TY - THES A1 - Brede, Christian T1 - Peripheral alloantigen expression directs the organ specific T cell infiltration after hematopoietic cell transplantation T1 - Die Expression von Alloantigenen im peripheren Gewebe beeinflusst die selektive Organinfiltration durch T Zellen nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation N2 - In acute graft-versus-host disease (GVHD) alloreactive donor T cells selectively damage skin, liver, and the gastrointestinal tract while other organs are rarely affected. The mechanism of this selective target tissue infiltration is not well understood. We investigated the importance of alloantigen expression for the selective organ manifestation by examining spatiotemporal changes of cellular and molecular events after allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT). To accomplish this we established a novel multicolor light sheet fluorescence microscopy (LSFM) approach for deciphering immune processes in large tissue specimens on a single-cell level in 3 dimensions. We combined and optimized protocols for antibody penetration, tissue clearing, and triple-color illumination to create a method for analyzing intact mouse and human tissues. This approach allowed us to successfully quantify changes in expression patterns of mucosal vascular addressin cell adhesion molecule–1 (MAdCAM-1) and T cell responses in Peyer’s patches following allo-HCT. In addition, we proofed that LSFM is suitable to map individual T cell subsets after HCT and detected rare cellular events. We employed this versatile technique to study the role of alloantigen expression for the selective organ manifestation after allo-HCT. Therefore, we used a T cell receptor (TCR) transgenic mouse model of GVHD that targets a single peptide antigen and thereby mimics a major histocompatibility complex (MHC)-matched single antigen mismatched (miHAg-mismatched) HCT. We transplanted TCR transgenic (OT-I) T cells into myeloablatively conditioned hosts that either express the peptide antigen ovalbumin ubiquitously (βa-Ova) or selectively in the pancreas (RIP-mOva), an organ that is normally not affected by acute GVHD. Of note, at day+6 after HCT we observed that OT-I T cell infiltration occurred in an alloantigen dependent manner. In βa-Ova recipients, where antigen was ubiquitously expressed, OT-I T cells infiltrated all organs and were not restricted to gastrointestinal tract, liver, and skin. In RIP-mOva recipients, where cognate antigen was only expressed in the pancreas, OT-I T cells selectively infiltrated this organ that is usually spared in acute GVHD. In conditioned RIP-mOva the transfer of 100 OT-I T cells sufficed to effectively infiltrate and destroy pancreatic islets resulting in 100% mortality. By employing intact tissue LSFM in RIP-mOva recipients, we identified very low numbers of initial islet infiltrating T cells on day+4 after HCT followed by a massive T cell migration to the pancreas within the following 24 hours. This suggested an effective mechanism of effector T cell recruitment to the tissue of alloantigen expression after initial antigen specific T cell encounter. In chimeras that either expressed the model antigen ovalbumin selectively in hematopoietic or in parenchymal cells only, transplanted OT-I T cells infiltrated target tissues irrespective of which compartment expressed the alloantigen. As IFN-γ could be detected in the serum of transplanted ovalbumin expressing recipients (βa-Ova, βa-Ova-chimeras and RIP-mOva) at day+6 after HCT, we hypothesized that this cytokine may be functionally involved in antigen specific OT-I T cell mediated pathology. In vitro activated OT-I T cells responded with the production of IFN-γ upon antigen re-encounter suggesting that IFN-γ might be relevant in the alloantigen dependent organ infiltration of antigen specific CD8+ T cell infiltration after HCT. Based on these data we propose that alloantigen expression plays an important role in organ specific T cell infiltration during acute GVHD and that initial alloreactive T cells recognizing the cognate antigen propagate a vicious cycle of enhanced T cell recruitment that subsequently culminates in the exacerbation of tissue restricted GVHD. N2 - In der akuten Graft-Versus-Host Disease (GVHD) infiltrieren allogene Spender T Zellen Haut, Leber und den Magen-Darm-Trakt des Empfängers und attackieren das Gewebe. Andere Organe sind dagegen interessanterweise nur selten betroffen. Die Mechanismen dieser selektiven Organinfliltration sind bisher weitestgehend unbekannt. In meiner Dissertationsarbeit untersuchte ich den Einfluss der Alloantigenexpression auf die selektive Organmanifestation während der GVHD. Um komplexe Immunprozesse die nach allogener Stammzelltransplantation auftreten, besser zu verstehen, entwickelten wir eine Lichtblattmikroskopietechnik (LSFM) die zelluläre und molekulare Veränderungen im intakten Gewebe detektieren kann. Wir etablierten eine neuartigen mehrfarben LSFM-Methodik, die es ermöglicht, Immunprozesse in großen Gewebsstücken von Maus und Mensch in Einzelzellauflösung dreidimensional darzustellen. Dazu kombinierten und optimierten wir Protokolle, um eine Penetration von Antikörpern tief in das Gewebe sowie die Aufklärung und die dreifache Beleuchtung des Gewebes zu ermöglichen. Diese Methode erlaubte uns die erfolgreiche Quantifizierung der Proteinexpression des Adressins mucosal vascular addressin cell adhesion molecule–1 (MAdCAM-1) als auch die Quantifizierung der T Zell Antwort im intakten Peyer’s Plaque nach allogener hämatopoetischer Transplantation (HCT). Weiterhin konnten wir die Methode zur Untersuchung der Migration unterschiedlicher T Zell-Subpopulationen nach HCT erfolgreich einsetzen und konnten einzelne, organinfiltrierende Zellen detektierten und quantifizieren. Wir benutzten die LSFM Methode um den Einfluss der Alloantigenexpression auf die selektive Organmanifestation zu studieren. Dazu verwendeten wir ein Transplantationsmodell, in dem der Haupthistokompatibilitätskomplex übereinstimmt (MHC-matched) und eine Diskrepanz nur in einem einzelnen Peptid Antigen (miHAG-mismatch) zwischen Spender und Empfänger bestand. Wir transplantierten T Zell Rezeptor (TCR) transgene (OT-I) T Zellen in myeloablativ bestrahlte Empfänger, die das Peptidantigen Ovalbumin entweder in allen Geweben (βa-Ova) oder selektiv in der Bauchspeicheldrüse (RIP-mOva) exprimieren. Die Bauchspeicheldrüse ist ein Organ, das normalerweise nicht von der akuten GVHD betroffen ist. An Tag 6 nach allogener HCT waren alle Organe die das Alloantigen exprimieren auch von Spender T Zellen infiltriert. In myeloablativ bestrahlten RIP-mOva Empfängern reichten bereits 100 transferierte OT-I T Zellen aus, um Alloantigen-exprimierende pankreatische Inselzellen zu zerstören. Dies führte zu einer Mortalität von 100% der Empfänger und spricht für eine sehr effiziente Alloantigendetektion und Gewebsinfiltration durch die Spender T Zellen. Um die Kinetik der Organinfiltration der Spender T Zellen detailliert zu untersuchen, verwendeten wir die neue Lichtblattmikroskopietechnik, welche die Analyse intakter Organe ermöglicht. In RIP-mOva Empfängern identifizierten wir erste wenige Spender T Zellen im Pankreas an Tag 4 nach Transplantation, gefolgt von einer massiven Pankreasinfiltration durch Spender T Zellen innerhalb von 24 Stunden. Dies deutet auf eine gezielte Rekrutierung der Spender T Zellen nach erstem Antigenkontakt in das Gewebe mit Alloantigenexpression. Um zu untersuchen, ob die Alloantigenexpression vom parenchymalen Gewebe oder aber durch hämatopoetische Zellen zur spezifischen Organinfiltration