TY - JOUR A1 - Yanku, Yifat A1 - Bitman-Lotan, Eliya A1 - Zohar, Yaniv A1 - Kurant, Estee A1 - Zilke, Norman A1 - Eilers, Martin A1 - Orian, Amir T1 - Drosophila HUWE1 ubiquitin ligase regulates endoreplication and antagonizes JNK signaling during salivary gland development JF - Cells N2 - The HECT-type ubiquitin ligase HECT, UBA and WWE Domain Containing 1, (HUWE1) regulates key cancer-related pathways, including the Myc oncogene. It affects cell proliferation, stress and immune signaling, mitochondria homeostasis, and cell death. HUWE1 is evolutionarily conserved from Caenorhabditis elegance to Drosophila melanogaster and Humans. Here, we report that the Drosophila ortholog, dHUWE1 (CG8184), is an essential gene whose loss results in embryonic lethality and whose tissue-specific disruption establishes its regulatory role in larval salivary gland development. dHUWE1 is essential for endoreplication of salivary gland cells and its knockdown results in the inability of these cells to replicate DNA. Remarkably, dHUWE1 is a survival factor that prevents premature activation of JNK signaling, thus preventing the disintegration of the salivary gland, which occurs physiologically during pupal stages. This function of dHUWE1 is general, as its inhibitory effect is observed also during eye development and at the organismal level. Epistatic studies revealed that the loss of dHUWE1 is compensated by dMyc proeitn expression or the loss of dmP53. dHUWE1 is therefore a conserved survival factor that regulates organ formation during Drosophila development. KW - HECT KW - HUWE1 KW - ubiquitin KW - salivary gland KW - endoreplication KW - JNK KW - dMyc KW - dmP53 Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-197630 SN - 2073-4409 VL - 7 IS - 10 ER - TY - JOUR A1 - Reddy, C. E. A1 - Albanito, L. A1 - De Marco, P. A1 - Aiello, D. A1 - Maggiolini, M. A1 - Napoli, A. A1 - Musti, A. M. T1 - Multisite phosphorylation of c-Jun at threonine 91/93/95 triggers the onset of c-Jun pro-apoptotic activity in cerebellar granule neurons JF - Cell Death & Disease N2 - Cerebellar granule cell (CGC) apoptosis by trophic/potassium (TK) deprivation is a model of election to study the interplay of pro-apoptotic and pro-survival signaling pathways in neuronal cell death. In this model, the c-Jun N-terminal kinase (JNK) induces pro-apoptotic genes through the c-Jun/activator protein 1 (AP-1) transcription factor. On the other side, a survival pathway initiated by lithium leads to repression of pro-apoptotic c-Jun/AP-1 target genes without interfering with JNK activity. Yet, the mechanism by which lithium inhibits c-Jun activity remains to be elucidated. Here, we used this model system to study the regulation and function of site-specific c-Jun phosphorylation at the S63 and T91/T93 JNK sites in neuronal cell death. We found that TK-deprivation led to c-Jun multiphosphorylation at all three JNK sites. However, immunofluorescence analysis of c-Jun phosphorylation at single cell level revealed that the S63 site was phosphorylated in all c-Jun-expressing cells, whereas the response of T91/T93 phosphorylation was more sensitive, mirroring the switch-like apoptotic response of CGCs. Conversely, lithium prevented T91T93 phosphorylation and cell death without affecting the S63 site, suggesting that T91T93 phosphorylation triggers c-Jun pro-apoptotic activity. Accordingly, a c-Jun mutant lacking the T95 priming site for T91/93 phosphorylation protected CGCs from apoptosis, whereas it was able to induce neurite outgrowth in PC12 cells. Vice versa, a c-Jun mutant bearing aspartate substitution of T95 overwhelmed lithium-mediate protection