TY  - THES
A1  - Krähnke, Martin
T1  - Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived stromal cells in pellet culture and silk scaffolds for cartilage engineering – Effects of different growth factors and hypoxic conditions
T1  - Chondrogene Differenzierung von Stammzellen aus dem Knochenmark in Pelletkultur und Seidenimplantaten für die Knorpelregeneration - Effekte verschiedener Wachstumsfaktoren und hypoxischer Bedingungen
N2  - Articular cartilage lesions that occur upon intensive sport, trauma or degenerative disease represent a severe therapeutic problem. At present, osteoarthritis is the most common joint disease worldwide, affecting around 10% of men and 18% of women over 60 years of age (302). The poor self-regeneration capacity of cartilage and the lack of efficient therapeutic treatment options to regenerate durable articular cartilage tissue, provide the rationale for the development of new treatment options based on cartilage tissue engineering approaches (281). The integrated use of cells, biomaterials and growth factors to guide tissue development has the potential to provide functional substitutes of lost or damaged tissues (2,3). For the regeneration of cartilage, the availability of mesenchymal stromal cells (MSCs) or their recruitment into the defect site is fundamental (281). Due to their high proliferation capacity, the possibility to differentiate into chondrocytes and their potential to attract other progenitor cells into the defect site, bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BMSCs) are still regarded as an attractive cell source for cartilage tissue engineering (80). However, in order to successfully engineer cartilage tissue, a better understanding of basic principles of developmental processes and microenvironmental cues that guide chondrogenesis is required.
N2  - Verletzungen des Gelenkknorpels, die durch intensiven Sport, Trauma oder degenerative Krankheiten induziert wurden, stellen ein großes therapeutisches Problem dar. Heutzutage ist Arthrose die weltweit häufigste Gelenkerkrankung, die etwa 10% der männlichen und 18% der weiblichen Bevölkerung über 60 Jahre betrifft (302). Die geringe intrinsische Heilungskapazität von Knorpelgewebe und das Fehlen effizienter Behandlungsmethoden, um dauerhaften Gelenkknorpel zu erzeugen, bilden die Grundlage für die Entwicklung neuartiger Behandlungsmethoden auf Basis des Tissue Engineering (281). Hierbei verfügt speziell der integrierte Einsatz von Zellen, Biomaterialien und Wachstumsfaktoren über das Potential zerstörtes oder geschädigtes Gewebe zu ersetzen bzw. die Regeneration von neuem Gewebe zu fördern (2,3). Für die Regeneration von Knorpelgewebe ist vor allem die Verfügbarkeit von mesenchymalen Stammzellen (MSC) und deren Rekrutierung in die Defektzone von großer Bedeutung (281). Aufgrund ihrer hohen Proliferationsrate, der Fähigkeit in Chondrozyten zu differenzieren und des Potentials andere Vorläuferzellen in die Defektzone zu rekrutieren bilden MSCs auch heute noch einen attraktiven Ansatz im Knorpel-Tissue Engineering (80). Eine wichtige Voraussetzung für die erfolgreiche Entwicklung von Knorpelgewebe ist jedoch ein besseres Verständnis der grundlegenden Entwicklungsprozesse und der Einflussfaktoren der Mikroumgebung, die die Chondrogenese regulieren.
KW  - Hypoxie
KW  - Knorpelbildung
KW  - Tissue Engineering
KW  - Chondrogenesis
KW  - Hypoxia
KW  - Tissue Engineering
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192999
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wiesbeck, Christina
T1  - Fabrication and characterization of NCO-sP(EO-stat-PO)- crosslinked and functionalized electrospun gelatin scaffolds for tissue engineering applications
T1  - Herstellung und Charakterisierung von elektrogesponnenen Nanofasern aus Gelatine und NCO-sP(EO-stat-PO) für Tissue Engineering Anwendungen
N2  - In Tissue Engineering, scaffolds composed of natural polymers often show a distinct lack in stability. The natural polymer gelatin is highly fragile under physiological conditions, nevertheless displaying a broad variety of favorable properties. The aim of this study was to fabricate electrospun gelatin nanofibers, in situ functionalized and stabilized during the spinning process with highly reactive star polymer NCO-sP(EO-stat-PO) (“sPEG”). A spinning protocol for homogenous, non-beaded, 500 to 1000 nm thick nanofibers from different ratios of gelatin and sPEG was successfully established. Fibers were subsequently characterized and tested with SEM imaging, tensile tests, water incubation, FTIR, EDX, and cell culture. It was shown that adding sPEG during the spinning process leads to an increase in visible fiber crosslinking, mechanical stability, and stability in water. The nanofibers were further shown to be biocompatible in cell culture with RAW 264.7 macrophages.