führt, transplantierten wir OT-I T Zellen in chimäre Empfänger, in denen das Alloantigen entweder nur im Gewebsparenchym oder ausschließlich von hämatopoetischen Zellen exprimiert wird. An Tag 6 nach der allogenen HCT fanden wir Spender T Zellen in allen Geweben, unabhängig davon welches Empfängerzellkompartment das Alloantigen präsentierte. Wir detektierten hohe IFN-γ-Werte im Serum von Ovalbumin exprimierenden Empfänger (βa-Ova, βa- Ova-Chimären und RIP-mOva). Weiterhin fanden wir, dass nach erneutem Kontakt mit dem spezifischen Alloantigen, OT-I T Zellen die in vitro aktiviert wurden, IFN-γ produzierten. Wir schließen aus diesen Beobachtungen, dass für die antigenabhängige Gewebeinfiltration IFN-γ wichtig ist. Zusammenfassend postulieren wir, dass die Alloantigenexpression im Gewebe eine wichtige Rolle in der organspezifischen Infiltration durch Spender T Zellen spielt, und dass T Zellen die Alloantigen spezifisch erkennen, dafür verantwortlich sind, dass weitere Effektor-T Zellen in das Gewebe rekrutiert werden. KW - Alloantigen KW - Transplantat-Wirt-Reaktion KW - Genexpression KW - Blutstammzelle KW - Graft versus Host Disease KW - Hematopoietic Cell Transplantation KW - Alloantigen Expression KW - Light Sheet Fluorescence Microscopy KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Hämatopoetische Stammzelltransplantation Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85365 ER - TY - THES A1 - Hofmann, Sebastian T1 - Studies on the function and regulation of CD84, GPVI and Orai2 in genetically modified mice T1 - Untersuchungen zur Funktion und Regulation von CD84, GPVI und Orai2 in genetisch veränderten Mäusen N2 - Platelet activation and aggregation at sites of vascular injury are essential processes to limit blood loss but they also contribute to arterial thrombosis, which can lead to myocardial infarction and stroke. Stable thrombus formation requires a series of events involving platelet receptors which contribute to adhesion, activation and aggregation of platelets. Regulation of receptor expression by (metallo-)proteinases has been described for several platelet receptors, but the molecular mechanisms are ill-defined. The signaling lymphocyte activation molecule (SLAM) family member CD84 is expressed in immune cells and platelets, however its role in platelet physiology was unclear. In this thesis, CD84 deficient mice were generated and analyzed. In well established in vitro and in vivo assays testing platelet function and thrombus formation, CD84 deficient mice displayed phenotypes indistinguishable from wild-type controls. It was concluded that CD84 in platelets does not function as modulator of thrombus formation, but rather has other functions. In line with this, in the second part of this thesis, a novel regulation mechanism for platelet CD84 was discovered and elucidated. Upon platelet activation, the N-terminus of CD84 was found to be cleaved exclusively by the a disintegrin and metalloproteinase 10 (ADAM10), whereas the intracellular part was cleaved by calpain. In addition, regulation of the platelet activating collagen receptor glycoprotein VI (GPVI) was studied and it was shown that GPVI is in contrast to CD84 differentially regulated by ADAM10 and ADAM17. A novel role of CD84 under pathophysiological conditions was revealed as CD84 deficient mice were protected from ischemic stroke in the model of transient middle cerebral artery occlusion and this protection was based on the lack of CD84 in T cells. Ca2+ is an essential second messenger that facilitates activation of platelets and diverse functions in different eukaryotic cell types. Store-operated Ca2+ entry (SOCE) represents the major mechanism leading to rise in intracellular Ca2+ concentration in non-excitable cells. The Ca2+ sensor STIM1 (stromal interaction