TY - THES A1 - Vasquez Ospina, Juan Jose T1 - Development of tools for the study of gene regulation in Trypanosoma brucei T1 - Entwicklung neuer Methoden zur Untersuchung der Genregulation in Trypanosoma brucei N2 - The protozoan parasite Trypanosoma brucei is the causal agent of sleeping sickness and besides its epidemiological importance it has been used as model organism for the study of many aspects of cellular and molecular biology especially the post-transcriptional control of gene expression. Several studies in the last 30 years have shown the importance of mRNA processing and stability for gene regulation. In T. brucei genes are unusually arranged in polycistronic transcription units (PTUs) and a coupled process of trans-splicing and polyadenylation produces the mature mRNAs. Both processes, mRNA processing and stability, cannot completely explain the control of gene expression in the different life cycle stages analyzed in T. brucei so far. In recent years, the relevance of expression regulation at the level of translation has become evident in other eukaryotes. Therefore, in the first part of my thesis I studied the impact of translational regulation by means of a genome-wide ribosome profiling approach. My data suggest that translational efficiencies vary between life cycle stages of the parasite as well as between genes within one life cycle stage. Furthermore, using ribosome profiling I was able to identify many new putative un-annotated coding sequences and to evaluate the coding potential of upstream open reading frames (uORF). Comparing my results with previously published proteomic and RNA interference (RNAi) target sequencing (RIT-seq) datasets allowed me to validate some of the new coding sequences and to evaluate their relevance for the fitness of the parasite. In the second part of my thesis I used the transcriptomic and translatomic profiles obtained from the ribosome profiling analysis for the identification of putative non-coding RNAs (ncRNAs). These results led to the analysis of the coding potential in the regions upstream and downstream of the expressed variant surface glycoprotein (VSG), which is outlined in the third part of the results section. The region upstream of the VSG, the co-transposed region (CTR), has been implicated in an increase of the in situ switching rate upon its deletion. The ribosome profiling results indicated moderate transcription but not translation in this region. These results raised the possibility that the CTR may be transcribed into ncRNA. Therefore, in the third part of my thesis, I performed a primary characterization of the CTR-derived transcripts based on northern blotting and RACE. The results suggested the presence of a unique transcript species of about 1,200 nucleotides (nt) and polyadenylated at the 3’-end of the sequence. The deletion of the CTR sequence promoting and increase of the in situ switching rates was performed around 20 years ago by means of inserting reporter genes. With the recent development of endonuclease-based tools for genome editing, it is now possible to delete sequences in a marker-free way. In the fourth part of my thesis, I show the results on the implementation of the highly efficient genome-editing CRISPR-Cas9 system in T. brucei using episomes. As a proof of principle, I inserted the sequence coding for the enhanced green fluorescent protein (eGFP) at the end of the SCD6 coding sequence (CDS). Fluorescent cells were observed as early as two days after transfection. Therefore, after the successful set up of the CRISPR-Cas9 system it will be possible to modify genomic regions with more relevance for the biology of the parasite, such as the substitution of codons present in gene tandem arrays. The implementation of ribosome profiling in T. brucei opens the opportunity for the study of translational regulation in a genome-wide scale, the re-annotation of the currently available genome, the search for new putative coding sequences, the detection of putative ncRNAs, the evaluation of the coding potential in uORFs and the role of unstranslated regions (UTRs) in the regulation of translation. In turn, the implementation of the CRISPR-Cas9 system offers the possibility to manipulate the genome of the parasite at a nucleotide resolution and without the need of including resistant makers. The CRISPR-Cas9 system is a powerful tool for editing ncRNAs, UTRs, multicopy gene families and CDSs keeping their endogenous UTRs. Moreover, the system can be used for the modification of both alleles after just one round of transfection and of codons coding for amino acids carrying post-translational modifications (PTMs) among other possibilities.     