N2  - Tissue Engineering Scaffolds aus natürlichen Polymeren zeigen häufig mangelnde Stabilität, insbesondere unter physiologischen Bedingungen. Das natürliche Polymer Gelatine besitzt einige sehr vorteilhafte Eigenschaften für die Anwendung bei der Produktion künstlicher Körpergewebe. Beim Einsatz im menschlichen Organismus ist die Gelatine durch ihre Wasserlöslichkeit höchst fragil. Das Ziel dieser Arbeit war die Herstellung von Nanofaser-Scaffolds aus Gelatine mittels Elektrospinning und deren in situ Stabilisierung durch das Sternpolymer NCO-sP(EO-stat-PO) („sPEG“). Zunächst wurde ein Spinningprotokoll zur Fabrikation homogener, glatter, 500 bis 1000 nm dicker Nanofasern in verschiedenen Verhältnissen von Gelatine und sPEG erarbeitet. Mittels REM Bildgebung, Zugversuchen, Wasserinkubationsversuchen, FTIR, EDX und Zellkultur wurden die Fasern untersucht und charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Zugabe von sPEG während des Spinningprozesses zu einer sichtbaren Quervernetzung der Fasern, sowie zu einem Anstieg der mechanischen Festigkeit und der Wasserstabilität führt. Des Weiteren wurde die Biokompatibilität der Nanofasern in der Zellkultur mit RAW 264.7 Makrophagen belegt.
KW  - Tissue Engineering
KW  - Electrospinning
KW  - Gelatine
KW  - Polyethylenglykole
KW  - NCO-sP(EO-stat-PO)
KW  - sPEG
KW  - starPEG
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-190988
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TY  - THES
A1  - Kremer, Antje
T1  - Tissue Engineering of a Vascularized Meniscus Implant
T1  - Tissue Engineering eines vaskularisierten Meniskus-Implantates
N2  - The knee joint is a complex composite joint containing the C-shaped wedge-like menisci composed of fibrocartilage. Due to their complex composition and structure, they provide mechanical resilience to the knee joint protecting the articular cartilage. Because of the limited repair potential, meniscal injuries do not only affect the meniscus itself but also lead to altered joint homeostasis and inevitably to secondary osteoarthritis.

The meniscus was characterized focusing on its anatomy, structure and meniscal markers such as aggrecan, collagen type I (Col I) and Col II. The components relevant for meniscus tissue engineering, namely  cells, Col I scaffolds, biochemical and biomechanical stimuli were studied. Meniscal cells (MCs) were isolated from meniscus, mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow and dermal microvascular endothelial cells (d-mvECs) from foreskin biopsies. For the human (h) meniscus model, wedge-shape compression of a hMSC-laden Col I gel was successfully established. During three weeks of static culture, the biochemical stimulus transforming growth factor beta-3 (TGF beta-3) led to a compact collagen structure. On day 21, this meniscus model showed high metabolic activity and matrix remodeling as confirmed by matrix metalloproteinases detection. The fibrochondrogenic properties were illustrated by immunohistochemical detection of meniscal markers, significant GAG/DNA increase and increased compressive properties. For further improvement, biomechanical stimulation systems by compression and hydrostatic pressure were designed. As one vascularization approach, direct stimulation with ciclopirox olamine (CPX) significantly increased sprouting of hd-mvEC spheroids even in absence of auxiliary cells such as MSCs. Second, a cell sheet composed of hMSCs and hd-mvECs was fabricated by temperature triggered cell sheet engineering and transferred onto the wedge-shaped meniscus model. Third, a biological vascularized scaffold (BioVaSc-TERM) was re-endothelialized with hd-mvECs providing a viable vascularized network. The vascularized BioVaSc-TERM was suggested as wrapping scaffold of the meniscus model by using two suture techniques, the all-inside-repair (AIR) for the posterior horn, and the outside-in-refixation (OIR) for the anterior horn and the middle part.

This meniscus model for replacing torn menisci is a promising approach to be further optimized regarding vascularization, biochemical and biomechanical stimuli.
