bicornis and Osmia cornuta) on the neuroanatomical level and behavioral output level. I firstly characterized in detail the localization of the circadian clock in the bee brain via the expression pattern of two clock components, namely the clock protein PERIOD (PER) and the neuropeptide Pigment Dispersing Factor (PDF), in the brain of honey bee and mason bee. PER is localized in lateral neuron clusters (which we called lateral neurons 1 and 2: LN1 and LN2) and dorsal neuron clusters (we called dorsal lateral neurons and dorsal neurons: DLN, DN), many glia cells and photoreceptor cells. This expression pattern is similar to the one in other insect species and indicates a common ground plan of clock cells among insects. In the LN2 neuron cluster with cell bodies located in the lateral brain, PER is co-expressed with PDF. These cells build a complex arborization network throughout the brain and provide the perfect structure to convey time information to brain centers, where complex behavior, e.g. sun-compass orientation and time memory, is controlled. The PDF arborizations centralize in a dense network (we named it anterio-lobular PDF hub: ALO) which is located in front of the lobula. In other insects, this fiber center is associated with the medulla (accessory medulla: AME). Few PDF cells build the ALO already in very early larval development and the cell number and complexity of the network grows throughout honey bee development. Thereby, dorsal regions are innervated first by PDF fibers and, in late larval development, the fibers grow laterally to the optic lobe and central brain. The overall expression pattern of PER and PDF are similar in adult social and solitary bees, but I found a few differences in the PDF network density in the posterior protocerebrum and the lamina, which may be associated with evolution of sociality in bees. Secondly, I monitored activity rhythms, for which I developed and established a device to monitor locomotor activity rhythms of individual honey bees with contact to a mini colony in the laboratory. This revealed new aspects of social synchronization and survival of young bees with indirect social contact to the mini colony (no trophalaxis was possible). For mason bees, I established a method to monitor emergence and locomotor activity rhythms and I could show that circadian emergence rhythms are entrainable by daily temperature cycles. Furthermore, I present the first locomotor activity rhythms of solitary bees, which show strong circadian rhythms in their behavior right after emergence. Honey bees needed several days to develop circadian locomotor rhythms in my experiments. I hypothesized that honey bees do not emerge with a fully matured circadian system in the hive, while solitary bees, without the protection of a colony, would need a fully matured circadian clock right away after emergence. Several indices in published work and preliminary studies support my hypothesis and future studies on PDF expression in different developmental stages in solitary bees may provide hard evidence. N2 - Zusammenfassung Bienen, sowie viele andere Organismen, evolvierten eine innere circadiane Uhr, die es ihnen ermöglicht, tägliche Umweltveränderungen voraus zu sehen und ihre Foragierflüge zu Tageszeiten durchzuführen, wenn sie möglichst viele Blüten besuchen können. Es zeigte sich, dass der soziale Lebensstil der Honigbiene Einfluss auf das rhythmische Verhalten der Ammenbienen hat, die während der Brutpflege keinen täglichen Rhythmus im Verhalten aufweisen. Sammlerbienen auf der anderen Seite zeigen ein stark rhythmisches Verhalten. Solitäre Bienen, wie die Mauerbiene, betreiben keine Brutpflege und leben nicht in einer Staatengemeinschaft, aber sind den gleichen Umweltveränderungen ausgesetzt. Nicht nur Lebensstil, sondern auch Entwicklung und Lebenszyklus unterscheiden sich zwischen Honig- und Mauerbienen. Mauerbienen überwintern als adulte Insekten in einem Kokon bis sie im Frühjahr schlüpfen. Honigbienen durchleben keine Diapause und schlüpfen nach wenigen Wochen der Entwicklung im Bienenstock. In meiner Dissertation vergleiche ich die circadiane Uhr von sozialen Honigbienen (Apis mellifera) und solitären Mauerbienen (Osmia bicornis und Osmia cornuta) auf Ebene der Neuroanatomie und das durch die innere Uhr verursachte rhythmische Verhalten. Erstens charakterisierte ich detailliert die Lage der circadianen Uhr im Gehirn von Honig- und Mauerbiene anhand des Expressionsmusters von zwei Uhrkomponenten. Diese sind das Uhrprotein PERIOD (PER) und das Neuropeptid Pigment Dispersing Factor (PDF). PER wird exprimiert in lateralen Neuronen-Gruppen (die wir laterale Neurone 1 und 2 nannten: LN1 und LN2) und dorsalen Neuronen-Gruppen (benannt dorsal laterale Neurone und dorsale Neurone: DLN und DN), sowie in vielen Gliazellen und Fotorezeptorzellen. Dieses Expressionsmuster liegt ähnlich in anderen Insektengruppen vor und deutet auf einen Grundbauplan der Inneren Uhr im Gehirn von Insekten hin. In der LN2 Neuronen-Gruppe, deren Zellkörper im lateralen Gehirn liegen, sind PER und PDF in den gleichen Zellen co-lokalisiert. Diese Zellen bilden ein komplexes Netzwerk aus Verzweigungen durch das gesamte Gehirn und liefern damit die perfekte Infrastruktur, um Zeitinformation an Gehirnregionen weiterzuleiten, die komplexe Verhaltensweisen, wie Sonnenkompass-Orientierung und Zeitgedächtnis, steuern. Alle PDF Neuriten laufen in einer anterior zur Lobula liegenden Region zusammen (sie wurde ALO, anterio-lobular PDF Knotenpunkt, genannt). Dieser Knotenpunkt ist in anderen Insekten mit der Medulla assoziiert und wird akzessorische Medulla (AME) genannt. Wenige PDF Zellen bilden bereits im frühen Larvalstadium diesen ALO und die Zellzahl sowie die Komplexität des Netzwerks wächst die gesamte Entwicklung der Honigbiene hindurch. Dabei werden zuerst die dorsalen Gehirnregionen von PDF Neuronen innerviert und in der späteren Larvalentwicklung wachsen die Neurite lateral in Richtung der optischen Loben und des Zentralgehirns. Das generelle Expressionsmuster von PER und PDF in adulten sozialen und solitären Bienen ähnelt sich stark, aber ich identifizierte kleine Unterschiede in der PDF Netzwerkdichte im posterioren Protocerebrum und in der Lamina. Diese könnten mit der Evolution von sozialen Bienen assoziiert sein. Zweitens entwickelte und etablierte ich eine Methode, Lokomotionsrhythmen von individuellen Bienen im Labor aufzunehmen, die in Kontakt mit einem Miniaturvolk standen. Diese Methode enthüllte neue Aspekte der sozialen Synchronisation unter Honigbienen und des Überlebens von jungen Bienen, die indirekten sozialen Kontakt zu dem Miniaturvolk hatten (Trophalaxis war nicht möglich). Für Mauerbienen etablierte ich eine Methode Schlupf- und lokomotorische Aktivitätsrhythmik aufzuzeichnen und konnte damit zeigen, dass tägliche Rhythmen im Schlupf durch Synchronisation der circadianen Uhr in Mauerbienen durch Tagestemperatur-Zyklen erzielt werden kann. Des Weiteren präsentiere ich die ersten lokomotorischen Aktivitätsrhythmen von solitären Bienen, die sofort nach ihrem Schlupf einen starken circadianen Rhythmus im Verhalten aufwiesen. Honigbienen brauchten in meinen Experimenten mehrere Tage, um circadiane Rhythmen in Lokomotion zu entwickeln. Ich erstellte die Hypothese, dass Honigbienen zum Zeitpunkt des Schlupfes