TY  - THES
A1  - Schilling, Tatjana
T1  - Transdifferentiation of Human Mesenchymal Stem Cells
T1  - Transdifferenzierung humaner Mesenchymaler Stammzellen
N2  - With ageing, the loss of bone mass correlates with the expansion of adipose tissue in human bone marrow thus facilitating bone-related diseases like osteopenia and osteoporosis. The molecular mechanisms underlying these events are still largely unknown. Reduced osteogenesis and concurrently enhanced adipogenesis might not only occur due to the impairment of conventional osteogenic differentiation originating from mesenchymal stem cells (MSCs). Additionally, transdifferentiation of (pre-)osteoblasts into adipocytes could contribute to the fatty conversion. Therefore, the aim of the present study was to prove the existence of transdifferentiation between the adipogenic and osteogenic lineage and to elucidate molecular mechanisms underlying this phenomenon. At first, a cell culture system of primary human MSCs was established that allowed for differentiation into the adipogenic and osteogenic lineage and proved that the MSC-derived adipocytes and pre-osteoblasts were capable of transdifferentiation (reprogramming) from one into the other lineage. Thereby, lineage-specific markers were completely reversed after reprogramming of pre-osteoblasts into adipocytes. The osteogenic transdifferentiation of adipocytes was slightly less efficient since osteogenic markers were present but the adipogenic ones partly persisted. Hence, plasticity also reached into the differentiation pathways of both lineages and the better performance of adipogenic reprogramming further supported the assumption of its occurrence in vivo. The subsequent examination of gene expression changes by microarray analyses that compared transdifferentiated cells with conventionally differentiated ones revealed high numbers of reproducibly regulated genes shortly after initiation of adipogenic and osteogenic reprogramming. Thereof, many genes were correlated with metabolism, transcription, and signal transduction as FGF, IGF, and Wnt signalling, but only few of the established adipogenesis- and none of the osteogenesis-associated marker genes were detected within 24 h after initiation of transdifferentiation. To find possible key control factors of transdifferentiation amongst the huge amount of regulated genes, a novel bioinformatic scoring scheme was developed that ranked genes due to their potential relevance for reprogramming. Besides the reproducibility and level of their regulation, also the possible reciprocity between the adipogenic and osteogenic transdifferentiation pathway was taken into account. Fibroblast growth factor 1 (FGF1) that ranked as one of the leading candidates to govern reprogramming was proven to inhibit adipogenic differentiation as well as adipogenic transdifferentiation in our cell culture system. Further examination of the FGF signalling pathway and other highly ranked genes could help to better understand the age-related fatty degeneration at the molecular level and therefore provide target molecules for therapeutic modulation of the plasticity of both lineages in order to inhibit adipogenic degeneration and to enhance osteogenesis.
N2  - Der Verlust an Knochenmasse im Alter ist mit der Ausbreitung von Fettgewebe im menschlichen Knochenmark assoziiert und fördert daher auch knochenspezifische Erkrankungen wie Osteopenie und Osteoporose. Die diesen Ereignissen zu Grunde liegenden Mechanismen sind immer noch weitgehend unbekannt. Die abnehmende Osteogenese und die gleichzeitig zunehmende Adipogenese treten wahrscheinlich nicht nur wegen der Beeinträchtigung der konventionellen osteogenen Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen (MSZ) auf. Zusätzlich könnte auch die Transdifferenzierung (Reprogrammierung) von Osteoblasten(vorläufern) zu Adipozyten zur fettigen Umwandlung beitragen. Das Ziel der vorliegenden Studie war es daher, die Existenz der Transdifferenzierung zwischen dem adipogenen und osteogenen Differenzierungsweg nachzuweisen und die molekularen Mechanismen aufzuklären, die diesem Phänomen zu Grunde liegen. Zunächst wurde ein Zellkultursystem primärer mesenchymaler Stammzellen etabliert, in dem eine Differenzierung zu