TY - THES A1 - Schäfer, Christin Marliese T1 - Approaching antimicrobial resistance – Structural and functional characterization of the fungal transcription factor Mrr1 from Candida albicans and the bacterial ß-ketoacyl-CoA thiolase FadA5 from Mycobacterium tuberculosis T1 - Auf den Spuren der antimikrobiellen Resistenz – Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des Transkriptionsfaktors Mrr1 aus Candida albicans und der bakteriellen β-ketoacyl-CoA thiolase FadA5 aus Mykobakterium tuberculosis N2 - The number of fungal infections is rising in Germany and worldwide. These infections are mainly caused by the opportunistic fungal pathogen C. albicans, which especially harms immunocompromised people. With increasing numbers of fungal infections, more frequent and longer lasting treatments are necessary and lead to an increase of drug resistances, for example against the clinically applied therapeutic fluconazole. Drug resistance in C. albicans can be mediated by the Multidrug resistance pump 1 (Mdr1), a membrane transporter belonging to the major facilitator family. However, Mdr1-mediated fluconazole drug resistance is caused by the pump’s regulator, the transcription factor Mrr1 (Multidrug resistance regulator 1). It was shown that Mrr1 is hyperactive without stimulation or further activation in resistant strains which is due to so called gain of function mutations in the MRR1 gene. To understand the mechanism that lays behind this constitutive activity of Mrr1, the transcription factor should be structurally and functionally (in vitro) characterized which could provide a basis for successful drug development to target Mdr1-mediated drug resistance caused by Mrr1. Therefore, the entire 1108 amino acid protein was successfully expressed in Escherichia coli. However, further purification was compromised as the protein tended to form aggregates, unsuitable for crystallization trials or further characterization experiments. Expression trials in the eukaryote Pichia pastoris neither yielded full length nor truncated Mrr1 protein. In order to overcome the aggregation problem, a shortened variant, missing the N-terminal 249 amino acids named Mrr1 ‘250’, was successfully expressed in E. coli and could be purified without aggregation. Similar to the wild type Mrr1 ‘250’, selected gain of function variants were successfully cloned, expressed and purified with varying yields and with varying purity. The Mrr1 `250’ construct contains most of the described regulatory domains of Mrr1. It was used for crystallization and an initial comparative analysis between the wild type protein and the variants. The proposed dimeric form of the transcription factor, necessary for DNA binding, could be verified for both, the wild type and the mutant proteins. Secondary structure analysis by circular dichroism measurements revealed no significant differences in the overall fold of the wild type and variant proteins. In vitro, the gain of function variants seem to be less stable compared to the wild type protein, as they were more prone to degradation. Whether this observation holds true for the full length protein’s stability in vitro and in vivo remains to be determined. The crystallization experiments, performed with the Mrr1 ‘250’ constructs, led to few small needle shaped or cubic crystals, which did not diffract very well and were hardly reproducible. Therefore no structural information of the transcription factor could be gained so far. Infections with M. tuberculosis, the causative agent of tuberculosis, are the leading cause of mortality among bacterial diseases. Especially long treatment times, an increasing number of resistant strains and the prevalence of for decades persisting bacteria create the necessity for new drugs against this disease. The cholesterol import and metabolism pathways were discovered as promising new targets and interestingly they seem to play an important role for the chronic stage of the tuberculosis infection and for persisting bacteria. In this thesis, the 3-ketoacyl-CoA thiolase FadA5 from M. tuberculosis was characterized and the potential for specifically targeting this enzyme was investigated. FadA5 catalyzes the last step of the β-oxidation reaction in the side-chain degradation pathway of cholesterol. We solved the three dimensional structure of this enzyme by X-ray crystallography and obtained two different apo structures and three structures in complex