im Bienenvolk ein noch nicht vollständig ausgereiftes circadianes System besitzen, während solitäre Bienen, die ohne den Schutz eines Volkes sind, direkt nach dem Schlupf eine vollständig ausgereifte Uhr brauchen. Mehrere Hinweise in Publikationen und Vorversuchen unterstützen meine Hypothese. Zukünftige Studien der Entwicklung des PDF Neuronen-Netzwerkes in solitären Bienen unterschiedlicher Entwicklungsstufen könnten dies nachweisen. KW - Chronobiologie KW - circadian rhythms KW - honeybee KW - Mauerbiene KW - Neuroanatomie Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-159765 ER - TY - THES A1 - Hackl, Thomas T1 - A draft genome for the Venus flytrap, Dionaea muscipula : Evaluation of assembly strategies for a complex Genome – Development of novel approaches and bioinformatics solutions T1 - Ein Genom für die Venus Fliegenfalle, Dionaea muscipula N2 - The Venus flytrap, \textit{Dionaea muscipula}, with its carnivorous life-style and its highly specialized snap-traps has fascinated biologist since the days of Charles Darwin. The goal of the \textit{D. muscipula} genome project is to gain comprehensive insights into the genomic landscape of this remarkable plant. The genome of the diploid Venus flytrap with an estimated size between 2.6 Gbp to 3.0 Gbp is comparatively large and comprises more than 70 % of repetitive regions. Sequencing and assembly of genomes of this scale are even with state-of-the-art technology and software challenging. Initial sequencing and assembly of the genome was performed by the BGI (Beijing Genomics Institute) in 2011 resulting in a 3.7 Gbp draft assembly. I started my work with thorough assessment of the delivered assembly and data. My analysis showed that the BGI assembly is highly fragmented and at the same time artificially inflated due to overassembly of repetitive sequences. Furthermore, it only comprises about on third of the expected genes in full-length, rendering it inadequate for downstream analysis. In the following I sought to optimize the sequencing and assembly strategy to obtain an assembly of higher completeness and contiguity by improving data quality and assembly procedure and by developing tailored bioinformatics tools. Issues with technical biases and high levels of heterogeneity in the original data set were solved by sequencing additional short read libraries from high quality non-polymorphic DNA samples. To address contiguity and heterozygosity I examined numerous alternative assembly software packages and strategies and eventually identified ALLPATHS-LG as the most suited program for assembling the data at hand. Moreover, by utilizing digital normalization to reduce repetitive reads, I was able to substantially reduce computational demands while at the same time significantly increasing contiguity of the assembly. To improve repeat resolution and scaffolding, I started to explore the novel PacBio long read sequencing technology. Raw PacBio reads exhibit high error rates of 15 % impeding their use for assembly. To overcome this issue, I developed the PacBio hybrid correction pipeline proovread (Hackl et al., 2014). proovread uses high coverage Illumina read data in an iterative mapping-based consensus procedure to identify and remove errors present in raw PacBio reads. In terms of sensitivity and accuracy, proovread outperforms existing software. In contrast to other correction programs, which are incapable of handling data sets of the size of D. muscipula project, proovread’s flexible design allows for the efficient distribution of work load on high-performance computing clusters, thus enabling the correction of the Venus flytrap PacBio data set. Next to the assembly process itself, also the assessment of the large de novo draft assemblies, particularly with respect to coverage by available sequencing data, is difficult. While typical evaluation procedures rely on computationally extensive mapping approaches, I developed and implemented a set of tools that utilize k-mer coverage and derived values to efficiently compute coverage landscapes of large-scale assemblies and in addition allow for automated visualization of the of the obtained information in comprehensive plots. Using the developed tools to analyze preliminary assemblies and by combining my findings regarding optimizations of the assembly process, I was ultimately able to generate a high quality draft assembly for D. muscipula. I further refined the assembly by removal of redundant contigs resulting from separate assembly of heterozygous regions and additional scaffolding and gapclosing using corrected PacBio data. The final draft assembly comprises 86 × 10 3 scaffolds and has a total size of 1.45 Gbp. The difference to the estimated genomes size is well explained by collapsed repeats. At the same time, the assembly exhibits high fractions full-length gene models, corroborating the interpretation that the obtained draft assembly provides a complete and comprehensive reference for further exploration of the fascinating biology of the Venus flytrap. N2 - Die Venus Fliegenfalle, D. muscipula fasziniert aufgrund ihres karnivoren Lebensstil und ihrer hochspezialisierten Fallen Biologen schon seit der Zeit von Charles Darwins. Das Ziel des D. muscipula Genomprojekts ist es, neue Einblicke in den genomischen Grundlagen dieser besonderen Pflanze zu gewinnen. Die diploide Venus Fliegenfalle verfügt mit eine geschätzten Größe von 2.6 bp bis 3Gbp über ein vergleichsweise großes Genom, das zudem zu über 70% aus repetitiven Regionen besteht. Sequenzierung und Assembly von Genomen dieser Größenordnung stellen selbst mit neusten technischen und informatischen Methoden eine große Herausforderung dar. Zum ersten mal sequenziert und assembliert wurde das Genom 2011 durch das BGI (Beijing Genomics Institute). Meine Arbeit am Genom der Fliegenfalle begann mit der Analyse des 3.7Gbp großen Assemblies, welches wir vom BGI erhalten haben. Mit meinen Untersuchungen könnte ich zeigen, dass das Assembly stark fragmentiert und gleichzeitig durch überrepräsentierte repetitive Sequenzen stark aufgebläht ist. Darüberhinaus beinhaltet es gerade ein mal eine drittel der erwarteten Gene in Volllänge, wodurch es für die weiter Analyse ungeeignet ist. In meiner weiteren Arbeit habe ich mich daher darauf konzentriert, unsere Sequenzierungsund Assemblierungsstrategie zu verfeinern um ein stärker zusammenhängendes und vollständigeres Assembly zu erhalten. Dafür war es notwendig die Qualität der Sequenzierdaten so wie den Assemblierungsprozess selbst zu optimieren, und Programme zu entwickeln, die eine Verbesserung der Daten und eine Analyse der Zwischenergebnisse ermöglichen. So wurden etwa zur neue Bibliotheken von nicht-polymorphen DNA-Proben sequenziert um die Heterogenität im Datensatz zu verringern. Um die Kontinuität der Assemblies zu verbessern und Probleme mit der Heterozygosität der Daten zu lösen habe ich eine Reihe verschiedener Assemblierungsprogramme getestet. Dabei zeigte sich, dass das Programm ALLPATHS-LG am besten geeignet ist für die Assemblierung von D. muscipula Daten. Durch den Einsatz von digitaler Normalisierung konnte ich den Bedarf an Computerressourcen für einzelne Assemblierungen deutlich reduzieren und gleichzeitig die Kontinuität der Assemblies deutlich erhöhen. Zur besseren Auflösung repetitiver