N2  - Das Knie ist ein komplex zusammengesetztes Gelenk mit zwei C-förmigen Keilen aus Bindegewebsknorpel, die Menisken. Sie sorgen für die mechanische Belastbarkeit des Knies, wodurch der Gelenksknorpel geschützt wird. Aufgrund des limitierten Heilungspotentials beeinträchtigen Meniskusverletzungen nicht nur den Meniskus selbst, sondern schädigen auch das Gelenksgleichgewicht und führen zu sekundärer Osteoarthritis.

Der Meniskus wurde in seiner Anatomie, Struktur und Meniskusmarkern wie Aggrekan, Kollagen I und Kollagen II charakterisiert. Die Komponenten von Meniskus Tissue Engineering, Zellen, Kollagen I Materialien, biochemische und biomechanische Stimuli wurden untersucht. Meniskuszellen (MCs) wurden aus Meniskus isoliert, mesenchymale Stammzellen (MSCs) aus Knochenmark und dermale mikrovaskuläre Endothelzellen (d-mvECs) aus Vorhautbiopsien. Für das humane (h) Meniskus-Modell wurde die keilförmige Kompression eines hMSC-beladenen Kollagen I Gels erfolgreich etabliert. Während drei Wochen statischer Kultur führte der biochemische Stimulus transformierender Wachs-tumsfaktor beta-3 (TGF beta-3) zu einer kompakten Kollagenstruktur. An Tag 21 zeigte dieses Meniskus-Modell eine hohe metabolische Aktivität und Matrixumbau durch die Detektion von Matrix-Metalloproteasen. Der Bindegewebsknorpel wurde durch immunhistochemische Detektion der Meniskusmarker, einem signifikanten GAG/DNA Anstieg und erhöhter Kompressionseigenschaften bestätigt. Für weitere Verbesserungen wurden biomechanische Stimulierungssysteme mittels Kompression und hydrostatischen Druck aufgebaut. Als Vaskularisierungsansatz führte die direkte Stimulierung mit Ciclopirox Olamine (CPX) sogar in Abwesenheit von Helferzellen wie MSCs zu einem erhöhten Sprouting der hd-mvEC Spheroide. Zweitens wurde ein hMSC/hd-mvEC Sheet mithilfe eines Temperatur-abhängigen Verfahrens produziert und auf das keilförmige Meniskus-Modell transferiert. Drittens wurde ein vaskularisiertes Biomaterial (BioVaSc-TERM) mit hd-mvECs besiedelt, wodurch ein vitales Gefäßystem bereitgestellt wurde. Die vaskularisierte BioVaSc-TERM wurde als Hülle des Meniskus-Modells unter der Verwendung von zwei Nahttechniken vorgeschlagen: die All-Inside-Repair (AIR) für das Hinterhorn und die Outside-In-Refixation (OIR) für das Vorderhorn und den mittleren Teil.

Dieses Meniskus-Modell ist ein vielversprechender Ansatz für den Meniskusersatz, um in Vaskularisierung, biochemischer und biomechanischer Stimuli weiter optimiert zu werden.
KW  - Meniskus
KW  - Tissue Engineering
KW  - Regenerative Medizin
KW  - Meniskusimplantat
KW  - meniscus implant
KW  - Tissue Engineering
KW  - tissue engineering
KW  - vascularization
KW  - Vaskularisierung
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184326
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TY  - THES
A1  - Kreß, Sebastian
T1  - Development and proof of concept of a biological vascularized cell‐based drug delivery system
T1  - Entwicklung und Proof of Concept eines biologischen, vaskularisierten, zellbasierten Drug‐Delivery‐Systems
N2  - A major therapeutic challenge is the increasing incidence of chronic disorders.
The persistent impairment or loss of tissue function requires constitutive on‐demand
drug availability optimally achieved by a drug delivery system ideally directly connected
to the blood circulation of the patient. However, despite the efforts and achievements in
cell‐based therapies and the generation of complex and customized cell‐specific
microenvironments, the generation of functional tissue is still unaccomplished.
This study demonstrates the capability to generate a vascularized platform technology to
potentially overcome the supply restraints for graft development and clinical application
with immediate anastomosis to the blood circulation.
The ability to decellularize segments of the rat intestine while preserving the ECM for
subsequent reendothelialization was proven. The reestablishment of a functional
arteriovenous perfusion circuit enabled the supply of co‐cultured cells capable to replace
the function of damaged tissue or to serve as a drug delivery system. During in vitro
studies, the applicability of the developed miniaturized biological vascularized scaffold
(mBioVaSc‐TERM®) was demonstrated. While indicating promising results in short term
in vivo studies, long term implantations revealed current limitations for the translation
into clinical application. The gained insights will impact further improvements of quality
and performance of this promising platform technology for future regenerative therapies.