with acetyl-CoA, CoA and a hydrolyzed steroid-CoA, which is the natural product of FadA5. Analysis of the FadA5 apo structures revealed a typical thiolase fold as it is common for biosynthetic and degradative enzymes of this class for one of the structures. The second apo structure showed deviations from the typical thiolase fold. All obtained structures show the enzyme as a dimer, which is consistent with the observed dimer formation in solution. Thus the dimer is likely to be the catalytically active form of the enzyme. Besides the characteristic structural fold, the catalytic triad, comprising two cysteines and one histidine, as well as the typical coenzyme A binding site of enzymes belonging to the thiolase class could be identified. The two obtained apo structures differed significantly from each other. One apo structure is in agreement with the characteristic thiolase fold and the well-known dimer interface could be identified in our structure. The same characteristics were observed in all complex structures. In contrast, the second apo structure followed the thiolase fold only partially. One subdomain, spanning 30 amino acids, was in a different orientation. This reorientation was caused by the formation of two disulfide bonds, including the active site cysteines, which rendered the enzyme inactive. The disulfide bonds together with the resulting domain swap still permitted dimer formation, yet with a significantly shifted dimer interface. The comparison of the apo structures together with the preliminary activity analysis performed by our collaborator suggest, that FadA5 can be inactivated by oxidation and reactivated by reduction. If this redox switch is of biological importance requires further evaluation, however, this would be the first reported example of a bacterial thiolase employing redox regulation. Our obtained complex structures represent different stages of the thiolase reaction cycle. In some complex structures, FadA5 was found to be acetylated at the catalytic cysteine and it was in complex with acetyl-CoA or CoA. These structures, together with the FadA5 structure in complex with a hydrolyzed steroid-CoA, revealed important insights into enzyme dynamics upon ligand binding and release. The steroid-bound structure is as yet a unique example of a thiolase enzyme interacting with a complex ligand. The characterized enzyme was used as platform for modeling studies and for comparison with human thiolases. These studies permitted initial conclusions regarding the specific targetability of FadA5 as a drug target against M. tuberculosis infection, taking the closely related human enzymes into account. Additional analyses led to the proposal of a specific lead compound based on the steroid and ligand interactions within the active site of FadA5. N2 - Die Zahl der Pilzinfektionen, welche hauptsächlich durch den opportunistisch-pathogenen Pilz C. albicans verursacht werden, ist nicht nur in Deutschland, sondern weltweit steigend. Die auftretenden Infektionen betreffen vor allem immunsupprimierte Personen. Dieser Anstieg an Pilzinfektionen verursacht häufigere und immer länger andauernde Behandlungen und resultiert auch im vermehrten Auftreten von Resistenzen gegen Antimykotika, unter anderem gegen das klinisch eingesetzte Fluconazol. Eine Möglichkeit der Resistenzbildung in C. albicans ist die Expression der ‚Multidrug resistance pump 1‘ (Mdr1), einer Membranpumpe, die zur Major-Facilitator-Superfamilie zählt. Diese durch Mdr1-vermittelte Fluconazolresistenz wird durch den Mdr1 regulierenden Transkriptionsfaktor Mrr1 (‚Multidrug resistance regulator 1‘) gesteuert. In resistenten C. albicans Stämmen befindet sich Mrr1 ohne weitere Stimulation oder externe Aktivierung bereits in einem hyperaktiven Zustand, der durch Mutationen mit Funktionsgewinn im MRR1 Gen verursacht wird. Um die Mechanismen, die sich hinter der konstitutiven Aktivität von Mrr1 verbergen, zu entschlüsseln, sollte dieser Transkriptionsfaktor in vitro strukturell und funktionell charakterisiert werden. Diese Charakterisierung könnte im Anschluss genutzt werden, um Wirkstoffe gegen die von Mrr1 gesteuerte und von Mdr1-vermittelte Resistenz zu entwickeln. Zu diesem Zweck, wurde das gesamte, 1108 Aminosäuren umfassende, Protein in Escherichia coli exprimiert. Die anschließende Proteinreinigung war allerdings durch Aggregatbildung beeinträchtigt, welche Kristallisationsansätze oder eine weitere