Strukturen im Genom, habe ich auf eine neu entwickelte Sequenziertechnologie von PacBio zurückgegriffen, die deutlich länger Sequenzen erzeugt. Um die neuen Daten trotz ihrer hohen Fehlerrate von 15% für Assemblierungen nutzen zu können, entwickelte ich das Korrekturprogramm proovread (Hackl et al., 2014). proovread nutzt kurze Illumina Sequenzen mit hoher Sequenziertiefe um innerhalb eines iterativen Prozess Fehler in PacBio Daten ausfindig zu machen und zu korrigieren. Das Programm erreicht dabei eine bessere Genauigkeit und eine höhere Sensitivität als vergleichbare Software. Darüber hinaus erlaubt sein flexibles Design auch Datensätze in der Größenordung des Fliegenfallengenoms effizient auf großen Rechenclustern zu bearbeiten. Neben dem Assemblierungsprozess an sich, stellt auch die Analyse von Assemblies großer Genome eine Herausforderung dar. Klassische Methoden basieren oft auf der rechenintensiven Berechnung von Alignments zwischen Sequenzierdaten und Assembly. Um vergleichbare Analysen deutlich schneller generieren zu können, habe ich Programme entwickelt die auf der Auswertung von k-mer Häufigkeiten beruhen, und die gewonnenen Ergebnisse in übersichtlichen Graphiken darstellen. Durch Kombination der so gewonnenen Einblicke und der verschiedenen Erkenntnisse bezüglich der Optimierung es Assemblierungsprozesses, war es mir am Ende möglich, ein Assembly von hoher Qualität für das Genom der Venus Fliegenfalle zu rekonstruieren. Dieses habe ich weiter verfeinert, unter anderem durch das Entfernen heterozygoter Sequenzen und durch das Flicken von Lücken mit Hilfe von PacBio Daten. Das so erstelle Assembly besteht aus 86 × 103 Sequenzen und hat eine Gesamtgröße von 1.45Gbp. Der Unterschied zur erwarteten Genomgröße lässt sich dabei gut durch kollabierte repetitive Regionen erklären. Gleichzeitig untermauert ein hoher Anteil an Volllängengenen im Assembly die Interpretation, dass das vorliegende Assembly eine vollständiges und umfassendes Abbild der D. muscipula Genom zeigt, und dass es sich damit als gute Grundlage für weitere Untersuchungen zur Biologie dieser faszinierenden Pflanze eignet. KW - Venusfliegenfalle KW - genome assembly KW - repeats KW - heterozygosity KW - pacbio correction KW - Genom Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133149 ER - TY - THES A1 - El-Masri, Harun T1 - A genetic analysis of somitogenesis in the Medaka (Oryzias latipes) T1 - Genetische Analyse der Somitogenese in Medaka (Oryzias latipes) N2 - Somites are repeated epithelial segments that are generated in a rhythmic manner from the presomitic mesoderm (PSM) in the embryonic tailbud. Later, they differentiate into skeletal muscle, cartilage and dermis. Somitogenesis is regulated by a complex interplay of different pathways. Notch/Delta signaling is one of the pathways well characterized in zebrafish through mutants affected in its different components. Previous work in mouse, chicken and zebrafish has shown that also additional components are required during somitogenesis, most importantly through an FGF and Retinoic acid (RA) gradient, as well as Wnt signaling. However, no zebrafish mutants with defects in these pathways showing specific somite malformations are described. This was explained by functional redundancies among related genes that have resulted from a whole genome duplication which occurred in a teleost fish ancestor 350 million years ago. As distinct duplicates exist in different teleost species, a large scale mutagenesis screen in the medaka (Oryzias latipes) has been performed successfully in Kyoto, Japan. I analyzed nine of the isolated medaka mutants that show variable aspects of somitic phenotypes. This includes a complete or partial loss of somite boundaries (e.g. bms and sne), somites with irregular sizes and shapes (e.g. krz and fsl) or partially fused and enlarged somites (e.g. dpk). Although some of these medaka mutants share characteristics with previously described zebrafish somite mutants, most of the mutants represent unique phenotypes, not obtained in the zebrafish screens. In-situ hybridization analyses with marker genes implicated in the segmentation clock (e.g. her7), establishment of anterior-posterior (A-P) polarity (e.g. mesp) and differentiation of somites (e.g. myf5, lfng) revealed that the medaka mutants can be separated into two classes. Class I shows defects in tailbud formation and PSM prepatterning, and lateron somite boundary formation was impaired in these mutants. A unique member of this class with a novel phenotype is the doppelkorn (dpk) mutant that has single fused or enlarged somites. This phenotype has not been reported till now in zebrafish somite mutants. In-situ analyses on dpk showed that stabilization of the cyclically expressed somitogenesis clock genes must be affected in this mutant. This is accompanied by a disrupted regulation of A-P polarity genes like mesp. This suggests that dpk is a mutant deficient in the wave front, which is necessary for the down-regulation of oscillating genes in the anterior PSM. Furthermore, as the initiation of oscillation of all three cyclic her genes was unaffected in dpk embryos, I could exclude that this mutant in affected in the Notch/Delta pathway. Another mutant that belongs to this class is the samidare (sam) mutant. Morphologically, sam mutants are similar to zebrafish after eight (aei). In both cases, the first 7-9 somites are formed properly, but after this somite formation ceases. Different to the situation in aei, sam mutant embryos presented an additional defect in the mid-hindbrain boundary (MHB) region. Similar MHB defects were described in the zebrafish fgf8 mutant acerebellar (ace). In ace zebrafish mutant, somites were only slightly defective, although FGF signaling has been shown to be important for somite formation in chicken, mouse and zebrafish. This was explained by functional redundancy between fgf8 and fgf24 ligands in the tailbud of zebrafish. Thus, it is interesting to suggest that the sam mutant, based on the parallel defects in somites and MHB, is a potential member of the FGF signaling pathway muatnts. It was shown that FGF plays a crucial role during MHB formation in medaka. In addition, I showed that fgf8 acts non-redundantly during tailbud formation and somitogenesis in medaka. Furthermore, I showed that FGF signaling regulates somite size also in medaka and that fgfr1 is the only FGF receptor expressed in the tailbud and somites. In class II medaka somite mutants, PSM prepatterning appears normal, whereas A-P polarity, boundary formation, epithelialization or the later differentiation of somites appears to be affected. Such mutants have not been isolated so far in zebrafish, mice or chicken. Therefore, medaka class II somite mutants seem to be a novel group of mutants that opens new perspectives to analyze A-P polarity regulation, determination and boundary formation in the presence of a normally functioning clock in the PSM. Identifying the encoding genes for all analyzed medaka somite mutants will contribute to the understanding of the molecular interactions of different signaling pathways involved during somitogenesis, and is expected to result in the identification of new components. N2 - Die Somitogenese stellt einen entscheidenden Prozess bei der Entwicklung von Wirbeltierembryonen