N2  - Eine kontinuierlich steigende Inzidenz chronischer Krankheiten stellt eine immer größer
werdende therapeutische Herausforderung dar. Der anhaltende Funktionsverlust von
Geweben erfordert die bedarfsgerechte Verfügbarkeit von Wirkstoffen, deren
kontinuierliche Bereitstellung und Verteilung über die Blutzirkulation von
implantierbaren Pharmakotherapie‐Produkten gelöst werden kann. Trotz der
Fortschritte und Erfolge mit Zelltherapien sowie der Nachbildung der Zell‐eigenen
Nischen konnten bisher noch keine funktionellen Gewebe für die medizinische
Anwendbarkeit hergestellt werden.
Diese Studie zeigt die Möglichkeit zur Herstellung einer vaskularisierten Plattform‐
Technologie um die Beschränkung der Nährstoff‐Versorgung zu überwinden für die
Entwicklung von Transplantaten für die klinische Anwendung und deren sofortige
Anastomose an die Blutzirkulation.
Die Möglichkeit Rattendarmsegmente zu dezellularisieren, die Extrazellulärmatrix und
das interne Gefäßsystem dabei jedoch zu erhalten um diese Strukturen
wiederzubesiedeln wurde bewiesen. Das Wiederherstellen des funktionellen
arteriovenösen Perfusionskreislaufs ermöglichte die Versorgung von Ko‐kultivierten
Zellen um damit funktionalen Gewebeersatz bzw. ‐modelle aufzubauen oder als Medizin‐
Produkt Einsatz zu finden. In vitro‐Studien zeigten eindrucksvoll Reife und
Anwendbarkeit des hier entwickelten miniaturisierten, biologischen, vaskularisierten
Scaffold (mBioVaSc‐TERM®). Während in in vivo‐Studien zunächst vielversprechende
Ergebnisse erzielt wurden, zeigten Langzeit Implantationen die aktuellen Grenzen zur
Translation in die klinische Anwendung. Die gewonnenen Erkenntnisse werden dazu
dienen Qualität und Funktionalität dieser vielversprechenden Plattform‐Technologie zu
verbessern um zukünftige regenerative Therapien zu ermöglichen.
KW  - Vaskularisation
KW  - Dezellularisierung
KW  - Tissue Engineering
KW  - Therapeutisches System
KW  - Implantat
KW  - Vascularized
KW  - drug delivery
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178650
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TY  - THES
A1  - Rücker, Christoph
T1  - Development of a prevascularized bone implant
T1  - Entwicklung eines prävaskularisierten Knochenimplantats
N2  - The skeletal system forms the mechanical structure of the body and consists of bone, which is hard connective tissue. The tasks the skeleton and bones take over are of mechanical, metabolic and synthetic nature. Lastly, bones enable the production of blood cells by housing the bone marrow. Bone has a scarless self-healing capacity to a certain degree. Injuries exceeding this capacity caused by trauma, surgical removal of infected or tumoral bone or as a result from treatment-related osteonecrosis, will not heal. Critical size bone defects that will not heal by themselves are still object of comprehensive clinical investigation. The conventional treatments often result in therapies including burdening methods as for example the harvesting of autologous bone material. The aim of this thesis was the creation of a prevascularized bone implant employing minimally invasive methods in order to minimize inconvenience for patients and surgical site morbidity. The basis for the implant was a decellularized, naturally derived vascular scaffold (BioVaSc-TERM®) providing functional vessel structures after reseeding with autologous endothelial cells. The bone compartment was built by the combination of the aforementioned scaffold with synthetic β-tricalcium phosphate. In vitro culture for tissue maturation was performed using bioreactor technology before the testing of the regenerative potential of the implant in large animal experiments in sheep. A tibia defect was treated without the anastomosis of the implant’s innate vasculature to the host’s circulatory system and in a second study, with anastomosis of the vessel system in a mandibular defect. While the non-anastomosed implant revealed a mostly osteoconductive effect, the implants that were anastomosed achieved formation of bony islands evenly distributed over the defect.
In order to prepare preconditions for a rapid approval of an implant making use of this vascularization strategy, the manufacturing of the BioVaSc-TERM® as vascularizing scaffold was adjusted to GMP requirements.
