TY  - THES
A1  - Delto, Carolyn Francesca
T1  - Structural and Biochemical Characterization of the GABA(A) Receptor Interacting Protein Muskelin
T1  - Strukturelle und Biochemische Charakterisierung des GABA(A) Rezeptor interagierenden Proteins Muskelin
N2  - In a study from 2011, the protein muskelin was described as a central coordinator of the retrograde transport of GABA(A) receptors in neurons. As muskelin governs the transport along actin filaments as well as microtubules, it might be the first representative of a novel class of regulators, which coordinate cargo transport across the borders of these two independent systems of transport paths and their associated motorproteins. To establish a basis for understanding the mode of operation of muskelin, the aim of this thesis was an in-depth biochemical and structural characterization of muskelin and its interaction with the GABA(A) receptor.
One focus of the work was the analysis of the oligomerization of muskelin. As could be demonstrated, the oligomerization is based on two independent interactions mediated by different domains of the protein: a known interaction of the N-terminal discoidin domain with the C-terminal portion, termed head-to-tail interaction, and a dimerization of the LisH motif in muskelin that was so far neglected in the literature. For the detailed studies of both binding events, the solution of a crystal structure of a fragment of muskelin, comprising the Discoidin domain and the LisH motif, was an important basis. The fragment crystallized as a dimer, with dimerization being mediated solely by the LisH motif. Biochemical analysis corroborated that the LisH motif in muskelin serves as a dimerization element, and, moreover, showed that the C-terminal domain of the protein substantially stabilizes this dimerization. In addition, the crystal structure revealed the molecular composition of the surface of the head in the head-to-tail interaction, namely the discoidin domain. This information enabled to map the amino acids contributing to binding, which showed that the binding site of the head-to-tail interaction coincides with the generic ligand binding site of the discoidin domain.
As part of the analyses, residues that are critical for LisH-dimerization and the head-to-tail binding, respectively, were identified, whose mutation specifically interfered with each of the interactions separately. These mutations allowed to investigate the interplay of these interactions during oligomerization. It could be shown that recombinant muskelin assembles into a tetramer to which both interactions, the LisH-dimerization and the head-to-tail binding, contribute independently. When one of the two interactions was disturbed, only a dimer mediated via the respective other interaction could be formed; when both interactions were disturbed, the protein was present as monomer. Furthermore, Frank Heisler in the group of Matthias Kneussel was able to show the drastic impact of an impaired LisH-dimerization on muskelin in cells using these mutations. Disturbing the LisH-dimerization led to a complete redistribution of the originally cytoplasmic muskelin to the nucleus which was accompanied by a severe impairment of its function during GABA(A) receptor transport. Following up on these results in an analysis of muskelin variants, for which alterations of the subcellular localization had been published earlier, the crucial influence of LisH-dimerization to the subcellular localization and thereby the role of muskelin in the cell was confirmed.
The biochemical studies of the interaction of muskelin and the alpha1 subunit of the GABA(A) receptor demonstrated a direct binding with an affinity in the low micromolar range, which is mediated primarily by the kelch repeat domain in muskelin. For the binding site on the GABA(A) receptor, it was confirmed that the thirteen most C-terminal residues of the intracellular domain are critical for the binding of muskelin. In accordance with the strong conservation of these residues among the alpha subunits of the GABA(A) receptor, it could be shown that an interaction with muskelin in vitro is also possible for the alpha2 and alpha5 subunits. Based on the comparison of the binding sites between the homologous subunits, tentative conclusions can be drawn about the details of the binding, which may serve as a starting point for follow-up studies.
This thesis thereby makes valuable contributions to the understanding of muskelin, in particular the significance of its oligomerization. It furthermore provides an experimental framework for future studies that address related topics, such as the characterization of other muskelin interaction partners, or the questions raised in this work.