of CGCs from TK-deprivation, validating that inhibition of T91/T93/T95 phosphorylation underlies the effect of lithium on cell death. Mass spectrometry analysis confirmed multiphosphorylation of c-Jun at T91/T93/T95 in cells. Moreover, JNK phosphorylated recombinant c-Jun at T91/T93 in a T95-dependent manner. On the basis of our results, we propose that T91/T93/T95 multiphosphorylation of c-Jun functions as a sensitivity amplifier of the JNK cascade, setting the threshold for c-Jun pro-apoptotic activity in neuronal cells. KW - c-Jun KW - JNK KW - cell death KW - neurons KW - trophic/potassium deprivation KW - lithium Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-128793 VL - 4 IS - e852 ER - TY - THES A1 - Reddy, Edamakanti Chandrakanth T1 - Role of differential phosphorylation of c-Jun N-terminal domain in degenerative and inflammatory pathways of CNS T1 - Die Rolle der unterschiedlichen Phosphorylierung von c-Jun N-terminale Domäne bei degenerativen und entzündlichen Wirkungen im Nervengewebe N2 - In this study we have investigated the possible role of c-Jun and it’s activation by the JNK pathway in neuronal cell death and in the inflammatory response of activated astrocytes. The first part of this thesis focuses on the role of site specific phosphorylation of c-Jun in neuronal cell death. The second part focuses on the function of c-Jun in LPS-mediated activation of Bergmann glia cells. In the nervous system, activation of c-Jun transcription factor by different isoforms of c-Jun N-terminal kinase (JNK) functions in various cellular programs, including neurite outgrowth, repair and apoptosis. Yet, the regulatory mechanism underlying the functional dichotomy of c-Jun remains to be elucidated. Serine (S) 63/73 and threonine (T) 91/93 of c-Jun are the target phosphorylation sites for JNKs in response to various stimuli. Yet, these two groups of phosphorylation sites are differentially regulated in vivo, as the S63/73 sites are promptly phosphorylated upon JNK activation, whereas T91/93 phosphorylation requires a priming event at the adjacent T95 site. In our study, we used cerebellar granule cell (CGC) apoptosis by trophic/potassium (TK) deprivation as a model system to investigate the regulation and function of site-specific c-Jun phosphorylation at the S63 and T91/T93 JNK-sites in neuronal cell death. In this model system, JNK induces pro-apoptotic genes through the c-Jun/Ap-1 transcription factor. On the other side, a survival pathway initiated by lithium leads to repression of pro-apoptotic c-Jun/Ap-1 target genes without interfering with JNK activity. Yet, the mechanism by which lithium inhibits c-Jun activity remains to be elucidated. We found that TK-deprivation led to c-Jun phosphorylation at all three JNK sites. However, immunofluorescence analysis of c-Jun phosphorylation at single cell level revealed that the S63 site was phosphorylated in all c-Jun-expressing cells, whereas the response of T91/T93 phosphorylation was more sensitive, mirroring the switch-like apoptotic response of cerebellar granular cells (CGCs). Furthermore, we observed that lithium impaired c-Jun phosphorylation at T91/93, without interfering with S63/73 phosphorylation or JNK activation, suggesting that T91/T93 phosphorylation triggers c-Jun pro-apoptotic activity. Notably, expression of a c-Jun mutant lacking the T95-priming site for T91/93 phosphorylation (c-Jun A95) mimicked the effect of lithium on both cell death and c-Jun site-specific phosphorylation, whereas it was fully able to induce neurite outgrowth in naïve PC12 cells. Vice-versa, a c-Jun mutant bearing aspartate-substitution of T95 