TY - THES A1 - Heupel, Wolfgang-Moritz Felix T1 - Role and modulation of cadherins in pathologic processes T1 - Rolle und Modulation von Cadherinen in pathologischen Prozessen N2 - Ca2+ dependent cell adhesion molecules (cadherins) are central for a variety of cell and tissue functions such as morphogenesis, epithelial and endothelial barrier formation, synaptic function and cellular signaling. Of paramount importance for cadherin function is their specific extracellular adhesive trans-interaction. Cadherins are embedded in a cellular environment of intracellular and extracellular regulators that modify cadherin binding in response to various physiological and pathological stimuli. Most experimental approaches used for studying cadherin interaction however lack a physiological proof of principle mostly by not investigating cadherins in their physiological environment. In the present cumulative dissertation, experimental approaches were applied to characterize and modulate vascular endothelial (VE)-cadherin and desmocadherin functions in the (patho-)physiological contexts of endothelial permeability regulation and disturbance of epidermal barrier function, which is typical to the blistering skin disease pemphigus, respectively. Whereas VE-cadherin is a key regulator of the endothelial barrier that separates the blood compartment from the interstitial space of tissues, desmosomal cadherins are crucial for maintenance of epidermal integrity and separation of the external environment from the body’s internal milieu. Cadherin functions were both investigated in cell-free and cell-based conditions: by using biophysical single molecule techniques like atomic force microscopy (AFM), cadherin function could be investigated in conditions, where contributions of intracellular signaling were excluded. These experiments were, however, compared and combined with cell-based experiments in which cadherins of epidermal or endothelial cell cultures were probed by laser force microscopy (laser tweezers), fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and other techniques. The autoimmune blistering skin diseases pemphigus foliaceus (PF) and pemphigus vulgaris (PV) are caused by autoantibodies directed against the extracellular domains of the desmosomal cadherins desmoglein (Dsg) 1 and 3, which are important for epidermal adhesion. The mechanism of autoantibody-induced cell dissociation (acantholysis) in pemphigus, however, is still not fully understood. For the first time, it is shown by AFM force spectroscopy that pemphigus autoantibodies directly inhibit Dsg3 adhesion by steric hindrance but do not inhibit adhesion of Dsg1. However, the full pathogenicity of the autoantibodies depended on cellular signaling processes, since autoantibodies targeting Dsg1 also resulted in loss of cadherin-mediated adhesion in cell-based experiments. However, two other signaling pathways that have been reported to be involved in pemphigus pathogenesis, i.e. epidermal growth factor receptor (EGFR) and c-Src activation, were not found to be important in this context. Furthermore, peptide-based modulators of cadherin functions were generated for Dsg1/3 and VE-cadherin. By comparing Dsg1, Dsg3 and VE-cadherin sequences to published X-ray structures of cadherin trans-interactions, specific amino acid sequences of the binding pockets of these cadherins were identified. Peptide versions of these motifs were synthesized and the antagonistic functions of these “single peptides” were validated by AFM force spectroscopy as well as by cell-based assays. By linking two single peptides in tandem, stabilization of cadherin bonds because of by cross-bridge formation between trans-interacting cadherins was demonstrated. Protective effects of tandem peptides were shown by partly preventing pemphigus autoantibody-induced acantholysis, or in the case of VE-cadherin, by stabilizing endothelial barrier properties against barrier disrupting agents like the Ca2+ ionophore A23187 and an inhibitory VE-cadherin antibody. Most importantly, VE-cadherin