N2  - Das Skelett bildet die mechanische Struktur des Körpers und besteht aus Knochen, einem harten Bindegewebe. Knochen übernehmen mechanische, metabolische und synthetische Aufgaben. Schlussendlich ermöglichen Knochen die Synthese von Blutzellen durch die Beherbergung des Knochenmarks. Wird die Heilungskapazität von Knochen durch Trauma, operative Entfernung von infiziertem oder tumorösem Knochen oder als Ergebnis behandlungsbedingter Osteonekrose, überschritten, findet keine vollständige Heilung statt. Knochendefekte, die eine kritische Größe überschreiten, sind daher immer noch Gegenstand umfangreicher, klinischer Forschung. Bei herkömmlichen Behandlungsmethoden können Eingriffe notwendig werden, die den Patienten belasten, wie bei der Gewinnung von autologem Knochenmaterial. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Herstellung eines prävaskularisierten Implantats unter Verwendung minimalinvasiver Methoden, um die Belastung von Patienten und die Morbidität an der Entnahmestelle, zu verringern. Zur Herstellung eines vaskularisierten Implantats bildete ein dezellularisiertes Darmsegment (Jejunum) porcinen Ursprungs die Grundlage (BioVasc-TERM®). Diese Trägerstruktur stellte ein funktionales Blutgefäßsystem nach Wiederbesiedelung mit autologen Endothelzellen bereit. Der Knochenanteil des Implantats wurde durch die Kombination der genannten Trägerstruktur mit dem synthetischen Knochenersatzmaterial β-Tricalciumphosphat gebildet. In-vitro-Kultivierung in einem Bioreaktor führte zur Reifung des Implantats vor der Testung seines Potenzials zur Knochenregeneration in Großtierversuchen bei Schafen. Ein Tibiadefekt wurde behandelt ohne die Anastomose des implantateigenen Gefäßsystems an den Blutkreislauf und ein Mandibeldefekt wurde mit Gefäßanschluss behandelt. Das Implantat ohne Gefäßanschluss hatte einen osteokonduktiven Effekt, während das anastomosierte Implantat zur Bildung zahlreicher Knocheninseln, gleichmäßig über den Defekt verteilt, führte. Um eine zügige Zulassung eines Implantats, das diese Strategie zur Vaskularisierung von Knochen nutzt, zu ermöglichen, wurde die Herstellung der BioVaSc-TERM® an die Vorgaben der Guten Herstellungspraxis angepasst.
KW  - Tissue Engineering
KW  - Knochenregeneration
KW  - Regenerative Medizin
KW  - Angiogenese
KW  - Implantat
KW  - bone
KW  - implant
KW  - Knochenimplantat
KW  - Vaskularisierung
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178869
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TY  - THES
A1  - Nelke, Lena
T1  - Establishment and optimization of 3-dimensional mamma carcinoma models for therapy simulation and drug testing
T1  - Etablierung und Optimierung 3-dimensionaler Mammakarzinommodelle für die Therapiesimulation und die Wirkstofftestung
N2  - Breast cancer is the most common cancer among women worldwide and the second most common cause of cancer death in the developed countries. As the current state of the art in first-line drug screenings is highly ineffective, there is an urgent need for novel test systems that allow for reliable predictions of drug sensitivity.
In this study, a tissue engineering approach was used to successfully establish and standardize a 3-dimensional (3D) mamma carcinoma test system that was optimized for the testing of anti-tumour therapies as well as for the investigation of tumour biological issues. This 3D test system is based on the decellularised scaffold of a porcine small intestinal segment and represents the three molecular subsets of oestrogen receptor-positive, HER2/Neu-overexpressing and triple negative breast cancer (TNBC). The characterization of the test system with respect to morphology as well as the expression of markers for epithelial-mesenchymal transition (EMT) and differentiation indicate that the 3D tumour models cultured under static and dynamic conditions reflect tumour relevant features and have a good correlation with in vivo tumour tissue from the corresponding xenograft models. In this respect, the dynamic culture in a flow bioreactor resulted in the generation of tumour models that exhibited best reflection of the morphology of the xenograft material. Furthermore, the proliferation indices of 3D models were significantly reduced compared to 2-dimensional (2D) cell culture and therefore better reflect the in vivo situation. As this more physiological proliferation index prevents an overestimation of the therapeutic effect of cytostatic compounds, this is a crucial advantage of the test system compared to 2D culture. Moreover, it could be shown that the 3D models can recapitulate different tumour stages with respect to tumour cell invasion. The scaffold SISmuc with the preserved basement membrane structure allowed the investigation of invasion over this barrier which tumour cells of epithelial origin have to cross in in vivo conditions during the process of metastasis formation. Additionally, the data obtained from ultrastructural analysis and in situ zymography indicate that the invasion observed is connected to a tumour cell-associated change in the basement membrane in which matrix metalloproteinases (MMPs) are also involved. This features of the model in combination with the mentioned methods of analysis could be used in the future to mechanistically investigate invasive processes and to test anti-metastatic therapy strategies.