dar. Somiten sind transiente Strukturen, die sich im Verlauf der Embryonalentwicklung zu Skelettmuskulatur, Dermis und Wirbelkörper differenzieren. Somiten entstehen in einem sich regelmäßig wiederholenden Zyklus aus Stammzellen des präsomitischen Mesoderms (PSM), einer Wachstumszone am caudalen Ende des Embryos. Ein wichtiger Bestandteil der Somitogenese ist ein molekularer Oszillator, das so genannte „Segmentierungs-Uhrwerk“. Die periodische Segmentierung des präsomitischen Mesoderms wird reguliert durch eine Reihe komplexer Interaktionen von unterschiedlichen Signale wegen. Der Notch/Delta Signalweg spielt dabei eine zentrale Bedeutung, da hierbei Komponenten entdeckt wurden, die während der Somitogenese zyklisch im PSM exprimiert werden. Außer dem Notch/Delta Signalweg spielen auch ein FGF und Retinolsäure Gradient, sowie Wnt Signale eine wichtige Rolle bei der Somitogenese. Trotz mehrerer Mutagenese Screens im Zebrafisch wurden bislang keine Mutanten im FGF oder Wnt Signalweg entdeckt, die einen spezifischen Somiten Defekt besitzen. Die wurde durch eine funktionelle Redundanz unterschiedlicher Gene erklärt, die durch eine Duplikation im Genom von Teleostieren vor 350 Millionen Jahren enstanden ist. Da unterschiedliche Duplikate in verschiedenen Fischspezies existieren, wurde in den letzten Jahren ein grosser Mutagenese Screen bei Medaka (Oryzias latipes) in Kyoto, Japan durchgeführt. In meiner Arbeit habe ich neue Somitogenese Mutanten aus dieser Screen isoliert und Phänotypisch charakterisiert. Die neun isolierten Mutanten zeigten unterschiedliche Somiten Phänotypen. Einige Mutanten hatten wenige oder gar keine Somitengrenzen (z.B bms oder sne), andere hatten unregelmäßige Somiten Formen (z.B. krz oder fsl) oder unterschiedlich große Somiten (z.B dpk). Manche dieser Medaka wiesen Änlichkeiten Mutanten zu im Zebrafisch beschriebenen Somiten Mutanten auf. Die Mehrzahl der Mutanten zeigten jedoch Phänotypen, die bis jetzt noch nicht in Zebrafisch Screens gefunden worden. In-Situ Analysen mit Hilfe unterschiedlicher, neu isolierter Somitenmarker, wie z.B. her7 einem Bestandteil des molekularen Oszillators, mesp einem anterior-posterioren Gen oder den Somitendifferenzierungsgenen lfng oder myf5 erlaubten, die Medaka Mutanten in zwei unterschiedliche Gruppen zuzuordnen. Gruppe I zeigt Defekte in der Bildung der Schwanzknospe und der Musterbildung im PSM. Ein besonderes Beispiel dieser Gruppe ist die Mutante doppelkorn (dpk), die einen bislang nicht beschriebenen Somitenphänotyp besitzt. In-situ Analysen von dpk zeigten, dass zyklische Gene im anterioren PSM dieser Mutante nicht stabilisiert werden und auch A-P Polaritätsgene fehlerhaft reguliert werden. Das deutet darauf hin, dass in der dpk Mutante ein Faktor der sogenannten „Wavefront“ betroffen sein könnte, der wichtig ist für die Regulation von oszillierenden Genen im anterioren PSM ist. Ich konnte zeigen, daß der wichtige Notch/Delta Signalweg in dieser Mutante nicht betroffen ist, weil alle unterschiedlichen zyklischen Gene, her1, her5 und her7, eine normale dynamische initiation ihrer Expression zeigten. Gruppe II Mutanten zeigen Defekte bei der Bildung der Somitengrenzen und Epithelialisierung der Somiten trotz normales, Musterbildung im PSM. Solche Mutanten wurden bislang weder in Zebrafisch, noch in Maus oder Hühnchen gefunden. Deshalb sollten nach der molekularen Identifiezierung der mutierten Gene neue Faktoren erhalten werden, die vor allem für die Regulation später Somitogenese-phasen wichtig sind. KW - Japankärpfling KW - Somit KW - Genanalyse KW - Somiten KW - Präsomitisches Mesoderm KW - Medaka KW - FGF Signalweg KW - Notch/Delta Signalweg KW - Somites KW - Presomitic meoderm KW - Medaka KW - FGF pathway KW - Notch/Delta pathway Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14515 ER - TY - THES A1 - Xu, Jiajia T1 - A high-complexity lentiviral shRNA screen identifies synthetic lethal interactions with deregulated N-Myc in neuroblastoma cells T1 - Ein hoch-Komplexität Genom-weit RNAi Screen für synthetisch letale Interaktion mit dereguliertem N-Myc in Neuroblastomzellen N2 - In contrast to c-Myc, a deregulated expression of the MYCN gene is restricted to human neuroendocrine tumours. In most cases, the excessive activity of N-Myc results from a MYCN amplification. In neuroblastoma, amplification of MYCN is a predictor of poor prognosis and resistance to therapy. The inability to target the N-Myc protein directly necessitates the search for alternative targets. This project aimed at identifying genes specifically required for growth and survival of cells that express high levels of N-Myc using high-throughput shRNA screening combined with next generation sequencing. The identification and analysis of these genes will shed light on functional interaction partners of N-Myc. We screened a shRNA library containing 18,327 shRNAs and identified 148 shRNAs, which were selectively depleted in the presence of active N-Myc. In addition, shRNAs targeting genes that are involved in p53 and ARF turnover and apoptosis were depleted in the cell population during the screen. These processes are known to affect N-Myc-mediated apoptosis. Consequently, these results biologically validated the screen. The 148 shRNAs that showed a significant synthetic lethal interaction with high levels of N-Myc expression were further analysed using the bioinformatics program DAVID. We found an enrichment of shRNAs that target genes involved in specific biological processes. For example, we validated synthetic lethal interactions for genes such as, THOC1, NUP153 and LARP7, which play an important role in the process of RNA polymerase II-mediated transcription elongation. We also validated genes that are involved in the neddylation pathway. In the screen we identified Cullin 3, which is a component of the BTB-CUL3-Rbx1 ubiquitin ligase that is involved in the turnover of Cyclin E. Depletion of cullin 3 and activation of N-Myc was found to synergistically increase Cyclin E expression to supraphysiological levels, inducing S-phase arrest and a strong DNA damage response. Together with results from a proteomics analysis of N-Myc associated proteins, our results lead us to the following hypothesis: In a neuroblastoma cell, the high levels of N-Myc result in a conflict between RNA polymerase II and the replication machinery during S-phase. The newly identified interaction partners of N- Myc are required to solve this conflict. Consequently, loss of the interaction leads to a massive DNA damage and the induction of apoptosis. In addition, inhibition or depletion of the essential components of the neddylation pathway also results in an unresolvable problem during S-phase. N2 - 6.2 Zusammenfassung Im Gegensatz zu c-Myc findet man eine Deregulation von N-Myc nur in einer begrenzten Anzahl maligner Tumore die neuroektodermalen Ursprungs sind. Die übermäßige Aktivität ist dabei fast immer durch eine genomische Amplifikation von N-Myc begründet. Im Neuroblastom korreliert eine MYCN-Amplifikation mit einer schlechten Prognose. Da es auf Grund einer fehlenden katalytischen Domäne nicht möglich ist N-Myc direkt zu inhibieren, ist die Suche nach alternativen Targets notwendig. Das Ziel dieser Arbeit war es neue Gene zu identifizieren, die notwendig für das Wachstum und Überleben von MYCN amplifizierten