tandem peptides abolished microvascular hyperpermeability induced by the physiologic inflammatory agent tumor necrosis factor-α in the rat mesentery in vivo. Both classes of tandem peptides therefore can be considered as a starting point for the generation of potential therapeutic agents that might prevent cell dissociation in pemphigus and breakdown of the endothelial barrier under inflammatory conditions. N2 - Die Familie der Ca2+ - abhängigen Adhäsionsproteine (Cadherine) spielt eine zentrale Rolle bei elementaren zellulären, geweblichen und Entwicklungsprozessen. Eine in der vorliegenden kumulativen Dissertation untersuchte Funktion von Cadherinen ist ihre Rolle beim Aufbau und der Aufrechterhaltung der epidermalen Barriere der Haut und der endothelialen Barriere von Blutgefäßen. Cadherine vermitteln Adhäsion über die extrazelluläre Bindung mit Cadherinen auf der Zelloberfläche angrenzender Zellen. Die durch Cadherine vermittelte Zelladhäsion ist ein dynamischer Prozess, der durch extrazelluläre und intrazelluläre Modulatoren im Zusammenspiel mit vielfältigen physiologischen Prozessen reguliert wird. Vielen Experimentalsystemen fehlt der realistische physiologische und gewebliche Bezug zur funktionellen Bedeutung der untersuchten Eigenschaften der Cadherine. In der vorliegenden kumulativen Dissertation wurden verschiedene Ansätze zur Untersuchung und Modulation von Cadherinen im Hinblick zweier (patho-)physiologischer Prozesse durchgeführt. Zum einen befasst sich die Doktorarbeit mit den Blasen-bildenden Hauterkrankungen der Pemphigus-Gruppe, bei welcher die Funktionsstörung desmosomaler Cadherine im Mittelpunkt steht. Zum anderen wurde das vaskuläre endotheliale (VE)-Cadherin und dessen Rolle bei der Regulation und pathologischen Entgleisung der Gefäßpermeabilität untersucht. Die Funktion dieser Cadherine wurde in der Arbeit sowohl in Zell-freien als auch in Zell-basierten Experimenten analysiert: mittels biophysikalischer Charakterisierung auf Einzelmolekülebene durch Kraftspektroskopie mit dem Atomkraftmikroskop (AFM) konnte die Adhäsion (Transinteraktion) von Cadherinen frei von zellulären Einflüssen isoliert untersucht werden. Diese Einzelmolekülstudien wurden durch Laserkraftmikroskopie (Laserpinzette) und verschiedene zellphysiologische Untersuchungen an epithelialen und endothelialen Zellkulturen und Geweben komplettiert. Bei der autoimmunen Hauterkrankung Pemphigus foliaceus (PF) und Pemphigus vulgaris (PV) bewirken Autoantikörper, die gegen die desmosomale Cadherine Desmoglein (Dsg) 1 und 3 gerichtet sind, eine Zelldissoziation (Akantholyse), die zu einer charakteristischen Blasenbildung auf der Haut der Patienten teils mit Ablösung der Epidermis führt. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe der AFM-Kraftspektroskopie zum ersten Mal gezeigt, dass Pemphigus-Autoantikörper direkt die Dsg3-vermittelte Adhäsion durch sterische Behinderung inhibieren. Zusätzlich wurden auch Unterschiede in der Pathogenität der Autoantikörper in Abhängigkeit von zellulären Signalwegen gefunden. In früheren Studien konnte bereits gezeigt werden, dass neben der vermuteten Hemmung der Cadherinbindung durch die Autoantikörper auch inhibitorische, die Zelladhäsion herabsetzende zytoplasmatische Signalwege für die Pathogenese dieser Krankheit wichtig sind. Daneben belegen Experimente dieser Arbeit, dass die durch Autoantikörper vermittelte Akantholyse in unseren Versuchsbedingungen unabhängig von der in anderen Studien postulierten Beteilung des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) und von c-Src war. In weiteren Experimenten wurden Peptide zur Modulation der Funktion von Dsg1/3 und VE-Cadherin entwickelt. Dazu wurden die Sequenzen von Dsg1, Dsg3 und VE-Cadherin mit bereits beschriebenen Röntgenkristallstrukturen von anderen Cadherinen verglichen und eigene Strukturmodelle auf der Grundlage einer Analogiemodellierung generiert. Auf diese Weise wurden Sequenzabschnitte identifiziert, die für die Cadherin-Transinteraktion wichtig sind. Aus diesen Sequenzen wurden Peptide abgeleitet, die