The validation of the 3D models as a test system with respect to the predictability of therapeutic effects was achieved by the clinically relevant targeted therapy with the monoclonal antibody trastuzumab which induces therapeutic response only in patients with HER2/Neu-overexpressing mamma carcinomas due to its specificity for HER2. While neither in 2D nor in 3D models of all molecular subsets a clear reduction of cell viability or an increase in apoptosis could be observed, a distinct increase in antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) was detected only in the HER2/NEU-overexpressing 3D model with the help of an ADCC reporter gene assay that had been adapted for the application in the 3D model in the here presented work. This correlates with the clinical observations and underlines the relevance of ADCC as a mechanism of action (MOA) of trastuzumab. In order to measure the effects of ADCC on the tumour cells in a direct way without the indirect measurement via a reporter gene, the introduction of an immunological component into the models was required. This was achieved by the integration of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), thereby allowing the measurement of the induction of tumour cell apoptosis in the HER2/Neu-overexpressing model. Hence, in this study an immunocompetent model could be established that holds the potential for further testing of therapies from the emergent field of cancer immunotherapies.
Subsequently, the established test system was used for the investigation of scientific issues from different areas of application. By the comparison of the sensitivity of the 2D and 3D model of TNBC towards the water-insoluble compound curcumin that was applied in a novel nanoformulation or in a DMSO-based formulation, the 3D test system was successfully applied for the evaluation of an innovative formulation strategy for poorly soluble drugs in order to achieve cancer therapy-relevant concentrations. Moreover, due to the lack of targeted therapies for TNBC, the TNBC model was applied for testing novel treatment strategies. On the one hand, therapy with the WEE1 kinase inhibitor MK 1775 was evaluated as a single agent as well as in combination with the chemotherapeutic agent doxorubicin. This therapy approach did not reveal any distinct benefits in the 3D test system in contrast to testing in 2D culture. On the other hand, a novel therapy approach from the field of cellular immunotherapies was successfully applied in the TNBC 3D model. The treatment with T cells that express a chimeric antigen receptor (CAR) against ROR1 revealed in the static as well as in the dynamic model a migration of T cells into the tumour tissue, an enhanced proliferation of T cells as well as an efficient lysis of the tumour cells via apoptosis and therefore a specific anti-cancer effect of CAR-transduced T cells compared to control T cells. These results illustrate that the therapeutic application of CAR T cells is a promising strategy for the treatment of solid tumours like TNBC and that the here presented 3D models are suitable for the evaluation and optimization of cellular immunotherapies.
In the last part of this work, the 3D models were expanded by components of the tumour stroma for future applications. By coculture with fibroblasts, the natural structures of the intestinal scaffold comprising crypts and villi were remodelled and the tumour cells formed tumour-like structures together with the fibroblasts. This tissue model displayed a strong correlation with xenograft models with respect to morphology, marker expression as well as the activation of dermal fibroblasts towards a cancer-associated fibroblast (CAF) phenotype. For the integration of adipocytes which are an essential component of the breast stroma, a coculture with human adipose-derived stromal/stem cells (hASCs) which could be successfully differentiated along the adipose lineage in 3D static as well as dynamic models was established. These models are suitable especially for the mechanistic analysis of the reciprocal interaction between tumour cells and adipocytes due to the complex differentiation process.
Taken together, in this study a human 3D mamma carcinoma test system for application in the preclinical development and testing of anti-tumour therapies as well as in basic research in the field of tumour biology was successfully established. With the help of this modular test system, relevant data can be obtained concerning the efficacy of therapies in tumours of different molecular subsets and different tumour stages as well as for the optimization of novel therapy strategies like immunotherapies. In the future this can contribute to improve the preclinical screening and thereby to reduce the high attrition rates in pharmaceutical industry as well as the amount of animal experiments.
N2  - Brustkrebs ist die häufigste Krebsart bei Frauen und die zweithäufigste Todesursache bei Krebserkrankungen in den Industrienationen. Aufgrund der Ineffizienz der derzeit verwendeten Modelle für die Identifizierung neuer Therapeutika herrscht ein hoher Bedarf an neuartigen Testsystemen, welche aussagekräftige Vorhersagen über die Wirksamkeit ermöglichen.
