TY - THES A1 - Blocka, Joanna T1 - Molecular mechanisms underlying Woodhouse-Sakati syndrome: characterization of DCAF17 with specific, polyclonal antibodies T1 - Molekulare Grundlagen des Woodhouse-Sakati Syndroms: Charakterisierung des DCAF 17 mit spezifischen, polyklonalen Antikörpern N2 - Woodhouse-Sakati syndrome (WSS) is a rare multisystemic, autosomal recessive disease. The underlying cause of WSS are mutations of C2orf37 gene, which result in a truncated protein. Little is known about the function of C2orf37 (DDB1-CUL4A-associated factor 17, DCAF17) apart from it being part of the DDB1-CUL4-ROC1 E3 ubiquitin ligase complex, specifically binding directly to DDB1 and serving as a substrate recruiter for E3. There are two major isoforms of DCAF17: beta (65 kDa, 520 amino acids) and alpha (27 kDa, 240 amino acids), which is a C-terminal part of beta. The intracellular localization of the WSS protein is thought to be primarily the nucleolus. A murine ortholog protein was found to be expressed in all tissues with a relatively higher expression in the brain, liver, and skin.The aim of this work was to investigate DCAF17 in HeLa cells in more detail, in particular the redistribution of both WSS isoforms on the subcellular and -nuclear level as well as their chemical features. For these experiments, I developed, through recombinant expression and affinity purification, a specific polyclonal antibody against a WSS-epitope 493-520. Furthermore, three other specific polyclonal antibodies were obtained through affinity purification with help of commercially produced high-affinity epitope peptides.By means of these antibodies, I determined- through immunofluorescence and subcellular protein fractionation- that, apart from the redistribution of the WSS protein within the non-soluble = chromatin-bound nuclear fraction, a significant amount of both WSS isoforms is present in the soluble nuclear fraction. Indeed, treatment of purified nuclear envelopes with an increasing concentration of NaCl as well as urea confirmed a non-covalent binding of the WSS protein to the nuclear envelope with the detachment ofbeta-WSS at a lower NaCl concentration than alpha-WSS. In regard to the chromatin-bound WSS protein, I performed hydrolysis of nuclear and nucleolar extract with DNase and RNase. The results indicate that the WSS protein is bound to DNA but not RNA, with alpha-WSS being possibly located more abundantly in the nucleolus, whereas beta-WSS within other subnuclear departments. Furthermore, in all the above-mentioned experiments, a presence of an 80-kDa protein, which specifically reacted with the polyclonal high-affinity antibodies and showed similar redistribution and chemical features as alpha- and beta-WSS, was observed. In order to investigate whether this protein is a posttranslationally modified WSS isoform, I performed deglycosylation and dephosphorylation of nuclear extract, which showed no disappearance or change in abundance of the 80-kDa band on Western blot. While other ways of poststranslational modification cannot be excluded as the cause of occurrence of the 80-kDa protein, an existence of a third, yet undescribed, major isoform is also conceivable. Summarizing, this work contributed to a deeper characterization of the WSS protein, which can help future investigators in developing new experimental ideas to better understand the pathology of WSS. N2 - Woodhouse-Sakati Syndrom (WSS) ist eine seltene, autosomal rezessive Multisystemerkrankung, deren Ursache Mutationen im C2orf37 Gen, resultierend in einem trunkierten Protein, sind. Die Funktion des C2orf37 (DDB1-CUL4A-associated factor 17, DCAF 17) ist weitgehend unbekannt. Das Protein ist Teil des DDB1-CUL4-ROC1 E3-Ubiquitin-Ligase-Komplexes, wo es direkt an DDB1 bindet und Substrate für E3 rekrutiert. Zwei Isoformen des DCAF17: beta (65 kDa, 520 Aminosäuren) und alpha (27 kDa, 240 Aminosäuren), die ein C-terminaler Teil der beta-Isoform ist, sind heutzutage bekannt. Man geht von einer primär nukleolären Lokalisation des WSS-Proteins in den Zellen aus. Untersuchungen des murinen C2orf37-Ortholog-Proteins ergaben eine Expression in allen Zellen mit einer erhöhten Expression im Gehirn, in der Leber und in der Haut. Das Ziel dieser Arbeit war es, DCAF17 in HeLa-Zellen zu untersuchen, insbesondere die Lokalisation beider WSS-Isoformen auf dem subzellulären und -nukleären Niveau sowie deren chemische Eigenschaften. Durch rekombinante Expression