overwhelmed lithium-mediate protection of CGCs from TK-deprivation, validating that inhibition of T91/T93/T95 phosphorylation underlies the effect of lithium on cell death. Mass-spectrometry analysis confirmed that c-Jun is phosphorylation at T91/T93/T95 in cells. Moreover, recombinant-JNK phosphorylated c-Jun at T91/T93 in a T95-dependent manner. Based on our results, we propose that T91/T93/T95 phosphorylation of c-Jun functions as a sensitivity amplifier of the JNK cascade, setting the threshold for c-Jun pro-apoptotic activity in neuronal cells. In the central nervous system (CNS), the c-Jun transcription factor has been mainly studied in neuronal cells and coupled to apoptotic and regenerative pathways following brain injury. Besides, several studies have shown a transcriptional role of c-Jun in activated cortical and spinal astrocytes. In contrast, little is known about c-Jun expression and activation in Bergmann glial (BG) cells, the radial cerebellar astrocytes playing crucial roles in cerebellar development and physiology. In this study, we used neuronal/glial cerebellar cultures from neonatal mice to assess putative functions of c-Jun in BG cells. By performing double immunocytochemical staining of c-Jun and two BG specific markers, S100 and GLAST, we observed that c-Jun was highly expressed in radial glial cells derived from Bergmann glia. Bergmann glia-derived cells expressed toll-like receptor (TLR 4) and treatment with bacterial lipopolysaccharide (Le et al.) induced c-Jun phosphorylation at S63, exclusively in BG cells. Moreover, LPS induced IL-1β expression and inhibition of JNK activity abolished both c-Jun phosphorylation and the increase of IL-1β mRNA. Notably, we also observed that LPS failed to induce IL-1β mRNA in neuronal/glial cerebellar cultures generated from conditional knockout mice lacking c-Jun expression in the CNS. These results indicate that c-Jun plays a central role in c-Jun in astroglial-specific induction of IL-1β. Furthermore, we confirmed in vivo that c-Jun is expressed in BG cells, during the formation of the BG monolayer. Altogether, our finding underlines a putative role of c-Jun in astroglia-mediated neuroinflammatory dysfunctions of the cerebellum. N2 - In dieser Studie wurde die Rolle des Transkriptionsfaktors c-Jun sowie seine Aktivierung durch den JNK Signalweg beim neuronalen Zelltod und bei der entzündlichen Reaktion von aktivierten Astrozyten untersucht. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Rolle von mehrfacher c-Jun Phosphorylierung an den Aminosäuren Threonin 91/93/95 beim neuronalen Zelltod. Der zweite Teil konzentriert sich auf die Rolle von c-Jun und seine Transaktivierung in LPS-vermittelter Aktivierung von Bergmann Gliazellen. Als Modellsystem für den neuronalen Zelltod wurde die Apoptose von cerebellären Granularzellen (CGC) durch trophische Granulazellen Kaliumkonzentration-Erniedrigung (TK) verwendet, da es ein Modell der Um das ist, das Zusammenspiel von pro-apoptotischen und pro-Überleben Signalwegen beim neuronalen Zelltod zu studieren. In diesem Modell induziert die c-Jun N-terminale Kinase (JNK) pro-apoptotische Gene durch den c-Jun/Ap-1 Transkriptionsfaktor. Auf der anderen Seite, führt ein Lithium-induzierter Überleben-Signalweg zur Unterdrückung der pro-apoptotischen c-Jun/Ap-1 Zielgene, ohne Interferenz mit JNK Aktivität. Es blieb jedoch der Mechanismus zu klären, durch den Lithium c-Jun-Aktivität hemmt. In der Arbeit wurde dieses Modellsystem benutzt, um die Regulation und Funktion der c-Jun-Phosphorylierung durch JNK an den Stellen S63 und T91/T93 beim neuronalen Zelltod zu studieren. Es wurde gefunden, dass