N2 - Trypanosoma brucei ist nicht nur als Erreger der Schlafkrankheit von großer epidemiologischer Bedeutung, sondern dient auch der Zell-­‐ und Molekularbiologie – insbesondere zur Erforschung der Genregulation auf posttranskriptionaler Ebene – als wichtiger Modellorganismus. In den vergangenen 30 Jahren konnten mehrere Forschungsarbeiten zeigen, dass mRNA-­‐Stabilität und –Prozessierung maßgeblich zur Regulation der Genexpression beitragen. Anders als in den meisten Eukaryoten sind die Gene in T. brucei in polycistronischen Transkriptionseinheiten (PTUs) angeordnet. Die reife mRNA entsteht aus dem polycistronischen Transkript in einem gekoppelten Prozess aus Trans-­‐splicing und paralleler Polyadenylierung. Beide Vorgänge allein, mRNA-­‐Stabilität und –Prozessierung, reichen nicht aus, um die Regulation der Genexpression in T. brucei vollständing zu erklären und zusätzliche Mechanismen müssen wirksam sein. Daher habe ich im ersten Teil meiner hier vorliegenden Doktorarbeit die Genregulation auf Ebene der Translation mittels genomweitem Ribosome Profiling untersucht. Die dabei gewonnen Daten deuten darauf hin, dass die Translationseffizienzen nicht nur zwischen prozyklischen-­‐ und Blutstromformen des Parasiten differieren, sondern auch die Gene innerhalb eines Stadiums verschieden effizient translatiert werden. Zudem war es mir mit diesem Ansatz möglich, neue, noch nicht annotierte kodierende Sequenzen zu identifizieren und das Kodierungspotenzial der jeweils vorgelagerten offenen Leseraster (ORFs) zu evaluieren. Mithilfe bereits veröffentlichter Proteom-­‐ und RNA Interferenz-­‐ Studien (RIT-­‐seq) konnte ich einige der neu identifizierten kodierenden Sequenzen validieren und deren Bedeutung für die Fitness des Parasiten bestimmen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die ermittelten Translations-­‐ und Transkriptionsprofile miteinander verglichen, um auf diese Weise mögliche nicht-­‐kodierende RNAs (ncRNAs) zu identifizieren. Dies führte zu einer eingehenderen Betrachtung der Kodierungspotenziale der dem exprimierten variablen Oberflächenproteins (VSG) vor-­‐ und nachgeschalteten Regionen. In früheren Arbeiten wurde bereits beschrieben, dass eine Deletion der dem VSG vorgelagerten, sogenannten co-­‐transposed region (CTR), vermehrt zu einer Aktivierung einer alternativen VSG Expressionsseite (in situ switches) führt. Ribosome Profiling zeigte, dass eben jede Regionen zwar moderat transkribiert, jedoch nicht translatiert werden. Da diese Ergebnisse vermuten ließen, dass die CTR für eine ncRNA kodiert, hab ich im dritten Teil meiner Arbeit die CTR Transkripte mittels Northern Blot und RACE weiter charakterisiert. Auf diese Weise konnte ich spezifische, 1200 Nukleotide (nt) lange und am 3`-­‐Ende polyadenylierte Transkripte nachweisen. Die bereits erwähnte Deletion der CTR verbunden mit einer erhöhten Rate an in situ switches wurde vor etwa 20 Jahren durch Insertion von Reportergenen durchgeführt. Heute ist es möglich mithilfe von Endonukleasen Genome ohne solche Marker zu editieren. So beschreibt der vierte Teil der Arbeit die Konstruktion von Episomen zur Etablierung und Anwendung des CRISPR-­‐ Cas9 Systems in T. brucei. Als Machbarkeitsnachweis wurde die kodierende Sequenz des grün fluoreszierenden Proteins (eGFP) am Ende des SCD6 Gens als Fusionsprotein inseriert. Grün fluoreszierende Zellen konnten bereits zwei Tage nach der Transfektion nachgewiesen werden. Nachdem CRISPR-­‐Cas9 erfolgreich in T. brucei etabliert werden konnte, werde ich im Folgenden weitere relevante Regionen im Genom modifizieren und beispielsweise die Deletion zweier Histonvarianten durchführen. Die Ribosome Profiling Studie in T. brucei erlaubt es uns, genomweit Genregulation auf Ebene der Translation zu analysieren, das uns zurzeit vorliegende Genom zu