Charakterisierung dieses Proteinkonstruktes verhinderten. Im Eukaryot Pichia pastoris durchgeführte Expressionsanalysen, waren leider erfolglos und weder die Expression des Volllängen-Mrr1 noch seiner verkürzten Proteinvarianten konnte nachgewiesen werden. Um Proteinaggregation zu umgehen, wurde deshalb ein N-terminal, um 249 Aminosäuren, verkürztes Proteinkonstrukt, Mrr1 ‚250‘, in E. coli exprimiert und erfolgreich, ohne Aggregation, gereinigt. Zusätzlich zum wildtypischen Mrr1 ‚250‘ Protein wurden auch ausgewählte Varianten kloniert, exprimiert und gereinigt, allerdings mit unterschiedlicher Ausbeute und Reinheit. Da das verkürzte Mrr1 ‚250‘ Protein noch immer fast alle in der Literatur beschriebenen Regulierungsdomänen besitzt, wurde es zur Kristallisation und für einen initialen Vergleich zwischen Wildtyp und Varianten genutzt. So konnte zum Beispiel die vermutete Dimerisierung des Transkriptionsfaktors sowohl für das Wildtypprotein als auch für die Varianten gezeigt werden. Eine weiterführende Untersuchung der Sekundärstruktur mittels zirkular Dichroismus Messungen zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Mutanten und dem Wildtypprotein. Allerdings erscheinen die Funktionsgewinn Varianten von Mrr1 in vitro instabiler als das Wildtypprotein, was sich durch stärkeren Abbau der Variantenproteine zeigt. Ob diese Beobachtungen allerdings vom verkürzten Protein auf das Gesamtprotein und dessen in vitro und in vivo Stabilität übertragbar sind, ist derzeit noch unklar. Kristallisationsansätze, die mit den verschiedenen Varianten des Mrr1 ‚250‘ Konstrukts durchgeführt wurden, führten zu sehr wenigen, nadelförmigen oder kubischen Kristallen, die kaum reproduzierbar waren und schlecht diffraktierten. Bisher konnten deshalb keine strukturellen Daten für den untersuchten Transkriptionsfaktor erhalten werden. Noch immer sind Infektionen, die durch M. tuberculosis, dem Erreger der Tuberkulose, verursacht werden die Haupttodesursache im Bereich der bakteriellen Infektionen. In diesem Zusammenhang stellen vor allem lange Behandlungszeiten, das vermehrte Auftreten resistenter Stämme und das Vorkommen persistierender Bakterien, die Jahrzehnte in ihrem Wirt überdauern können, nach wie vor große Herausforderungen dar und die Entwicklung neuer Tuberkulosemedikamente ist dringend erforderlich. Sowohl der Cholesterinimport als auch dessen Stoffwechselweg wurden als vielversprechende Wirkstoffziele identifiziert. Nicht zuletzt, da beide Mechanismen eine wichtige Rolle während der chronischen Phase der Tuberkuloseinfektion und für persistierende Bakterien zu spielen scheinen. Im Laufe dieser Arbeit wurde die 3-ketoacyl-CoA Thiolase FadA5 aus M. tuberculosis strukturell charakterisiert und auf ihre Tauglichkeit als spezifisches Wirkstoffziel hin untersucht. FadA5 katalysiert den letzten Schritt der β-Oxidation im Zuge des Seitenkettenabbaus von Cholesterin. Wir konnten die Proteinstruktur des FadA5 Proteins mittels Röntgenkristallographie ermitteln und erhielten zwei unterschiedliche apo-Strukturen sowie drei Komplexstrukturen. In den Komplexstrukturen waren entweder Acetyl-CoA, CoA oder ein hydrolisiertes Steroid-CoA, welches das natürliche Produkt von FadA5 darstellt, an das Enzym gebunden. Die Strukturanalyse der apo-Strukturen lies für eine der beiden Modelle die typische Thiolasefaltung erkennen, welche für biosynthetische und degradative Enzyme dieser Klasse üblich ist. In der zweiten apo-Struktur konnte diese Faltung nur teilweise identifiziert werden. Das Protein liegt in allen erhaltenen Strukturen als Dimer vor, was auch in Lösung beobachtet werden konnte und darauf hinweist, dass das Dimer die katalytisch aktive Form des Proteins darstellt. Neben der charakteristischen Faltung, wurde das aktive Zentrum, bestehend aus zwei Cysteinen und einem Histidin, sowie die für Thiolasen übliche Coenzym A Bindetasche identifiziert. Die erhaltenen apo-Strukturen unterschieden sich deutlich voneinander. Die zuvor beschriebene typische Dimer-Interaktionsfläche wird auch in den Komplexstrukturen beobachtet. Dahingegen war die Thiolasefaltung in der zweiten Apo-Struktur nur teilweise vorhanden, da beispielsweise eine Domäne, die 30 Aminosäuren umfasst, umorientiert vorlag. Die Bildung zweier Disulfidbrücken, welche beide katalytischen Cysteine involviert, verursachte die beschriebene Umorientierung und damit gepaart eine wahrscheinliche Inaktivität des Enzyms. Trotz der beschriebenen Umorientierung