TY - THES A1 - Maimari, Theopisti T1 - The influence of N-terminal peptides of G-protein coupled receptor kinase (GRK) 2, 3 and 5 on β-adrenergic signaling T1 - Der Einfluss von N-terminalen Peptiden der G-Protein gekoppelten Rezeptorkinasen (GRK) 2, 3 und 5 in der β-adrenergen Signaltransduktion N2 - G protein coupled receptor kinases (GRK) phosphorylate and thereby desensitize G protein coupled receptors (GPCR) including β-adrenergic receptors (βAR), which are critical regulators of cardiac function. We identified the Raf kinase inhibitor protein (RKIP) as an endogenous inhibitor of GRK2 that leads to increased cardiac contractility via βAR activation. RKIP binds to the N-terminus (aa1-185) of GRK2, which is important for the GRK2/receptor interaction. Thereby it interferes with the GRK2/receptor interaction without interference with cytosolic GRK2 target activation. In this project, the RKIP/GRK interface was investigated to develop strategies that simulate the effects of RKIP on βAR. RKIP binding to different isoforms of GRK expressed in the heart was analyzed by protein interaction assays using full-length and N-termini of GRK2, GRK3 and GRK5: 1-53, 54-185 and 1-185. Co-immunoprecipitation (Co-IPs) and pull-down assays revealed that RKIP binds to the peptides of GRK2 and GRK3 but not to the ones of GRK5, which suggests the existence of several binding sites of RKIP within the N-termini of GRK2 and GRK3. To analyze whether the peptides of GRK2 and GRK3 are able to simulate the RKIP mediated interference of the GRK2/receptor interaction, we analyzed the β2-AR phosphorylation in the absence and presence of the peptides. Interestingly, N-termini (aa1-185) of GRK2 and GRK3 reduced β2AR phosphorylation to a comparable extent as RKIP. In line with reduced receptor phosphorylation, the peptides also reduced isoproterenol-stimulated receptor internalization as shown by [3H] CGP-12177 radioligand binding assay and fluorescence microscopy compared to control cells. Subsequently, these peptides increased downstream signaling of β2AR, i.e. the phosphorylation of the PKA substrate phosducin. In an attempt to elucidate the mechanism behind the observed effects, Co-IPs were performed in order to investigate whether the peptides bind directly to the β2-AR and block its phosphorylation by GRK2. Indeed, GRK2 1-185 and GRK3 1-185 could bind the receptor, suggesting that this way GRK2 is prevented from inhibiting the receptor. To investigate the physiological effect of GRK2 1-185, GRK3 1-185 and GRK5 1-185, their effect on neonatal mouse cardiomyocyte contractility and hypertrophy was analyzed. After long-term isoproterenol stimulation, in the presence of GRK2 1 185 and GRK3 1-185 the cross-sectional area of the cardiomyocytes showed no significant increase in comparison to the unstimulated control cells. In addition, upon isoproterenol stimulation, GRK2 1-185 and GRK3 1-185 increased the beat rate in cardiomyocytes, mimicking RKIP while the base impedance, an indicator of viability, remained stable. The N-termini (1-185) of GRK2 and GRK3 simulated RKIP’s function and had a significant influence on β2AR phosphorylation, on its downstream signaling and internalization, could bind β2-AR, increased beat rate and did not significantly induce hypertrophy, suggesting that they may serve as a model for the generation of new and more specific targeting strategies for GRK mediated receptor regulation. N2 - G-Protein gekoppelte Rezeptorkinasen (GRK) phosphorylieren und desensitisieren G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR), einschließlich β-adrenerge Rezeptoren (βAR), welche wichtige Regulatoren der Herzfunktion sind. Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP) ist ein endogener Inhibitor von GRK2, der zur Aktivierung von βAR führt und dadurch zur Steigerung der Herzkontraktilität. RKIP bindet N-terminal (1-185) an GRK2; der GRK2 N-Terminus ist wichtig für die GRK2/Rezeptor Interaktion. Durch diese Bindung wird GRK2 inhibiert und derer Interaktion mit den Rezeptor gestört, allerdings bleiben die zytosolische GRK2 Substrate unbeeinflusst. In diesem Projekt wurde die Interaktion zwischen RKIP und GRK untersucht, um neue Targeting Strategien zu entwickeln, die die positiven Effekte von RKIP auf βAR Signalwege simulieren. Die Bindung von RKIP an verschiedene, im Herzen lokalisierte GRK-Isoformen wurde über protein interaction assays untersucht: mit GRK2, GRK3 und GRK5 und mit deren N-terminalen Peptiden 1-53, 54-185, 1-185. Die Co-Immunopräzipitationen (Co-IPs) und die pull-down Versuche haben gezeigt, dass RKIP sowohl GRK2 und GRK3 als auch deren N-Termini bindet, GRK5 und dessen N-termini hingegen nicht. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass sich mehrere RKIP Bindungsstellen an dem GRK2 N-Terminus befinden. Um zu analysieren, ob die GRK2- und GRK3-Peptide eine ähnliche Wirkung wie RKIP auf die Interaktion von GRK2 und Rezeptor aufweisen, wurde die Rezeptorphosphorylierung ermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass GRK2 1-185 und GRK3 1-185 die Phosphorylierung des βAR reduzieren können. Radioligandbindungsassays mit [3H] CGP-12177 und Fluoreszenzmikroskopie zeigten zudem, dass GRK2 1-185 und GRK3 1-185 auch die Internalisierungsrate des βAR senken können. Anschließend hatten GRK2 1-185 und GRK3 1-185 einen positiven Effekt auf einem βAR downstream Signalmolekül. Hierbei handelte es sich um die Phosphorylierung von Phosducin, was ein PKA-Substrat ist. Um die Wirkungsweise der N-termini zu erläutern, wurde untersucht, ob diese direkt den β2AR binden und somit die GRK2 vermittelte Phosphorylierung hindern. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass GRK2 1-185 und GRK3 1- 185 den β2AR binden und dementsprechend einen Einfluss auf die Phosphorylierung haben. Des Weiteren, wurden die Effekte der Peptide auf Kontraktilität und Hypertrophie in neonatalen Mauskardiomyozyten analysiert. In Anwesenheit von GRK2 1-185 und GRK3 1-185 war die Querschnittsfläche der Mauskardiomyozyten nicht signifikant größer im Vergleich zu den unstimulierten Kontrollzellen. Außerdem wurde eine signifikante Erhöhung der Kontraktilität in den Mauskardiomyozyten mit GRK2 1-185 und GRK3 1-185 beobachtet. Insgesamt, konnten GRK2 1-185 und GRK3 1-185 RKIPs Funktion simulieren: sie hatten einen signifikanten Effekt auf β2AR-Phosphorylierung, Internalisierung und downstream Signaling. Zudem konnten sie die Kontraktilität erhöhen und hatten keinen Einfluss auf Hypertrophie. Somit könnten sie als Prototyp für die Entwicklung neuer Targeting Strategien für die GRK-vermittelte Rezeptor Regulation, genutzt werden. KW - G protein-coupled receptor kinase KW - Raf kinase inhibitor protein KW - Inhibition KW - Heart failure KW - Peptides Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199322 ER - TY - THES A1 - Hagmann, Hanns Antony T1 - The impact of the CRISPR/Cas system on the interaction of Neisseria meningitidis with human host cells T1 - Der Einfluss des CRISPR/Cas-Systems auf die Interaktion von Neisseria meningitidis mit menschlichen Wirtszellen N2 - Neisseria meningitidis, a commensal β-proteobacterium residing exclusively in the human nasopharynx, is a leading cause of sepsis and epidemic meningitis worldwide. While comparative genome analysis was able to define hyperinvasive lineages that are responsible for most of the cases of invasive meningococcal disease (IMD), the genetic basis of their virulence remains unclear. Recent studies demonstrate that the type II C CRISPR/Cas system of meningococci is associated with carriage and less invasive lineages. CRISPR/Cas, an adaptive defence system against foreign DNA, was shown to be involved in gene regulation in Francisella novicida. This study shows that knockout strains of N. meningitidis lacking the Cas9 protein are impaired in the adhesion to human nasopharyngeal cells in a strain-dependant manner, which constitutes a central step in the pathogenesis of IMD. Consequently, this study indicates that the meningococcal CRISPR/Cas system fulfils functions beyond the defence of foreign DNA and is involved in the regulation of meningococcal virulence. N2 - Neisseria meningitidis, ein ß-Proteobakterium, welches als Kommensale ausschließlich den humanen Nasopharynx besiedelt, ist ein weltweit führender Verursacher von Sepsis und epidemischer Meningitis. Auch wenn mittels vergleichender Genomanalysen hyperinvasive Stämme definiert werden konnten, welche für die meisten Fälle von invasiven Meningokokkenerkrankungen verantwortlich sind, bleibt die genetische Grundlage ihrer Virulenz ungeklärt. In vorangegangenen Studien konnte gezeigt werden, dass das Typ II-C CRISPR/Cas-System der Meningokokken assoziiert ist mit Trägerstämmen. CRISPR/Cas ist ein adaptives Verteidigungssystem der Bakterien gegen fremde DNA, das darüber hinaus Aufgaben in der Genregulation von Francisella novicida erfüllt. Diese Arbeit zeigt, dass knockout Stämme von N. meningitidis, denen das Cas9-Protein fehlt, in Abhängigkeit von ihrem genetischen Hintergrund die Fähigkeit verlieren an Zellen des menschlichen Nasopharynx zu adhärieren. Die Adhäsion an den Wirtszellen stellt einen zentralen Schritt in der Pathogenese der invasiven Meningokokkenerkrankungen dar. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass das CRISPR/Cas-System in Meningokokken neben seiner Funktion als bakterielles Immunsystem an der Regulation der bakteriellen Virulenz beteiligt sein könnte. KW - CRISPR/Cas-Methode KW - Neisseria meningitidis KW - Bacteria-Host Cell Interaction KW - Regulation of Gene Expression KW - Cas9 KW - Type II-C CRISPR/Cas KW - Adhesion and Invasion Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199490 ER - TY - THES A1 - John, Vini T1 - Interaction of mycobacteria with myeloid-derived suppressor cells T1 - Wechselwirkung von Mykobakterien mit myeloiden Suppressorzellen N2 - Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) constitute of monocytic (M-MDSCs) and granulocytic cell subsets (G-MDSCs)and were initially described as suppressors of T-cell function in tumor microenvironments. Recent studies have shown the involvement of MDSCs in a number of infectious diseases including Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection. MDSCs are tremendously accumulated in patients with Mtb infection and exert a suppressive effect on T cell responses against mycobacteria. Mycobacterium bovis BCG, the only available vaccine against Mtb fails to protect against the adult pulmonary tuberculosis (TB). Understanding the mechanisms of MDSC suppression for immunity against mycobacterial infection will provide a rational basis to improve anti- TB vaccination and host-directed therapies against TB. In this study, we investigated the role of three lipid-rich components of the plasma membrane, Caveolin-1(Cav-1), Acid Sphingomyelinase (ASM) and asialo-GM1 on BCG-activated MDSCs. Cav-1 is one of the vital components of caveolae (plasma membrane invaginations) which regulates apoptosis and lipid metabolism. In this work, we found that MDSCs upregulated Cav-1, TLR4 and TLR2 expression after BCG infection on the cell surface. However, Cav-1 deficiency resulted in a selective defect in the intracellular TLR2 accumulation in the M-MDSC, but not G-MDSC subset. Further analysis indicated no difference in the phagocytosis of BCG by M-MDSCs from WT and Cav1-/- mice but a reduced capacity to up-regulate surface markers, to secrete various cytokines, induce iNOS and NO production. These defects correlated with deficits of Cav1-/- MDSCs in the suppression of T cell proliferation. Among the signaling pathways that were affected by Cav-1 deficiency, we found lower phosphorylation of NF-kB and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) in BCG - activated MDSCs. ASM is an enzyme present in lysosomes and is translocated to the cell surface where it hydrolyzes sphingomyelin into ceramide. Flow cytometric studies revealed that MDSCs phagocytosed BCG independent of inhibiting ASMase using pharmacological inhibitors (amitryptiline or desipramine) or MDSCs from WT and ASM-/-. Suppression of ASMase or using ASM-/- MDSCs resulted in reduced NO production and decreased cytokine secretion by MDSCs in response to BCG. Furthermore, MDSCs inhibited by amitryptiline had impaired AKT phosphorylation upon BCG infection. Asialo-GM1 is a ganglioside expressed on the cell surface of MDSCs reported to cooperate with TLR2 for activating ERK signaling. Here, in this study, we found that asialo-GM1 expression was upregulated specifically upon mycobacterial infection and not upon any other stimulus. We noted that the soluble form of asialo-GM1 bound to BCG. Flow cytometric studies revealed that blocking 81 asialo-GM1 did not affect the phagocytosis of BCG into MDSCs. Furthermore, blocking of asialo- GM1 had no effect on the cytokine and NO secretion or AKT signaling. Collectively, the data presented in this work implicated that Cav-1, ASM, asialo-GM1 are dispensable for the internalization of BCG. Rather, Cav-1 and ASM are required for the functional activation of MDSCs. Although asialo-GM1 binds to BCG, we did not find any difference in the functional activation of MDSCs after blocking asialo-GM1. This study provides insights into the role of lipid raft components of the MDSC cell membrane during mycobacterial infection. N2 - Myeloide Suppressorzellen (engl, myeloid-derived suppressor cells MDSCs) bestehen aus monozytischen (M-MDSCs) und granulozytären Subtypen (G-MDSCs) und wurden anfangs als Suppressoren der T-Zellfunktion in Tumormikroumgebungen beschrieben. Kürzlich durchgeführte Studien haben gezeigt, dass MDSCs an einer Reihe von Infektionskrankheiten beteiligt sind, einschließlich einer Infektion mit Mycobacterium tuberculosis (Mtb). MDSCs sind bei der Patienten Mtb-Infektion enorm akkumuliert und üben eine supprimierende Wirkung auf die T-Zell-Antworten gegen Mykobakterien aus. Mycobacterium bovis BCG, der einzige verfügbare Impfstoff gegen Mtb, schützt nicht gegen die Lungentuberkulose bei Erwachsenen (TB). Das Verständnis der Mechanismen über welche MDSCs eine der Immunsuppression bei mykobakteriellen Infektionen vermitteln, bilden eine rationale Grundlage für die Verbesserung der Anti-TB-Impfung und Therapien gegen TB. In dieser Studie wurden die Rolle der drei lipidreichen Komponenten der Plasmamembran, Caveolin-1 (Cav-1), Saure Sphingomyelinase (ASM) und Asialo-GM1 bei BCGaktivierten MDSCs untersucht. Cav-1 ist eine der Komponenten von Caveolae (Plasmamembran-Invagination), die die Apoptose und den Fettstoffwechsel regulieren. Diese Arbeit zeigte, dass MDSCs die Expression von Cav-1, TLR4 und TLR2 nach BCG-Infektion auf der Zelloberfläche hochregulierten. Eine Cav-1 Defizienz führte jedoch zu einem selektiven Defekt in der intrazellulären TLR2-Akkumulation bei MMDSCs, jedoch nicht bei G-MDSCs. Weitere Analysen zeigten keinen Unterschied in der Phagozytose von BCG durch M-MDSCs von WT- und Cav1-/- Mäusen, jedoch eine verringerte Fähigkeit, Oberflächenmarker hoch zu regulieren, verschiedene Zytokine zu sekretieren und die Produktion von iNOS und NO zu induzieren. Diese Defekte korrelierten mit Defiziten von Cav1-/- MDSCs bei der Unterdrückung der T-Zell-Proliferation. Unter den von Cav-1-Mangel betroffenen Signalwegen fanden wir eine geringere Phosphorylierung der NF-KB- und p38- Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) in BCG-aktivierten MDSCs. ASM ist ein in Lysosomen vorhandenes Enzym, das an die Zelloberfläche transloziert wird, wo es Sphingomyelin zu Ceramid hydrolysiert. Durchflusszytometrische Studien ergaben, dass MDSCs BCG unabhängig von der Hemmung von ASMase mit pharmakologischen Inhibitoren (Amitryptilin oder Desipramin) oder MDSCs von ASM-/- Mäusen BCG phagozytierten. Die Suppression von ASMase oder die Verwendung von ASM-/- MDSCs führte zu einer verringerten NO Produktion und einer verringerten Zytokinsekretion durch MDSCs als Antwort auf BCG. Darüber hinaus hatten MDSCs, die durch Amitryptilin inhibiert wurden, die AKT-Phosphorylierung bei einer BCG-Infektion beeinträchtigt. Asialo-GM1 ist ein Gangliosid, das auf der Zelloberfläche von MDSCs exprimiert wird, von dem berichtet wurde, dass es mit TLR2 kooperiert, um ERK-Signale zu aktivieren. Hier in dieser Studie haben wir festgestellt, dass die Expression von Asialo-GM1 spezifisch bei mycobakterieller Infektion und nicht bei einem anderen Stimulus hochreguliert wurde. Wir haben festgestellt, dass die lösliche Form von Asialo-GM1 an BCG binden kann. Durchflusszytometrische Studien ergaben, dass die Blockade von Asialo-GM1 die Phagozytose von BCG in MDSCs nicht beeinflusst. Darüber hinaus hatte die Blockierung von Asialo-GM1 keinen Einfluss auf die Zytokin- und NO-Sekretion oder das AKT-Signal. Zusammenfassend ergaben die in dieser Arbeit präsentierten Daten, dass Cav-1, ASM, asialoGM1 für die Internalisierung von BCG entbehrlich sind. Dagegen sind Cav-1 und ASM für die funktionale Aktivierung von MDSCs erforderlich. Obwohl Asialo-GM1 an BCG bindet, konnten wir nach der Blockierung von Asialo-GM1 keinen Unterschied in der funktionellen Aktivierung von MDSCs feststellen. Diese Studie liefert Einblicke in die Rolle einiger Komponenten der lipid-reicher