re-­‐annotieren, neue kodierende Sequenzen wie auch ncRNAs zu identifizieren und den Einfluss nicht-­‐kodierender Sequenzen auf die Translation zu untersuchen. Gleichzeitig ermöglicht die Etablierung des CRISPR-­‐ Cas9 Systems in T. brucei eine hochpräzise Manipulation des Genoms ohne den Einsatz von Resistenzmarkern. Auf diese Weise ist es möglich, Gene zu modifizieren und dabei die zugehörigen untranslatierten Bereiche (UTRs) zu erhalten, aber auch ncRNAs, UTRs und mehrfache Kopien eines Gens (gleichzeitig) zu editieren. Ebenso können einzelne Kodons in der Sequenz und somit posttranslational modifizierte Aminosäuren im Genprodukt verändert werden, was uns weitere Möglichkeiten zur Erforschung der Genregulation eröffnet. KW - Trypanosoma brucei KW - Ribosom KW - Posttranskriptionelle Regulation KW - Trypanosoma brucei KW - Gene expression regulation KW - Ribosome profiling KW - CRISPR Cas9 KW - CRISPR Cas9 system Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133996 ER - TY - JOUR A1 - Siegel, T. Nicolai A1 - Vasquez, Juan-José A1 - Hon, Chung-Chau A1 - Vanselow, Jens T. A1 - Schlosser, Andreas T1 - Comparative ribosome profiling reveals extensive translational complexity in different Trypanosoma brucei life cycle stages N2 - While gene expression is a fundamental and tightly controlled cellular process that is regulated at multiple steps, the exact contribution of each step remains unknown in any organism. The absence of transcription initiation regulation for RNA polymerase II in the protozoan parasite Trypanosoma brucei greatly simplifies the task of elucidating the contribution of translation to global gene expression. Therefore, we have sequenced ribosome-protected mRNA fragments in T. brucei, permitting the genome-wide analysis of RNA translation and translational efficiency. We find that the latter varies greatly between life cycle stages of the parasite and ∼100-fold between genes, thus contributing to gene expression to a similar extent as RNA stability. The ability to map ribosome positions at sub-codon resolution revealed extensive translation from upstream open reading frames located within 5' UTRs and enabled the identification of hundreds of previously un-annotated putative coding sequences (CDSs). Evaluation of existing proteomics and genome-wide RNAi data confirmed the translation of previously un-annotated CDSs and suggested an important role for >200 of those CDSs in parasite survival, especially in the form that is infective to mammals. Overall our data show that translational control plays a prevalent and important role in different parasite life cycle stages of T. brucei. KW - Ribosom KW - Profilierung KW - Trypanosoma brucei KW - Entwicklung KW - Lebenszyklus Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-112657 ER - TY - THES A1 - Schwarz, Jessica Denise T1 - Genome-wide reporter screens identify transcriptional regulators of ribosome biogenesis T1 - Genomweite Reporterscreens identifizieren transkriptionelle Regulatoren ribosomaler Biogenese N2 - Cellular growth and proliferation are among the most important processes for cells and organisms. One of the major determinants of these processes is the amount of proteins and consequently also the amount of ribosomes. Their synthesis involves several hundred proteins and four different ribosomal RNA species, is highly coordinated and very energy-demanding. However, the molecular mechanims of transcriptional regulation of the protein-coding genes involved, is only poorly understood in mammals. In this thesis, unbiased genome-wide knockout reporter screens were performed, aiming to identify previously unknown transcriptional regulators of ribosome biogenesis factors (RiBis), which are important for the assembly and maturation of ribosomes, and ribosomal proteins (RPs), which are ribosomal components themself. With that approach and follow-up (validation) experiments, ALDOA and RBM8A among others, could be identified as regulators of ribosome biogenesis. Depletion of the glycolytic enzyme ALDOA led to a downregulation of RiBi- and RPpromoter driven reporters on protein and transcript level, as well as to a downregulation of ribosome biogenesis gene transcripts and of mRNAs of other genes important for