und Affinitätsreinigung entwickelte ich spezifische polyklonale Antikörper gegen das WSS-Epitop 493-530. Zudem reinigte ich drei weitere spezifische polyklonale Antikörper mithilfe kommerziell produzierter hochaffiner Epitop-Peptide auf. Mithilfe dieser Antikörper konnte ich- durch Immunfluoreszenz und subzelluläre Proteinfraktionierug- eine Lokalisation des WSS-Proteins in der löslichen Kernfraktion, zusätzlich zu der bereits bekannten chromatingebundenen Kernfraktion, nachweisen. Die Behandlung reiner Kernhüllen mit steigernden NaCl-Konzentrationen und Harnstoff zeigte eine nicht-kovalente Bindung des DCAF17 an die Kernhülle mit einer Ablösung der beta-Isoform von der Kernhülle bereits bei niedrigeren NaCl-Konzentrationen als im Falle der alpha-Isoform. Um das chromatingebundene DCAF17 genauer zu untersuchen, führte ich eine Hydrolyse des Ganzkern- und Nukleolusextraktes mit DNase und RNase durch. Diese ergab eine Bindung des WSS-Proteins an die DNA, jedoch nicht an die RNA, mit der möglichen Hauptlokalisation der alpha-Isoform im Nukleolus und der beta-Isoform in anderen subnukleären Kompartimenten. Des Weiteren wurde in den oben beschriebenen Experimenten ein 80-kDa Protein nachgewiesen, das eine spezifische Reaktion mit den polyklonalen hochaffinen Antikörpern sowie eine dem WSS-Protein ähnliche subzelluläre / -nukleäre Lokalisation und chemische Eigenschaften zeigte. Um zu untersuchen, ob es sich um ein posttranslational modifiziertes DCAF17 handelt, führte ich Deglycosylierung und Dephosphorylierung des Ganzkernextraktes durch. Diese zeigten weder ein Verschwinden noch eine Änderung des 80-kDa-Signals auf Immunoblots. Obwohl eine andere Art einer posttranslationalen Proteinmodifizierung ist nicht ausgeschlossen, entspricht dieses Protein möglicherweise einer dritten, bisher nicht beschriebenen, Hauptisoform des DCAF17. Zusammenfassend trug diese Arbeit zur genaueren Charakterisierung des WSS-Proteins bei. Dies kann zukünftigen Forschern helfen, die Pathologie des WSS besser zu verstehen. KW - Humangenetik KW - Molekulargenetik KW - Grundlagenforschung KW - Woodhouse-Sakati Syndrom KW - Woodhouse-Sakati sydrome KW - DCAF17 KW - Humangenetik KW - genetics KW - autosomal recessive Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174766 ER - TY - THES A1 - Wolf, Beat T1 - Reducing the complexity of OMICS data analysis T1 - Verringerung der Komplexität von OMICS Datenanalysen N2 - The field of genetics faces a lot of challenges and opportunities in both research and diagnostics due to the rise of next generation sequencing (NGS), a technology that allows to sequence DNA increasingly fast and cheap. NGS is not only used to analyze DNA, but also RNA, which is a very similar molecule also present in the cell, in both cases producing large amounts of data. The big amount of data raises both infrastructure and usability problems, as powerful computing infrastructures are required and there are many manual steps in the data analysis which are complicated to execute. Both of those problems limit the use of NGS in the clinic and research, by producing a bottleneck both computationally and in terms of manpower, as for many analyses geneticists lack the required computing skills. Over the course of this thesis we investigated how computer science can help to improve this situation to reduce the complexity of this type of analysis. We looked at how to make the analysis more accessible to increase the number of people that can perform OMICS data analysis (OMICS groups various genomics data-sources). To approach this problem, we developed a graphical NGS data analysis pipeline aimed at a diagnostics environment while still being useful in research in close collaboration with the Human Genetics Department at the University of Würzburg. The pipeline has been used in various research papers on covering subjects, including works with direct author participation in genomics, transcriptomics as well as epigenomics. To further validate the graphical pipeline, a user survey was carried out which confirmed that it lowers the complexity of OMICS data analysis. We also studied how the data analysis can be improved in terms of computing infrastructure by improving the performance of certain analysis steps. We did this both in terms of speed improvements on a single computer (with notably variant calling being faster by up to 18 times), as well as with distributed computing to better use an existing infrastructure. The