TY - THES A1 - Segerer, Gabriela T1 - Characterization of cell biological and physiological functions of the phosphoglycolate phosphatase AUM T1 - Charakterisierung zellbiologischer und physiologischer Funktionen der Phosphoglykolat-Phosphatase AUM N2 - Mammalian haloacid dehalogenase (HAD)-type phosphatases are a large and ubiquitous family of at least 40 human members. Many of them have important physiological functions, such as the regulation of intermediary metabolism and the modulation of enzyme activities, yet they are also linked to diseases such as cardiovascular or metabolic disorders and cancer. Still, most of the mammalian HAD phosphatases remain functionally uncharacterized. This thesis reveals novel cell biological and physiological functions of the phosphoglycolate phosphatase PGP, also referred to as AUM. To this end, PGP was functionally characterized by performing analyses using purified recombinant proteins to investigate potential protein substrates of PGP, cell biological studies using the spermatogonial cell line GC1, primary mouse lung endothelial cells and lymphocytes, and a range of biochemical techniques to characterize Pgp-deficient mouse embryos. To characterize the cell biological functions of PGP, its role downstream of RTK- and integrin signaling in the regulation of cell migration was investigated. It was shown that PGP inactivation elevates integrin- and RTK-induced circular dorsal ruffle (CDR) formation, cell spreading and cell migration. Furthermore, PGP was identified as a negative regulator of directed lymphocyte migration upon integrin- and GPCR activation. The underlying mechanisms were analyzed further. It was demonstrated that PGP regulates CDR formation and cell migration in a PLC- and PKC-dependent manner, and that Src family kinase activities are required for the observed cellular effects. Upon integrin- and RTK activation, phosphorylation levels of tyrosine residues 1068 and 1173 of the EGF receptor were elevated and PLCγ1 was hyper-activated in PGP-deficient cells. Additionally, PGP-inactivated lymphocytes displayed elevated PKC activity, and PKC-mediated cytoskeletal remodeling was accelerated upon loss of PGP activity. Untargeted lipidomic analyses revealed that the membrane lipid phosphatidylserine (PS) was highly upregulated in PGP-depleted cells. These data are consistent with the hypothesis that the accumulation of PS in the plasma membrane leads to a pre-assembly of signaling molecules such as PLCγ1 or PKCs that couple the activation of integrins, EGF receptors and GPCRs to accelerated cytoskeletal remodeling. Thus, this thesis shows that PGP can affect cell spreading and cell migration by acting as a PG-directed phosphatase. To understand the physiological functions of PGP, conditionally PGP-inactivated mice were analyzed. Whole-body PGP inactivation led to an intrauterine growth defect with developmental delay after E8.5, resulting in a gradual deterioration and death of PgpDN/DN embryos between E9.5 and E11.5. However, embryonic lethality upon whole-body PGP inactivation was not caused by a primary defect of the (cardio-) vascular system. Rather, PGP inactivated embryos died during the intrauterine transition from hypoxic to normoxic conditions. Therefore, the potential impact of oxygen on PGP-dependent cell proliferation was investigated. Analyses of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) generated from E8.5 embryos and GC1 cells cultured under normoxic and hypoxic conditions revealed that normoxia (~20% O2) causes a proliferation defect in PGP-inactivated cells, which can be rescued under hypoxic (~1% O2) conditions. Mechanistically, it was found that the activity of triosephosphate isomerase (TPI), an enzyme previously described to be inhibited by phosphoglycolate (PG) in vitro, was attenuated in PGP-inactivated cells and embryos. TPI constitutes a critical branch point between carbohydrate- and lipid metabolism because it catalyzes the isomerization of the glycolytic intermediates dihydroxyacetone phosphate (DHAP, a precursor of the glycerol backbone required for triglyceride biosynthesis) and glyceraldehyde 3’-phosphate (GADP). Attenuation of TPI activity, likely explains the observed elevation of glycerol 3-phosphate levels and the increased TG biosynthesis (lipogenesis). Analyses of ATP levels and oxygen consumption rates (OCR) showed that mitochondrial respiration rates and ATP production were elevated in PGP-deficient cells in a lipolysis-dependent manner. However under hypoxic conditions (which corrected the impaired proliferation of PGP-inactivated cells), OCR and ATP production was indistinguishable between PGP-deficient and PGP-proficient cells. We therefore propose that the inhibition of TPI activity by PG accumulation due to loss of PGP activity shifts cellular bioenergetics from a pro-proliferative, glycolytic metabolism to a lipogenetic/lipolytic metabolism. Taken together, PGP acts as a metabolic phosphatase involved in the regulation of cell migration, cell proliferation and cellular bioenergetics. This thesis constitutes the basis for further studies of the interfaces between these processes, and also suggests functions of PGP for glucose and lipid metabolism in the adult organism. N2 - Haloazid Dehalogenase (HAD)-Typ Phosphatasen in Säugetieren gehören zu einer großen ubiquitären Proteinfamilie, zu der auch mindestens 40 Phosphatasen, die im menschlichen Organismus vertreten sind, zählen. Eine Vielzahl dieser Phosphatasen hat wichtige physiologische Funktionen beispielsweise als regulatorische Enzyme im Metabolismus. Gleichzeitig werden sie