Areale der MDSC-Zellmembran bei mykobakteriellen Infektionen. KW - MDSCs KW - BCG KW - Caveolin-1 KW - ASM KW - asialoGM1 KW - BCG KW - nitric oxide Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-183501 ER - TY - THES A1 - Martens, Johannes T1 - Development of an In-Silico Model of the Arterial Epicardial Vasculature T1 - Entwicklung eines in-silico Modells der arteriellen epikardialen Vaskulatur N2 - In dynamic CE MR perfusion imaging the passage of an intravenously injected CA bolus through tissue is monitored to assess the myocardial pefusion state. To enable this, knowledge of the shape of CA wash-in through upstream epicardial vessels is required, the so-called AIF. For technical reasons this cannot be quantified directly in the supplying vessels and is thus measured in the left ventricle, which introduces the risk of systematic errors in quantification of MBF due to bolus dispersion in coronary vessels. This means occuring CA dispersion must be accounted in the quantification process in order to produce reliable and reproducible results. In order to do this, CFD simulations are performed to analyze and approximate these errors and deepen insights and knowledge gained from previous CFD analyses on both idealized as well as realistic and pathologically altered 3D geometries. In a first step, several different procedures and approaches are undertaken in order to accelerate the performed workflow, however, maintaining a sufficient degree of numerical accuracy. In the end, the implementation of these steps makes the analysis of the cardiovascular 3D model of unprecedented detail including vessels at pre-arteriolar level feasible at all. The findings of the Navier-Stokes simulations are thus validated with regard to different aspects of cardiac blood flow. These include the distribution of VBF into the different myocardial regions, the areals, which can be associated to the large coronary arteries as well as the fragmentation of VBF into vessels of different diameters. The subsequently performed CA transport simulations yield results on the one hand confirming previous studies. On the other hand, interesting additional knowledge about the behavior of CA dispersion in coronary arteries is obtained both regarding travelled distance as well as vessel diameters. The relative dispersion of the so-called vascular transport function, a characterizing feature of vascular networks, shows a linear decrease with vessel diameter. This results in asymptotically decreased additional dispersion of the CA time curve towards smaller and more distal vessels. Nonetheless, perfusion quantification errors are subject to strong regional variability and reach an average value of $(-28\pm16)$ \% at rest across the whole myocardium. Depending on the distance from the inlet and the considered coronary tree, MBF errors up to 62 \% are observed. N2 - Bei der Messung der myokardialen Perfusion mittels Kontrastmittel (KM)-gestützter Magnet Resonanz Tomographie (MRT) wird die zeitliche Entwicklung der Anströmung eines intravenös injizierten Kontrastmittel-Bolus im Herzmuskelgewebe gemessen und hinsichtlich des Myokardialen Blutflusses (MBF) ausgewertet. Zusätzlich zum Signal des KM im Gewebe ist für eine Quantifizierung des MBF außerdem aber die sogenannte arterielle Eingangsfunktion (AEF) notwendig. Diese Funktion beschreibt, wie das KM durch das versorgende koronare Blutgefäß ins Gewebe einströmt. Aus technischen Gründen ist die AEF nicht direkt messbar, weshalb sie in der Regel im großen Blutvolumen des linken Ventrikels bestimmt wird. Da der KM-Bolus auf dem Weg vom linken Ventrikel aufgrund der Strömungsverhältnisse in den Herzkranzgefäßen einer zeitlichen und räumlichen Veränderung, sogenannter Dispersion unterliegt, birgt die Verwendent der AEF aus dem linken Ventrikel das Risiko systematischer Fehler bei der MBF-Quantifizierung mit dieser Methode. Für eine reproduzierbare und verlässliche Perfusionsmessung mittels KM-gestützter MRT ist daher die Berücksichtigung der Bolus-Dispersion zwingend erforderlich. Um diese Effekte zu untersuchen und eine Fehlerabschätzung zu ermöglichen, werden in dieser Arbeit fluid-mechanische Berechnungen (Computational Fluid Dynamics, CFD) des Blutflusses und KM-Transports in 3D Geometrien von Herzkranzgefäßen durchgeführt. CFD Simulationen auf realistischen Gefäßgeometrien, wie sie hier präsentiert werden, gehen mit speziellen Anforderungen einher. Dies betrifft sowohl die technische Durchführbarkeit als auch die Wahl der Randbedingungen um physiologisch korrekte Ergebnisse zu erhalten. In dieser Arbeit werden daher verschiedene Ansätze angewendet und validiert, um die zeitlich effiziente aber dennoch numerisch akkurate Berechnung des Blutflusses und KM-Transports in hochdetaillierten 3D Geometrien der kardialen Vaskulatur unter Verwendung realistischer Randbedingungen überhaupt erst zu ermöglichen. Anschließend werden die Ergebnisse der Blutfluss-Simulationen hinsichtlich verschiedener Aspekte validiert. Dies beinhaltet sowohl die Verteilung des gesamten Blutvolumens in die verschiedenen Regionen des Myokards, die Zuordnung dieser Regionen zu den großen epikardialen Gefäßen (die rechte und die Hauptadern der linken Koronarie) sowie das Verhältnis des Volumen-Blut-Flusses zur Größe des betrachteten Gefäßes. Anschließend werden die Ergebnisse der Blutfluss-Simulationen verwendet, um die CFD-Analyse des KM-Transports in den kleinen koronaren Gefäßen durchzuführen. Diese Analysen bestätigen zum Einen die Erkenntnisse aus vorherigen Arbeiten, liefern jedoch wichtige neue Erkenntnisse über auftretende KM-Dispersion in Abhängigkeit sowohl des Gefäßdurch\-messers als auch des zurückgelegten Wegs des KM. Hierfür wird die sogenannte vaskuläre Transportfunktion (VTF) verwendet. Sie beschreibt die Veränderung der AEF auf dem Weg vom linken Ventrikel durch die Herzkranzgefäße aufgrund der Gefäßbeschaffenheit. Die relative Dispersion (RD) der VTF kann als charakteristische Größe eines vaskulären Netzwerks betrachtet werden und die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen eine lineare Abnahme der RD mit dem Gefäßdurchmesser. Dies hat zur Folge, dass die zeitliche Verbreiterung der AEF selbst eine asmptotische Sättigung in kleineren distalen Gefäßen aufweist. Nichtsdestotrotz zeigen die Untersuchungen dieser Arbeit, dass die Fehler der Perfusionsquantifizierung mit Bolus-basierten MRT-Messungen starker regionaler Variabilität unterliegen. Im Ruhezustand beträgt dieser Fehler $(-28\pm16)$ \% im Durchschnitt über den gesamten Herzmuskel. In Abhängigkeit vom Abstand zum Inlet des Gefäßmodells und des betrachteten Koronarbaums wird eine maximale Unterschätzung von bis zu 62 \% beobachtet. KW - Computerunterstütztes Verfahren KW - Magnetische Resonanz KW - Kardiologie KW - Computational Fluid Dynamics KW - Contrast Agent Bolus Based Perfusion Magnetic Resonance Imaging KW - Numerische Fluidmechanik KW - Kontrastmittel-gestützte MRT-Perfusionsmessung Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-182478 ER - TY - THES A1 - Höfner, Christiane T1 - Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a 3D Spheroid Culture System - Extracellular Matrix Development, Adipogenic Differentiation, and Secretory Properties T1 - Humane mesenchymale Stammzellen aus dem Fettgewebe in einem 3D Sphäroid Kultursystem - Entwicklung der Extrazellulärmatrix, adipogene Differenzierung und sekretorische Eigenschaften N2 - The ability to differentiate into mesenchymal lineages, as well as immunomodulatory, anti-inflammatory, anti-apoptotic, and angiogenic properties give ASCs great therapeutic potential. Through their culture as multicellular, three-dimensional spheroids this potential can even be enhanced. Accordingly, 3D spheroids are not only promising candidates for the application in regenerative medicine and inflammatory disease therapy, but also for the use as building blocks in tissue engineering approaches. Due to the resemblance to physiological cell-cell and cell-matrix interactions, 3D spheroids gain higher similarity to real tissues, what makes them a valuable tool in the development of bioactive constructs equivalent to native tissues in terms of its cellular and extracellular structure. Especially, to overcome the still tremendous clinical need for adequate implants to repair soft tissue defects, 3D spheroids consisting of ASCs are a promising approach in adipose tissue engineering. Nevertheless, studies on the use of ASC-based spheroids as building blocks for fat tissue reconstruction have so far been very rare. In order to optimally exploit their therapeutic potential