Adipozyten und Osteoblasten durchgeführt werden konnte, und nachgewiesen, dass aus MSZ erhaltene Adipozyten und Osteoblastenvorläufer von einer zur anderen Zelllinie transdifferenziert (reprogrammiert) werden können. Dabei wurden die zelllinienspezifischen Marker nach der Reprogrammierung von Osteoblastenvorläufern zu Adipozyten vollständig umgekehrt. Die osteogene Transdifferenzierung von Adipozyten war etwas weniger effizient, da die osteogenen Marker zwar vorhanden waren, aber auch die adipogenen Marker weiterhin auftraten. Die Plastizität erstreckte sich also auch auf die Differenzierungswege der beiden Zellpopulationen, wobei das bessere Ergebnis bezüglich der adipogenen Reprogrammierung die Annahme ihres Auftretens in vivo weiter unterstützte. Die nachfolgende Untersuchung von Genexpressionsänderungen mittels Mikroarray-Analysen, die transdifferenzierte mit konventionell differenzierten Zellen verglichen, führte kurz nach Initiation der adipogenen und osteogenen Transdifferenzierung zum Auffinden zahlreicher, reproduzierbar regulierter Gene. Viele dieser Gene standen mit Metabolismus, Transkription und Signaltransduktion wie dem FGF-, IGF- und Wnt-Signalweg in Zusammenhang, es wurden allerdings nur einige Adipogenese- und keinerlei Osteogenese-assoziierte Markergene innerhalb 24 h nach Initiation der Transdifferenzierung detektiert. Um unter der großen Zahl an regulierten Genen mögliche Schlüsselkontrollfaktoren der Transdifferenzierung zu finden, wurde ein neuartiges, bioinformatisches Punktesystem entwickelt, das Gene entsprechend ihrer potenziellen Relevanz für die Reprogrammierung auflistete. Dabei wurde neben der Reproduzierbarkeit und dem Ausmaß ihrer Regulation auch eine mögliche Reziprozität der Regulation zwischen dem adipogenen und osteogenen Transdifferenzierungsweg berücksichtigt. Es konnte nachgewiesen werden, dass der Fibroblastenwachstumsfaktor 1 (FGF1), der als einer der Hauptkandidaten für die Steuerung der Reprogrammierung eingeordnet worden war, in unserem Zellkultursystem sowohl die adipogene Differenzierung als auch die adipogene Transdifferenzierung hemmt. Die weitere Untersuchung des FGF-Signalwegs und anderer, hoch gelisteter Gene könnte zum besseren Verständnis der altersbezogenen fettigen Degeneration auf molekularer Ebene beitragen und daher Zielmoleküle liefern, die eine therapeutische Beeinflussung der Plastizität zwischen beiden Zelllinien zur Verhinderung der fettigen Degeneration und zur Förderung der Osteogenese erlauben.
KW  - Zelldifferenzierung
KW  - Metaplasie
KW  - Mesenchymale Stammzellen
KW  - Transdifferenzierung
KW  - Osteoblasten
KW  - Adipozyten
KW  - Mesenchymal Stem Cells
KW  - transdifferentiation
KW  - osteoblasts
KW  - adipocytes
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24299
ER  - 
TY  - THES
A1  - Haddad-Weber, Meike
T1  - Development of stem cell-based ACL- and tendon reconstruction
T1  - Entwicklung Stammzell-basierter Konstrukte für den Kreuzband- und Sehnenersatz
N2  - Ruptures of the anterior cruciate ligament (ACL) and defects of the rotator cuff represent the most common ligament and tendon injuries in knee and shoulder. Both injuries represent significant implications for the patients. After an injury, the ACL and the rotator cuff both exhibit poor intrinsic healing capacities. In order to prevent further defects such as arthritis of the knee and fatty infiltration of the rotator cuff, surgical interaction is essential. In both cases, the currently used surgical techniques are far from optimal because even after the therapy many patients report problems ranging from pain and reduced mobility to complete dysfunction of the involved joint and muscles. Tissue engineering may be a possible solution. It is a promising field of regenerative medicine and might be an advantageous alternative for the treatment of musculoskeletal injuries and diseases in the near future. In this thesis, different tissue engineering based approaches were investigated. For the reconstruction of damaged or diseased ligaments and tendons, the use of MSCs and gene therapy with growth factors is especially suitable and possesses a great therapeutic potential. Therefore, the first method studied and tested in this thesis was the development of a