proliferation. Reducing the amount of the exon junction complex protein RBM8A, led to a more prominent downregulation of one of the fluorescent reporters, but this regulation was independent of the promoter driving the expression of the reporter. However, acute protein depletion experiments in combination with nascent RNA sequencing (4sU-Seq) revealed, that mainly cytosolic ribosomal proteins (CRPs) were downregulated upon acute RBM8A withdrawal. ChIP experiments showed RBM8A binding to promoters of RP genes, but also to other chromatin regions. Total POL II or elongating and initiating POL II levels were not altered upon acute RBM8A depletion. These data provide a starting point for further research on the mechanisms of transcriptional regulation of RP and RiBi genes in mammals. N2 - Zelluläres Wachstum und Proliferation zählen zu den wichtigsten Prozessen für Zellen und Organismen. Eine der größten Determinanten dieser Prozesse ist die Menge an Proteinen und in der Konsequenz auch die Menge an Ribosomen. Deren Synthese erfordert mehrere hundert Proteine und vier verschiedene ribosomale RNA-Spezies, ist stark koordiniert und sehr energiefordernd. Dennoch sind die molekularen Mechanismen der transkriptionellen Regulation der beteiligten protein-kodierenden Gene in Säugetieren nur schlecht verstanden. In dieser Arbeit wurden hypothesenfreie genomweite Knockout-Reporterscreens mit dem Ziel durchgeführt, bisher unbekannte transkriptionelle Regulatoren von ribosomalen Biogenesefaktoren (RiBis), welche wichtig für den Zusammenbau und die Reifung der Ribosomen sind, und ribosomalen Proteinen (RPs), welche selbst ribosomale Bestandteile sind, zu identifizieren. Durch diesen Ansatz und nachfolgende (Validierungs- )Experimente, konnten unter anderem ALDOA und RBM8A als Regulatoren ribosomaler Biogenese identifiziert werden. Eine Depletion des glykolytischen Enzyms ALDOA führte sowohl zu einer Herunterregulation von RiBi- und RP-Promotor-gesteuerten Reportern auf Protein- und Transkriptebene, als auch zu einer Herunterregulation von ribosomalen Biogenesegentranskripten und von mRNAs anderer für die Proliferation wichtiger Gene. Eine Reduktion der Menge des Exon-Junction-Komplexproteins RBM8A führte zu einer deutlicheren Herunterregulation eines der beiden fluoreszierenden Reporter, aber diese Regulation war unabhängig vom Promotor, der die Expression des Reporters steuert. Akute Proteinabbauexperimente in Verbindung mit einer Sequenzierung naszenter RNA (4sU-Seq) zeigten allerdings, dass hauptsächlich zytosolische ribosomale Proteine (CRPs) nach akuter RBM8A-Depletion herunterreguliert waren. ChIP-Experimente zeigten RBM8A-Bindung an Promotoren von RP-Genen, aber auch an andere Chromatinregionen. Gesamt-POL II- oder elongierende und initiierende POL II-Mengen waren nach akuter RBM8A-Depletion nicht verändert. Diese Daten stellen einen Ausgangspunkt für weitere Forschung zu den Mechanismen transkriptioneller Regulation von RP- und RiBi-Genen in Säugetieren dar. KW - Ribosom KW - Fructosebisphosphat-Aldolase KW - Transkription KW - Genregulation KW - ribosome biogenesis KW - Rbm8a KW - genetic screen KW - reporter screen Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-279010 ER - TY - THES A1 - Deng, Chunchu T1 - Dynamic remodeling of endoplasmic reticulum and ribosomes in axon terminals of wildtype and Spinal Muscular Atrophy motoneurons T1 - Dynamische Reorganization des endoplasmatischen Retikulums und der Ribosomen in Axonterminalen von Wildtyp- und Spinaler Muskelatrophie Motoneuronen N2 - In highly polarized neurons, endoplasmic reticulum (ER) forms a dynamic and continuous network in axons that plays important roles in lipid synthesis, Ca2+ homeostasis and the maintenance of synapses. However, the mechanisms underlying the regulation of axonal ER dynamics and its function in regulation of local translation still remain elusive. In the course of my thesis, I investigated the fast dynamic movements of ER and ribosomes in the growth cone of wildtype motoneurons as well as motoneurons from a mouse model of Spinal Muscular Atrophy (SMA), in response to Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) stimulation. Live cell imaging data show that ER extends into axonal growth cone filopodia along