to further their use in regenerative medicine, including adipose tissue engineering approaches, a 3D spheroid model consisting of ASCs was characterized extensively in this work. This included not only the elucidation of the structural features, but also the differentiation capacity, gene expression, and secretory properties. In addition, the elucidation of underlying mechanisms contributing to the improved therapeutic efficiency was addressed. N2 - Humane mesenchymale Stammzellen aus dem Fettgewebe (ASCs) verfügen über ein großes therapeutisches Potenzial. Dieses reicht von ihrer Fähigkeit zur Differenzierung entlang der mesenchymalen Linien bis hin zu entzündungshemmenden und immunmodulatorischen Eigenschaften, was sie zu vielversprechenden Kandidaten im Einsatz für die regenerative Zelltherapie macht. Die Routinekultur dieser Zellen unter herkömmlichen 2D-Kulturbedingungen führt durch den Verlust der Umgebung in einem dreidimensionalen Gewebeverbund zur Beeinträchtigung ihrer regenerativen Fähigkeiten. Die Kultivierung in dreidimensionalen Zellaggregaten (Sphäroiden), in denen die Zellen in einem mehr physiologischen 3D Verbund innerhalb ihrer sekretierten Matrix interagieren können, erscheint somit als geeignete Möglichkeit das therapeutische Potential von ASCs zu steigern. Dies macht ASC-basierte Sphäroide nicht nur zu einem vielversprechenden Ansatz in der regenerativen Medizin im Allgemeinen, sondern auch zu einem innovativen Tool in ihrer Verwendung als „Bausteine“ für das Konzept des Tissue Engineerings. Insbesondere im Bereich des Fettgewebe-Engineerings besteht ein immenser klinischer Bedarf an der Entwicklung geeigneter Implantate für die Rekonstruktion von Weichteildefekten. Hierfür erscheinen Sphäroide aus den leicht und in ausreichender Menge zu isolierenden ASCs besonders attraktiv. Der effektive Einsatz solcher Sphäroide in der regenerativen Medizin, sowie im Fettgewebe-Engineering, erfordert jedoch zunächst ihre umfassende Charakterisierung in Bezug auf Strukturmerkmale, Differenzierungsfähigkeit und sekretorische Eigenschaften. Dazu wurden im ersten Teil dieser Arbeit der Prozess der Sphäroidbildung sowie die daran beteiligten Zell-Zell- und Zell-ECM-Interaktionen untersucht. Mit Hilfe der sogenannten Liquid-Overlay Technik gelang die reproduzierbare und kontrollierte Zusammenlagerung der ASCs in dreidimensionale Sphäroide innerhalb von 24 h. Hinsichtlich der Entwicklung von Extrazellulärmatrix-Komponenten während der Sphäroidbildung zeigte sich Fibronektin als die Matrix-Komponente, welche als Erste während des Prozesses zu detektieren war. Durch das Blockieren des Fibronektin-spezifischen β1-Integrins mittels eines spezifischen Antikörpers konnte ein Einfluss dieser frühen Fibronektin-Expression auf den Verlauf der Zellaggregation gezeigt werden. Bei dem hier blockierten β1-Integrin handelt es sich um einen zellulären Rezeptor, welcher maßgeblich an der Fibronektinbindung beteiligt ist. Eine Abhängigkeit der Sphäroidbildung von der Zell-Zell Interaktion mittels Cadherine konnte hingegen für die ASCs nicht nachgewiesen werden. Somit konnten im ersten Abschnitt neben einer detaillierten Beschreibung der ASC-Sphäroidbildung zusätzlich erste Erkenntnisse über die dem Prozess zugrundeliegenden Mechanismen gewonnen werden. Der effektive Einsatz von ASC-basierten Sphäroiden als Bausteine für das Fettgewebe-Engineering erfordert Kenntnisse sowohl über die Entwicklung der ECM als wichtigen gewebe-inhärenten Faktor, als auch über eine effiziente adipogene Induktion. Somit lag der Fokus im zweiten Teil dieser Arbeit auf der Charakterisierung der Extrazellulärmatrix in den ASC-Sphäroiden, sowie auf deren Fähigkeit zur adipogenen Differenzierung im Vergleich zur konventionellen 2D-Kultur unter der Verwendung verschiedener Induktionsprotokolle. Differenzierte Sphäroide weisen mit Laminin, Kollagen Typ I, IV und VI als nachgewiesenen Hauptbestandteilen eine Fettgewebs-spezifische Matrixzusammensetzung auf, die eine ausgeprägte Ähnlichkeit zu der des nativen Fettgewebes zeigt. Darüber hinaus konnte eine verbesserte Differenzierungsfähigkeit der ASC-Sphäroide nach einem kurzen induktiven Stimulus gegenüber der 2D kultivierten Zellen gezeigt werden. Dies wurde sowohl hinsichtlich des Triglyceridgehalts, sowie der Expression adipogener Markergene nachgewiesen. Diese verbesserte Differenzierbarkeit und die Möglichkeit mit den Sphäroiden fettgewebeähnliche Mikrogewebe herzustellen, machen diese Zellaggregate zu vielversprechenden Bausteinen für Ansätze im Fettgewebe-Engineering. Inzwischen ist bekannt, dass die Extrazellulärmatrix nicht nur als inertes, unterstützendes Gerüst wirkt, sondern auch zelluläre Prozesse, einschließlich der Differenzierung, durch die Interaktion mit zellulären Rezeptoren beeinflusst. Laminin als wichtige ECM Komponente der Basalmembran reifer Adipozyten konnte in der ECM der adipogen differenzierenden Sphäroide im Gegensatz zu 2D Kulturen zu einem sehr frühen Zeitpunkt der Adipogenese nachgewiesen werden. Um einen positiven Einfluss des Laminins auf den Prozess der adipogenen Differenzierung weitergehend zu untersuchen, wurde ein shRNA-vermittelter Knockdown eines spezifischen Laminin-Gens, welches für die Lamininkette α4 des adipospezifischen Laminin-8 Heterotrimers kodiert, durchgeführt. Obwohl ein stabiler Knockdown des LAMA4 Gens in den ASCs erreicht wurde, so konnte dennoch keine direkte Korrelation zur adipogenen Differenzierungsfähigkeit der Zellen festgestellt werden, da die reduzierte Expression dieses einzelnen Laminin-Gens sich nicht konsequent in der Expression des Gesamtlaminins auf Proteinebene durchsetzte. Das verbesserte therapeutische Potenzial mesenchymaler Stammzellen in einer dreidimensionalen Umgebung beschränkt sich nicht nur auf ihre verbesserte Differenzierungsfähigkeit, sondern umfasst auch die parakrine Sekretion der Zellen, die angiogene, anti-apoptotische, entzündungshemmende und immunmodulatorische Eigenschaften vermittelt. Um dies auch für ASCs zu bestätigen, wurden im letzten Teil dieser Arbeit die Genexpression von ASC-basierten Sphäroiden im Vergleich zu 2D kultivierten Zellen untersucht. Durch mRNA Genexpressionsanalysen konnte für ausgewählte entzündungshemmende, anti-apoptotische und anti-tumor wirksame Zytokine eine signifikant höhere Expression in den Sphäroiden gegenüber der 2D Kultur gezeigt werden. Für einen der wichtigsten entzündungshemmenden Faktoren, Prostaglandin E2, konnte eine erhöhte Sekretion von ASCs, kultiviert als 3D Sphäroide, auch auf Sekretionsebene bestätigt werden. Die Identifizierung intrinsischer Faktoren, welche zu dem verbesserten therapeutischen Potenzial der Zellen in einer dreidimensionalen Umgebung beitragen, ist noch ausstehend. Zur Untersuchung des Einflusses von Zell-Zellkontakten diente ein PCR-Array zum Screening hierfür relevanter Gene. Durch den Vergleich der beiden Kulturbedingungen, 2D Monolayer und 3D Sphäroide, sollten mögliche Unterschiede in den ASCs festgestellt werden können, welche eventuell für das verbesserte therapeutische Potenzial der Sphäroide mitunter verantwortlich sind. Dabei konnten eindeutige Unterschiede zwischen ASCs aus der 3D bzw. 2D-Kultur festgestellt werden. Diese Ergebnisse bilden die Grundlage für weitere Untersuchungen auf diesem Gebiet, um einem umfassenden Verständnis der Rolle von Zell-Zell- und Zell-ECM-Interaktionen in einem 3D-Sphäroid-Kultursystem näherzukommen. Zusammengefasst tragen die Ergebnisse dieser Arbeit zu einer umfangreichen Charakterisierung der ASC Sphäroide hinsichtlich struktureller Merkmale, Differenzierungsfähigkeit und sekretorischer Eigenschaften bei. Es wurde gezeigt, dass ASCs der 3D Sphäroide nicht nur eine verbesserte Differenzierungsfähigkeit, sowie eine erhöhte Expression von Genen aufweisen, welche für verschiedene Zytokine codieren, sondern ebenso in der Lage sind Fettgewebs-ähnliche Mikrogewebe zu bilden. Diese Erkenntnisse tragen dadurch insgesamt zur Förderung der ASC Sphäroide in ihrer effektiven Anwendung in der regenerativen Medizin und im Bereich des Fettgewebe-Engineerings bei. KW - adipose KW - Extracellular Matrix KW - adipose-derived KW - mesenchymal stem cells KW - 3D spheroid culture KW - adipogenic differentiation KW - secretory properties Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204249 N1 - Journal of Tissue Engineering Part A ER - TY - THES A1 - Spindler, Markus T1 - The role of the adhesion and degranulation promoting adapter protein (ADAP) in platelet production T1 - Die Rolle des adhesion and degranulation promoting adapter Proteins (ADAP) in der Thrombopoese N2 - Bone marrow (BM) megakaryocytes (MKs) produce platelets by extending proplatelets into sinusoidal blood vessels. Although this process is fundamental to maintain normal platelet counts in circulation only little is known about the regulation of directed proplatelet formation. As revealed in this thesis, ADAP (adhesion and degranulation promoting adapter protein) deficiency (constitutive as well as MK and platelet-specific) resulted in a microthrombocytopenia in mice, recapitulating the clinical hallmark of patients with mutations in the ADAP gene. The thrombocytopenia was caused by a combination of an enhanced removal of platelets from the circulation by macrophages and a platelet production defect. This defect led to an ectopic release of (pro)platelet-like particles into the bone marrow compartment, with a massive accumulation of such fragments around sinusoids. In vitro studies of cultured BM cell-derived MKs revealed a polarization defect of the demarcation membrane system, which is dependent on F-actin dynamics. ADAP-deficient MKs spread on collagen and fibronectin displayed a reduced F-actin content and podosome density in the lowest confocal plane. In addition, ADAP-deficient MKs exhibited a reduced capacity to adhere on Horm collagen and in line with that the activation of beta1-integrins in the lowest confocal plane of spread MKs was diminished. These results point to ADAP as a novel regulator of terminal platelet formation. Beside ADAP-deficient mice, three other knockout mouse models (deficiency for profilin1 (PFN1), Wiskott-Aldrich-syndrome protein (WASP) and Actin-related protein 2/3 complex subunit 2 (ARPC2)) exist, which display ectopic release of (pro)platelet-like particles. As shown in the final part of the thesis, the pattern of the ectopic release of (pro)platelet-like particles in these genetically modified mice (PFN1 and WASP) was comparable to ADAP-deficient mice. Furthermore, all tested mutant MKs displayed an adhesion defect as well as a reduced podosome density on Horm collagen. These results indicate that similar mechanisms might apply for ectopic release. N2 - Die Megakaryozyten (MKn) des Knochenmarks produzieren Thrombozyten durch die Ausbildung und Verlängerung von Proplättchen in die sinusoidalen Blutgefäße. Obwohl dieser Prozess für die Aufrechterhaltung der normalen Thrombozytenzahl in der Blutzirkulation von grundlegender Bedeutung ist, ist über die Regulation der gerichteten Proplättchenbildung und damit der Thrombozytenproduktion nur wenig bekannt. Wie in dieser Arbeit gezeigt, führte sowohl die konstitutive als auch die MK- und Thrombozyten-spezifische Defizienz von ADAP (adhesion and degranulation promoting adapter protein) in Mäusen zu einer Mikrothrombozytopenie, ähnlich wie dies bei Patienten mit Mutationen im ADAP Gen zu beobachten ist. Die Thrombozytopenie wurde durch eine Kombination aus einer verstärkten Entfernung (clearance) von Thrombozyten aus der Zirkulation durch Makrophagen und einem Defekt in der Thrombozytenproduktion verursacht. Dieser Defekt führte zu einer ektopischen Freisetzung von Proplättchen-ähnlichen Partikeln ins Knochenmark und zur Anreicherung derartiger Fragmente um die Sinusoiden. In vitro-Studien an kultivierten MKn aus Zellen des Knochenmarks zeigten einen Polarisationsdefekt des Demarkationsmembransystems, welcher abhängig von der F-Aktin-Dynamik ist. ADAP-defiziente MKn wiesen nach Spreading auf Kollagen und Fibronektin einen reduzierten F-Aktin Gehalt und eine geringere Dichte von Podosomen in der untersten konfokalen Ebene auf. Zusätzlich zeigten ADAP-defiziente MKn beim Spreading Versuch eine verminderte Kapazität sich an Horm Kollagen anzuhaften, und die Aktivierung von beta1-Integrinen war in der untersten konfokalen Ebene von MKn reduziert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ADAP ein wichtiges Protein im terminalen Schritt der Thrombozytenproduktion ist. Neben ADAP-defizienten Mäusen existieren drei weitere Knockout-Mausmodelle (für die Proteine: Profilin1 (PFN1), Wiskott-Aldrich-Syndrom-Protein (WASP) und Actin-related protein 2/3 complex subunit 2 (ARPC2)), die eine ektopische Freisetzung von Proplättchen-ähnlichen Partikeln zeigen. Wie im letzten Teil der Arbeit gezeigt, war das Muster der ektopischen Freisetzung von Proplättchen-ähnlichen Partikeln in diesen genetisch veränderten Mäusen (PFN1 und WASP) zu den ADAP-defizienten Mäusen vergleichbar. Darüber hinaus zeigten die MKn von den knockout Mäusen einen Adhäsionsdefekt sowie eine reduzierte Podosomendichte auf Horm Kollagen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ähnliche Mechanismen für die Freisetzung von Proplättchen-ähnlichen Partikeln in das Knochenmark verantwortlich sein könnten. KW - Adhesion and degranulation promoting adapter protein KW - Megakaryocyte KW - ectopic release KW - platelet KW - cytoskeleton Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200977 ER - TY - THES A1 - Börner, Kevin T1 - How CLEC16A modifies the function of thymic epithelial cells T1 - Wie CLEC16A die Funktion von Thymus-Epithelzellen beeinflusst N2 - Genomweite Assoziationsstudien haben CLEC16A als ein Suszeptibilitätsgen für Typ 1 Diabetes und weitere Autoimmunerkrankungen identifiziert. Die genaue Funktion von CLEC16A bleibt jedoch ungeklärt. Studien zeigten, dass sowohl das Drosophila Ortholog ema als auch das murine Clec16a eine Rolle in Autophagie spielen. Autophagie trägt zur Beladung der MHC-Klasse-II Moleküle und somit der Antigenpräsentation bei. Darüber hinaus konnten Studien belegen, dass Autophagie zur Antigenpräsentation während der T-Zell Selektion in Thymus-Epithelzellen benötigt wird. Dies schlägt eine mögliche Funktion von CLEC16A in Thymus-Epithelzellen während der T-Zell Selektion vor. Außerdem berichteten Arbeiten, dass CLEC16A als quantitativer Trait Locus für seine Nachbargene fungiert und dass Clec16a KD in Langerhans Inseln im Pankreas die Insulinsekretion und den Glukosestoffwechsel beeinträchtigt. Dieser Arbeit vorausgehend hatten Schuster et al. eine Clec16a KD NOD Maus generiert, welche vor spontanem autoimmunem Diabetes geschützt war. Für diese Arbeit wurde vermutet, dass CLEC16A als Suszeptibilitätsgen für Typ 1 Diabetes den Prozess der Autophagie in Thymus-Epithelzellen beeinträchtigt und somit Antigenpräsentation und das T-Zell Repertoire beeinflusst. Um auf der Vorarbeit von Schuster et al. aufzubauen und diese zu ergänzen, zielte diese Arbeit darauf ab, den Einfluss von CLEC16A auf Thymus-Epithelzellen zu untersuchen. Hierfür wurde ein CLEC16A KD in menschlichen Zellen mittels RNA Interferenz erzeugt und Autophagie durch Immunoblotting untersucht. Zusätzlich wurde die Entzündung im Pankreasgewebe von Clec16a KD NOD Mäusen mittels H.E. Färbung beurteilt und bewertet. Thymus-Transplanationen wurden durchgeführt, um zu sehen, ob der Einfluss von Clec16a KD T-Zell intrinsisch ist. Außerdem wurden intraperitoneale Glukosetoleranztests durchgeführt, um den Blutzuckerstoffwechsel in Clec16a KD Mäusen zu beurteilen. Schließlich wurden mittels qPCR Expressionslevel der benachbarten Gene, wie zum Beispiel Dexi und Socs1, erhoben, um die Eigenschaften von CLEC16A als quantitativer Trait Locus einzuordnen. Gemeinsam mit den Ergebnissen von Schuster et al. kann diese Arbeit aufzeigen, dass Clec16a KD die Ausprägung von Insulitis im Pankreas reduziert und Clec16a KD NOD Mäuse vor spontanem Autoimmundiabetes schützt. Dieser Schutz vor Erkrankung wird durch beeinträchtigte Autophagie in Thymus-Epithelzellen hervorgerufen, welche die T-Zell Selektion beeinflusst und die Reaktivität von T-Zellen reduziert. Der Einfluss des Clec16a KD ist innerhalb des Thymus wirksam. Der Blutzuckerstoffwechsel in Clec16a KD NOD Mäusen bleibt unverändert und kann deshalb als Ursache für den Schutz vor Type 1 Diabetes ausgeschlossen werden. Clec16a und Dexi zeigen ähnliche Expressionslevel auf, dennoch benötigt es weitere detaillierte Studien, um eine Beziehung zwischen den beiden Genen etablieren zu können. Letztlich konnte die Beeinträchtigung von Autophagie in menschlichen CLEC16A KD Zellen nachgewiesen werden, was bedeutet, dass die Funktion von CLEC16A evolutionär konserviert ist und ein möglicher Zusammenhang zwischen CLEC16A Polymorphismen und einem erhöhten Risiko für Typ 1 Diabetes im Menschen besteht. N2 - Genome-wide association studies revealed CLEC16A as a candidate gene for Type 1 Diabetes and multiple other autoimmune disorders. The function of CLEC16A remains unknown. However, previous work showed that the CLEC16A ortholog ema and the murine Clec16a were both implicated in autophagy, a process partially required for MHC