Zellen sind. Dies wurde durch eine Kombination von Hochdurchsatz-RNAi-Screens und Next-Generation-Sequenzierung erreicht. Durch das Screenen einer shRNA-Bibliothek, die insgesamt 18327 shRNAs beinhaltet, konnten 148 shRNAs identifiziert werden, die selektiv nachteilig für das Überleben N-Myc überexpremierender Zellen sind. Die statistische Auswertung der Ergebnisse des Screens zeigte zusätzlich eine Anreichung von shRNAs gegen Gene, die p53-und ARF-abhängig Apoptose vermitteln. Da es bekannt ist, dass diese Gene in der N-Myc-vermittelten Apoptose involviert sind, konnte dadurch der Screen validiert werden. Die weitere Auswertung mit dem bioinformatischen Programm DAVID ergab, dass unter den 148 als synthetisch letal identifizierten shRNAs solche angereichert waren, die gegen Gene spezifischer biologischer Prozesse gerichtet sind. Zum einen wurden Gene wie THOC1, NUP153 und LARP7 validiert, die eine Rolle im Prozeß der Elongation der RNA Polymerase II spielen. Zum anderen konnten Gene validiert werden die einen Beitrag bei der Neddylierung von Proteinen leisten. Durch die Depletion von Cullin 3, ein Bestandteil des BTB-CUL3-Rbx1 Ubiquitin-Ligase-Komplexes, der am Abbau von Cyclin E beteiligt ist, konnte gezeigt werden, dass zusammen mit der Aktivierung von N-Myc eine supraphysiologische Erhöhung von Cyclin E induziert wird. Dies führt zu einem S-Phase Arrest in der Zelle, der die DNA-Schadens-Signalkaskade auslöst. Zusammen mit den Ergebnissen einer Proteomanalyse, bei der neue N-Myc-assoziierte Proteine identifiziert wurden, konnte folgende Hypothese aufgestellt werden: In einer Neuroblastomzelle helfen diese neuen Interaktionspartner den durch die N-Myc Überexpression in der S-phase entstehenden Konflikt zwischen RNA-Polymerase II und Replikationsmaschinerie zu lösen. Der Verlust dieser Interaktion führt zu einer massiven Schädigung der DNA, worauf in der Zelle Apoptose ausgelöst wird. Des Weiteren führen auch die Inhibition oder Ausschaltung wesentlicher Komponenten des Neddylierungs-Signalwegs zu unlösbaren Problemen in der S-Phase des Zellzyklus. KW - Neuroblastom KW - synthetic lethality KW - apoptosis KW - cul3 ring ligase KW - replicative stress KW - N-Myc KW - Deregulierung KW - RNS-Interferenz KW - synthetische Letalität Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103157 ER - TY - THES A1 - Breitenbach, Tim T1 - A mathematical optimal control based approach to pharmacological modulation with regulatory networks and external stimuli T1 - Ein auf mathematischer Optimalkontrolle basierender Ansatz für pharmakologische Modulation mit regulatorischen Netzwerken und externen Stimuli N2 - In this work models for molecular networks consisting of ordinary differential equations are extended by terms that include the interaction of the corresponding molecular network with the environment that the molecular network is embedded in. These terms model the effects of the external stimuli on the molecular network. The usability of this extension is demonstrated with a model of a circadian clock that is extended with certain terms and reproduces data from several experiments at the same time. Once the model including external stimuli is set up, a framework is developed in order to calculate external stimuli that have a predefined desired effect on the molecular network. For this purpose the task of finding appropriate external stimuli is formulated as a mathematical optimal control problem for which in order to solve it a lot of mathematical methods are available. Several methods are discussed and worked out in order to calculate a solution for the corresponding optimal control problem. The application of the framework to find pharmacological intervention points or effective drug combinations is pointed out and discussed. Furthermore the framework is related to existing network analysis tools and their combination for network analysis in order to find dedicated external stimuli is discussed. The total framework is verified with biological examples by comparing the calculated results with data from literature. For this purpose platelet aggregation is investigated based on a corresponding gene regulatory network and associated receptors are detected. Furthermore a transition from one to another type of T-helper cell is analyzed in a tumor setting where missing agents are calculated to induce the corresponding switch in vitro. Next a gene regulatory network of a myocardiocyte is investigated where it is shown how the presented framework can be used to compare different treatment strategies with respect to their beneficial effects and side effects quantitatively. Moreover a constitutively activated signaling pathway, which thus causes maleficent effects, is modeled and intervention points with corresponding treatment strategies are determined that steer the gene regulatory network from a pathological expression pattern to physiological one again. N2 - In dieser Arbeit werden Modelle für molekulare Netzwerke bestehend aus gewöhnlichen Differentialgleichungen durch Terme erweitert, die die Wechselwirkung zwischen dem entsprechenden molekularen Netzwerk und der Umgebung berücksichtigen, in die das molekulare Netzwerk eingebettet ist. Diese Terme modellieren die Effekte von externen Stimuli auf das molekulare Netzwerk. Die Nutzbarkeit dieser Erweiterung wird mit einem Modell der circadianen Uhr demonstriert, das mit gewissen Termen erweitert wird und Daten von mehreren verschiedenen Experimenten zugleich reproduziert. Sobald das Modell einschließlich der externen Stimuli aufgestellt ist, wird eine Grundstruktur entwickelt um externe Stimuli zu berechnen, die einen gewünschten vordefinierte Effekt auf das molekulare Netzwerk haben. Zu diesem Zweck wird die Aufgabe, geeignete externe Stimuli zu finden, als ein mathematisches optimales Steuerungsproblem formuliert, für welches, um es zu lösen, viele mathematische Methoden zur Verfügung stehen. Verschiedene Methoden werden diskutiert und ausgearbeitet um eine Lösung für das entsprechende optimale Steuerungsproblem zu berechnen. Auf die Anwendung dieser Grundstruktur pharmakologische Interventionspunkte oder effektive Wirkstoffkombinationen zu finden, wird hingewiesen und diese diskutiert. Weiterhin wird diese Grundstruktur in Bezug zu existierenden Netzwerkanalysewerkzeugen gesetzt und ihre Kombination für die Netzwerkanalyse diskutiert um zweckbestimmte externe Stimuli zu finden. Die gesamte Grundstruktur wird mit biologischen Beispielen verifiziert, indem man die berechneten Ergebnisse mit Daten aus der Literatur vergleicht. Zu diesem Zweck wird die Blutplättchenaggregation untersucht basierend auf einem entsprechenden genregulatorischen Netzwerk und damit assoziierte Rezeptoren werden detektiert. Weiterhin wird ein Wechsel von einem T-Helfer Zelltyp in einen anderen in einer Tumorumgebung analysiert, wobei fehlende Agenzien berechnet werden um den entsprechenden Wechsel in vitro zu induzieren. Als nächstes wird ein genregulatorisches Netzwerk eines Myokardiozyten untersucht, wobei gezeigt wird wie die präsentierte Grundstruktur genutzt werden kann um verschiedene Behandlungsstrategien in Bezug auf ihre nutzbringenden Wirkungen und Nebenwirkungen quantitativ zu vergleichen. Darüber hinaus wird ein konstitutiv aktivierter Signalweg, der deshalb unerwünschte Effekte