in Verbindung mit Erkrankungen des kardiovaskulären Systems, Stoffwechselstörungen und Krebs gebracht. Dennoch sind die Funktionen vieler Mitglieder dieser Phosphatasen Familie bis heute weitestgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden die zellbiologischen und physiologischen Funktionen der Phosphoglykolat-Phosphatase PGP, auch AUM genannt, charakterisiert. Zu diesem Zweck wurde mit gereinigtem Enzym nach potenziellen Protein-Substraten von PGP gesucht. Weiterhin wurden zellbiologische Studien mit der spermatogonialen GC1 Zelllinie sowie mit primären Endothelzellen und Lymphozyten durchgeführt. Mit biochemischen Methoden wurden zudem PGP-defiziente Mausembryonen charakterisiert. Es wurde zunächst die Rolle von PGP für RTK- und integrin- induzierte Zellmigration untersucht. Dabei zeigte sich, dass PGP Inaktivierung die Zelladhäsion und Zellmigration steigerte. Gleichzeitig wurde eine vermehrte Bildung von RTK- und integrinvermittelten ringförmigen Plasmamembranausstülpungen, sogenannten Circular Dorsal Ruffles (CDR) auf der dorsalen Zelloberfläche beobachtet. PGP wurde zudem als negativer Regulator integrinund GPCR-induzierter gerichteter Lymphozytenmigration identifiziert. Der zugrundeliegende molekulare Mechanismus wurde näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass PGP die Bildung von CDRs und die gerichtetete Zellmigration in Abhängigkeit der Phospholipase C- (PLC-), Proteinkinase C- (PKC-) sowie Src Kinase-Aktivität steuert. Nach Integrin- und RTKAktivierung waren die Tyrosinreste 1068 und 1173 des EGF-Rezeptors in PGP-depletierten Zellen vermehrt phosphoryliert und PLCγ1 in diesen Zellen hyperaktiviert. Interessanterweise wurde zudem eine beschleunigte PKC-vermittelte Reorganisation des Zytoskeletts beobachtet. In stimulierten Lymphozyten führte PGP-Inaktivierung zu einer erhöhten PKCAktivität. Durch massenspektrometrische Analysen konnten erhöhte Spiegel des Membranlipids Phosphatidylserin (PS) in PGP-defizienten Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse sind konsistent mit der Hypothese, dass die Anreicherung von PS in der Plasmamembran PGP-defizienter Zellen zu einer Vor-Rekrutierung von Signalproteinen führt, die die Aktivierung von Integrinen, EGF-Rezeptoren und GPCRs mit einer beschleunigten Zytoskelett-Reorganisation verbindet. Hierdurch konnte gezeigt werden, dass PGP durch die Dephosphorylierung von Phosphoglykolat die Zelladhäsion und Zellmigration reguliert. Um die physiologischen Funktionen von PGP zu verstehen, wurden konditional PGPinaktivierte Mäuse untersucht. Die Inaktivierung von PGP im gesamten Organismus führte zu einem Wachstumsdefekt ab Tag E8.5 und dem Tod der Embryonen im Uterus zwischen Tag E9.5 und E11.5. Die beobachtete embryonale Letalität war nicht durch einen Defekt des (kardio-)vaskulären Systems zu erklären. PGP-inaktivierte Embryonen starben zu einem Zeitpunkt, an dem der intrauterine Übergang von einem hypoxischen zu einem normoxischen Millieu stattfindet. Der Einfluss von Sauerstoff wurde deshalb weiter untersucht. Zellwachstumsanalysen unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen mit GC1 Zellen und embryonalen Maus-Fibroblasten, die aus E8.5 Embryonen gewonnen wurden zeigten, dass normoxische Bedingungen (~20% O2) einen Wachstumsdefekt PGP-inaktivierter Zellen verursacht, wohingegen dies unter hypoxischen Bedingungen (~1% O2) nicht der Fall war. Mechanistisch konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der Triosephosphatisomerase (TPI), ein durch PG in vitro gehemmtes Enzym, in PGP inaktivierten Zellen und Embryonen vermindert war. TPI stellt einen entscheidenden Verzweigungspunkt des Glukose- und Lipidstoffwechsels dar. TPI katalysiert die Isomerisierung der aus der Glykolyse stammenden Intermediate Dihydroxyacetonphosphat (DHAP, eine Vorstufe des für die Triglycerid-Biosynthese benötigten Glycerol-Grundgerüsts) und Glyceraldehyd-3’-phosphat (GADP). Eine Verringerung der TPI-Aktivität in PGPinaktivierten Zellen resultierte in erhöhten Glycerol-3-phosphat Spiegeln und einer gesteigerten Triglycerid-Biosynthese. Die Analyse des zellulären ATP Gehalts und des Sauerstoffverbrauchs bei der mitochondrialen Atmung zeigte, dass sowohl die ATP Produktion als auch die mitochondriale Atmung in Abhängikeit der Lipolyse in PGP-defizienten Zellen erhöht waren. Unter hypoxischen Bedingungen, die zu einer Normalisierung der Zellproliferation führten, wiesen PGP-profiziente und -defiziente Zellen keinen Unterschied bezüglich ATP Produktion und mitochondrialer Atmung auf. Wir vermuten deswegen, dass die Inhibierung der TPI-Aktivität durch PG-Anreicherung aufgrund ausbleibender Hydrolyse durch PGP zu einer Verschiebung des zellulären Energiehaushaltes von Seiten eines pro-proliferativ glykolytischen auf die Seite eines lipogenetisch/lipolytischen Metabolismus führt. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass PGP als eine metabolische Phosphatase Zellmigration, Zellproliferation wie auch den zellulären Energiehaushalt reguliert. Die vorliegende Arbeit stellt somit die Grundlage für weitere Untersuchungen an der Schnittschnelle dieser zellulären Prozesse dar und lässt auf eine wichtige Rolle von PGP im Glukose- und Lipidstoffwechsel im adulten Organismus schließen. KW - Phosphoglykolatphosphatase KW - Phosphoglykolat-Phosphatase KW - Maus KW - Cytologie KW - Physiologie KW - Phosphatasen Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123847 ER - TY - THES A1 - Schäfer [geb. Stichler], Simone T1 - Thiol-ene Cross-linked Poly(glycidol) / Hyaluronic Acid Based Hydrogels for 3D Bioprinting T1 - Thilo-En vernetzte Hydrogele basierend auf Poly(glyzidolen) und Hyaluronsäure für das 3D-Biodrucken N2 - The aim of the work was the development of thiol-ene cross-linked hydrogels based on functionalized poly(glycidol)s (PG) and hyaluronic acid (HA) for extrusion based 3D bioprinting. Additionally, the functionalization of the synthesized PG with peptides and the suitability of these polymers for physically cross-linked gels were investigated, in a proof of principle study in order to demonstrate the versatile use of PG polymers in hydrogel development. First, the precursor polymers of the different hydrogel systems were synthesized. For thiol-ene cross-linked hydogels, linear allyl-functionalized PG (P(AGE-co-G)) and three different thiol-(SH-)functionalized polymers, ester-containing PG-SH (PG SHec), ester-free PG-SH (PG-SHef) and HA-SH were synthesized and analysed, The degree of functionalization of these polymers was adjustable. For physically cross-linked hydrogels, peptide-functionalized PG (P(peptide-co-G)), was synthesized through polymer analogue thiol-ene modification of P(AGE-co-G). Subsequently, thiol-ene cross-linked hydrogels were prepared with the synthesized thiol- and allyl-functionalized polymers. Depending on the origin of the used polymers, two different systems were obtained: on the one hand synthetic hydrogels consisting of PG-SHec/ef and P(AGE-co-G) and on the other hand hybrid gels, consisting of HA-SH and P(AGE-co-G). In synthetic gels, the degradability of the gels was determined by the applied PG-SH. The use of PG-SHec resulted in hydrolytically degradable hydrogels, whereas the cross-linking with PG-SHef resulted in non-degradable gels. The physical properties of these different hydrogel systems were determined by swelling, mechanical and diffusion studies and subsequently compared among each other. In swelling studies the differences of degradable and non-degradable synthetic hydrogels as well as the differences of synthetic compared to hybrid hydrogels were demonstrated. Next, the stiffness and the swelling ratios (SR) of the established hydrogel systems were examined in dependency of different parameters, such as incubation time, polymer concentration and UV irradiation. In general, these measurements revealed the same trends for synthetic and hybrid hydrogels: an increased polymer concentration as well as prolonged UV irradiation led to an increased network density. Moreover, it was demonstrated that the incorporation of additional non-bound HMW HA hampered the hydrogel cross-linking resulting in gels with decreased stiffness and increased SR. This effect was strongly dependent on the amount of additional HMW HA. The diffusion of different molecular weight fluorescein isothiocyanate-dextran (FITC-dextran) through hybrid hydrogels (with/without HMW HA) gave information about the mesh size of these gels. The smallest FITC-dextran (4 kDa) completely diffused through both hydrogel systems within the first week, whereas only 55 % of 40 kDa and 5-10 % HMW FITC-dextrans (500 kDa and 2 MDa) could diffuse through the networks. The applicability of synthetic and hybrid hydrogels for cartilage regeneration purpose was investigated through by biological examinations. It was proven that both gels support the survival of embedded human mesenchymal stromal cells (hMSCs) (21/28 d in vitro culture), however, the chondrogenic differentiation was significantly improved in hybrid hydrogels compared to synthetic gels. The addition of non-bound HMW HA resulted in a slightly less distinct chondrogenesis. Lastly the printability of the established hydrogel systems was examined. Therefore, the viscoelastic properties of the hydrogel solutions were adjusted by incorporation of non-bound HMW HA. Both systems could be successfully printed with high resolution and high shape fidelity. The introduction of the double printing approach with reinforcing PCL allowed printing of hydrogel solutions with lower viscosities. As a consequence, the amount of additional HMW HA necessary for printing could be reduced allowing successful printing of hybrid hydrogel solutions with embedded cells. It was demonstrated that the integrated cells survived the printing process with high viability measured after 21 d. Moreover, by this reinforcing technique, robust hydrogel-containing constructs were fabricated. In addition to thiol-ene cross-linked hydrogels, hydrogel cross-linking via ionic interactions was investigated with a hybrid hydrogel based on HMW HA and peptide-functionalized PG. Rheological measurements revealed an increase in the viscosity of a 2 wt.% HMW HA solution by the addition of peptide-functionalized PG. The increase in viscosity could be attributed to the ionic interactions between the positively charge PG and the negatively charge HMW HA. In conclusion, throughout this thesis thiol-ene chemistry and PG were introduced as promising cross-linking reaction and polymer precursor for the field of biofabrication. Furthermore, the differences of hybrid and synthetic hydrogels as well as chemically and physically cross-linked hydrogels were demonstrated. Moreover, the double printing approach was demonstrated to be a promising tool for the fabrication of robust hydrogel-containing constructs. It opens the possibility of printing hydrogels that were not printable yet, due to too low viscosities. N2 - Ziel der Arbeit war die Entwicklung von Thiol-En-vernetzten Hydrogelen basierend auf funktionalisierten Poly(glyzidolen) (PG) und Hyaluronsäure (HA) für das extrusionsbasierte 3D-Biodrucken. Um die vielseitigen Anwendungsmöglichkeiten von PG-Polymeren für die Hydrogelentwicklung