class II loading and antigen presentation. Furthermore, studies could show that autophagy was required in thymic epithelial cells for antigen presentation during T cell selection, suggesting a possible role of CLEC16A in T cell selection in the thymus. Additionally, it was postulated that CLEC16A may function as an expression quantitative trait locus for its neighboring genes and that Clec16a KD was involved in pancreatic islet function and impaired insulin secretion and glucose homeostasis. Prior to this work, Schuster et al. had created a Clec16a KD NOD mouse, which was protected from spontaneous autoimmune diabetes. For this work it was hypothesized that CLEC16A variation serves as a Type 1 Diabetes risk gene by affecting autophagy in thymic epithelial cells, which modulates antigen presentation and shapes the T cell repertoire. To expand and complement previous findings by Schuster et al., this thesis aimed to investigate how CLEC16A modifies the function of thymic epithelial cells. For this purpose, CLEC16A KD was induced in human cells via RNA interference and autophagy was studied through immunoblotting. Additionally, inflammation of pancreatic tissue in Clec16a KD NOD mice was scored using H.E. stained pancreatic sections. Thymic transplantation experiments were conducted to test whether the effects of Clec16a KD were T cell intrinsic. Also, intraperitoneal glucose tolerance tests were performed to study glucose homeostasis in Clec16a KD NOD animals. Finally, using qPCR, gene expression levels of neighboring genes such as Dexi and Socs1 were measured to study Clec16a as an expression quantitative trait locus. In combination with the findings of Schuster et al., this thesis demonstrates that Clec16a KD reduces the severity of insulitis and protects from onset of spontaneous diabetes in the NOD mouse. Disease protection is conveyed by impaired autophagy in TEC, which leads to altered T cell selection and hyporeactive CD4+ T cells. The effects of Clec16a KD in the NOD mouse are thymus intrinsic. Glucose homeostasis remains unchanged in the Clec16a KD NOD mouse and plays no role in disease protection. Clec16a and Dexi presented similar expression levels, but further studies are required to investigate a clear link between these two genes. Finally, impaired autophagy could be replicated in human CLEC16A KD cells, which demonstrates a conserved function of CLEC16A and suggests a possible link between CLEC16A variation and risk of autoimmune disease in human. KW - Thymus KW - Toleranz KW - Autoimmunität KW - Diabetes mellitus Typ 1 KW - Epithelzelle KW - CLEC16A KW - T cell selection KW - Antigen presentation KW - Autophagy KW - Autoimmunity KW - T Zell Selektion KW - Antigenpräsentation KW - Autophagie Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200230 ER - TY - THES A1 - Böhm, Lena T1 - Dissecting Mechanisms of Host Colonization by C. albicans T1 - Untersuchungen zur Wirtskoloniserung durch C. albicans N2 - The human body is laden with trillions of microorganisms that belong to all three domains of life. Some species of this microbiota subsist as harmless commensals in healthy adults, but under certain circumstances, they can cause mucosal disease or even systemic, life-threatening infections. While the bacterial members of our microbiota are heavily studied today, much less attention is afforded to eukaryotic species that colonize different mucocutaneous surfaces of the human body. This dissertation focuses on identifying regulatory circuits that enable a prominent member of these eukaryotes, C. albicans, to, on the one hand, live on a specific mammalian mucosal surface as a harmless commensal and, on the other hand, proliferate as a pathogen. Since the ultimate source of many fatal Candida infections is the gastrointestinal (GI) tract of the infected individual, this organism is particularly suited to distinguishing traits essential for the gut colonization of commensal fungi and their ability to cause disease. Sequence-specific DNA-binding proteins that regulate transcription are important to most biological processes; I thus used these proteins as starting points to gain insights into 1) how a specific transcription regulator promotes virulence in C. albicans; 2) which traits C. albicans requires to inhabit the GI tract of a specific, well-defined mouse model as a harmless commensal; and 3) how three previously undescribed transcriptional regulators contribute to the commensal colonization of the digestive tract of this mouse model. Altogether, this work advances the knowledge concerning the biology of commensal fungi in the mammalian gut and genetic determinants of fungal commensalism, as well as pathogenicity. N2 - Der menschliche Körper wird von unzähligen Mikroorganismen aus allen drei Domänen des Lebens besiedelt. Einige Spezies dieser so genannten Mikrobiota leben mit gesunden Menschen als harmlose Kommensale, können jedoch unter bestimmten Umständen auch Erkrankungen der Schleimhäute oder sogar systemische, lebensbedrohliche Krankheiten verursachen. Der bakterielle Anteil unserer Mikrobiota wurde bereits ausgiebig untersucht. Sehr viel weniger Aufmerksamkeit haben bisher eukaryotische Organismen erlangt, die unterschiedliche Schleimhäute des menschlichen Körpers besiedeln. Ziel dieser Dissertation ist es regulatorische Kreisläufe zu identifizieren, die es einem prominenten eukaryotischen Mitglied unserer Mikrobiota, Candida albicans, ermöglichen auf der einen Seite eine spezielle mukokutane Oberfläche von Säugern zu besiedeln, und sich auf der anderen Seite als Pathogen zu verbreiten. Da man annimmt, dass viele bedrohliche Candida Infektionen ihren Ursprung im Gastrointestinaltrakt desselben Individuums haben, eignet sich dieser Organismus im speziellen um Eigenschaften zu identifizieren, die es kommensalen Pilzen ermöglicht den Darm zu besiedeln aber auch Krankheiten zu verursachen. Sequenz-spezifische DNA Bindeproteine, die die Transkription regulieren sind zentrale Akteure in den meisten biologischen Prozessen; aus diesem Grund verwende ich diese Proteine als Startpunkte um Einblicke in Folgendes zu erlangen: Zuerst, wie ein spezieller Transkriptionsregulator C. albicans‘ Virulenz beeinflusst. Dann welche Eigenschaften von C. albicans Voraussetzung für die Kolonisierung des Gastrointestinaltrakts eines klar definierten Mausmodells sind. Und zuletzt wie drei bisher nicht beschriebene Transkriptionsregulatoren zu der kommensale Kolonisierung des Verdauungstrakts dieses Mausmodells beitragen. Zusammenfassend trägt diese Arbeit dazu bei, das Wissen über die Biologie kommensaler Pilze im Säugertrakt und über genetische Determinanten zu erweitern, die zum Kommensalismus aber auch zur Pathogenität von Pilzen beitragen. KW - Candida albicans KW - Host Colonization KW - Microbiota KW - Pathogenicity KW - Commensalism KW - Transcription Factor Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192303 ER - TY - THES A1 - Sasi, Manju T1 - A mouse model for genetic deletion of presynaptic BDNF from adult hippocampal mossy fiber terminals T1 - Mausmodell für genetische Deletion von präsynaptischem BDNF aus adulten hippokampalen Moosfaserterminalen N2 - Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is a modulator and mediator of structural and functional plasticity at synapses in the central nervous system. Despite our profound knowledge about the synaptic function of BDNF at synapses, it is still controversially discussed whether synaptic BDNF acts primarily from pre- or postsynaptic sites. In the central nervous system, several studies show that mossy fiber (MF) projections formed by hippocampal granule neurons store the highest amount of BDNF. However, immunofluorescence and RNA labelling studies suggest that MF BDNF is primarily produced by granule neurons. Multiple other studies prefer the view that BDNF is primarily produced by postsynaptic neurons such as CA3 pyramidal neurons. Here, we question whether the BDNF, which is stored in the mossy fiber synapse, is primarily produced by granule neurons or whether by other cells in the MF-CA3 microcircuit. After standardization of immunolabelling of BDNF, confocal imaging confirmed the localization of BDNF in presynaptic MF terminals. This anterograde location of synaptic BDNF was also found in distinct regions of the fear and anxiety circuit, namely in the oval nucleus of the bed nucleus stria terminals (ovBNST) and in the central amygdala. To find out whether the presynaptic BDNF location is due to protein translation in the corresponding presynaptic dentate gyrus (DG) granule neuron, we developed and