verursacht, modelliert und Interventionspunkte mit entsprechenden Behandlungsstrategien werden bestimmt, die das genregulatorische Netzwerk wieder von einem pathologischen Expressionsmuster zu einem physiologischen steuern. KW - Bioinformatik KW - systematic drug targeting KW - optimal drug combination KW - disease modelling KW - external stimuli KW - intervention point analyzing KW - Molekülsystem KW - Reiz Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174368 ER - TY - THES A1 - Rapp, Ulrike T1 - Achieving protective immunitity against intracellular bacterial pathogens : a study on the efficiency of Gp96 as a vaccine carrier T1 - Immunisierung gegen intrazelluläre Bakterien mit Hilfe von HSP-Fusionsproteinen N2 - Protective vaccination against intracellular pathogens using HSP fusion proteins in the listeria model. N2 - Impfschutz gegen intrazelluläre Pathogene durch Immunisierung mit HSP-Fusionsproteinen im listerien Modell. KW - Listeria monocytogenes KW - Immunisierung KW - Hitzeschock-Proteine KW - Hitzeschockproteine KW - Immunsierung KW - Intrazelluläre Pathogene KW - Heat Shock Proteins KW - Immunization KW - Intracellular Pathogens Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9096 ER - TY - THES A1 - Cseh, Richard T1 - Adsorption of phloretin to lipid layers T1 - Adsorption von Phloretin an Lipidschichten N2 - The mode of action of phloretin and its analogs on the permeability of natural membranes for neutral and charged molecules, such as urea, glucose and chloride has been characterized 25 years ago. In contrast to signal molecules with primary effects on transport systems of natural membranes, phloretin also affects model membranes, i.e., artificial membranes, which do not contain proteins. Since the dipole potential reducing effect of phloretin on mono- and bilayers has been found, it became clear that its primary effect must be a biophysical one: phloretin adsorbs to lipid layers and changes biophysical parameters of these layers. The aim of this work was the characterization of the interaction between the surface-active molecule phloretin and artificial lipid layers. We were able to describe structural and functional parameters of the model systems mono- and bilayer as functions of one or few variables. One of these parameters, the dipole potential, measured as a function of the aqueous phloretin concentration, allowed a critical examination of the Langmuir adsorption model that has been postulated for the interaction between phloretin and lipid layers. Surface pressure versus area per lipid molecule isotherms and surface (dipole) potential change versus area per lipid molecule isotherms, measured at lipid monolayers, allowed a structural description of the phloretin-lipid interaction: phloretin integrates into monolayers dependent on the surface pressure and the phase state of the lipid. Calorimetric measurements confirmed the integration of phloretin into membranes because of the strong decrease of the phase transition temperature, but they also showed that the cooperativity of phase transition is hardly affected, even at very high amounts of phloretin in the membrane. Obviously the interaction between phloretin and lipids is restricted to the head groups, an integration into the hydrocarbon layer is unlikely. 2H NMR measurements with spherical unilamellar vesicles of headgroup-deuterated lipid showed changed quadrupolar splittings indicating the interaction between phloretin and headgroups of the lipids. N2 - Die Wirkung von Phloretin und seinen Analogen auf die Permeabilität von natürlichen Membranen für bestimmte ungeladene und geladene Moleküle wie z.B. Harnstoff, Glukose und Chlorid ist bereits vor 25 Jahren beschrieben worden. Im Gegensatz zu Signalmolekülen mit Primärwirkungen auf Transportsysteme natürlicher Membranen wirkt Phloretin auch auf Modellmembranen, d.h., künstliche, reine Lipidmembranen, die keine Proteine enthalten. Nach der Entdeckung des dipolpotential-reduzierenden Effekts von Phloretin auf Monolayer und Bilayer war klar, daß dessen primäre Wirkung biophysikalischer Natur sein mußte: Phloretin adsorbiert an Lipidschichten und verändert biophysikalische Parameter dieser Schichten. Ziel dieser Arbeit war es, die Wechselwirkungen des oberflächenaktiven Moleküls Phloretin mit künstlichen Lipidschichten näher zu charakterisieren. Strukturelle und funktionelle Parameter der Modellsysteme Mono- und Bilayer konnten in Abhängigkeit einer oder weniger Variablen verfolgt und beschrieben werden. Einer dieser Parameter, das Dipolpotential, gemessen als Funktion der Phloretinkonzentration in der wässrigen Phase, erlaubte eine kritische Betrachtung des in der Literatur postulierten Langmuirschen Adsorptionsverhaltens von Phloretin. Oberflächendruck-molekulare Fläche Isothermen sowie Oberflächenpotential (Dipolpotential)-molekulare Fläche Isothermen, ermittelt an Lipidmonoschichten, erlaubten eine strukturelle Beschreibung der Phloretin-Lipid Wechselwirkung: Phloretin integriert in Monoschichten, wobei dieser Effekt stark abhängig ist vom Filmdruck und vom Phasenzustand des Lipids. Kalorimetrische Messungen bestätigten die Integration von Phloretin in Membranen durch eine starke Abnahme der Phasenübergangstemperatur, sie zeigten aber auch, daß die Kooperativität der Lipidmoleküle nur wenig beeinträchtigt wird, selbst bei sehr großen Mengen von Phloretin in der Membran. Die Wechselwirkung von Phloretin mit Lipiden ist offensichtlich beschränkt auf die Kopfgruppen, eine Integration in die hydrophobe Kohlenwasserstoffphase findet wahrscheinlich nicht statt. 2H NMR Messungen an sphärischen, unilamellaren Vesikeln aus kopfgruppen-deuteriertem Lipid zeigten unter dem Einfluß von Phloretin eine veränderte Quadrupol-Aufspaltung, was die Wechselwirkung von Phloretin mit den Kopfgruppen der Lipide belegt. KW - Phloretin KW - Lipide KW - Grenzflächenpotenzial KW - Phloretin KW - Oberflächendruck KW - Oberflächenpotential KW - Dipolpotential KW - Dipol-Dipol Wechselwirkung KW - Langmuir Adsorptionsisotherme KW - Phloretin KW - Surface pressure KW - Surface potential KW - Dipole potential KW - Dipole-dipole interaction KW - Langmuir adsorption isotherm Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1069 ER - TY - THES A1 - Franke, Christian T1 - Advancing Single-Molecule Localization Microscopy: Quantitative Analyses and Photometric Three-Dimensional Imaging T1 - Weiterentwicklung von Einzel-Molekül Lokalisations-Mikroskopie: Quantitative Analysen und photometrische drei-dimensionale Bildgebung N2 - Since its first experimental implementation in 2005, single-molecule localization microscopy (SMLM) emerged as a versatile and powerful imaging tool for biological structures with nanometer resolution. By now, SMLM has compiled an extensive track-record of novel insights in sub- and inter- cellular organization.\\ Moreover, since all SMLM techniques rely on the analysis of emission patterns from isolated fluorophores, they inherently allocate molecular information $per$ $definitionem$.\\ Consequently, SMLM transitioned from its origin as pure high-resolution imaging instrument towards quantitative microscopy, where the key information medium is no longer the highly resolved image itself, but the raw localization data set.