zu zeigen, wurde darüber hinaus, in einer Proof-of-Principle-Studie, PG mit Peptiden funktionalisiert und die Eignung dieser Polymere für die Herstellung von physikalisch vernetzten Gelen untersucht. Zunächst wurden die Vorläuferpolymere für die verschiedenen Hydrogelsysteme synthetisiert. Für die Thiol-En-vernetzten Hydrogele wurde lineares Allyl-funktionalisiertes PG (P(AGE-co-G)) und drei verschiedene Thiol-(SH )funktionalisierte Polymere, Ester haltiges PG-SH (PG-SHec), Ester freies PG SH (PG-SHef) und HA-SH synthetisiert und analysiert. Dabei war der Funktionalisierungsgrad dieser Polymere einstellbar. Für physikalisch vernetzte Hydrogele wurde Peptid-funktionalisierte PGs (P(Peptid co-G)) mittels polymeranaloger Thiol-En-Modifikation von P(AGE-co-G) synthetisiert. Anschließend wurden Thiol-En-vernetzte Hydrogele auf Basis der synthetisierten Thiol- und Allyl-funktionalisierten Polymeren hergestellt. Je nach Ursprung der verwendeten Polymere wurden zwei verschiedene Systeme erhalten: einerseits synthetische Hydrogele bestehend aus PG-SHec/ef und P(AGE-co-G) und andererseits hybride Gele, bestehend aus HA-SH und P(AGE-co-G). Bei den synthetischen Gelen wurde die Abbaubarkeit der Gele durch das verwendete PG-SH bestimmt. Die Verwendung von PG-SHec resultierte in hydrolytisch abbaubaren Hydrogelen, während die Vernetzung mit PG-SHef zu nicht abbaubaren Gelen führte. Die physikalischen Eigenschaften der verschiedenen Hydrogelsysteme wurden mittels Quell-, mechanischen und Diffusionsexperimenten bestimmt und anschließend miteinander verglichen. Die Quellungsstudien zeigten die Unterschiede von abbaubaren und nicht abbaubaren synthetischen Hydrogelen, sowie die Unterschiede von synthetischen gegenüber hybriden Hydrogelen. Als nächstes wurden die Steifigkeit und das Quellverhältnis (SR) der etablierten Hydrogelsysteme in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern wie Inkubationszeit, Polymerkonzentration und UV-Bestrahlung untersucht. Im Allgemeinen zeigten diese Messungen für synthetische und hybride Hydrogele die gleichen Trends: eine erhöhte Polymerkonzentration sowie eine verlängerte UV-Bestrahlung führten zu einer erhöhten Netzwerkdichte. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass das Einbringen zusätzlicher, nicht gebundener HMW HA die Hydrogelvernetzung behinderte, was zu Gelen mit verringerter Steifigkeit und erhöhtem SR führte. Dieser Effekt war stark abhängig von der Menge an zusätzlich eingebrachter HMW HA. Die Diffusion von Fluorescein-Isothiocyanat-Dextran (FITC-Dextran) mit unterschiedlichem Molekulargewichten durch hybride Hydrogele (mit/ohne HMW HA) lieferte Informationen über die Maschengröße dieser Gele. Das kleinste FITC-Dextran (4 kDa) diffundierte innerhalb der ersten Woche vollständig durch beide Hydrogelsysteme, während nur 55 % der 40 kDa und 5-10 % HMW FITC-Dextrane (500 kDa und 2 MDa) durch die Netzwerke diffundieren konnten. Die Anwendbarkeit von synthetischen und hybriden Hydrogelen für Knorpelregenerationszwecke wurde durch biologische Experimente untersucht. Es wurde bewiesen, dass beide Gele das Überleben von eingebetteten humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSCs) unterstützen (21/28 d in vitro Kultur), jedoch war die chondrogene Differenzierung in hybriden Hydrogelen im Vergleich zu synthetischen Gelen signifikant verbessert. Die Zugabe von nicht gebundenem HMW HA führte zu einer etwas weniger ausgeprägten Chondrogenese. Zuletzt wurde die Druckbarkeit der etablierten Hydrogelsysteme untersucht. Dafür wurden die viskoelastischen Eigenschaften der Hydrogellösungen durch das Einbringen von nicht gebundener HMW HA eingestellt. Beide Systeme konnten erfolgreich mit hoher Auflösung und hoher Formgenauigkeit gedruckt werden. Die Einführung des Doppeldruck-Konzeptes mit verstärkendem PCL ermöglichte das Drucken von Hydrogellösungen mit niedrigeren Viskositäten. Infolgedessen konnte die für den Druck notwendige Menge an HMW HA reduziert und hybride Hydrogellösungen mit eingebetteten Zellen erfolgreich gedruckt werden. Es wurde gezeigt, dass die integrierten Zellen den Druckprozess mit hoher Vitalität überlebten (gemessen nach 21 d). Darüber hinaus wurden mit dieser Verstärkungstechnik robuste Hydrogel-enthaltende Konstrukte hergestellt. Zusätzlich zu den Thiol-En-vernetzten Hydrogelen wurde die Hydrogelvernetzung mittels elektrostatischen Wechselwirkungen mit einem hybriden Gel auf der Basis von HMW HA und Peptid-funktionalisiertem PG untersucht. Rheologische Messungen ergaben eine Erhöhung der Viskosität einer 2 wt.% HMW HA Lösungen durch die Zugabe von Peptid-funktionalisiertem PG. Der Viskositätsanstieg konnte auf die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen dem positiv geladenen PG und der negativ geladenen HMW HA zurückgeführt werden. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit die Thiol-En-Chemie und PG als vielversprechende Vernetzungsreaktion bzw. Polymervorstufe für die Biofabrikation eingeführt. Des Weiteren wurden die Unterschiede von hybriden und synthetischen Hydrogelen sowie von chemisch und physikalisch vernetzten Hydrogelen aufgezeigt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass das Doppeldruck-Konzept eine vielversprechende Methode für die Herstellung von robusten Hydrogel-enthaltenden Konstrukten ist. Es eröffnet die Möglichkeit, Hydrogele zu drucken, die aufgrund zu geringer Viskositäten bis jetzt nicht druckbar waren. KW - Hyaluronsäure KW - thiol-ene KW - Hyaluronic Acid KW - poly(glycidol) KW - hydrogels KW - Hydrogel KW - Glycidol KW - 3D-Druck KW - 3D printing Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174713 ER - TY - THES A1 - Lange, Stanislav T1 - Optimization of Controller Placement and Information Flow in Softwarized Networks T1 - Optimierungsverfahren für Controllerplatzierung und Informationsaustausch in softwarisierten Netzen N2 - The Software Defined Networking (SDN) paradigm offers network operators numerous improvements in terms of flexibility, scalability, as well as cost efficiency and vendor independence. However, in order to maximize the benefit from these features, several new challenges in areas such as management and orchestration need to be addressed. This dissertation makes contributions towards three key topics from these areas. Firstly, we design, implement, and evaluate two multi-objective heuristics for the SDN controller placement problem. Secondly, we develop and apply mechanisms for automated decision making based on the Pareto frontiers that are returned by the multi-objective optimizers. Finally, we investigate and quantify the performance benefits for the SDN control plane that can be achieved by integrating information from external entities such as Network Management Systems (NMSs) into the control loop. Our evaluation results demonstrate the impact of optimizing various parameters of softwarized networks at different levels and are used to derive guidelines for an efficient operation. N2 - Heutige Kommunikationsnetze müssen ein breites Spektrum an Applikationen mit sehr heterogenen Anforderungen unterstützen sowie mit einer kontinuierlich steigenden Anzahl an Nutzern und Endgeräten skalieren. Softwarisierte Netze, welche sich insbesondere durch Paradigmen wie Software Defined Networking (SDN) und Network Functions Virtualization (NFV) kennzeichnen, zielen auf eine Erhöhung der Flexibilität und Skalierbarkeit ab, um diesen Anforderungen auch in Zukunft gerecht zu werden. Um jedoch in vollem Umfang von den Vorteilen dieser Paradigmen zu profitieren, müssen neue Fragestellungen adressiert werden. Diese umfassen insbesondere die Platzierung neuer Entitäten im Netz sowie deren Integration in bestehende Architekturen und ihre Interaktion mit vorhandenen Komponenten. In dieser Dissertation werden Optimierungsverfahren entwickelt und bewertet, welche zu verschiedenen Zeitpunkten im Lebenszyklus softwarisierter Netze eingesetzt werden und ihre Performanz sowie Automatisierbarkeit steigern. Diese umfassen Verfahren für das Platzieren von Kontrollentitäten in SDN-basierten Netzen, welche eine effiziente Dimensionierung während der Planungsphase ermöglichen. Zudem werden diese Verfahren um Mechanismen erweitert, welche eine automatisierte Anpassung an dynamische Veränderungen ermöglichen und somit die Effizienz des Netzes aufrechterhalten. Zuletzt wird die Integration von Daten aus externen Informationsquellen wie Netzmanagementsystemen in SDN-Komponenten untersucht, um deren Entscheidungen und somit die Performanz im gesamten Netz zu optimieren. T3 - Würzburger Beiträge zur Leistungsbewertung Verteilter Systeme - 03/18 KW - Leistungsbewertung KW - Graph KW - Optimierung KW - Telekommunikationsnetz KW - Platzierungsalgorithmen KW - Softwarisierte Netze Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174570 SN - 1432-8801 ER - TY - THES A1 - Gutmann, Marcus T1 - Functionalization of cells, extracellular matrix components and proteins for therapeutic application T1 - Funktionalisierung von Zellen, extrazellulären Matrixbestandteilen und Proteinen für die therapeutische Anwendung N2 - Glycosylation is a biochemical process leading to the formation of glycoconjugates by linking glycans (carbohydrates) to proteins, lipids and various small molecules. The glycans are formed by one or more monosaccharides that are covalently attached, thus offering a broad variety depending on their composition, site of glycan linkage, length and ramification. This special nature provides an exceptional and fine tunable possibility in fields of information transfer, recognition, stability and pharmacokinetic. Due to their intra- and extracellular omnipresence, glycans fulfill an essential role in the regulation of different endogenous processes (e.g. hormone action, immune surveillance, inflammatory response) and act as a key element for maintenance of homeostasis. The strategy of metabolic glycoengineering enables the integration of structural similar but chemically modified monosaccharide building blocks into the natural given glycosylation pathways, thereby anchoring them in the carbohydrate architecture of de novo synthesized glycoconjugates. The available unnatural sugar molecules which are similar to endogenous sugar molecules show minimal perturbation in cell function and - based on their multitude functional groups - offer the potential of side directed coupling with a target substance/structure as well as the development of new biological properties. The chemical-enzymatic strategy of glycoengineering provides a valuable complement to genetic approaches. This thesis primarily focuses on potential fields of application for glycoengineering and its further use in clinic and research. The last section of this work outlines a genetic approach, using special Escherichia coli systems, to integrate chemically tunable amino acids into the biosynthetic pathway of proteins, enabling specific and site-directed coupling with target substances. With the genetic information of the methanogen archaea, Methanosarcina barkeri, the E. coli. system is able to insert a further amino acid, the pyrrolysine, at the ribosomal site during translation of the protein. The natural stop-codon UAG (amber codon) is used for this newly obtained