TY  - JOUR
A1  - Szabó, Áron
A1  - Papin, Christian
A1  - Zorn, Daniela
A1  - Ponien, Prishila
A1  - Weber, Frank
A1  - Raabe, Thomas
A1  - Rouyer, François
T1  - The CK2 Kinase Stabilizes CLOCK and Represses Its Activity in the Drosophila Circadian Oscillator
JF  - PLoS Biology
N2  - Phosphorylation is a pivotal regulatory mechanism for protein stability and activity in circadian clocks regardless of their evolutionary origin. It determines the speed and strength of molecular oscillations by acting on transcriptional activators and their repressors, which form negative feedback loops. In Drosophila, the CK2 kinase phosphorylates and destabilizes the PERIOD (PER) and TIMELESS (TIM) proteins, which inhibit CLOCK (CLK) transcriptional activity. Here we show that CK2 also targets the CLK activator directly. Downregulating the activity of the catalytic alpha subunit of CK2 induces CLK degradation, even in the absence of PER and TIM. Unexpectedly, the regulatory beta subunit of the CK2 holoenzyme is not required for the regulation of CLK stability. In addition, downregulation of \(CK2\alpha\) activity decreases CLK phosphorylation and increases per and tim transcription. These results indicate that CK2 inhibits CLK degradation while reducing its activity. Since the CK1 kinase promotes CLK degradation, we suggest that CLK stability and transcriptional activity result from counteracting effects of CK1 and CK2.
KW  - negative feedback loop
KW  - PER-TIM complex
KW  - posttranslational regulation
KW  - transcription factor
KW  - in-vivo
KW  - behavioral rhythms
KW  - proteins period
KW  - beta-subunit
KW  - phosphorylation
KW  - gene
KW  - CT, circadian time
KW  - LD, light:dark
KW  - DD, constant darkness
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127234
SN  - 1545-7885
VL  - 11
IS  - 8
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Dusik, Verena
A1  - Senthilan, Pingkalai R.
A1  - Mentzel, Benjamin
A1  - Hartlieb, Heiko
A1  - Wülbeck, Corina
A1  - Yoshii, Taishi
A1  - Raabe, Thomas
A1  - Helfrich-Förster, Charlotte
T1  - The MAP Kinase p38 Is Part of Drosophila melanogaster's Circadian Clock
JF  - PLoS Genetics
N2  - All organisms have to adapt to acute as well as to regularly occurring changes in the environment. To deal with these major challenges organisms evolved two fundamental mechanisms: the p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway, a major stress pathway for signaling stressful events, and circadian clocks to prepare for the daily environmental changes. Both systems respond sensitively to light. Recent studies in vertebrates and fungi indicate that p38 is involved in light-signaling to the circadian clock providing an interesting link between stress-induced and regularly rhythmic adaptations of animals to the environment, but the molecular and cellular mechanisms remained largely unknown. Here, we demonstrate by immunocytochemical means that p38 is expressed in Drosophila melanogaster's clock neurons and that it is activated in a clock-dependent manner. Surprisingly, we found that p38 is most active under darkness and, besides its circadian activation, additionally gets inactivated by light. Moreover, locomotor activity recordings revealed that p38 is essential for a wild-type timing of evening activity and for maintaining ∼ 24 h behavioral rhythms under constant darkness: flies with reduced p38 activity in clock neurons, delayed evening activity and lengthened the period of their free-running rhythms. Furthermore, nuclear translocation of the clock protein Period was significantly delayed on the expression of a dominant-negative form of p38b in Drosophila's most important clock neurons. Western Blots revealed that p38 affects the phosphorylation degree of Period, what is likely the reason for its effects on nuclear entry of Period. In vitro kinase assays confirmed our Western Blot results and point to p38 as a potential "clock kinase" phosphorylating Period. Taken together, our findings indicate that the p38 MAP Kinase is an integral component of the core circadian clock of Drosophila in addition to playing a role in stress-input pathways.