die Cadherinfunktion entweder in einer agonistischen oder antagonistischen Weise beeinflussen sollten. Die inhibitorische Funktion der Einzelpeptide wurde sowohl durch AFM-Kraftspektroskopie als auch in Zell-basierten Laserpinzetten-Studien validiert. Durch das Zusammenfügen von zwei separaten Einzelpeptidsequenzen wurden Tandempeptide erzeugt. Diese sollten die jeweilige Cadherininteraktion durch das Überbrücken benachbarter adhäsiver Cadherindomänen stabilisieren. Das Dsg-spezifische Tandempeptid verhinderte teilweise die durch Autoantikörper hervorgerufene Akantholyse beim Pemphigus und das VE-Cadherin-spezifische Tandempeptid schützte die Endothelbarriere vor Permeabilitätserhöhung durch das Ca2+ - Ionophor A23187 oder durch einen inhibitorischen VE-Cadherin-Antikörper. In in-vivo-Experimenten an perfundierten Mikrogefäßen des Rattenmesenteriums verhinderte das VE-Cadherin-Tandempeptid den Anstieg der Endothelpermeabilität durch den physiologischen Entzündungsmediator Tumornekrosefaktor-α. Die Tandempeptide können als Ausgangspunkt für die Identifikation von spezifischen therapeutischen Agenzien zur Prävention der Akantholyse beim Pemphigus oder Verlust der VE-Cadherin-Bindung bei vaskulärer Hyperpermeabilität angesehen werden. KW - Cadherine KW - Zelladhäsion KW - Pemphigus KW - Desmosom KW - Endothel KW - Zelladhäsion KW - Cadherine KW - Desmogleine KW - VE-Cadherin KW - cell adhesion KW - cadherins KW - desmosomes Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52716 ER - TY - THES A1 - Filatova, Alina T1 - Mechanism and Control of Nuclear-Cytoplasmic Translocation of the Transporter Regulator RS1 T1 - Mechanismus und Kontrolle der Translokation der Transporterregulator RS1 zwischen Kern und Zytoplasma N2 - Das RS1 Protein (Gen RSC1A1) beteiligt sich an der Regulation des Na+-D-Glukose-kotransporters SGLT1 und einiger anderer Transporter. In subkonfluenten LLC-PK1 Zellen hemmt RS1 die Freisetzung von SGLT1 aus dem trans-Golgi-Netzwerk und die Transkription von SGLT1. Während es sich in konfluenten Zellen hauptsächlich im Zytoplasma befindet, ist RS1 in subkonfluenten Zellen im Kern und im Zytoplasma lokalisiert. In der vorliegenden Arbeit wurden Mechanismus und Regulation der konfluenzabhängigen Kernlokalisation von RS1 untersucht. Dabel konnte gezeigt werden, dass die von Konfluenz abhängige Kernlokalisation von RS1 durch den Zellzyklus reguliert wird. In RS1 aus Sus scrofa (pRS1) wurde eine Sequenz identifiziert („nuclear shuttling signal“, NS), die für die konfluenzabhängige Verteilung von RS1 verantwortlich ist und sowohl das Signal für die Kernlokalisation (NLS) als auch das Signal für den Export aus dem Kern (NES) beinhaltet. Die NLS und NES Signale von RS1 vermitteln die Translokation des Proteins in den Kern und aus dem Kern mit Hilfe von Importin β1 bzw. CRM1, wobei die Verteilung von RS1 zwischen Kern und Zytoplasma durch die Aktivität des Exportsystems bestimmt wird. Es wurde gezeigt, dass die benachbarte Proteinkinase C (PKC) Phosphorylierungsstelle an Serin 370 von pRS1 die NS-gesteuerte Kernlokalisierung kontrolliert und für die vom Zellzyklus abhängige Kernlokalisation notwendig ist. Aufgrund der Ergebnisse der ortsgerichteten Mutagenese, PKC-Aktivierungsexperimenten und Massenspektrometrie-Analyse des Phosphorylierungsmusters von RS1 wurde ein Modell vorgeschlagen, das die Regulation der Kernlokalisation des RS1 Proteins in LLC-PK1 Zellen beschreibt. Dem Modell zufolge wird RS1 in subkonfluenten Zellen stark in den Kern befördert, während der Export von RS1 aus dem Kern nicht stattfindet. Das führt zur Anreicherung von RS1 im Kern. Nach Konfluenz wird Serin 370 durch PKC phosphoryliert, was die Steigerung des RS1-Exports aus dem Kern begünstigt und die überwiegend zytoplasmatische Lokalisation des Proteins in konfluenten Zellen hervorruft. Die konfluenzabhängige Regulation der Lokalisation von RS1 kann die Expression von SGLT1 während der Regeneration von Enterozyten im Dünndarm und der Regeneration von Zellen der Nierentubuli nach hypoxämischem Stress