molecule 1) and the SOC channel subunit protein Orai1 are established mediators of SOCE in platelets. STIM2 is the major STIM isoform in neurons, but the role of the SOC channel subunit protein Orai2 in platelets and neurons has remained elusive. In the third part of this thesis, Orai2 deficient mice were generated and analyzed. Orai2 was dispensable for platelet function, however, Orai2 deficient mice were protected from ischemic neurodegeneration and this phenotype was attributed to defective SOCE in neurons. N2 - Die Aktivierung und Aggregation von Blutplättchen sind wichtige Prozesse um Blutverlust nach Gefäßverletzungen zu vermeiden. Diese Prozesse spielen aber auch eine Rolle in der arteriellen Thrombose, die zu Herzinfarkt und Schlaganfall führen kann. Die Bildung stabiler Thromben setzt eine Reihe von Vorgängen voraus, an denen Blutplättchenrezeptoren beteiligt sind, welche zur Adhäsion, Aktivierung und Aggregation der Blutplättchen beitragen. Für einige Blutplättchenrezeptoren wurde eine Regulation der Expression durch (Metallo )Proteinasen beschrieben, jedoch sind die molekularen Mechanismen weitgehend unbekannt. CD84, ein Protein das zur signaling lymphocyte activation molecule (SLAM) Familie gehört, wird sowohl in Immunzellen als auch in Blutplättchen exprimiert. Jedoch war die Rolle von CD84 in der Physiologie der Blutplättchen unklar. In der vorliegenden Arbeit wurden CD84 defiziente Mäuse generiert und analysiert. In etablierten in vitro und in vivo Test, welche die Blutplättchenfunktion und Thrombusbildung untersuchen, war der Phänotyp von CD84 defizienten Mäusen unverändert gegenüber Wildtyp-Kontrollen. Es wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass CD84 in Blutplättchen nicht als Modulator der Thrombusbildung fungiert, sondern eher andere Funktionen hat. Im Einklang damit wurde im zweiten Teil dieser Arbeit ein neuer Regulationsmechanismus entdeckt und aufgeklärt. Infolge von Blutplättchenaktivierung wurde der N-terminale Teil von CD84 ausschließlich von a disintegrin and metalloproteinase 10 (ADAM10) geschnitten, während der intrazelluläre Anteil durch Calpain prozessiert wurde. Weiterhin wurde die Regulation des Blutplättchen-aktivierenden Kollagenrezeptors Glykoprotein VI (GPVI) untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass GPVI, im Gegensatz zu CD84, einer differenziellen Regulation durch ADAM10 und ADAM17 unterliegt. Unter pathophysiologischen Bedingungen wurde eine neue Rolle von CD84 aufgedeckt, da CD84 defiziente Mäuse vor ischämischem Schlaganfall im transient middle cerebral artery occlusion Modell geschützt waren. Dieser Schutz beruhte auf dem Fehlen von CD84 auf T Zellen. Ca2+ ist ein wichtiger sekundärer Botenstoff, der die Aktivierung von Blutplättchen ermöglicht sowie diverse Funktionen in verschiedenen eukaryotischen Zellen erfüllt. Store-operated Ca2+ entry (SOCE) stellt den Hauptmechanismus dar, der zum Anstieg der intrazellulären Ca2+ Konzentration in nicht-erregbaren Zellen führt. Der Ca2+ Sensor STIM1 (stromal interaction molecule 1) und das SOC-Kanal Protein Orai1 sind als Vermittler des SOCE in Blutplättchen bekannt. STIM2 stellt die Hauptisoform der STIM Moleküle in Neuronen dar, jedoch war die Rolle des SOC-Kanal Proteins Orai2 in Blutplättchen und Neuronen weitgehend unbekannt. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden Orai2 defiziente Mäuse generiert und analysiert. Orai2 war nicht essentiell für die Funktion von Blutplättchen, jedoch waren Orai2 defiziente Mäuse vor ischämischer Neurodegeneration geschützt. Dieser Phänotyp wurde auf einen defekten SOCE in Neuronen zurückgeführt. KW - Thrombozyt KW - Maus KW - Genexpression KW - Metalloproteinasen KW - platelets KW - CD84 KW - Metalloproteinase KW - GPVI Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-87949 ER -