N2  - Das Protein Muskelin wurde in einer Studie aus dem Jahr 2011 als zentraler Koordinator des retrograden Transports von GABA(A)-Rezeptoren in Neuronen beschrieben. Da Muskelin den Transport des Rezeptors sowohl entlang von Aktinfilamenten als auch Mikrotubuli steuert, könnte es der erste bekannte Vertreter einer neuen Klasse von Regulatoren sein, die den Transport einer Fracht über die Grenzen dieser beiden unabhängigen Systeme von Transportwegen und der damit assoziierten Motorproteine hinweg koordinieren. Um Grundlagen für das Verständnis der Wirkungsweise von Muskelin zu schaffen, war das Ziel dieser Arbeit die biochemische und strukturelle Charakterisierung von Muskelin und seiner Interaktion mit dem GABA(A)-Rezeptor.
Ein Schwerpunkt der Arbeit lag dabei auf der Analyse der Oligomerisierung von Muskelin. Wie gezeigt werden konnte, beruht die Oligomerisierung auf zwei unabhängigen, von verschiedenen Domänen des Proteins vermittelten Bindungen: zum Einen auf einer bereits bekannten Wechselwirkung der N-terminalen Discoidin-Domäne und des C-terminalen Teils (anschaulich als Head-to-tail, englisch für Kopf-an-Schwanz, bezeichnet), zum Anderen auf einer in der Literatur bisher außer Acht gelassenen Dimerisierung des LisH-Motivs in Muskelin.
Für die detaillierten Studien beider Bindungen lieferte die Aufklärung der Kristallstruktur eines Teilstücks von Muskelin, das die Discoidin-Domäne und das LisH-Motiv umfasst, eine wichtige Grundlage. Das Teilstück kristallisierte als Dimer, wobei die Dimerisierung ausschließlich über das LisH-Motiv vermittelt wurde. Die biochemischen Analysen bestätigten, dass das LisH-Motiv in Muskelin als Dimerisierungselement wirkt, und zeigten darüber hinaus, dass die C-terminale Domäne des Proteins diese Dimerisierung wesentlich stabilisiert. Zudem offenbarte die Kristallstruktur den molekularen Aufbau der Oberfläche des Kopfes in der Head-to-tail-Bindung, der Discoidin-Domäne. Die Kartierung der zur Bindung beitragenden Aminosäuren belegte, dass die Bindungsstelle der Head-to-tail-Interaktion mit der generischen Ligandenbindungsstelle der Discoidin-Domäne zusammenfällt.
Als Teil der Analysen wurden zur LisH-Dimerisierung oder zur Head-to-tail-Bindung kritisch beitragende Aminosäurenseitenketten identifiziert, durch deren Mutationen
Ispezifisch jeweils eine der beiden Interaktionen unterbunden werden konnte. Diese Mutationen ermöglichten es, das Zusammenspiel der Bindungen in der Oligomerisierung zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass rekombinantes Muskelin ein Tetramer bildet, wozu beide Interaktionen, die LisH-Dimerisierung und die Head-to-tail-Bindung, unabhängig beitragen. Wurde jeweils eine der beiden Interaktionen durch Mutation gestört, konnte nur noch ein über die jeweils andere Interaktion vermitteltes Dimer gebildet werden, bei gleichzeitiger Störung beider Interaktionen lag das Protein als Monomer vor. Darüber hinaus konnte Frank Heisler in der Arbeitsgruppe von Matthias Kneussel mit Hilfe dieser Mutationen zeigen, dass eine Störung der LisH-Dimerisierung drastische Auswirkungen auf Muskelin in Zellen hat. Die Störung der LisH-Dimerisierung führte zu einer vollständigen Umverteilung des sonst im Zytoplasma lokalisierten Muskelins in den Kern, begleitet von einer starken Beeinträchtigung seiner Funktion im Transport des GABA(A)-Rezeptors. Auf diesen Ergebnissen aufbauend wurde durch Analysen der oligomeren Zustände von Muskelin-Varianten, für die in der Literatur eine veränderte Lokalisation beschrieben worden war, die entscheidende Bedeutung der LisH-Dimerisierung für die subzelluläre Verteilung und damit die Rolle von Muskelin in der Zelle bekräftigt.