kontrollieren. Außerdem deutet die Analyse der Genexpression in embryonalen Fibroblasten der RS-/- Mäuse deutet darauf hin, dass die transkriptionale Regulation durch RS1 im Zellzyklus und bei der Zellteilung eine wichtige Rolle spielen kann. Da die Lokalisation von RS1 zellzyklusabhängig ist, kann RS1 für die Regulation der Transporter in spezifischen Phasen des Zellzyklus wichtig sein. N2 - The RS1 protein (gene RSC1A1) participates in regulation of Na+-D-glucose cotransporter SGLT1 and some other solute carriers. In subconfluent LLC-PK1 cells, RS1 inhibits release of SGLT1 from the trans-Golgi network and transcription of SGLT1. In subconfluent cells, RS1 is localized in the nucleus and the cytoplasm whereas confluent cells contain predominantly cytoplasmic RS1. In the present study, the mechanism and regulation of confluence-dependent nuclear location of RS1 was investigated. Confluence dependent nuclear location of RS1 was shown to be regulated by the cell cycle. A nuclear shuttling signal (NS) in pRS1 was identified that ensures confluence-dependent distribution of pRS1 and comprises nuclear localization signal (NLS) and nuclear export signal (NES). The NLS and NES of RS1 mediate translocation into and out of the nucleus via importin ß1 and CRM1, respectively, and the nuclear/cytoplasmic distribution of the RS1 protein is determined by the nuclear export activity. The adjacent protein kinase C (PKC) phosphorylation site at serine 370 of pRS1 was shown to control nuclear localization driven by NS and is necessary for the differential localization of RS1 in quiescent versus proliferating cells. Basing on the data of site-directed mutagenesis, PKC activation experiments and mass spectrometry analysis of RS1 phosphorylation, the following model of the regulation of RS1 nuclear location in LLC-PK1 cells was proposed. In subconfluent cells, RS1 is actively imported into the nucleus whereas nuclear export of RS1 is not active leading to accumulation of RS1 in the nucleus. After confluence, phosphorylation of serine 370 of pRS1 by PKC takes place leading to enhancement of RS1 nuclear export and predominantly cytoplasmic distribution of the protein in the confluent cells. The confluence-dependent regulation of RS1 localization may control SGLT1 expression during regeneration of enterocytes in small intestine and during regeneration of renal tubular cells after hypoxemic stress. Moreover, the gene expression profiling of mouse embryonic fibroblasts with RS1-/- genotype suggests that transcriptional regulation by RS1 might be important for the cell cycle and cell division. Since RS1 localization depends on the cell cycle, RS1 might play a role in the regulation of the solute carriers during specific phases of the cell cycle. KW - RS1 KW - NES KW - NLS KW - Kern KW - Regulation KW - SGLT1 KW - Zellzyklus KW - Glukose KW - RS1 KW - NES KW - NLS KW - nucleus KW - transporter regulator KW - SGLT1 KW - glucose KW - nuclear export signal KW - nuclear localization signal KW - cell cycle KW - glucose Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-38512 ER - TY - THES A1 - Gorbunov, Dmitry T1 - Rat organic cation transporter 1 (rOCT1): investigation of conformational changes and ligand binding T1 - Kationentransporter 1 der Ratte (rOCT1): Untersuchung der Konformationsänderungen und Ligandbindung N2 - Polyspecific organic cation transporters (OCTs) of the SLC22 family mediate downhill transport of organic cations and play an essential role in excretion and distribution of endogenous organic cations and for the uptake, elimination and distribution of cationic drugs and toxins. Although physiological and pharmacological significance of OCTs is widely accepted, many questions concerning structure and transport mechanism still remain open. To investigate conformational changes of the rat OCT1 during transport cycle, voltage-clamp fluorometry was performed with a cysteine-deprived mutant in which phenylalanine 483 in transmembrane helix (TMH) 11 close to the extracellular surface was replaced by cysteine and