\\ The work presented in this thesis is part of the ongoing effort to translate those $per$ $se$ molecular information gained by SMLM imaging to insights into the structural organization of the targeted protein or even beyond. Although largely consistent in their objectives, the general distinction between global or segmentation clustering approaches on one side and particle averaging or meta-analyses techniques on the other is usually made.\\ During the course of my thesis, I designed, implemented and employed numerous quantitative approaches with varying degrees of complexity and fields of application.\\ \\ In my first major project, I analyzed the localization distribution of the integral protein gp210 of the nuclear pore complex (NPC) with an iterative \textit{k}-means algorithm. Relating the distinct localization statistics of separated gp210 domains to isolated fluorescent signals led, among others, to the conclusion that the anchoring ring of the NPC consists of 8 homo-dimers of gp210.\\ This is of particular significance, both because it answered a decades long standing question about the nature of the gp210 ring and it showcased the possibility to gain structural information well beyond the resolution capabilities of SMLM by crafty quantification approaches.\\ \\ The second major project reported comprises an extensive study of the synaptonemal complex (SNC) and linked cohesin complexes. Here, I employed a multi-level meta-analysis of the localization sets of various SNC proteins to facilitate the compilation of a novel model of the molecular organization of the major SNC components with so far unmatched extend and detail with isotropic three-dimensional resolution.\\ In a second venture, the two murine cohesin components SMC3 and STAG3 connected to the SNC were analyzed. Applying an adapted algorithm, considering the disperse nature of cohesins, led to the realization that there is an apparent polarization of those cohesin complexes in the SNC, as well as a possible sub-structure of STAG3 beyond the resolution capabilities of SMLM.\\ \\ Other minor projects connected to localization quantification included the study of plasma membrane glycans regarding their overall localization distribution and particular homogeneity as well as the investigation of two flotillin proteins in the membrane of bacteria, forming clusters of distinct shapes and sizes.\\ \\ Finally, a novel approach to three-dimensional SMLM is presented, employing the precise quantification of single molecule emitter intensities. This method, named TRABI, relies on the principles of aperture photometry which were improved for SMLM.\\ With TRABI it was shown, that widely used Gaussian fitting based localization software underestimates photon counts significantly. This mismatch was utilized as a $z$-dependent parameter, enabling the conversion of 2D SMLM data to a virtual 3D space. Furthermore it was demonstrated, that TRABI can be combined beneficially with a multi-plane detection scheme, resulting in superior performance regarding axial localization precision and resolution.\\ Additionally, TRABI has been subsequently employed to photometrically characterize a novel dye for SMLM, revealing superior photo-physical properties at the single-molecule level.\\ Following the conclusion of this thesis, the TRABI method and its applications remains subject of diverse ongoing research. N2 - Seit ihrer ersten experimentellen Umsetzung in 2005 hat sich die Einzel-Molekül Lokalisations-Mikroskopie (\textit{engl.} single-molecule localization microscopy (SMLM)) als vielseitig einsetzbares Verfahren in der biologischen Bildgebung etabliert, vor allem aufgrund ihres hohen Auflösungsvermögens im Nanometer Bereich. Bis heute wurde eine Reihe neuer Erkenntnisse bezüglich der sub- und inter- zellulären Organisation durch den Einsatz der SMLM erlangt.\\ Aufgrund der Tatsache, dass alle SMLM Techniken auf dem Prinzip basieren, isolierte Fluorophore zu detektieren und zu analysieren, beinhalten SMLM Daten $per$ $definitionem$ molekulare Informationen.\\ Folgerichtig entwickelte sich das Feld der SMLM vom reinen Bildgebungsinstrument mit Nanometer-Auflösung hin zu quantitativer Mikroskopie, bei welcher der Fokus nicht länger vornehmlich auf dem hochaufgelöstem Bild, sondern vielmehr auf den Lokalisationsdaten liegt.\\ Die vorliegende Arbeit ist als Teil der anhaltenden Bestrebungen zu sehen, aus den $per$ $se$ molekularen Informationen der SMLM weiterführende Erkenntnisse über die strukturelle Organisation der markierten Proteine zu gewinnen. Obwohl mit der gleichen prinzipiellen Zielsetzung versehen, unterscheiden sich hierbei globale oder Segmentierungs- Clusteranalysen von Lokalisations-Meta-Analysen oder so genannten \textit{particle averaging} Ansätzen.\\ Während meiner Doktorarbeit habe ich verschiedene Quantifizierungs Ansätze entworfen, implementiert und angewendet, mit unterschiedlichen Graden an Komplexität und Breite des Anwendungsgebietes.\\ \\ In meinem ersten wesentlichem Projekt analysierte ich mit einem iterativen \textit{k}-means Algorithmus die Lokalisationsverteilung des integralen Proteins gp210, welches Teil des Kernporenkomplexes ist (\textit{engl.} nuclear pore complex (NPC)). Durch den Vergleich der charakteristischen Lokalisations-Statistik von separierten gp210 Domänen mit isolierten Fluoreszenzmarkern konnte unter anderem festgestellt werden, dass der Verankerungsring des NPC aus acht gp210 Homodimeren bestehen muss.\\ Diese Erkenntnis beantwortet zum einen eine jahrzehntealte Frage nach der Zusammensetzung des gp210 Rings und zum anderen liefert sie ein Beispiel dafür, dass durch eine geschickte Analyse der Lokalisationsstatistik strukturelle Informationen erlangt werden können, die jenseits des räumlichen Auflösungsvermögens von SMLM liegen.\\ \\ Das zweite hier vorgestellte wesentliche Projekt beinhaltet eine umfassende Studie des Synaptonemalen Komplexes (\textit{engl.} synaptonemal complex (SNC)) und damit verbundenen Cohesin Komplexen. Um die molekulare Organisation des SNC zu untersuchen, implementierte ich eine multi-level Meta-Analyse der Lokalisationsdaten mehrerer SNC Komponenten. Aus dessen Ergebnissen konnte ein neues drei dimensionales molekulares Modell des SNC erstellt werden.\\ Nachfolgend wurden die beiden murinen Cohesine SMC3 und STAG3 mit adaptierter Methodik untersucht. Hierbei musste die starke intrinsische Dispersion der Cohesin-Signale berücksichtigt werden. Die Analyse ergab deutliche Hinweise auf eine Polarisation der Cohesine innerhalb des SNC. Zudem zeigte sich eine mögliche Substruktur in der Organisation von STAG3, die unterhalb der Auflösungsgrenze von SMLM liegt.\\ \\ Weitere Nebenprojekte im Zusammenhang mit quantitativer Lokalisationsanalyse umfassten die Untersuchung der Lokalisationsverteilung von Plasma-Membran Glykanen, sowie zweier Flotillin Proteine in den Membranen von Bakterien, welche Cluster unterschiedlicher Form und Größe aufzeigten.\\ \\ Schließlich wird ein neuartiger Ansatz für dreidimensionale SMLM vorge-stellt, die auf der genauen Bestimmung von Einzel-Molekül Intensitäten basiert. Diese Methode, genannt TRABI, stützt sich auf die Prinzipien der Apertur Photometrie, welche für die SMLM angepasst und verbessert wurden.