proteinogenic amino acid. Chapter I describes two systems for the integration of chemically tunable monosaccharides and presents methods for characterizing these systems. Moreover, it gives a general overview of the structure as well as intended use of glycans and illustrates different glycosylation pathways. Furthermore, the strategy of metabolic glycoengineering is demonstrated. In this context, the structure of basic building blocks and the epimerization of monosaccharides during their metabolic fate are discussed. Chapter II translates the concept of metabolic glycoengineering to the extracellular network produced by fibroblasts. The incorporation of chemically modified sugar components in the matrix provides an innovative, elegant and biocompatible method for site-directed coupling of target substances. Resident cells, which are involved in the de novo synthesis of matrices, as well as isolated matrices were characterized and compared to unmodified resident cells and matrices. The natural capacity of the matrix can be extended by metabolic glycoengineering and enables the selective immobilization of a variety of therapeutic substances by combining enzymatic and bioorthogonal reaction strategies. This approach expands the natural ability of extracellular matrix (ECM), like the storage of specific growth factors and the recruitment of surface receptors along with synergistic effects of bound substances. By the selection of the cell type, the production of a wide range of different matrices is possible. Chapter III focuses on the target-oriented modification of cell surface membranes of living fibroblast and human embryonic kidney cells. Chemically modified monosaccharides are inserted by means of metabolic glycoengineering and are then presented on the cell surface. These monosaccharides can later be covalently coupled, by “strain promoted azide-alkyne cycloaddition“ (SPAAC) and/or “copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition“ (CuAAC), to the target substance. Due to the toxicity of the copper catalysator in the CuAAC, cytotoxicity analyses were conducted to determine the in vivo tolerable range for the use of CuAAC on living cell systems. Finally, the efficacy of both bioorthogonal reactions was compared. Chapter IV outlines two versatile carrier – spacer – payload delivery systems based on an enzymatic cleavable linker, triggered by disease associated protease. In the selection of carrier systems (i) polyethylene glycol (PEG), a well-studied, Food and Drug Administration approved substance and very common tool to increase the pharmacokinetic properties of therapeutic agents, was chosen as a carrier for non-targeting systems and (ii) Revacept, a human glycoprotein VI antibody, was chosen as a carrier for targeting systems. The protease sensitive cleavable linker was genetically inserted into the N-terminal region of fibroblast growth factor 2 (FGF-2) without jeopardizing protein activity. By exchanging the protease sensitive sequence or the therapeutic payload, both systems represent a promising and adaptable approach for establishing therapeutic systems with bioresponsive release, tailored to pre-existing conditions. In summary, by site-specific functionalization of various delivery platforms, this thesis establishes an essential cornerstone for promising strategies advancing clinical application. The outlined platforms ensure high flexibility due to exchanging single or multiple elements of the system, individually tailoring them to the respective disease or target site. N2 - Glykosylierung beschreibt einen auf biochemischen Reaktionen basierenden Prozess, welcher durch die Verknüpfung von Glykanen (Kohlenhydraten) mit Proteinen, Lipiden oder einer Vielzahl kleiner organischer Moleküle zur Bildung von Glykokonjugaten führt. Die Entstehung der Kohlenhydratketten erfolgt hierbei durch die kovalente Verknüpfung eines oder mehrerer verschiedener Einfachzucker, welche auf Grund unterschiedlicher Zusammensetzung der Bausteine, Verknüpfungsregion, Länge und Verzweigung eine hohe Diversität aufweisen. Diese Besonderheit ermöglicht eine außergewöhnliche Feinabstimmung im Bereich der Informationsübertragung, Erkennung, Stabilität und Pharmakokinetik. Aufgrund ihrer intra- und extrazellulären Omnipräsenz spielen Glykane zudem eine essentielle Rolle in der Regulierung verschiedenster körpereigener Prozesse (z.B. hormonelle Wirkung, Immunmodulation, Entzündungsreaktionen) und sind folglich ein zentraler Bestandteil bei der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase. Durch die Strategie des „Glycoengineering“ ist man in der Lage, strukturähnliche, aber chemisch modifizierte Zuckerbausteine in die natürlichen Glykosilierungswege einzubinden und diese somit in der Architektur der Kohlenstoffketten von neu-synthetisierten Glykokonjugaten zu verankern. Die hierfür zur Verfügung stehenden, unnatürlichen Zuckermoleküle führen auf Grund ihrer Ähnlichkeit zu körpereigenen Zuckern zu kaum relevanten Störungen der zellulären Funktion, bieten aber durch zahlreiche funktionelle Gruppen die Möglichkeit der gezielten Verknüpfung mit einer Zielsubstanz/-struktur und der Bildung neuer biologischer Eigenschaften. „Glycoengineering“ als chemisch-enzymatische Strategie bietet dabei eine wertvolle Ergänzung zu gentechnischen Ansätzen. Entsprechend beschäftigt sich diese Dissertation primär mit der Beschreibung potentieller Anwendungsgebiete des „Glycoengineering“ und dessen möglichen Einsatz in Klinik und Forschung. Der letzte Abschnitt dieser Arbeit beschreibt einen gentechnischen Ansatz, bei dem mit Hilfe von speziellen Escherichia