KW  - in vitro kinase assay
KW  - biological locomotion
KW  - circadian oscillators
KW  - MAPK signaling cascades
KW  - circadian rhythms
KW  - drosophila melanogaster
KW  - neurons
KW  - phosphorylation
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119433
SN  - 1553-7404
VL  - 10
IS  - 8
ER  - 
TY  - THES
A1  - Baljuls, Angela
T1  - Differences and Similarities in the Regulation of RAF Isoforms: Identification of Novel A-RAF Phosphorylation Sites
T1  - Unterschiede und Ähnlichkeiten in der Regulierung der RAF Isoformen : Identifizierung der neuen A-RAF Phosphorylierungsstellen
N2  - In mammals, the RAF family of serine/threonine kinases consists of three members, A-, B- and C-RAF. Activation of RAF kinases involves a complex series of phosphorylations. Although the most prominent phosphorylation sites of B- and C-RAF are well characterized, little is known about regulatory phosphorylation of A-RAF. Using mass spectrometry, we identified here a number of novel in vivo phosphorylation sites in A-RAF. The physiological role and the function of these sites were investigated subsequently by amino acid exchange at the relevant positions. In particular, we found that S432 participates in MEK binding and is indispensable for A-RAF signaling. On the other hand, phosphorylation within the activation segment does not contribute to epidermal growth factor-mediated activation. Regarding regulation of A-RAF activity by 14-3-3 proteins, we show that A-RAF activity is regulated differentially by its C-terminal and internal 14-3-3 binding domain. Furthermore, by use of SPR technique, we found that 14-3-3 proteins associate with RAF in an isoform-specific manner. Of importance, we identified a novel regulatory domain in A-RAF (referred to as IH-segment) positioned between amino acids 248 and 267, which contains seven putative phosphorylation sites. Three of these sites, serines 257, 262 and 264, regulate A-RAF activation in a stimulatory manner. The spatial model of the A-RAF fragment including residues between S246 and E277 revealed a “switch of charge” at the molecular surface of the IH-region upon phosphorylation, suggesting a mechanism in which the high accumulation of negative charges may lead to an electrostatic destabilization of protein/membrane interaction resulting in depletion of A-RAF from the plasma membrane. Activation of B- and C-RAF is regulated by phosphorylation at conserved residues within the negative-charge regulatory region (N-region). Identification of phosphopeptides covering the sequence of the N-region led to the conclusion that, similar to B- and C-RAF, kinase activity of A-RAF is regulated by phosphorylation of the N-region. Abrogation of A-RAF activity by S299A substitution and elevated activity of the A-RAF-Y301D-Y302D mutant confirmed this conclusion. In addition, we studied the role of the non-conserved residues within the N-region in the activation process of RAF kinases. The non-conserved amino acids in positions –3 and +1 relative to the highly conserved S299 in A-RAF and S338 in C-RAF have so far not been considered as regulatory residues. Here, we demonstrate that Y296R substitution in A-RAF led to a constitutively active kinase. In contrast, G300S substitution (mimicking B- and C-RAF) acts in an inhibitory manner. These data were confirmed by analogous mutations in C-RAF. Based on the three-dimensional structure of the catalytic domain of B-RAF, a tight interaction between the N-region residue S339 and the catalytic domain residue R398 was identified in C-RAF and proposed to inhibit the kinase activity of RAF proteins. Furthermore, Y296 in A-RAF favors a spatial orientation of the N-region segment, which enables a tighter contact to the catalytic domain, whereas a glutamine residue at this position in C-RAF abrogates this interaction. Considering this observation, we suggest that Y296, which is unique for A-RAF, is a major determinant of the low activating potency of this RAF isoform. Finally, the residues R359 in A-RAF and R398 in C-RAF, which interact with the N-region, are also involved in binding of phosphatidic acid. Substitution of this conserved arginine by alanine resulted in accumulation of hyper-phosphorylated form of RAF, suggesting that this residue play a crucial role in phosphorylation-mediated feedback regulation of A- and C-RAF. Collectively, we provide here for the first time a detailed analysis of in vivo A-RAF phosphorylation status and demonstrate that regulation of A-RAF by phosphorylation exhibits unique features compared with B- and C-RAF.