covalently labeled with tetramethylrhodamine-6-maleimide. Potential-dependent fluorescence changes were observed that were sensitive to the presence of substrates choline, tetraethylammonium (TEA), 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP), and of the contransported inhibitor tetrabutylammonium (TBuA). The data suggest that the transporter undergoes conformational changes in voltage- and substrate-dependent manner which are compatible with alternating access mechanism. Using potential-dependent fluorescence changes as readout, one high-affinity binding site per substrate and two highaffinity binding sites for TBuA were identified in addition to the previously described single interaction sites. Coexisting high-affinity cation binding sites in organic cation transporters may collect xenobiotics and drugs; however, translocation of organic cations across the membrane may only be induced when a low-affinity cation binding site is loaded. Whereas high-affinity binding of TBuA has no effect on cation uptake by wildtype rat OCT1, replacement by cysteine or serine of amino acids W147, F483, and F486 located in a modeled contact region between TMH2 and TMH11 outside the binding pocket leads to inhibition of MPP or TEA uptake. Thus, mutations of amino acids in transport relevant key positions, which can be distinct from the cation binding region, may transform noninhibitory highaffinity binding sites of high-affinity inhibition sites and thereby cause adverse drug reactions in patients. N2 - Polyspezifische Transporter für organische Kationen (OCTs) der SLC22 Familie transportieren organische Kationen entlang des elektrochemischen Gradienten und spielen eine entscheidende Rolle bei der Ausscheidung und Gewebeverteilung von endogenen organischen Kationen und bei der Aufnahme, Ausscheidung und Verteilung von kationischen Medikamenten und Toxinen. Obwohl die physiologische und pharmakologische Bedeutung von Transportern für organische Kationen allgemein anerkannt ist, bleiben viele Fragen bezüglich der Struktur und des Transportmechanismus dieser Transporter noch offen. Um Konformationsänderungen von rOCT1 während des Transportzyklus zu untersuchen, wurde die „Voltage-clamp-Fluorometrie“ angewandt, bei der in einer cysteinarmen rOCT1 Mutante Phenylalanin 483 in der Transmembranhelix (TMH) 11 nahe an der extrazellulären Seite der Membran durch Cystein ersetzt und mit Tetramethylrhodamin-6-maleimid kovalent markiert wurde. Dabei wurden Spannungsabhängige Fluoreszenzänderungen beobachtet, die durch die Anwesenheit der Substrate - Cholin, Tetraethylammonium (TEA), 1-Methyl-4-phenylpyridinium (MPP) - und des nichttransportierten Hemmstoffes Tetrabutylammonium (TBuA) moduliert wurden. Die gewonnenen Daten deuten darauf hin, dass der Transporter Konformationsänderungen durchläuft, die spannungs- und substratabhängig sind, was mit dem „alternating access“ Mechanismus vereinbar ist. Die Analyse der spannungsabhängigen Fluoreszenzänderungen zeigte die Existenz je einer hochaffinen Bindungsstelle für Substrate und zweier hochaffinen Bindungsstellen für TBuA zusätzlich zu den früher identifizierten Bindungsstellen. Multiple hochaffine Kationenbindungsstellen in OCTs können Xenobiotika und Arzneimittel anreichern, aber die Translokation von organischen Kationen über die Membran kann erst dann erfolgen, wenn die niederaffine Bindungsstelle besetzt ist. Während die hochaffine Bindung von TBuA an den Wildtyp rOCT1 keine Wirkung auf die Aufnahme von Kationen hat, führt der Austausch der Aminosäuren W147, F483 und F486, die anhangs des Modells in der Kontaktregion zwischen TMH 2 und TMH 11 außerhalb der Bindungstasche lokalisiert sind, durch Cystein oder Serin zur Hemmung der MPP- und TEA-Aufnahme. Die Mutation der Aminosäuren in den für den Transport entscheidenden Positionen, die sich nicht unbedingt in der Kationenbindungstasche befinden, kann also eine nichtinhibitorische hochaffine Bindungsstelle in eine inhibitorische hochaffine Bindungsstelle umwandeln und dadurch unerwartete Effekte bei der Therapie mit