Die biochemischen Studien der Interaktion von Muskelin und der alpha1-Untereinheit des GABA(A)-Rezeptors demonstrierten eine direkte Bindung mit mikromolarer Affinität, die in Muskelin vorwiegend durch die Kelch-repeat-Domäne vermittelt wird. Für die Bindungsstelle auf Seite des GABA(A)-Rezeptors wurde bestätigt, dass die dreizehn C-terminalen Reste der intrazellulären Domäne entscheidend sind. In Übereinstimmung mit der starken Konservierung dieser Reste in verschiedenen alpha-Untereinheiten des GABA(A)-Rezeptors, konnte gezeigt werden, dass in vitro eine Bindung von Muskelin auch an die intrazelluläre Domäne der alpha2- und alpha5-Untereinheit möglich ist. Anhand des Vergleichs der Bindungsstelle zwischen den homologen Untereinheiten lassen sich erste Rückschlüsse auf die Details der Interaktion ziehen, die als Anknüpfungspunkt für kommende Studien dienen können.
Diese Arbeit liefert damit wesentliche Beiträge zum Verständnis von Muskelin, insbesondere der Bedeutung seiner Oligomerisierung. Sie bietet zudem ein experimentelles Rahmenwerk für zukünftige Studien, die sich verwandten Themen, wie der Charakterisierung weiterer Interaktionen von Muskelin, oder den in dieser Arbeit aufgeworfenen Fragen widmen.
KW  - Oligomerisation
KW  - GABA-Rezeptor
KW  - Muskelin
KW  - Oligomerization
KW  - GABA(A) receptor
KW  - Interaction analysis
KW  - Strukturanalyse
KW  - Biochemie
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115922
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Argos, P.
A1  - Dandekar, Thomas
T1  - Delineating the main chain topology of four-helix bundle proteins using the genetic algorithm and knowledge based on the amino acid sequence alone
N2  - No abstract available
KW  - Proteine
KW  - Strukturanalyse
KW  - Abstandsmessung
Y1  - 1994
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33807
ER  - 
TY  - THES
A1  - Patiño Gonzalez, Edwin
T1  - Functional Studies and X-Ray Structure Analysis of Human Interleukin-5 Receptor Alpha and Human Interleukin-5 Complex
N2  - Interleukin-5 (IL-5) is a member of the hematopoietic class I cytokines and is specifically involved in eosinophil activation. IL-5 plays an important role in disease conditions such as allergic asthma and other hypereosinophilias, which are characterized by highly increased levels of eosinophils in peripheral blood and tissues. The IL-5 receptor is a heterodimer consisting of a binding alpha subunit (IL- 5Rα) and a common beta subunit (IL-5Rβ). This IL-5Rβ is shared with the IL-3 and GM-CSF receptors. The IL-5Rα is required for ligand-specific binding, whereas the association of the IL-5Rβ subunit triggers intracellular signal transduction. Previous studies have described the crystallographic structure of human IL-5 (hIL-5), as well as that of the common IL-5Rβ chain (IL-5Rβc) However, no experimental structural data are yet available for the interaction of the high-affinity IL-5 receptor IL-5Rα with its ligand IL-5. Therefore, this thesis had the principle objective to gain new insights into the basis of this important agonist-receptor interaction. In particular, data on the recombinant expression, purification and preparation of the binary complex of hIL-5 bound to the receptor ectodomain of hIL-5Rα are shown, as well as the subsequent crystal structure analysis of the binary ligand-receptor (hIL-5Rα/hIL-5) complex. Both proteins were expressed in an Escherichia coli expression system, purified to homogeneity, and crystallized. However, since the initial analysis of these crystals did not show any X-ray diffraction, each step of the preparation and crystallization procedure had to be stepwise optimized. Several improvements proved to be crucial for obtaining crystals suitable