biomaterial based construct for the repair of a ruptured ACL. The second approach represents a cell based strategy for the treatment of the fatty infiltration in the rotator cuff. The third approach was a combined cell, biomaterial, and growth factor based strategy for ACL ruptures. Biomaterial based ACL construct The implant is currently tested in a preclinical in vivo study in mini pigs. This proof-of-principle study is performed to validate the functional capability of the collagen fiber based implant under load in vivo and its population with fibroblasts which produce a ligamentogenic matrix. Cell based treatment of the fatty infiltration in the rotator cuff Regarding the treatment of the fatty infiltration of the rotator cuff in a rabbit model, the in vivo results are also promising. The group treated with autologous MSCs (+MSC group) showed a lower fat content than the untreated group (–MSC group) 6 weeks after the treatment. Furthermore, the SSP muscle of the MSC-treated animals revealed macroscopically and microscopically only few differences compared to the healthy control group. The exact underlying mechanisms leading to the positive results of the treatment are not yet fully understood and have therefore to be further investigated in the future. Cell, biomaterial, and growth factor based treatment of ACL ruptures Studies described in current literature show that collagen hydrogel scaffolds are not ideal for a complete ligament or tendon reconstruction, because of their insufficient mechanical stability. Introduced as an alternative and superior therapy, the combined strategy used in this thesis proves that the cultivation of BMP-12, -13, and IGF-1 transduced MSCs and ACL fibroblasts in a collagen hydrogel is successful. The results of the performed in vitro study reveal that the cells exhibit a fibroblastic appearance and produce a ligamentogenic matrix after 3 weeks. Furthermore, the adenoviral transduction of MSCs and ACL fibroblasts showed no negative effects on proliferation or viability of the cells nor was apoptosis caused. Therefore, the application of these cells represents a possible future therapy for a partial ligament and tendon rupture where the mechanical stability of the remaining ligament or tendon is sufficient and the healing can be improved substantially by this therapy. In general, prospective randomized clinical trials still have to prove the postulated positive effect of MSCs for the treatment of various musculoskeletal diseases, but the results obtained here are already very promising. Ideally, the treatment with MSCs is superior compared to the standard surgical procedures. Because of current safety issues the use of genetically modified cells cannot be expected to be applied clinically in the near future. In summary, the different tissue engineering approaches for novel therapies for musculoskeletal injuries and diseases invested in this thesis showed very promising results and will be further developed and tested in preclinical and clinical trials.
N2  - 7.2 Zusammenfassung Kreuzbandrupturen und Defekte im Bereich der Rotatorenmanschette stellen die häufigsten Band- und Sehnenverletzungen im Kniegelenk bzw. in der Schulter dar. Beide Verletzungen haben erhebliche Auswirkungen für den Patienten. Sowohl das Kreuzband als auch die Rotatorenmanschette weisen ein sehr schlechtes Heilungspotential nach einer Verletzung auf. Um weiteren Schäden wie einer Kniegelenksarthrose oder einer Verfettung der Rotatorenmanschette vorzubeugen, ist ein operativer Eingriff erforderlich. In beiden Fällen sind die zurzeit verwendeten Behandlungsstandards nicht optimal, da auch nach einer Therapie viele Patienten über Beschwerden klagen, die von Schmerzen und einer eingeschränkten Mobilität bis hin zu einer kompletten Dysfunktion des betroffenen Gelenks und Muskels reichen. Tissue Engineering ist ein zukunftsträchtiges Feld der Regenerativen Medizin und kann ein möglicher Lösungsansatz sein. Vor allem bei der Behandlung von muskuloskelettalen Verletzungen und Erkrankungen kann es zukünftig eine vorteilhafte Behandlungsalternative darstellen. In dieser Doktorarbeit wurden verschiedene Tissue Engineering-basierte Lösungsansätze untersucht. Zur Rekonstruktion von defektem Band- und