verschiedenen Arzneimitteln hervorrufen. KW - Kationentransporter 1 der Ratte KW - rOCT1 KW - Mutationsanalyse KW - Konformationsänderungen KW - Organic cation transporters KW - rOCT1 KW - mutational analysis KW - protein conformational changes Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32645 ER - TY - THES A1 - Vernaleken, Alexandra T1 - Identification and Characterisation of the Domains of RS1 (RSC1A1) Inhibiting the Monosaccharide Dependent Exocytotic Pathway of Na+-D-Glucose Cotransporter SGLT1 with High Affinity T1 - Identifizierung und Charakterisierung der Domänen von RS1 (RSC1A1), die den Monosaccharid-abhängigen exozytotischen Pfad des Na+-D-Glukose Kotransporters SGLT1 mit hoher Affinität hemmen N2 - Das RS1-Protein, das durch ein intronloses single-copy Gen kodiert wird, welches nur bei Säugetieren vorkommt, bewirkt eine posttranskriptionelle Herunterregulation des Natrium-D-Glukose-Cotransporters SGLT1. Es wurde gezeigt, dass eine kurzfristige posttranskriptionelle Hemmung von SGLT1 durch RS1 am trans-Golgi-Netzwerk (TGN) stattfindet. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Tripeptide des menschlichen RS1-Proteins (hRS1) identifiziert, GlnCysPro und GlnSerPro, welche die posttranskriptionelle Hemmung von SGLT1 am TGN induzieren. Das Applizieren der Tripeptide reduzierte die Menge des SGLT1-Proteins in der Plasmamembran um 40-50%, diese Reduktion korrelierte mit dem Rückgang des durch SGLT1 vermittelten Glukosetransports. Hinsichtlich der kurzfristigen Hemmung von SGLT1 durch die Tripeptide wurden für die effektiven intrazellulären Konzentration der Tripeptide IC50-Werte von 2.0 nM (GlnCysPro, QCP) und 0.16 nM (GlnSerPro, QSP) ermittelt. Die beobachtete Hemmung von SGLT1 durch die Tripeptide QCP und QSP wurde, ähnlich wie beim hRS1-Protein, durch verschiedene intrazelluläre Monosaccharide, einschließlich Methyl-α-D-Glucopyranosid und 2-Deoxyglukose, verringert. Im Gegensatz dazu konnte die kurzfristige Hemmung von hOCT2 durch QCP nur nach Anhebung der intrazellulären Konzentration von AMG beobachtet werden. QCP und QSP werden durch den H+-Peptid-Kotransporter PEPT1 transportiert, der zusammen mit SGLT1 in den Enterozyten des Dünndarms kolokalisiert ist. Nach Einwärtstransport des Peptids wird dann im Anschluss der durch hSGLT1 vermittelte Glukosetransport gehemmt. Die Daten legen nahe, dass eine orale Applikation der Tripeptide QCP oder QSP dazu genutzt werden kann, die Absorption von D-Glukose im Dünndarm zu hemmen und somit als Therapeutika für Adipositas oder Diabetes mellitus genutzt werden könnte. N2 - The RS1 protein, a 67 kDa protein, encoded by an intronless single copy gene that was only detected in mammals, mediates transcriptional and post-transcriptional down-regulation of the sodium-D-glucose co-transporter SGLT1. The short-term post-transcriptional down-regulation of SGTL1 by RS1 has been shown to occur at the trans-Golgi network (TGN). In the present study, two tripeptides from the human RS1 protein (hRS1), GlnCysPro and GlnSerPro, that induce the post-transcriptional down-regulation of SGLT1 at the TGN, were identified. The application of the tripeptides led to 40-50% reduction of the amount of the SGLT1 protein in the plasma membrane, which correlated to the degree of decrease in SGLT1-mediated glucose transport. For the short-term down-regulation of SGLT1 by the tripeptides, the effective intracellular concentrations IC50 values of 2.0 nM (GlnCysPro, QCP) and 0.16 nM (GlnSerPro, QSP) were estimated. The observed down-regulation of SGLT1 by the tripeptides QCP and QSP, similar to hRS1 protein, was attenuated by different intracellular monosaccharides including nonmetabolized methyl-α-D-glucopyranoside and 2-deoxyglucose. On the contrary, the short-term inhibition of the hOCT2 by QCP could only be observed after rising of intracellular concentration of AMG. QCP and QSP are transported by H+-peptide cotransporter PEPT1 that is co-located with SGLT1 in the small intestinal enterocytes and thereafter effectively down-regulate hSGLT1-mediated transport