for structure analysis. A free cysteine residue in the N-terminal domain of the hIL-5Rα ectodomain protein was mutated to alanine to remove protein heterogeneity. In addition, hIL-5 affinity chromatography of the receptor protein proved to be absolutely crucial for crystal quality. Additive screening using the initial crystallization condition finally yielded crystals of the binary complex, which diffracted to 2.5Å resolution and were suitable for structure analysis. The preliminary structure data demonstrate a new receptor architecture for the IL-5Rα ligand-binding domain, which has no similarities to other cytokine class I receptor structures known so far. The complex structure demonstrates that the ligand-binding region of human IL-5Rα is dispersed over all three extracellular domains, and adopts a binding topology in which the cytokine recognition motif (CRM) needs the first Fn-III domain of the human IL-5Rα to bind the ligand. In a second project, a prokaryotic expression system for murine IL-5 (mIL-5) was established to allow the production of mIL-5 and mIL-5 antagonist that should facilitate functional studies in mice. Since the expression of mIL-5 in E. coli had never been successful so far, a fusion protein system was generated expressing high yields of mIL-5. Chemical cleavage with cyanogen bromide (CNBr) was used to release mIL-5 monomers, which were subsequently purified and refolded. This technique yielded an active murine IL-5 dimer as confirmed by TF-1 cell proliferation assays. The protein was crystallized and the structure of mIL-5 could be determined at 2.5Å resolution. The molecular structure revealed a symmetrical left-handed four helices bundle dimer similar to human IL-5. Analysis of the structure-/function relationship allowed us to design specific mIL-5 antagonist molecules, which are still under examination. Taken together, these findings provide further insights in the IL-5 and IL-5R interaction which may help to further understand and depict this and other cytokine-receptor interactions of similar architecture, e.g. the IL-13 ligand-receptor system. Ultimately, this may represent another piece of puzzle in the attempts to rationally design and engineer novel IL-5-related pharmacological therapeutics.
N2  - Interleukin-5 (IL-5) ist ein Mitglied der Gruppe der hematopoetischen Zytokine der Klasse I und spielt eine Schlüsselrolle bei der Aktivierung von eosinophilen Granulozyten. IL-5 hat damit ein wichtige pathophysiologische Funktion bei der Entstehung von Krankheiten wie allergischem Asthma und anderen Hypereosinophilien, die alle durch eine stark erhöhte Zahl von Eosinophilen in peripherem Blut und Geweben charakerisiert sind. Der IL-5 Rezeptor ist ein Heterodimer, der aus einer alpha-Untereinheit (IL-5Rα) und einer mit den IL-3 und GM-CSF Rezeptoren gemeinsamen beta-Untereinheit (IL-5Rβ) besteht. Der IL-5Rα ist für die spezifische Liganden-Bindung notwendig, während der mit der IL-5Rβ Untereinheit assozierte Komplex die intrazelluläre Signaltransduktion einleitet. In früheren Studien konnte bereits die Kristallstruktur des menschlichen IL-5 (hIL-5) und der gemeinsamen IL-5Rβ-Kette (IL-5Rβc) aufgeklärt werden. Allerdings liegen bisher noch keine experimentellen Strukturdaten für die Interaktionen des hochaffinen IL-5 Rezeptor IL-5Rα mit seinem Ligand IL-5 vor. Deshalb war es die Hauptzielsetzung dieser Arbeit, neue Einblicke in die molekulare Basis der Interaktion von IL-5 Rezeptor und Agonisten zu gewinnen. Im Einzelnen beschreibe ich in dieser Arbeit die rekombinante Expression, Aufreinigung und Herstellung des binären Komplexes von der hIL-5 Bindung an die extrazellulären Domäne des Rezeptors hIL-5Rα sowie die anschließende