characterized a mouse model that exhibits BDNF deletion specifically from adult DG granule neurons. In this mouse model, loss of presynaptic BDNF immunoreactivity correlated with the specific Creactivity in granule neurons, thus confirming that MF BDNF is principally released by granule neurons. After BDNF deletion from granule neurons, we observed more immature neurons with widely arborized dendritic trees. This indicated that local BDNF deletion also affects the local adult neurogenesis, albeit Cre-mediated BDNF deletion only occur in adult granule neurons. Since BDNF is a master regulator of structural synaptic plasticity, it was questioned whether it is possible to visualize presynaptic, synapse-specific, structural plasticity in mossy fiber synapses. It was established that a combination of Cre-techniques together with targeting of GFP to membranes with the help of palmitoylation / myristoylation anchors was able to distinctly outline the synaptic structure of the BDNF-containing MF synapse. In summary, the mouse model characterized in here is suited to investigate the synaptic signalling function of presynaptic BDNF at the mossy fiber terminal, a model synapse to investigate microcircuit information processing from molecule to behaviour. N2 - Der neurotrophe Wachstumsfaktor BDNF (brain-derived neurotrophic factor) ist ein Regulator und Vermittler von struktureller und funktionaler Plastizität in Synapsen des zentralen Nervensystems. Trotz des umfassenden Wissens über die synaptische Funktion von BDNF an Synapsen wird immer noch kontrovers diskutiert, ob synaptisches BDNF vorrangig von der prä- oder von der postsynaptischen Seite her agiert. Zahlreiche Studien zeigen, dass die größten BDNF Mengen des Zentralnervensystems in den Projektionen der hippocampalen Körnerzellen, den sogenannten Moosfasern (MF), enthalten sind. Während manche Studien basierend auf der Markierung von RNA und Immunofloureszenz nahelegen, dass MF BDNF in erster Linie von Körnerzellen produziert wird, bevorzugen zahlreiche andere Studien wiederum die Sicht, dass BDNF primär von postsynaptischen Neuronen wie beispielsweise den CA3 Pyramidenneuronen gebildet wird. In dieser Arbeit wurde die Fragestellung untersucht, ob das BDNF, welches in den Moosfasersynapsen enthalten ist, in erster Linie von Körnerzellen hergestellt wird, oder ob es hauptsächlich von anderen Zellen aus dem MF-CA3 Mikronetzwerk gebildet wird. Nachdem eine Standardisierung der Immunfluoreszenzmarkierung von BDNF etabliert wurde, konnte anhand von konfokaler Bildgebung die Lokalisierung von BDNF in den präsynaptischen MF Terminalen bestätiget werden. Diese anterograde Lokalisierung synaptischen BDNFs konnte außerdem in zwei weiteren Regionen des Furcht- und Angstnetzwerkes, genauer gesagt im ovalen Kern des bed nucleus stria terminalis (ovBNST) und in der zentralen Amygdala, nachgewiesen werden. Um Herauszufinden, ob die präsynaptische Lokalisation von BDNF von der Proteintranslation in den zugehörigen präsynaptischen Körnerzellen des Gyrus Dentatus abhängig ist, entwickelten und charakterisierten wir ein Mausmodel , welches die spezifische Deletion von BDNF aus den ausgereiften Körnerzellen des Gyrus Dentatus ermöglicht. In diesem Mausmodell korrelierte der Verlust präsynaptischer BDNF Immunreaktivität mit der spezifischen Cre-Aktivität in Körnerzellen, was bestätigt, dass MF BDNF hauptsächlich von den Körnerzellen ausgeschüttet wird. Nach BDNF Deletion aus den Körnerzellen konnten mehr unreife Neurone mit sich weit verzweigenden, dendritischen Strukturen beobachtet werden. Dies weist darauf hin, dass die lokale Deletion von BDNF auch die lokale adulte Neurogenese beeinflusst, obwohl die Crevermittelte BDNF Deletion nur in adulten Körnerzellen stattfindet. Da BDNF ein Hauptregulator von struktureller synaptischer Plastizität ist, kam die Frage auf, ob es möglich ist, diese präsynaptische, synapsenspezifische strukturelle Plastizität in Moosfasersynapsen zu visualisieren. Es wurde festgestellt, dass eine Kombination aus der Cre- Technik zusammen mit der gezielten Verankerung von GFP in der Zellmembran durch Palmitoylierungs-/Myristoylierungsmotive in der Lage ist, die synaptische Struktur von BDNF enthaltenden MF Synapsen darzustellen. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass das hier entwickelte und charakterisierte Mausmodell dafür geeignet ist, die synaptische Signalfunktion präsynaptischen BDNFs in der Moosfaserterminale, einer Modellsynapse für die Erforschung der Informationsverarbeitung in Mikronetzwerken vom Molekül bis hin zum Verhalten, zu untersuchen. KW - Wachstumsfaktor KW - Brain derived neurotorphic factor KW - Hippokampus KW - Moosfaserterminalen KW - hippocampus KW - mossy fiber terminal Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186250 ER - TY - THES A1 - Seitz, Nicola T1 - Bee demise and bee rise: From honey bee colony losses to finding measures for advancing entire bee communities T1 - Bienenschwund und Bienenaufschwung: Von Honigbienen-Kolonieverlusten zur Förderung von gesamten Bienengemeinschaften N2 - My dissertation comprises three studies: (1) an assessment of honey bee colony losses in the USA between 2014 and 2015, (2) an exploration of the potential of reclaimed sand mines as bee habitat, and (3) an evaluation of native and non-native pollinator friendly plants in regard to their attraction to bees. While the first study focuses on honey bees, the latter two studies primarily take wild bees or entire bee communities in focus. The study on honey bee colony losses was conducted within the framework of the Bee Informed Partnership (BIP, beeinformed.org) and aligns with the annual colony loss surveys which have been conducted in the USA since the winter of 2006/2007. It was the fourth year for which summer and annual losses were calculated in addition to winter losses. Among participants, backyard beekeepers were the largest group (n = 5690), although sideline (n = 169) and commercial (n = 78) beekeepers managed the majority (91.7 %) of the 414 267 surveyed colonies. Overall, 15.1 % of the estimated 2.74 million managed colonies in the USA were included in the study. Total honey bee colony losses (based on the entirety of included colonies) were higher in summer (25.3 %) than in winter (22.3 %) and amounted to 40.6 % for the entire 2014/2015 beekeeping year. Average colony losses per beekeeper or operation were higher in winter (43.7 %) than in summer (14.7 %) and amounted to 49 % for the entire 2014/2015 beekeeping year. Due to the dominance of backyard beekeepers among participants, average losses per operation (or unweighted loss) stronger reflected this smaller type of beekeeper. Backyard beekeepers mainly named colony management issues (e.g., starvation, weak colony in the fall) as causes for mortality, while sideline and commercial beekeepers stronger emphasized parasites or factors outside their control (e.g., varroa, nosema, queen failure). The second study took place at reclaimed sand mines. Sand mines represent anthropogenically impacted habitats found worldwide, which bear potential for bee conservation. Although floral resources can be limited at these habitats, vegetation free patches of open sandy soils and embankments may offer good nesting possibilities for sand restricted and other bees. We compared bee communities as found in three reclaimed sand mines and at adjacent roadside meadows in Maryland, USA, over two years. Both sand mines and roadsides hosted diverse bee communities with 111 and 88 bee species, respectively. Bee abundances as well as richness and Shannon diversity of bee species were higher in sand mines than at roadsides and negatively correlated with the percentage of vegetational ground cover. Species composition also differed significantly between habitats. Sand mines hosted a higher proportion of ground nesters, more uncommon and more ‘sand loving’ bees similar to natural sandy areas of Maryland. Despite the destruction of the original pre-mining habitat, sand mines thus appear to represent a unique habitat for wild bees, particularly when natural vegetation and open sand spots are encouraged. Considering habitat loss, the lack of natural disturbance regimes, and ongoing declines of wild bees, sand mines could add promising opportunities for bee conservation which has hitherto mainly focused on agricultural and urban habitats. The third study was an experimental field study on pollinator friendly plants. Bees rely on the pollen and nectar of plants as their food source. Therefore, pollinator friendly plantings are often used for habitat enhancements