of AMG. The data indicates that orally applied tripeptides QCP or QSP can be used to down-regulate D-glucose absorption in small intestine and used for treatment of obesity and diabetes mellitus. KW - Regulation von SGLT1 KW - RS1 KW - Monosaccharid-abhängig KW - Regulation of SGLT1 KW - RS1 KW - exocytotic pathway KW - monosaccharide-dependent Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25790 ER - TY - THES A1 - Shatskaya, Natalia T1 - Identification of amino acids within the substrate binding region of organic cation transporters (OCTZs) that are involved in binding of corticosterone T1 - Identifizierung der Aminosaüren in der Substratbindungstelle der organischen Kationentransporter, die in Kortikosteronbindung involviert sind N2 - The polyspecific organic cation transporters (OCT) are involved in the elimination and distribution of drugs, environmental toxins, and endogenous organic cations including monoamine neurotransmitters. Steroid hormones inhibit organic cation transport by the three OCT subtypes with different affinities showing distinct species difference; for example, the IC50 values for corticosterone inhibition of cation uptake by transporters rOCT1 and rOCT2 are ~150μM and ~4 μM, respectively. By introducing domains and amino acids from rOCT2 into rOCT1, we identified three amino acids in the presumed 10th TMD of rOCT2 which are responsible for the higher affinity of corticosterone in comparison to rOCT1. This is the first study which revealed the components of the binding site for corticosterone in OCTs. The evidence is presented that these amino acids (alanine 443, leucine 447, and glutamine 448 in rOCT1 and isoleucine 443, tyrosine 447, and glutamate 448 in rOCT2) are probably located within the substrate binding region of OCTs since the affinity of transported cations was increased together with the affinity of corticosterone. In the double mutant rOCT1(L447Y/Q448E) the IC50 value for the inhibition of [3H]MPP (0.1 μM) uptake by corticosterone (24 ± 4 μM) was significantly higher compared to the IC50 value for inhibition of [14C]TEA (10 μM) uptake (5.3 ± 1.7 μM), indicating an allosteric interaction between transported substrate and corticosterone. The data suggest that more than one compound can bind simultaneously to the substrate binding region. These results confirm previous suggestion that binding of substrates and inhibitors to OCTs involves interaction with a comparatively large surface that may include multiple binding domains rather than with a structurally restricted single binding site. N2 - Die polyspezifischen Transporter für organische Kationen (OCT) spielen eine wichtige Rolle bei der Ausscheidung von Medikamenten, Toxinen und endogenen organischen Kationen, zu denen auch monoamine Neurotransmitter gehören. Der durch OCT vermittelte Transport von organischen Kationen kann von Steroidhormonen gehemmt werden, die für drei OCT Subtypen deutlich unterschiedliche Affinität aufweisen: Zum Beispiel, IC50 Werte der Hemmung des Transportes von organischen Kationen durch Corticosteron betragen ~ 150 μM für rOCT1 und ~ 4 μM für rOCT2. Mithilfe des Austausches von rOCT1 Domänen und einzelnen Aminosäuren gegen die entsprechenden Elemente des rOCT2 Moleküls haben wir in der 10th TMD von rOCT2 drei Aminosäuren identifiziert, die für die höhere Affinität des rOCT2 Transporters zu Corticosteron verantwortlich sind. In dieser Arbeit wurden zum ersten Mal die Aminosäuren identifiziert, die zu der Bindungsstelle eines OCT Transporters für Corticosteron gehören. Die Ergebnisse der Untersuchungen deuten darauf hin, dass diese drei Aminosäuren (Alanin 443, Leucin 447 und Glutamin 448 in rOCT1 und Isoleucin 443, Tyrosin 447 und Glutamat 448 in rOCT2) hochwahrscheinlich in der ubstratbindungstasche von OCT liegen, da zusammen mit der Erhöhung der Affinität zu Corticosteron stieg auch die Affinität zu transportierenden Substraten. Für die doppelte Mutante rOCT1(L447Y/Q448E) unterscheiden sich die IC50 Werte für die Hemmung des [3H]MPP (0,1 μM) und des [14C]TEA (10 μM) Transportes