coli Systemen chemisch modifizierbare Aminosäuren in den Biosyntheseweg von Proteinen eingebunden werden, wodurch anschließend eine spezifische und gerichtete Verknüpfung mit Zielsubstanzen ermöglicht wird. Hierbei benutzt das E. coli-System die genetische Information des methanbildenden Archaeas, Methanosarcina barkeri, mit der es in der Lage ist, eine weitere Aminosäure, das Pyrrolysin, bei der Translation eines Proteins am Ribosom einzufügen. Als Codon für diese neu gewonnene proteinogene Aminosäure fungiert das natürliche Stopp-Codon („amber codon“) UAG. Kapitel I beschreibt zwei Systeme für den Einbau von chemisch modifizierten Zuckern und zeigt Methoden für die Charakterisierung dieser Systeme auf. Es gibt zudem eine allgemeine Übersicht über den Aufbau und die Verwendung von Glykanen und veranschaulicht verschiedene Glykosilierungswege. Des Weiteren wird auch die Strategie des „metabolic glycoengineering“ erläutert. Hierbei wird der Aufbau der dabei verwendeten Grundbausteine dargestellt und auf die Epimerisierung der Zucker während deren Metabolismus eingegangen. Kapitel II überträgt das Konzept des „metabolic glycoengineering“ auf das extrazelluläre Netzwerk von Fibroblasten. Hierbei bietet der Einbau eines chemisch modifizierten Zuckerbausteins in die Matrix eine neue, elegante und biokompatible Möglichkeit der gezielten Verknüpfung von Zielsubstanzen. Die an der Neusynthese der Matrix beteiligten Bindegewebszellen sowie die isolierte Matrix wurden dabei im Vergleich zu nicht modifizierten Bindegewebszellen und Matrices charakterisiert. Durch den Aspekt des “metabolic glycoengineering” wird die natürliche Fähigkeit der Matrix erweitert und ermöglicht durch die Kombination verschiedener enzymatischer und bioorthogonal-chemischer Strategien die selektive Immobilisation einer Vielzahl von therapeutischen Substanzen. Dieser Ansatz erweitert das natürliche Spektrum der Extrazellulärmatrix (ECM), wie Bindung von spezifischen Wachstumsfaktoren, Rekrutierung von Oberflächenrezeptoren und damit einhergehend synergistische Effekte der gebundenen Stoffe. Durch die Auswahl des Zelltyps wird zudem ein breites Spektrum an verschiedenen Matrices ermöglicht. Kapitel III befasst sich mit der Möglichkeit, die Zellmembran von lebenden Fibroblasten sowie menschliche embryonale Nierenzellen gezielt zu verändern. Durch „metabolic glycoengineering“ werden auch hier chemisch modifizierte Zuckerbausteine eingefügt, die dabei auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Anschließend können diese Zucker mittels „ringspannungs-geförderter Azid-Alkin Cycloaddition“ (“strain promoted azide-alkyne cycloaddition“, SPAAC) und „Kupfer(I)-katalysierter Azid-Alkin Cycloaddition“ (“copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition“, CuAAC) umgesetzt werden, was eine kovalente Verknüpfung mit einer Zielsubstanz ermöglicht. Aufgrund der Toxizität des Kupferkatalysators in der CuAAC wurde anhand von zytotoxischen Untersuchungen nach einem in vivo vertretbaren Bereich für diese Reaktion gesucht, um die CuAAC auch für lebende Systeme verwendbar zu machen. Zuletzt wurde die Effizienz dieser bioorthogonalen Reaktionen miteinander verglichen. Kapitel IV beschreibt zwei vielseitig einsetzbare „carrier – spacer – payload“ Therapiesysteme (Träger-Verbindungsstück-Therapeutikum-Systeme), basierend auf einem Verbindungsstück (Linker), dessen Spaltung enzymatisch durch krankheitsspezifisch prävalente Proteasen ausgelöst wird. Bei der Auswahl der Trägersysteme wurde für das nicht-zielgerichtete System Polyethylenglycol (PEG) als Träger eingesetzt, eine gut untersuchte, „Food and Drug Administration“ zugelassene Substanz, welche als sehr gängiges Mittel zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften verwendet wird. Für das zielgerichtete System diente Revacept als Träger, ein humaner Glykoprotein VI-Antikörper. Der Protease-sensitive Linker wurde genetisch in der N-terminalen Region des Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 verankert, ohne dabei die Bioaktivität zu gefährden. Durch den Austausch der Protease-sensitiven Erkennungssequenz oder des Therapeutikums stellen beide Systeme einen vielversprechenden und anpassungsfähigen Ansatz für therapeutische Systeme dar, welche auf ein bereits bestehendes Erkrankungsbild genau zugeschnitten werden können. Zusammengefasst setzt diese Arbeit durch eine spezifische Funktionalisierung von verschiedenen Therapiesysteme einen wichtigen Meilenstein für vielversprechende Strategien zur Verbesserung der klinischen Anwendbarkeit. Durch den Austausch einer oder mehrerer Komponenten des Systems gewährleisten die hier beschriebenen Therapiesysteme eine hohe Anpassungsfähigkeit, wodurch sie individuell auf die jeweilige Krankheit oder den jeweiligen Zielort angepasst werden können. KW - Glykosylierung KW - Extrazelluläre Matrix KW - Zelloberfläche KW - Antikörper KW - Fibroblastenwachstumsfaktor KW - Glycoengineering KW - Drug delivery platforms KW - Protease-sensitive release Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170602 ER - TY - THES A1 - Alexander, Stephanie T1 - Collective cancer cell invasion \(in\) \(vivo\): function of β1 and β3 integrins in perivascular invasion and resistance to therapy T1 - Kollektive Tumorzellinvasion \(in\) \(vivo\): Funktion von β1 und β3 Integrinen in perivaskulärer Invasion und Therapieresistenz N2 - Pro-migratory signals mediated by the tumor microenvironment contribute to the cancer progression cascade, including invasion, metastasis and resistance to therapy. Derived from in vitro studies, isolated molecular steps of cancer invasion programs