kristallographische Strukturanalyse dieses binären Ligand-Rezeptor-Komplexes (hIL-Rα/hIL-5). Beide Proteine wurden in einem Escherichia coli-Expressionssystem rekombinant hergestellt, bis zur Homogenität gereinigt und anschließend kristallisiert. Die Analysen dieser ersten Kristalle zeigten nicht die gewünschte Beugung der Röntgenstrahlung, weshalb in allen anschließenden Schritten eine schrittweise Optimierung der Produktions- und Kristallisationsbedingungen durchgeführt wurde. Als Ergebnis dieser Optimierungsstrategie konnten schließlich Kristalle erhalten werden, die für eine Strukturanalyse geeignet waren. Ein ungepaartes Cystein in der N-terminalen Domäne des extrazellulären hIL-5Rα-Protein wurde durch Alanin ersetzt, um so die Protein-Heterogenität durch Cystein-Oxidationsprodukte zu verringern. Die affinitätschromatographische Aufreinigung des Rezeptorproteins war ebenfalls entscheidend, um eine hohe Kristallqualität zu erreichen. Die Verwendung verschiedener Additivsubstanzen zusätzlich zu der initialen Kristallisationsbedingungen führte letztlich zur Bildung für die Strukturanalyse geeigneter Einzelkristallen des binären Komplexes (hIL-5Rα/hIL-5). Ihre Messung ergab Beugungsdaten mit einer maximalen Auflösung von 2.5Å. Eine erste Strukturanalyse zeigt klar, dass die Liganden-bindende Domäne des IL-5Rα Rezeptors eine bisher unbekannte, neuartige Rezeptor-Architektur aufweist, die keinerlei Ähnlichkeit zu bisher bekannten Zytokinrezeptor-strukturen der Klasse I hat. Die Struktur des Komplexes zeigt zudem, dass das Liganden-bindende Epitop von IL-5Rα über alle drei extrazelluläre Domänen verteilt ist und eine Topologie aufweist, in der zusätzlich zu dem Zytokin-Erkennungsmotiv (CRM) die erste Fn-III Domäne von hIL-5Rα benötigt wird, um den Liganden hochaffin binden zu können. In einem zweiten Projekt wurde ein prokaryotisches Expressionssystem für murines Interleukin-5 (mIL-5) entwickelt, welches die Produktion von mIL-5 und eines mIL-5 Antagonisten für funktionelle Studien in einem Mausmodell ermöglichen sollte. Da eine rekombinante Produktion von mIL-5 in E.coli bisher nicht erfolgreich war, wurde ein Fusionsproteinsystem entwickelt, welches die Produktion großer Mengen von mIL-5 Protein erlaubt. Es wurde eine chemische Spaltung mit Cyanbromid (CNBr) durchgeführt, um das Monomer aus dem Fusionsprotein freizusetzen. Das so erhaltene mIL-5 Monomer wurde gereinigt und renaturiert. Nach Rückfaltung zeigt das dimere Protein in TF-1 Zellen eine mit den Literaturwerten vergleichbare biologische Aktivität. Das so erhaltene mIL-5 Protein wurde kristallisiert und mittels Röntgenbeugung analysiert. Auf diese Weisen konnten Beugungsdaten von mIL-5 Kristallen mit einer maximalen Auflösung von 2.5Å erhalten werden. Die Struktur weist ähnlich wie das humane IL-5 ein symmetrisches Vier-Helix Bündel auf. Die Struktur-/Funktionsanalyse ermöglichte daraufhin, definierte mIL-5-Antagonisten zu entwickeln, die sich derzeit noch in der Untersuchung befinden. Zusammengefasst tragen die hier präsentierten Ergebnisse dazu bei, die molekularen Grundlagen der spezifischen IL-5 und IL-5R Bindung sowie Interaktionen ähnlichen Liganden-Rezeptor-Typen zu verstehen. Letztendlich besteht die Hoffnung, dass diese und ähnliche Arbeiten ein weiteres wichtiges Puzzlestück darstellen bei dem Versuch, neue und innovative pharmakologische Therapieansätze zu entwickeln, die bei dem für die Pathophysiologie von Asthma wichtigen Schlüsselmolekül IL-5 angreifen.
KW  - Functional Studies
KW  - Interleukin-5
KW  - structure analysis
KW  - Strukturanalyse
KW  - Interleukin-5
KW  - Functional Studies
KW  - Interleukin-5
KW  - structure analysis
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27319
ER  -