durch Corticosteron um Faktor 4 (24 ± 4 μM bzw. 5,3 ± 1,7 μM), was eine allosterische Interaktion zwischen transportierenden Substraten und Corticosteron vermuten lässt. Die Daten deuten darauf hin, dass mehr als eine Substanz sich gleichzeitig an die Substratbindungsregion binden kann. Die gewonnenen Erkenntnisse bestätigen unsere vorigen Vorstellungen, dass die Bindung von Substraten und Hemmstoffen zu OCT die Interaktion mit der relativ großen Oberfläche des Proteins vorsieht, die vermutlich nicht auf eine einzige Bindungsstelle beschränkt ist, sondern eher mehrere Bindungsdomäne. KW - Kation KW - Ionentransport KW - Bindestelle KW - Corticosteroide KW - Aminosäuren KW - OCT KW - corticosterone KW - mutationen KW - OCT KW - corticosterone KW - mutation analysis Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20430 ER - TY - THES A1 - Leyerer, Marina T1 - Identification and characterization of Nuclear Localization Signal of pRS1 protein T1 - Identifikation und Charakterisierung der Kernlokalisierungssequenz von pRS1 Protein N2 - RS1, ein Genprodukt von RSC1A1, ist entscheidend an der zelldichteabhängigen transkriptionellen Herunterregulation von SGLT1 in LLC-PK1 Zellen und an der post-transkriptionellen Herunterregulation von SGLT1 im Dünndarm beteiligt. RS1 hemmt die Freigabe von SGLT1 enthaltenden Vesikeln aus dem trans-Golgi Netzwerk und wandert in den Zellkern wo es die Transkription von SGLT1 inhibiert. In der vorliegenden Arbeit identifizierten wir eine neuartige 21 Aminosäuren lange nicht-konventionelle Kernlokalisierungssequenz (RS1 NLS) in RS1 vom Schwein (pRS1), die für die Kernlokalisierung von pRS1 nötig und ausreichend ist. RS1 NLS ist von zwei Konsensussequenzen für Phosphorylierung umrahmt, welche für die konfluenzabhängige Regulierung von RS1 NLS verantwortlich sind: Eine Stelle für Casein Kinase 2 (CK2) in der Position 348 und eine Stelle für Protein Kinase C (PKC) in der Position 370. Es wurde eine konfluenz-abhängige Kernlokalisierung mit den Aminosäuren 342-374 (R-NLS-Reg) beobachtet. Die Mutationsanalyse deutete darauf hin, dass Kernlokalisierung durch die Phosphorylierung von Serin 370 (PKC) geblockt wird, und dass die Phosphorylierung von Serin 348 (CK2) die Phosphorylierung von Serin 370 verhindert. Da während der Konfluenz CK2 herunterreguliert und PKC hochreguliert wird, deuten unsere Daten darauf hin, dass die Kernlokalisierung die zelldichteabhängigen Veränderungen in der transkriptionellen und posttranskriptionellen Hemmung von SGLT1 Expression koordiniert. N2 - RS1, a gene product of RSC1A1, is critically involved in cell density-dependent transcriptional down-regulation of SGLT1 in LLC-PK1 cells and in the post-transcriptional down-regulation of SGLT1 in small intestine. RS1 inhibits the release of SGLT1 containing vesicles from the trans-Golgi network and migrates into the nucleus where it inhibits transcription of SGLT1. In the present work we identified a novel 21 amino acids-long nonconventional nuclear localization sequence (RS1 NLS) in porcine RS1 (pRS1) that is necessary and sufficient for nuclear targeting of pRS1. RS1 NLS is framed by two consensus sequences for phosphorylation which are responsible for confluence-dependent regulation of RS1 NLS: a casein kinase 2 (CK2) site in position 348 and a protein kinase C (PKC) site in position 370. Confluence-dependent nuclear targeting was observed with amino acids 342-374 (R-NLS-Reg). Mutation analysis suggested that nuclear targeting is blocked by phosphorylation of serine 370 (PKC) and that phosphorylation of serine 348 (CK2) prevents phosphorylation of serine 370. Because CK2 is down-regulated and PKC is up-regulated during confluence of LLC-PK1 cells, our data suggest that nuclear localization coordinates cell density-dependent changes in transcriptional and post-transcriptional inhibition of SGLT1 expression. KW - Regulierung KW - Konfokale Mikroskopie KW - Proteinkinase CK2 KW - Proteinkinase C KW - NLS KW - regulation KW - confluence Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25573 ER -