have been identified but their integration into the tumor microenvironment and suitability as molecular targets remain elusive. The purpose of the study was to visualize central aspects of tumor progression, including proliferation, survival and invasion by real-time intravital microscopy. The specific aims were to monitor the kinetics, mode, adhesion and chemoattraction mechanisms of tumor cell invasion, the involved guidance structures, and the response of invasion zones to anti-cancer therapy. To reach deeper tumor regions by optical imaging with subcellular resolution, near-infrared and infrared excited multiphoton microscopy was combined with a modified dorsal skinfold chamber model. Implanted HT-1080 fibrosarcoma and B16/F10 and MV3 melanoma tumors developed zones of invasive growth consisting of collective invasion strands that retained cell-cell contacts and high mitotic activity while invading at velocities of up to 200 μm per day. Collective invasion occurred predominantly along preexisting tissue structures, including blood and lymph vessels, collagen fibers and muscle strands of the deep dermis, and was thereby insensitive to RNAi based knockdown and/or antibody-based treatment against β1 and β3 integrins, chemokine (SDF-1/CXCL12) and growth factor (EGF) signaling. Therapeutic hypofractionated irradiation induced partial to complete regression of the tumor main mass, yet failed to eradicate the collective invasion strands, suggesting a microenvironmentally privileged niche. Whereas no radiosensitization was achieved by interference with EGFR or doxorubicin, the simultaneous inhibition of β1 and β3 integrins impaired cell proliferation and survival in spontaneously growing tumors and strongly enhanced the radiation response up to complete eradication of both main tumor and invasion strands. In conclusion, collective invasion in vivo is a robust process which follows preexisting tissue structures and is mainly independent of established adhesion and chemoattractant signaling. Due to its altered biological response to irradiation, collective invasion strands represent a microenvironmentally controlled and clinically relevant resistance niche to therapy. Therefore supportive regimens, such as anoikisinduction by anti-integrin therapy, may serve to enhance radio- and chemoefficacy and complement classical treatment regimens. N2 - Die Progression von Tumorerkrankungen, einschließlich Tumorinvasion, Metastasierung und Therapieresistenz wird unter anderem durch migrationsfördernde Signale aus der Tumorumgebung vermittelt. Zur bisherigen Aufklärung einzelner Schritte des Tumorinvasions- und Progressionsprogramms trugen dabei wesentlich In-vitro-Studien bei, jedoch erfordert die Darstellung der Relevanz molekularer Zielstrukturen und deren Funktion im Tumormikromilieu die Validierung in geeigneten In-vivo-Tumormodellen. Ziel dieser Studie war, zelluläre und molekulare Mechanismen der Tumorprogression inklusive Proliferation, Überleben und Invasion mittels Echtzeit-Intravitalmikroskopie darzustellen. Untersucht wurden insbesondere die Kinetik und Arten der Tumorzellinvasion, die zugrunde liegenden Adhäsionswege und pro-migratorischen Signale (EGF, SDF-1), beteiligte Leitstrukturen des Tumorstromas, und Strategien, therapeutisch gegen Invasionszonen vorzugehen. Um tiefe Tumorareale mittels subzellulär aufgelöster optischer Bildgebung zu erreichen, wurde nah-infrarote und infrarote Multiphotonenmikroskopie mit einem modifizierten Rückenkammermodell kombiniert. Orthotope Xeno- und Allotransplantate von HT-1080-Fibrosarkom- und B16/F10- oder MV3-Melanomzellen entwickelten dabei ausgeprägte invasive Wachstumszonen bestehend aus kollektiven Invasionssträngen mit intakten Zell-Zell-Kontakten und zeitgleicher Mitoseaktivität, die Geschwindigkeiten von bis zu 200 μm pro Tag erreichten. Diese kollektive Invasion orientierte sich bevorzugt entlang von Funktionsstrukturen der tiefen Dermis wie Blut- und Lymphgefäßen, Kollagenfasern und Muskelsträngen. RNAibasierende Herrunterregulation und/oder Injektion blockierender Antikörper gegen β1 und β3 Integrine, wie auch Inhibition von EGF führten nur zu minimaler Änderung der Invasionseffizienz. Therapeutische hypofraktionierte Bestrahlung induzierte partielle bis komplette Regression der Tumorhauptmasse, nicht jedoch der kollektiven Invasionsstränge, was auf eine kombinierte Invasions- und Resistenznische hinweist. Weder Doxorubicin noch gegen EGFR gerichtete Antikörper steigerten die Radiosensitivität, jedoch führte die simultane Inhibition von β1 und β3 Integrinen zu einer starken Hemmung von Proliferation und Überleben spontan wachsender Tumoren (Anoikis) und verstärkte die Strahlungssensitivität bis hin zum kompletten Verschwinden von sowohl Tumorhauptmasse wie auch Invasionsträngen. Kollektive Invasion ist somit ein wichtiger Invasionsmodus, der sich an vorbestehenden Gewebsstrukturen orientiert und unabhängig von Integrinen und EGF- und SDF-1-Signalen erfolgt. Die kollektiven Stränge entwickeln dabei eine vom Haupttumor verschiedene biologische Reaktion auf Bestrahlung und entsprechen damit einer durch die Mikroumgebung kontrollierten und von Integrinsignalen abhängenden Resistenznische. Somit könnte eine zusätzliche anti- Integrin-Therapie die Effizienz von Bestrahlung und Chemotherapie erhöhen und klassische Behandlungsschemen/-programme ergänzen. KW - Tumorzelle KW - Kollektive Invasion KW - Multiphotonenmikroskopie KW - Integrine KW - collective invasion KW - multiphoton microscopy KW - integrins KW - Invasion KW - Integrine Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85435 ER -