N2  - Die Protein-Familie der Serin/Threonin-spezifischen RAF-Kinasen umfasst in Säugetieren drei Mitglieder, A-, B- und C-RAF. Bei der Aktivierung dieser Kinasen spielen Phosphorylierungs-ereignisse eine entscheidende Rolle. Im Gegensatz zu B- und C-RAF, deren Phosphorylierungsstellen ausgiebig charakterisiert sind, blieb die Phosphorylierung von A-RAF weitgehend unerforscht. In der vorliegenden Arbeit wurden unter Verwendung der massenspektrometrischen Analyse zahlreiche neue in vivo A-RAF-Phosphorylierungsstellen identifiziert. Die physiologische Relevanz und die Funktion dieser Stellen wurden anschließend durch Aminosäurenaustausch an den relevanten Positionen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass S432 in der A-RAF-Bindung zu MEK involviert und für die Signalweiterleitung unverzichtbar ist. Hingegen ist die EGF-bedingte A-RAF-Aktivierung nicht von der Phosphorylierung innerhalb des Aktivierungssegments abhängig. Hinsichtlich der Regulation von A-RAF-Aktivierung durch 14-3-3-Proteine, wurde hier gezeigt, dass die katalytische Aktivität von A-RAF durch die C-terminale und die interne 14-3-3-Bindungsdomänen unterschiedlich reguliert wird. Weiterhin wurde mittels SPR-Verfahren festgestellt, dass die Interaktion von 14-3-3-Proteinen mit RAF-Kinasen einen isoformspezifischen Charakter trägt. Von entscheidender Bedeutung war die Entdeckung einer neuen regulatorischen Domäne (hier als IH-Segment bezeichnet), die in der A-RAF-Sequenz die Aminosäuren 248 bis 267 umfasst und sieben A-RAF-spezifische Phosphorylierungsstellen enthält. Drei dieser Stellen, S257, S262 und S264, erwiesen sich als positive Regulatoren der A-RAF-Aktivierung. Das räumliche Modell dieses A-RAF-Fragments deckte eine „Ladungsumkehr“ an der molekularen Oberfläche der IH-Region infolge der Phosphorylierung auf. Dieser Befund begründete den Vorschlag eines Regulations-mechanismus, in dem die starke Akkumulierung der negativen Ladungen zu einer elektrostatischen Destabilisierung der Protein-Membran-Interaktion führt, was die Verdrängung der A-RAF-Kinase von der Plasma-Membran zur Folge haben könnte. Die Aktivierung von B- und C-RAF wird durch Phosphorylierung der sogenannten „negativ geladenen“ Region (N-Region) reguliert. Die Identifizierung mehrerer Phosphopeptide aus der N-Region von A-RAF veranlasste die Schlussfolgerung, dass die A-RAF-Aktivität ebenfalls durch die Phosphorylierung innerhalb dieser Region gesteuert werden könnte. In der Tat, die Aufhebung der A-RAF-Aktivität durch die S299A-Substitution und die erhöhte Aktivität der A-RAF-Y301D-Y302D-Mutante bestätigen diese Aussage. Darüberhinaus wurde die Rolle der nichtkonservierten Aminosäuren an den Positionen –3 und +1 relativ zum S299 in A-RAF und S338 in C-RAF im Aktivierungsprozess der RAF-Kinasen untersucht, nachdem diese ursprünglich nicht als regulatorische Stellen erkannt wurden. Es wird hier demonstriert, dass Y296R-Substitution der A-RAF-Kinase eine konstitutive Aktivität verleiht. Hingegen wirkte die G300S-Substitution, die von B- und C-RAF abgeleitet wurde, inhibitorisch. Diese Befunde wurden durch die analogen Mutationen in C-RAF bestätigt. Basierend auf der dreidimensionalen Struktur der katalytischen Domäne von B-RAF wurde eine Interaktion zwischen der N-Region und der katalytischen Domäne in A- und C-RAF festgestellt, die zu einer Inhibierung der Aktivität führen soll. Darüberhinaus wurde gezeigt, dass die räumliche Ausrichtung von Y296 in der N-Region von A-RAF einen engen Kontakt mit der katalytischen Domäne ermöglicht; dagegen hebt Glutamin in dieser Position die Interaktion auf. In Anbetracht dieser Befunde wurde vorschlagen, dass das A-RAF-spezifische Y296 das niedrige Aktivierungs-potential dieser RAF-Isoform determiniert. In diesem Zusammenhang wurde auch gefunden, dass die Aminosäuren R359 in A-RAF und R398 in C-RAF eine duale Funktion besitzen, indem sie sowohl mit der N-Region als auch mit Lipiden in Wechselwirkung treten können. Substitution dieser konservierten Arginine durch Alanin führte zur Akkumulierung der hyperphosphorylierten Formen der RAF-Kinasen, was die Schlussfolgerung erlaubt, dass diese Reste eine wichtige Rolle in der ERK-vermittelten Feedback-Regulation von A- und C-RAF spielen. Insgesamt wird hier zum ersten Mal eine detaillierte Analyse der in vivo A-RAF-Phosphorylierung geliefert und gezeigt, dass die phosphorylierungsvermittelte Regulation von A-RAF einzigartige Merkmale innerhalb der Familie von RAF-Kinasen aufweist.
KW  - Raf <Biochemie>
KW  - Phosphorylierung
KW  - Signaltransduktion
KW  - RAF kinases
KW  - phosphorylation
KW  - signal trunsduction
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36135
ER  -