\\ Mit TRABI konnte gezeigt werden, dass weit verbreitete Lokalisations-Software, die auf $Gaussian-Fitting$ basiert, die Photonenzahl von Emittern oftmals stark unterschätzt. Diese Diskrepanz kann als $z$-abhängiger Parameter verwendet werden um z.B. einen 2D SMLM Datenatz in einen virtuellen 3D Raum zu überführen. Außerdem wird gezeigt, dass TRABI vorteilhaft mit einem multi-plane Detektionsschema kombiniert werden kann und dabei höhere axiale Lokalisationsgenauigkeiten und Auflösungen er-reicht.\\ Zudem wurde TRABI eingesetzt, um einen neuen Fluoreszenzfarbstoff für SMLM zu charakterisieren und dessen verbesserte photo-physikalische Eigenschaften auf Einzel-Molekül Basis zu demonstrieren.\\ Auch nach Abschluss dieser Arbeit ist die TRABI Methode und deren Anwendung weiterhin Gegenstand diverser Forschungen. KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - Quantitative Mikroskopie KW - dSTORM Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156355 ER - TY - THES A1 - Schardt, Simon T1 - Agent-based modeling of cell differentiation in mouse ICM organoids T1 - Agentenbasierte Modellierung von Maus ICM Organoiden N2 - Mammalian embryonic development is subject to complex biological relationships that need to be understood. However, before the whole structure of development can be put together, the individual building blocks must first be understood in more detail. One of these building blocks is the second cell fate decision and describes the differentiation of cells of the inner cell mass of the embryo into epiblast and primitive endoderm cells. These cells then spatially segregate and form the subsequent bases for the embryo and yolk sac, respectively. In organoids of the inner cell mass, these two types of progenitor cells are also observed to form, and to some extent to spatially separate. This work has been devoted to these phenomena over the past three years. Plenty of studies already provide some insights into the basic mechanics of this cell differentiation, such that the first signs of epiblast and primitive endoderm differentiation, are the expression levels of transcription factors NANOG and GATA6. Here, cells with low expression of GATA6 and high expression of NANOG adopt the epiblast fate. If the expressions are reversed, a primitive endoderm cell is formed. Regarding the spatial segregation of the two cell types, it is not yet clear what mechanism leads to this. A common hypothesis suggests the differential adhesion of cell as the cause for the spatial rearrangement of cells. In this thesis however, the possibility of a global cell-cell communication is investigated. The approach chosen to study these phenomena follows the motto "mathematics is biology's next microscope". Mathematical modeling is used to transform the central gene regulatory network at the heart of this work into a system of equations that allows us to describe the temporal evolution of NANOG and GATA6 under the influence of an external signal. Special attention is paid to the derivation of new models using methods of statistical mechanics, as well as the comparison with existing models. After a detailed stability analysis the advantages of the derived model become clear by the fact that an exact relationship of the model parameters and the formation of heterogeneous mixtures of two cell types was found. Thus, the model can be easily controlled and the proportions of the resulting cell types can be estimated in advance. This mathematical model is also combined with a mechanism for global cell-cell communication, as well as a model for the growth of an organoid. It is shown that the global cell-cell communication is able to unify the formation of checkerboard patterns as well as engulfing patterns based on differently propagating signals. In addition, the influence of cell division and thus organoid growth on pattern formation is studied in detail. It is shown that this is able to contribute to the formation of clusters and, as a consequence, to breathe some randomness into otherwise perfectly sorted patterns. N2 - Die embryonale Entwicklung von Säugetieren unterliegt komplexen biologischen Zusammenhängen, die es zu verstehen gilt. Bevor jedoch das gesamte Gebilde der Entwicklung zusammengesetzt werden kann, müssen zunächst die einzelnen Bausteine genauer verstanden werden. Einer dieser Bausteine ist die zweite Zellschicksalsentscheidung und beschreibt die Differenzierung von Zellen der inneren Zellmasse des Embryos hin zu Epiblast- und primitiven Endodermzellen. Diese Zellen teilen sich daraufhin räumlich auf und bilden die anschließend die Grundlagen für den Embryo und den Dottersack. In Organoiden der inneren Zellmasse wird ebenfalls beobachtet, wie sich diese zwei Typen von Vorläuferzellen bilden, und sich in gewissem Maße räumlich voneinander trennen. Diesem Phänomenen widmete sich diese Arbeit im Verlaufe der letzten drei Jahre. Über diese Zelldifferenzierung ist bereits bekannt, dass die ersten Anzeichen für Epiblast- und primitive Endodermdifferenzierung jeweils die Expressionslevel der Transkriptionsfaktoren NANOG und GATA6 sind. Dabei nehmen Zellen mit niedriger Expression an GATA6 und hoher Expression an NANOG das Epiblastschicksal an. Sind die Expressionen umgekehrt, so entsteht eine primitive Endodermzelle. Bei der räumlichen Aufteilung der beiden Zelltypen ist noch nicht eindeutig geklärt, welcher Mechanismus dazu führt. Eine gängige Hypothese besagt, dass die Ursache für die räumliche Umlagerung der Zellen in der unterschiedlichen Adhäsion der Zellen liegt. In dieser Arbeit wird jedoch die Möglichkeit einer globalen Zell-Zell-Kommunikation untersucht. Die gewählte Vorgehensweise bei der Untersuchung dieser Phänomene folgt dem Motto "Die Mathematik ist das nächste Mikroskop der Biologie". Mit Hilfe mathematischer Modellierung wird das zentrale genregulierende Netzwerk im Mittelpunkt dieser Arbeit in ein Gleichungssystem umgewandelt, welches es ermöglicht, die zeitliche Entwicklung von NANOG und GATA6 unter Einfluss eines externen Signals zu beschreiben. Ein besonderes Augenmerk liegt dabei auf der Herleitung neuer Modelle mit Hilfe von Methoden der statistischen Mechanik, sowie dem Vergleich mit bestehenden Modellen. Nach einer ausführlichen Stabilitätsanalyse werden die Vorteile des hergeleiteten Modells dadurch deutlich, dass ein exakter Zusammenhang der Modellparameter und der Formierung von heterogenen Mischungen zweier Zelltypen gefunden wurde. Dadurch lässt sich das Modell einfach kontrollieren und die Proportionen der resultierenden Zelltypen bereits im Voraus abschätzen. Dieses mathematische Modell wird außerdem kombiniert mit einem Mechanismus zur globalen Zell-Zell Kommunikation, sowie einem Modell zum Wachstum eines Organoiden. Dabei wird gezeigt dass die globale Zell-Zell Kommunikation dazu in der Lage ist die Bildung von Schachbrettmustern, sowie auch umrandenden Muster anhand unterschiedlich ausbreitender Signale zu vereinen. Zusätzlich wird der Einfluss der Zellteilung und somit des Organoidwachstums auf die Musterbildung genauestens untersucht. Es wird gezeigt, dass dies zur Bildung von Clustern beiträgt und infolgedessen eine gewisse Zufälligkeit in ansonsten perfekt sortierte Muster einbringt. KW - Mathematische Modellierung KW - Embryonalentwicklung KW - Organoid KW - Differentialgleichung KW - Agentenbasierte Modellierung KW - Transkriptionelle Regulierung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-301940 ER -