TK-Kaliumerniedrigung zu c-Jun phosphorylierung führte und zwar an allen drei durch JNK phosphorylierbaren Ser/Thr (JNK-Stellen). Immunfluoreszenzanalyse von c-Jun Phosphorylierung auf Einzel-Zell-Ebene ergab jedoch, dass die S63-Stelle in allen c-Jun-exprimierenden Zellen phosphoryliert wurde, während T91/T93 Phosphorylierung empfindlicher war, analog zur Schalter-ähnlichen apoptotischen Antwort von CGCs. Umgekehrt verhinderte Lithium T91 und T93 Phosphorylierung und Zelltod ohne Wirkung auf die S63-Seite, was darauf hindeutet, dass T91/T93 Phosphorylierung durch c-Jun eine pro-apoptotische Aktivität auslöst. Dementsprechend schützte eine c-Jun-Mutation, der die T95 Priming-Stelle für T91/93 Phosphorylierung fehlt (T95A), CGCs vor Apoptose, wohingegen T95A Neuriten-wachstum in PC12-Zellen induzieren konnte. Umgekehrt führte eine c-Jun Mutante mit Aspartat-Substitution von T95 (T95D ) zur Aufhebung der schützenden Wirkung von Lithium auf CGC Apoptose, wodurch bestätigt wurde, dass die Inhibierung der T91/T93/T95 Phosphorylierung der Wirkung von Lithium auf den Zelltod zugrundeliegt. Massenspektrometrie-Analyse bestätigte multiple Phosphorylierung von c-Jun an T91/T93/T95 in den Zellen. Außerdem wurde rekombinantes c-Jun durch JNK an T91/T93 in einer T95-abhängigen Weise phosphoryliert. Basierend auf diesen Ergebnissen wird vorgeschlagen, dass T91/T93/T95 phosphorylierung von c-Jun als Empfindlichkeit-Verstärker der JNK-Kaskade fungiert, der die Schwelle für die pro-apoptotische Aktivität von c-Jun in neuronalen Zellen einstellt. Im zentralen Nervensystem (ZNS) wurde die Rolle des c-Jun Transkriptionsfaktors hauptsächlich bei neuronalem Zelltod und bei neuronaler Regeneration nach Hirnschädigung untersucht. Außerdem wurde auch eine Rolle für c-Jun bei der Transkription in aktivierten kortikalen und spinalen Astrozyten beschrieben. Im Gegensatz dazu ist wenig bekannt über die Expression von c-Jun und dessen Transaktivierung in Bergmann Gliazellen (BG)-Zellen, die eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung des Kleinhirns und dessen Physiologie spielen. In dieser Arbeit wurde die putative Rolle von c-Jun bei kultivierten neuronalen/BG-Zellen aus dem Maus-Kleinhirn untersucht. Immunfluoreszenzanalyse von c-Jun und zwei für BG-Zellen spezifische Marker, S100 und GLAST, ergab, dass c-Jun in BG-Zellen hoch exprimiert wurde. Außerdem wurde gefunden, dass der Toll-like Rezeptor TLR4 in BG-Zellen exprimiert ist und dass die Behandlung mit bakteriellem Lipopolysaccharid (Le et al.) die c-Jun- Phosphorylierung an S63 induziert. Zusätzlich wurde gefunden, dass LPS IL-1b Expression induziert und die Inhibierung von JNK Aktivität verhinderte sowohl c-Jun-Phosphorylierung, als auch die Zunahme von IL-1 b mRNA. Insbesondere konnte LPS die IL-1b mRNA-Produktion in neuronalen / BG-Kulturen aus konditionellen Knockout Mäusen, denen c-Jun im ZNS fehlte, nicht induzieren, womit gezeigt wurde, dass c-Jun bei der Astroglia-spezifischen Induktion von IL-1 b essentiell ist. Immunohistochemische Analyse von c-Jun-exprimierenden Zellen im postnatalen Kleinhirn bestätigte in-vivo die Expression von c-Jun in BG Zellen und förderte eine dynamische Expression von c-Jun während der Entwicklung der BG Monolayer zutage. Insgesamt unterstreichen die Befunde dieser Arbeit eine wahrscheinliche Rolle von c-Jun bei Astroglia-vermittelten neuroinflammatorischen Funktionsstörungen des Kleinhirns. KW - Jun KW - c-Jun Phosphorylierung KW - JNK KW - neuronal cell death KW - Licl KW - degeneratives Nervengewebe KW - Zelltod KW - Zentralnervensystem KW - Astrozyt Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-90748 ER -