In dieser Arbeit wurde mit Hilfe des Tissue Engineerings erfolgreich ein 3-dimensionales (3D) Mammakarzinom-Testsystem etabliert, standardisiert und für die Testung von anti-tumoralen Therapien sowie weitere tumorbiologische Fragestellungen optimiert. Dieses 3D Testsystem basiert auf der dezellularisierten Gerüststruktur eines porcinen Dünndarmsegments und repräsentiert die drei molekularen Subtypen des Östrogen-Rezeptor-positiven, HER2/Neu-überexprimierenden sowie des tripel-negativen Brustkrebses (TNBC). Die Charakterisierung des Testsystems anhand der Morphologie sowie der Expression von Markern zur Bestimmung der epithelialen-mesenchymalen Transition (EMT) und der Differenzierung zeigte, dass die statisch und dynamisch kultivierten 3D Modelle Tumor-relevante Charakteristika widerspiegeln und eine deutliche Ähnlichkeit zu in vivo Tumormaterial aus entsprechenden Xenograft-Modellen aufweisen, wobei die dynamische Kultivierung in einem Flussreaktor zur Generierung von Tumormodellen führte, welche die Morphologie des Tumorgewebes aus Xenograft-Modellen am besten repräsentierten. Des Weiteren war die Proliferationsrate in den 3D Modellen im Vergleich zu 2-dimensionalen (2D) Zellkulturen signifikant reduziert und entspricht daher eher der Situation in vivo. Dies ist ein entscheidender Vorteil des Testsystems gegenüber der 2D Zellkultur, da durch die physiologischere Proliferationsrate eine Überschätzung des Therapieeffekts zytostatischer Medikamente vermieden wird. Zudem konnte gezeigt werden, dass mit Hilfe der 3D Modelle unterschiedliche Tumorstadien in Bezug auf die Tumorzellinvasion abgebildet werden können. Die Gerüststruktur SISmuc mit erhaltener Basalmembranstruktur ermöglichte eine Untersuchung der Invasion über diese Barriere, welche Tumorzellen epithelialen Ursprungs unter in vivo-Bedingungen beim Prozess der Metastasierung überwinden müssen. Zudem deuten die durch ultrastrukturelle Analysen und in situ Zymographie gewonnenen Daten darauf hin, dass die beobachtete Invasion mit einer Tumorzell-assoziierten Veränderung der Basalmembran, an der auch Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) beteiligt sind, einhergeht. Diese Eigenschaften des Modells in Kombination mit den erwähnten Untersuchungsmethoden könnten in Zukunft dazu eingesetzt werden, Invasionsprozesse mechanistisch zu untersuchen sowie neue anti-metastatisch wirkende Therapiestrategien zu testen. 
Die Validierung der 3D Modelle als Testsystem bezüglich der Vorhersagbarkeit von Therapieeffekten erfolgte mit Hilfe der klinisch relevanten, zielgerichteten Therapie mit dem monoklonalen Antikörper Trastuzumab, welcher aufgrund seiner Spezifität für HER2/Neu nur in Patienten mit HER2/Neu-überexprimierendem Mammakarzinom einen Therapieerfolg erzielt. Während weder in 2D noch in den 3D Modellen aller molekularer Subtypen eine eindeutige Reduktion der Zellviabilität oder ein Anstieg der Apoptose gemessen werden konnte, zeigte sich mit Hilfe eines ADCC-Reportergenassays, der in dieser Arbeit für die Anwendung im 3D Modell angepasst wurde, ein deutlicher Anstieg der Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizität (ADCC) lediglich für das HER2/Neu-überexprimierende Modell. Dies entspricht den klinischen Beobachtungen und unterstreicht die Relevanz der ADCC als Wirkmechanismus des Antikörpers. Um die direkten Effekte einer ADCC auf die Tumorzellen im 3D Testsystem direkt – ohne den Umweg über ein Reportergen – messbar zu machen, war die Einführung einer immunologischen Komponente notwendig. Dies gelang mit Hilfe der Integration von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), wodurch die Induktion der Apoptose im HER2/Neu-überexprimierenden Modell messbar war. Somit konnte im Rahmen dieser Arbeit ein immunkompetentes Modell etabliert werden, welche das Potenzial für weitere Testungen aus dem aufstrebenden Bereich der Krebsimmuntherapien bietet. 