und Disulfidbrückenbildung liegt das Protein noch immer als Dimer vor, allerdings mit einer deutlich verschobenen Interaktionsfläche. Der Vergleich der beiden apo-Strukturen in Kombination mit einer vorläufigen Aktivitätsanalyse, die von unseren Kollaborationspartnern durchgeführt wurde, lassen vermuten, dass FadA5 durch Oxidation inaktiviert und durch Reduktion reaktiviert werden kann. Ob diese Redoxregulierung biologisch relevant ist, muss noch geklärt werden, allerdings wäre dies der erste beschriebene Fall einer redoxregulierten bakteriellen Thiolase. Die Komplexstrukturen stellen verschiedene Stufen der Thiolasereaktion dar. In einigen dieser Strukturen lag FadA5 am katalytischen Cystein acetyliert vor und befand sich im Komplex mit acetyl-CoA oder CoA. Durch eine weitere Struktur, in der FadA5 im Komplex mit einem hydrolisierten Steroid-CoA vorlag, konnten wichtige Einblicke in die Enzymdynamik während der Ligandenbindung und Freisetzung gewonnen werden. Die Steroid gebundene Struktur stellt derzeit ein einzigartiges Beispiel einer Thiolase im Komplex mit einem großen, mehrere Ringsysteme umfassenden Liganden dar. Das charakterisierte Enzym diente als Ausgangspunkt für Modellierungsversuche und Vergleiche mit humanen Thiolasen. Diese Analysen erlaubten initiale Schlussfolgerungen bezüglich einer Verwendung von FadA5 als spezifisches Wirkstoffziel gegen Tuberkuloseinfektionen, im Kontext verwandter humaner Enzyme. Zusätzliche Untersuchungen ermöglichten die Ausarbeitung einer spezifischen Leitsubstanz, die auf den analysierten Interaktionen zwischen dem aktiven Zentrum von FadA5 und den gebundenen Liganden basiert. KW - Multidrug-Resistenz KW - Candida albicans KW - Tuberkulose KW - Röntgenkristallographie KW - Cholesterinstoffwechsel KW - Structural Biology KW - Transcription factor KW - Thiolase Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108400 ER - TY - THES A1 - Zhang, Yi T1 - Regulation of Agrobacterial Oncogene Expression in Host Plants T1 - Regulierung der Expression der Onkogene aus Agrobakterien in Wirtspflanzen N2 - Virulent Agrobacterium tumefaciens strains transfer and integrate a DNA region of the tumor-inducing (Ti) plasmid, the T-DNA, into the plant genome and thereby cause crown gall disease. The most essential genes required for crown gall development are the T-DNA-encoded oncogenes, IaaH (indole-3-acetamide hydrolase), IaaM (tryptophan monooxygenase) for auxin, and Ipt (isopentenyl transferase) for cytokinin biosynthesis. When these oncogenes are expressed in the host cell, the levels of auxin and cytokinin increase and cause cell proliferation. The aim of this study was to unravel the molecular mechanisms, which regulate expression of the agrobacterial oncogenes in plant cells. Transcripts of the three oncogenes were expressed in Arabidopsis thaliana crown galls induced by A. tumefaciens strain C58 and the intergenic regions (IGRs) between their coding sequences (CDS) were proven to have promoter activity in plant cells. These promoters possess eukaryotic sequence structures and contain cis-regulatory elements for the binding of plant transcription factors. The high-throughput protoplast transactivation (PTA) system was used and identified the Arabidopsis thaliana transcription factors WRKY18, WRKY40, WRKY60 and ARF5 to activate the Ipt oncogene promoter. No transcription factor promoted the activity of the IaaH and IaaM promoters, despite the fact that the sequences contained binding elements for type B ARR transcription factors. Likewise, the treatment of Arabidopsis mesophyll protoplasts with cytokinin (trans-zeatin) and auxin (1-NAA) exerted no positive effect on IaaH and IaaM promoter activity. In contrast, the Ipt promoter strongly responded to a treatment with auxin and only modestly to cytokinin. The three Arabidopsis WRKYs play a role in crown gall development as the wrky mutants developed smaller crown galls than wild-type plants. The WRKY40 and WRKY60 genes responded very quickly to pathogen infection, two and four hours post infection, respectively. Transcription of the WRKY18 gene was induced upon buffer infiltration, which implicates a response to wounding. The three WRKY proteins interacted with ARF5 and with each other in the plant nucleus, but only WRKY40 together with ARF5 increased activation of the Ipt promoter. Moreover, ARF5 activated the Ipt promoter in an auxin-dependent manner. The severe developmental phenotype of