improvements were integrated into the previously described graphical pipeline, which itself also was focused on low resource usage. As a major contribution and to help with future development of parallel and distributed applications, for the usage in genetics or otherwise, we also looked at how to make it easier to develop such applications. Based on the parallel object programming model (POP), we created a Java language extension called POP-Java, which allows for easy and transparent distribution of objects. Through this development, we brought the POP model to the cloud, Hadoop clusters and present a new collaborative distributed computing model called FriendComputing. The advances made in the different domains of this thesis have been published in various works specified in this document. N2 - Das Gebiet der Genetik steht vor vielen Herausforderungen, sowohl in der Forschung als auch Diagnostik, aufgrund des "next generation sequencing" (NGS), eine Technologie die DNA immer schneller und billiger sequenziert. NGS wird nicht nur verwendet um DNA zu analysieren sondern auch RNA, ein der DNA sehr ähnliches Molekül, wobei in beiden Fällen große Datenmengen zu erzeugt werden. Durch die große Menge an Daten entstehen Infrastruktur und Benutzbarkeitsprobleme, da leistungsstarke Computerinfrastrukturen erforderlich sind, und es viele manuelle Schritte in der Datenanalyse gibt die kompliziert auszuführen sind. Diese beiden Probleme begrenzen die Verwendung von NGS in der Klinik und Forschung, da es einen Engpass sowohl im Bereich der Rechnerleistung als auch beim Personal gibt, da für viele Analysen Genetikern die erforderlichen Computerkenntnisse fehlen. In dieser Arbeit haben wir untersucht wie die Informatik helfen kann diese Situation zu verbessern indem die Komplexität dieser Art von Analyse reduziert wird. Wir haben angeschaut, wie die Analyse zugänglicher gemacht werden kann um die Anzahl Personen zu erhöhen, die OMICS (OMICS gruppiert verschiedene Genetische Datenquellen) Datenanalysen durchführen können. In enger Zusammenarbeit mit dem Institut für Humangenetik der Universität Würzburg wurde eine graphische NGS Datenanalysen Pipeline erstellt um diese Frage zu erläutern. Die graphische Pipeline wurde für den Diagnostikbereich entwickelt ohne aber die Forschung aus dem Auge zu lassen. Darum warum die Pipeline in verschiedenen Forschungsgebieten verwendet, darunter mit direkter Autorenteilname Publikationen in der Genomik, Transkriptomik und Epigenomik, Die Pipeline wurde auch durch eine Benutzerumfrage validiert, welche bestätigt, dass unsere graphische Pipeline die Komplexität der OMICS Datenanalyse reduziert. Wir haben auch untersucht wie die Leistung der Datenanalyse verbessert werden kann, damit die nötige Infrastruktur zugänglicher wird. Das wurde sowohl durch das optimieren der verfügbaren Methoden (wo z.B. die Variantenanalyse bis zu 18 mal schneller wurde) als auch mit verteiltem Rechnen angegangen, um eine bestehende Infrastruktur besser zu verwenden. Die Verbesserungen wurden in der zuvor beschriebenen graphischen Pipeline integriert, wobei generell die geringe Ressourcenverbrauch ein Fokus war. Um die künftige Entwicklung von parallelen und verteilten Anwendung zu unterstützen, ob in der Genetik oder anderswo, haben wir geschaut, wie man es einfacher machen könnte solche Applikationen zu entwickeln. Dies führte zu einem wichtigen informatischen Result, in dem wir, basierend auf dem Model von „parallel object programming“ (POP), eine Erweiterung der Java-Sprache namens POP-Java entwickelt haben, die eine einfache und transparente Verteilung von Objekten ermöglicht. Durch diese Entwicklung brachten wir das POP-Modell in die Cloud, Hadoop-Cluster und präsentieren ein neues Model für ein verteiltes kollaboratives rechnen, FriendComputing genannt. Die verschiedenen veröffentlichten Teile dieser Dissertation werden speziel aufgelistet und diskutiert. KW - Bioinformatik KW - Humangenetik KW - OMICS KW - Distributed computing KW - User interfaces KW - Verteiltes Datenbanksystem Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-153687 ER - TY - CHAP A1 - Adam, D. A1 - Schartl, A. A1 - Andexinger, S. A1 - Hölter, S. A1 - Wilde, B. A1 - Schartl, Manfred T1 - Genetic factors in tumour formation: The melanoma-inducing gene of Xiphophorus N2 - No abstract available. KW - Humangenetik KW - Tumor KW - Entstehung Y1 - 1991 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86388 ER -