actin filaments and disruption of actin cytoskeleton by cytochalasin D treatment impairs the dynamic movement of ER in the axonal filopodia. In contrast to filopodia, ER movements in the growth cone core seem to depend on coordinated actions of the actin and microtubule cytoskeleton. Myosin VI is especially required for ER movements into filopodia and drebrin A mediates actin/microtubule coordinated ER dynamics. Furthermore, we found that BDNF/TrkB signaling induces assembly of 80S ribosomes in growth cones on a time scale of seconds. Activated ribosomes relocate to the presynaptic ER and undergo local translation. These findings describe the dynamic interaction between ER and ribosomes during local translation and identify a novel potential function for the presynaptic ER in intra-axonal synthesis of transmembrane proteins such as the α-1β subunit of N-type Ca2+ channels in motoneurons. In addition, we demonstrate that in Smn-deficient motoneurons, ER dynamic movements are impaired in axonal growth cones that seems to be due to impaired actin cytoskeleton. Interestingly, ribosomes fail to undergo rapid structural changes in Smn-deficient growth cones and do not associate to ER in response to BDNF. Thus, aberrant ER dynamics and ribosome response to extracellular stimuli could affect axonal growth and presynaptic function and maintenance, thereby contributing to the pathology of SMA. N2 - Das Endoplasmatische Retikulum (ER) bildet ein dynamisches und kontinuierliches Netzwerk in Axonen von stark polarisierten Neuronen und spielt dabei eine wichtige Rolle in der Lipidsynthese, dem Ca2+ Homöostase und der Aufrechterhaltung von Synapsen. Allerding sind die Mechanismen, die der Regulierung der axonalen ER-Dynamik und seiner Funktion bei der dynamischen Regulierung der lokalen Translation zugrunde liegen, nicht vollständig aufgeklärt. Im Rahmen meiner Dissertation habe ich die schnellen dynamischen Bewegungen des ERs und Ribosomen in Wachstumskegeln von Wildtyp- und Smn-defizienten Motoneuronen als Reaktion auf einen kurzen Puls von Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) untersucht. Daten der Bildgebung lebender Zellen zeigen, dass sich das ER in axonalen Filopodien des Wachstumskegels entlang von Aktin-Filamenten ausbreitet. Die Beeinträchtigung des Aktin-Zytoskeletts mittels Cytochalasin D Behandlung führt zu einer Einschränkung der dynamischen Bewegung des ERs in den axonalen Filopodien. Im Gegensatz zu den Filopodien scheinen die Bewegungen des ERs in Wachstumskegeln von einem koordinierten Zusammenspiel des Aktin- und Mikrotubuli- Zytoskeletts zu beruhen. Myosin VI ist insbesondere für die ER-Bewegungen in Filopodien erforderlich, während Drebrin A die Aktin/Mikrotubuli koordinierte ER-Dynamik vermittelt. Darüber hinaus zeigte sich, dass das BDNF/TrkB Signal die Bildung von 80S-Ribosomen in Wachstumskegeln in Sekundenschnelle auslöst. Aktivierte Ribosomen verlagern sich in das präsynaptische ER und vollziehen eine lokale Translation. Diese Ergebnisse beschreiben die dynamische Interaktion zwischen ER und Ribosomen während der lokalen Translation und zeigen eine neuartige potentielle Funktion des präsynaptischen ER bei der intra-axonalen Synthese von Transmembranproteinen wie die α-1β Untereinheit der N-Typ Ca2+ Kanäle in Motoneuronen auf. Darüber hinaus zeigen wir, dass in Smn-defizienten Motoneuronen die dynamischen ER-Bewegungen in axonalen Wachstumskegeln beeinträchtigt sind, was mit einer gestörten Polymerisation von Aktinfilamenten zusammenzuhängen scheint. Interessanterweise erfahren Ribosomen in Smn-defizienten Wachstumskegeln keine schnellen strukturellen Veränderungen und assoziieren nicht mit dem ER als Reaktion auf BDNF. Somit könnten eine abweichende ER-Dynamik und die Reaktion der Ribosomen auf extrazelluläre Reize das axonale Wachstum und die präsynaptische Funktion und Aufrechterhaltung beeinträchtigen und damit zur Pathologie von SMA beitragen. KW - Motoneuron KW - Endoplasmatisches Retikulum KW - Ribosom KW - Brain-derived neurotrophic factor KW - Spinale Muskelatrophie KW - ER dynamics in axon terminals KW - Dynamics of ribosome assembly KW - BDNF stimulation KW - Spinal Muscular Atrophy Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-264954 ER -