the arf5 mutant prevented studies on crown gall development, nevertheless, the reduced crown gall growth on the transport inhibitor response 1 (TIR1) tir1 mutant, lacking the auxin sensor, suggested that auxin signaling is required for optimal crown gall development. In conclusion, A. tumefaciens recruits the pathogen defense related WRKY40 pathway to activate Ipt expression in T-DNA-transformed plant cells. IaaH and IaaM gene expression seems not to be controlled by transcriptional activators, but the increasing auxin levels are signaled via ARF5. The auxin-depended activation of ARF5 boosts expression of the Ipt gene in combination with WRKY40 to increase cytokinin levels and induce crown gall development. N2 - Virulente Bakterien des Stamms Agrobakterium tumefaciens, transferieren und integrieren einen Teil ihrer DNA, die T-DNA aus dem Tumor induzierenden Plasmid (Ti), in das Pflanzengenom. Dadurch wird die Tumorbildung induziert und die Krankheit bricht aus. Die wichtigsten Gene, die für die Entwicklung eines Tumors benötigt werden, sind auf der T-DNA lokalisierte Onkogene: IaaH (indole-3-aceetamide hydrolase), IaaM (tryptophan monooxygenase) für die Auxin Biosynthese und Ipt (isopentenyl transferase) für die Cytokinin Biosynthese. Werden diese Onkogene in der Wirtszelle exprimiert, steigt der Gehalt an Auxin und Cytokinin und fördert die Zellteilung. Das Ziel dieser Arbeit war es die molekularen Mechanismen, die die Expression der agrobakteriellen Onkogene in Pflanzenzellen regulieren, aufzuklären. Transkripte der drei Onkogene wurden in Tumoren an Arabidopsis thaliana exprimiert. Die Tumore wurden durch den A. tumefaciens Stamm C58 induziert. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Sequenzabschnitte zwischen den Onkogenen (IGRs: intergenic regions) eine Promoteraktivität in der Pflanzenzelle besitzen. Diese Promoter haben eukaryotische Sequenzstrukturen und enthalten cis-Elemente, an die pflanzliche Transkriptionsfaktoren binden. Mit Hilfe der PTA (high-throughput protoplast transactivation) Methode wurden die pflanzlichen Transkriptionsfaktoren WRKY18, WRKY40, WRKY60 und ARF5 von Arabidopsis thaliana identifiziert, welche den Promoter des Ipt Onkogens aktivieren. Für IaaH und IaaM konnte kein Transkriptionsfaktor, der die Promotersequenzen aktiviert, identifiziert werden, obwohl die Promotersequenzen Bindedomänen für den Typ B ARR Transkriptionsfaktor enthalten. Ebenso zeigte die Behandlung von Arabidopsis Protoplasten aus dem Mesophyll mit Cytokinin (trans-zeatin) und Auxin (1-NAA) keinen positiven Effekt auf die Aktivität des IaaH und des IaaM Promoters, wohingegen der Ipt Promoter stark auf eine Behandlung mit Auxin und leicht auf eine Behandlung mit Cytokinin reagierte. Die drei WRKYs aus Arabidopsis spielen eine Rolle in der Tumorentwicklung, da die wrky Mutante kleinere Tumore zeigt, als die Wild Typ Pflanzen. Die Gene WRKY40 und WRKY60 reagieren sehr schnell, innerhalb von zwei, beziehungsweise vier Stunden, auf eine Pathogen Infektion. Die Transkription des WRKY18 Gens wurde durch die Infiltration von Puffer in Blätter induziert, dies lässt auf eine Reaktion im Zusammenhang mit Wunderzeugung schließen. Die drei WRKY Proteine interagieren mit einander und mit ARF5 im Zellekern der Pflanzenzelle, aber nur WRKY40 und ARF5 können gemeinsam den Ipt Promoter aktivieren. Zusätzlich kann ARF5 den Ipt Promoter, in Abhängigkeit von Auxin, aktivieren. Wegen starker Entwicklungsstörungen der arf5 Mutante, konnte das Tumorwachstum an dieser Mutante nicht untersucht werden. Das reduzierte Tumorwachstum an der tri1 (transport inhibitor response, TIR) Mutante, der ein Auxinsensor fehlt, deutet auf die Notwendigkeit des Auxinsignalwegs für optimales Tumorwachstum hin. Zusammengefasst benutzt A. tumefaciens den WRKY40 Signalweg, der mit der Pathogen Abwehr verbunden ist, um die Ipt Expression in der mit T-DNA transformierten Pflanzenzelle zu aktivieren. Die Genexpression von IaaH und IaaM schein nicht von Transkriptionsfaktoren abhängig zu sein, aber erhöhte Auxin Werte werden von ARF5 erkannt. Die Auxin abhängige Aktivierung von ARF5 verstärkt die Expression des Ipt Gens gemeinsam mit WRKY40 um die Cytokin Werte in der Pflanzenzelle zu erhöhen und somit die Tumorentwicklung einzuleiten. KW - Agrobacterium tumefaciens KW - Transcription factor KW - Onkogen KW - Genexpression KW - Oncogene KW - Regulation Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-102578 ER -