Sehnengewebe sind sowohl der Einsatz von mesenchymalen Stammzellen (MSZ) als auch die Gentherapie mit Wachstumsfaktoren besonders geeignet und weisen ein großes therapeutisches Potential auf. Deswegen wurde in der vorliegenden Doktorarbeit als erster innovativer Therapieansatz ein Biomaterial-basiertes Konstrukt für den Ersatz eines gerissenen Kreuzbandes entwickelt und getestet. Der zweite Lösungsansatz stellt eine Zell-basierte Therapie zur Behandlung einer fettigen Atrophie der Rotatorenmanschette dar. Die dritte Methode kombiniert Zellen, Biomaterialien und Wachstumsfaktoren zur Therapie von Kreuzbandrupturen. Biomaterial-basiertes Kreuzbandkonstrukt Das Implantat wird zurzeit in einer präklinischen in vivo Studie am Mini Pig getestet. Diese Proof-of-Principle Studie wird durchgeführt, um die Funktionsfähigkeit der Kollagenfaser-basierten Implantate unter Belastung in vivo zu validieren und ihre Besiedelung mit Fibroblasten, die eine ligamentäre Matrix ausbilden, zu beobachten. Zell-basierte Behandlung der fettig-infiltrieten Rotatorenmanschette Auch bei der Behandlung der fettigen Infiltration der Rotatorenmanschette im Kaninchenmodel, wurden in vivo sehr viel versprechende Ergebnisse erzielt. Die mit autologen MSZ (+MSZ-Gruppe) behandelte Gruppe zeigte nach 6 Wochen einen deutlich geringeren Fettanteil als die unbehandelte Gruppe (-MSZ-Gruppe). Des Weiteren wies der SSP-Muskel aller MSZ-behandelten Tiere sowohl makroskopisch als auch mikroskopisch nur geringe Unterschiede im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe auf. Der genaue zugrunde liegende Mechanismus dieser erfolgreichen Behandlung konnte bisher noch nicht genau geklärt werden und muss in zukünftigen Studien weiter untersucht werden. Zell-, Biomaterial- und Wachstumsfaktor-basierte Behandlung von Kreuzbandrupturen In der aktuellen Literatur beschriebenen Studien zeigen, dass Kollagenhydrogel-konstrukte aufgrund der fehlenden biomechanischen Stabilität nicht geeignet sind für den kompletten Band- bzw. Sehnenersatz. Als vorteilhafte Behandlungsalternative wurde in der vorliegenden Arbeit eine kombinierte Strategie entwickelt und erfolgreich in vitro getestet: Die Kultivierung von BMP-12-, -13- bzw. IGF-1-transduzierten MSZ und Kreuzbandfibroblasten in einem Kollagenhydrogel verlief sehr viel versprechend und ergab, dass die Zellen nach 3 Wochen im Kollagenhydrogel eine fibroblastäre Morphologie aufweisen und eine ligamentäre Matrix ausbilden. Des Weiteren führte die adenovirale Transduktion der Zellen weder zu negativen Auswirkungen auf das Proliferationsverhalten noch auf die Vitalität der Zellen und löste auch keine Apoptose bei den transduzierten Zellen aus. Zukünftig kann der Einsatz dieser Zellen deswegen ein möglicher Ansatz zur Behandlung von Teilrupturen bei Bändern und Sehnen darstellen, bei denen die biomechanische Stabilität ausreichend ist und die Heilung durch die Therapie wesentlich verbessert wird. Im Allgemeinen müssen prospektive randomisierte klinische Studien zeigen, ob sich der positive Effekt der MSZ bei der Behandlung von Erkrankungen des muskuloskelettalen Systems in der Orthopädie und Unfallchirurgie bewährt, wobei die in der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnisse sehr Erfolg versprechend sind. Idealerweise erweist sich die Behandlung mit MSZ als deutlich vorteilhaft gegenüber den bisher etablierten chirurgischen Standardverfahren. Aufgrund der bestehenden Sicherheitsrichtlinien für den Einsatz von gentherapeutischen modifizierten Zellen ist mit deren Verwendung zur Behandlung von Band- und Sehnenerkrankungen in naher Zukunft nicht zu rechnen. Zusammenfassend führte die Untersuchung der unterschiedlichen Tissue Engineering Ansätze, die in dieser Doktorarbeit als neue Therapien zur Behandlung von muskuloskelettalen Verletzungen und Erkrankungen evaluiert wurden, zu sehr viel versprechende Ergebnisse. Diese Therapieansätze sollen weiterentwickelt und in präklinischen und klinischen Studien getestet werden.
KW  - Kreuzband
KW  - Sehne
KW  - Tissue Engineering
KW  - Mesenchymale Stammzellen
KW  - Gentherpie
KW  - Zell-basierte Therapie
KW  - ACL
KW  - tendon
KW  - MSC
KW  - genetherapy
KW  - cell-based therapy
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66796
ER  -