Anschließend wurde das etablierte Testsystem zur Untersuchung von Fragestellungen aus unterschiedlichen Anwendungsbereichen eingesetzt. Durch den Vergleich der Sensitivität von Tumorzellen in 2D und im 3D Modell des TNBC gegenüber des wasserunlöslichen Wirkstoffs Curcumin, welcher in einer neuartigen Nanoformulierung bzw. in einer DMSO-basierten Formulierung appliziert wurde, konnte das 3D Testsystem für die Evaluation einer innovativen Formulierungsstrategie für unlösliche Wirkstoffe angewendet werden, um für die Krebstherapie relevante Dosierungen zu erreichen. Weiterhin wurden aufgrund des Mangels an zielgerichteten Therapien für das tripel-negative Mammakarzinom neuartige Therapiestrategien anhand des 3D Modells getestet. Zum einen wurde die Therapie mit dem WEE1-Kinase Inhibitor MK 1775 als Monotherapie sowie in Kombination mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin evaluiert. Diese zeigte im Gegensatz zu Testungen in 2D Kultur keinen eindeutigen Therapieeffekt im 3D Testsystem. Zum anderen wurde eine neuartige Behandlung aus dem Bereich der zellulären Immuntherapie erfolgreich im TNBC 3D Modell angewendet. Die Behandlung mit T-Zellen, welche einen chimären Antigen-Rezeptor (CAR) gegen ROR1 tragen, zeigte sowohl im statischen als auch im dynamischen Modell eine Migration der T-Zellen in das Tumorgewebe, eine erhöhte Proliferation der T-Zellen sowie eine effiziente Lyse der Tumorzellen mittels Apoptose und damit eine spezifische anti-tumorale Wirkung der CAR-transduzierten T-Zellen im Vergleich zu Kontroll-T-Zellen. Diese Ergebnisse verdeutlichen einerseits, dass die therapeutische Anwendung von CAR-T-Zellen eine vielversprechende Strategie für die Behandlung von soliden Tumoren wie des TNBC ist, zum anderen, dass die hier vorgestellten 3D Modelle als Testsystem für die Evaluierung und Optimierung von zellulären Immuntherapien geeignet sind.
Im letzten Teil der Arbeit wurde das 3D Modell für die zukünftige Anwendung um Komponenten des Tumorstromas erweitert. Durch die Kokultur mit Fibroblasten wurden die natürlichen Strukturen der Darmmatrix, bestehend aus Krypten und Villi, umgebaut und die Krebszellen bildeten zusammen mit den Fibroblasten tumorartige Strukturen aus. Das so erzeugte Gewebemodell zeigte sowohl in morphologischer Hinsicht als auch bezogen auf die Markerexpression und die Aktivierung der dermalen Fibroblasten hin zu Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs) starke Ähnlichkeit mit Xenograft-Modellen. Für die Integration von Adipozyten, welche ein wichtiger Bestandteil des Stromas in der Brust sind, wurde eine Kokultur mit humanen, aus dem Fettgewebe stammenden Stroma-/Stammzellen (hASCs) etabliert, welche sowohl im statischen als auch im dynamischen 3D Modell erfolgreich adipogen differenziert werden konnten. Diese Modelle eignen sich aufgrund des komplexen Differenzierungsprozesses vor allem für die mechanistische Untersuchung der Interaktionen zwischen Tumorzellen und Adipozyten.
Zusammenfassend ist es in dieser Arbeit gelungen, ein humanes 3D Mammakarzinom-Testsystem zur Anwendung in der präklinischen Entwicklung und Testung anti-tumoraler Therapien sowie der Grundlagenforschung im Bereich der Tumorbiologie zu etablieren. Mit Hilfe dieses modularen Testsystems können relevante Daten zur Wirksamkeit von Therapien in Tumoren unterschiedlicher molekularer Subtypen sowie unterschiedlich fortgeschrittener Tumorstadien und zur Optimierung neuartiger Therapiestrategien wie Immuntherapien gewonnen werden. Dies kann in Zukunft dazu beitragen das präklinische Screening zu verbessern und somit die hohen klinischen Ausfallraten in der pharmazeutischen Industrie und die Zahl von Tierversuchen zu reduzieren.
KW  - Brustkrebs
KW  - Mamma carcinoma
KW  - Tissue Engineering
KW  - Drug testing
KW  - 3D model
KW  - therapy simulation
KW  - Mammakarzinom
KW  - Wirkstofftestung
KW  - 3D Modell
KW  - Therapiesimulation
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-172280
ER  -