in bee conservation. Non-native pollinator friendly plants may aid in bee conservation efforts, but have not been tested and compared with native pollinator friendly plants in a common garden experiment. In this study, we seeded mixes of 20 native and 20 non-native pollinator friendly plants in two separate plots at three sites in Maryland, USA. For two years, we recorded flower visitors to the plants throughout the blooming period and additionally sampled bees with pan traps. A total of 3744 bees (120 species) were sampled in the study. Of these, 1708 bees (72 species) were hand netted directly from flowers for comparisons between native and non-native plants. Depending on the season, bee abundance and species richness was either similar or lower (early season and for richness also late season) at native plots compared to non-native plots. Additionally, the overall bee community composition differed significantly between native and non-native plots. Furthermore, native plants were associated with more specialized plant-bee visitation networks compared to non-native plants. In general, visitation networks were more specialized in the early season than the later seasons. Four species (Bombus impatiens, Halictus poeyi/ligatus, Lasioglossum pilosum, and Xylocopa virginica) out of the five most abundant bee species (also including Apis mellifera) foraged more specialized on native than non-native plants. Our study showed that non-native plants were well accepted by a diverse bee community and had a similar to higher attraction for bees compared to native plants. However, we also demonstrated alterations in foraging behavior, bee community assemblage, and visitation networks. As long as used with caution, non-native plants can be a useful addition to native pollinator friendly plantings. This study gives a first example of a direct comparison between native and non-native pollinator friendly plants. N2 - Meine Dissertation umfasst drei Studien: (1) eine Erfassung von Honigbienen-Kolonieverlusten in den USA zwischen 2014 und 2015, (2) die Erforschung des Potenzials renaturierter Sandminen als Habitat für Bienen und (3) eine Evaluierung nativer sowie standortfremder bestäuberfreundlicher Pflanzen hinsichtlich ihrer Attraktivität für Bienen. Während die erste Studie Honigbienen im Fokus hat, verschiebt sich der Fokus der zwei weiteren Studien hin zu Wildbienen bzw. gesamten Bienengemeinschaften. Die Studie zu Honigbienenkolonieverlusten wurde im Rahmen des Bee Informed Partnerships (BIP, beeinformed.org) durchgeführt und reiht sich ein in die seit dem Winter 2006/2007 jährlich durchgeführten Untersuchungen in den USA. Es ist das vierte Jahr in dem Sommer- und Jahresverluste zusätzlich zu den Winterverlusten kalkuliert wurden. Unter den Teilnehmern bildete die Gruppe der Hobby-Imker den größten Anteil (n = 5690), obwohl nebenberufliche (n = 169) und kommerzielle (n = 78) Imker den Großteil (91,7 %) der 414 267 begutachteten Bienenvölkern bzw. Kolonien hielten. Insgesamt enthielt die Studie 15,1 % der auf 2,74 Mio. geschätzten Gesamtzahl an gehaltenen Bienenvölkern in den USA. Die Gesamtverluste an Honigbienenvölkern (basierend auf der Gesamtheit der erfassten Völker) waren im Sommer mit 25,3 % höher als im Winter mit 22,3 % und bezifferten sich auf 40,6 % für das gesamte Imkerjahr in 2014/2015. Durchschnittliche Kolonieverluste pro Imkerbetrieb waren höher im Winter (43,7 %) als im Sommer (14,7 %) und betrugen 49 % für das gesamte Imkerjahr in 2014/2015. Aufgrund der hohen Anzahl an Hobby-Imkern unter den Teilnehmern reflektieren die durchschnittlichen Kolonieverluste pro Imkerbetrieb (oder ungewichtete Verluste) v.a. die Situation dieser kleineren Imkerbetriebe. Hobby-Imker nannten als Gründe für die Honigbienenmortalität hauptsächlich Probleme des Koloniemanagements (z.B. Verhungerung, schwache Völker im Herbst), während nebenberufliche und kommerzielle Imker stärker Faktoren betonten, die außerhalb ihrer Kontrolle lagen (z.B. Varroamilben, Nosemasporen, Versagen der Königin). Die zweite Studie fand in renaturierten Sandminen statt. Sandminen sind weltweit zu findende anthropogen veränderte Landschaften, die ein Potenzial für Bienenschutz haben. Obwohl florale Ressourcen in diesen Habitaten limitiert sein können, könnten die vegetationsfreien Flecken auf offenen Sandböden und Böschungen gute Nistplätze für auf Sand spezialisierte und andere Bienen bieten. Wir haben Bienengemeinschaften aus drei renaturierten Sandminen sowie jeweils nahe gelegenen bepflanzten Straßenrändern in Maryland, USA verglichen. Sowohl die Sandminen als auch die Straßenränder enthielten vielfältige Bienengemeinschaften mit 111 (Sandminen) und 88 (Straßenränder) Bienenarten. Bienenabundanz, Artenreichtum und Shannon Diversität waren höher in den Sandminen als an den Straßenrändern und korrelierten negativ mit dem Anteil an vorhandener Bodenvegetation. Darüber hinaus unterschied sich die Artzusammensetzung signifikant zwischen den beiden Habitattypen. Sandminen enthielten einen größeren Anteil an Bodennistern, mehr seltene Arten und mehr sandliebende Arten, ähnlich natürlicher sandiger Gebiete in Maryland. Trotz der Zerstörung des ursprünglichen prä-Minen Habitats, scheinen Sandminen daher ein einzigartiges Bienenhabitat für Wildbienen darzustellen, besonders wenn die natürliche Besiedlung von Vegetation und offene Sandflächen gefördert werden. Im Hinblick auf Habitatverluste, auf das Fehlen von natürlichen Landschaftsstörungen und auf den weiterschreitenden Rückgang an Wildbienen, könnten Sandminen eine vielversprechende Möglichkeit für Bienenschutz darstellen, der sich bisher stark auf landwirtschaftliche und urbane Habitate konzentrierte. Bei der dritten Studie handelt es sich um eine experimentelle Feldstudie zu bestäuberfreundlichen Pflanzen. Bienen sind auf Pollen und Nektar von Pflanzen als Nahrungsquelle angewiesen. Aus diesem Grund werden bestäuberfreundliche Pflanzen oft für Habitatverbesserungen im Rahmen von Bienenschutzmaßnahmen gepflanzt. Standortfremde bestäuberfreundliche Pflanzen können dabei die Bienenschutzmaßnahmen unterstützen, wurden aber bisher nicht in einem Common Garden Experiment zusammen mit nativen bestäuberfreundlichen Pflanzen getestet bzw. verglichen. In dieser Studie haben wir Saatgutmischungen mit jeweils 20 nativen und 20 standortfremden Pflanzen in zwei separaten Plots in drei Gebieten in Maryland, USA ausgesät. Zwei Jahre lang protokollierten wir über die gesamten Blühzeiträume hinweg Pflanzenbesucher und sammelten Bienen mit Farbschalen. Insgesamt erfassten wir 3744 Bienen (120 Arten), von denen 1708 Individuen (72 Arten) per Hand direkt von den Blüten gesammelt wurden für die Vergleiche zwischen nativen und standortfremden Pflanzen. Abhängig von der Saison waren Bienenabundanz und Artenreichtum entweder ähnlich oder niedriger (frühe Saison und für Artenreichtum auch späte Saison) in nativen Plots verglichen mit den standortfremden Plots. Zusätzlich unterschied sich die Zusammensetzung der Bienengemeinschaft signifikant zwischen nativen und standortfremnden Pflanzen. Darüber hinaus waren die Bienen-Pflanzen-Besuchs-Netzwerke nativer Pflanzen spezialisierter als die Besuchs-Netzwerke standortfremder Pflanzen. Im Allgemeinen waren die Besuchs-Netzwerke in der frühen Saison spezialisierter als in der späten Saison. Vier Arten (Bombus impatiens, Halictus poeyi/ligatus, Lasioglossum pilosum, und Xylocopa virginica) der fünf am häufigsten vorkommenden Arten (zusätzlich auch Apis mellifera) fouragierten spezialisierter auf nativen Pflanzen als auf standortfremden Pflanzen. Unsere Studie zeigte, dass standortfremde Pflanzen weitläufig von einer artenreichen Bienengemeinschaft angenommen wurden und eine ähnliche bis höhere Attraktivität für Bienen aufwiesen verglichen mit nativen Pflanzen. Allerdings demonstrierten wir auch Änderungen im Fouragierverhalten, in der Zusammensetzung der Bienengemeinschaft und in den Besuchs-Netzwerken. Insgesamt kann ein vorsichtiger Einsatz standortfremder Pflanzen eine sinnvolle Ergänzung zu nativen bestäuberfreundlichen Anpflanzungen sein. Diese Studie stellt ein erstes Beispiel eines direkten Vergleichs von nativen und standortfremden bestäuberfreundlichen Anpflanzungen dar. KW - Biene KW - Wildbienen KW - Renaturierung <Ökologie> KW - Naturschutz KW - Honigbienen KW - exotische Pflanzen KW - Sandminen KW - Pflanzen-Bienen-Netzwerke KW - bestäuberfreundliche Pflanzen KW - wild bees KW - honey bees KW - sand mine KW - pollinator friendly plants KW - plant-bee visitation networks Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184180 ER -