TY  - THES
A1  - Ahmad, Ruhel
T1  - Neurogenesis from parthenogenetic human embryonic stem cells
T1  - Neurogenese von parthenogenetischen humanen embryonalen Stammzellen
N2  - Imprinted genes play important roles in brain development. As the neural developmental capabilities of human parthenogenetic embryonic stem cells (hpESCs) with only a maternal genome were not assessed in great detail, hence here the potential of hpESCs to differentiate into various neural subtypes was determined. In addition DNA methylation and expression of imprinted genes upon neural differentiation was also investigated. The results demonstrated that hpESC-derived neural stem cells (hpNSCs) showed expression of NSC markers Sox1, Nestin, Pax6, and Musashi1 (MS1), the silencing of pluripotency genes (Oct4, Nanog) and the absence of activation of neural crest (Snai2, FoxD3) and mesodermal (Acta1) markers. Moreover, confocal images of hpNSC cultures exhibited ubiquitous expression of NSC markers Nestin, Sox1, Sox2 and Vimentin. Differentiating hpNSCs for 28 days generated neural subtypes with neural cell type-specific morphology and expression of neuronal and glial markers, including Tuj1, NeuN, Map2, GFAP, O4, Tau, Synapsin1 and GABA. hpNSCs also responded to region-specific differentiation signals and differentiated into regional phenotypes such as midbrain dopaminergic- and motoneuron-type cells. hpESC-derived neurons showed typical neuronal Na+/K+ currents in voltage clamp mode, elicited multiple action potentials with a maximum frequency of 30 Hz. Cell depicted a typical neuron-like current pattern that responded to selective pharmacological blockers of sodium (tetrodotoxin) and potassium (tetraethylammonium) channels. Furthermore, in hpESCs and hpNSCs the majority of CpGs of the differentially methylated regions (DMRs) KvDMR1 were methylated whereas DMR1 (H19/Igf2 locus) showed partial or complete absence of CpG methylation, which is consistent with a parthenogenetic (PG) origin. Upon differentiation parent-of-origin-specific gene expression was maintained in hpESCs and hpNSCs as demonstrated by imprinted gene expression analyses. Together this shows that despite the lack of a paternal genome, hpNSCs are proficient in differentiating into glial- and neuron-type cells, which exhibit electrical activity similar to newly formed neurons. Moreover, maternal-specific gene expression and imprinting-specific DNA-methylation are largely maintained upon neural differentiation. hpESCs are a means to generate histocompatible and disease allele-free ESCs. Additionally, hpESCs are a unique model to study the influence of imprinting on neurogenesis.
N2  - Imprinted Gene spielen eine wichtige Rolle bei der Gehirnentwicklung. Da das neurale Entwicklungspotenzial von hpESCs bisher noch nicht ausführlich untersucht wurde, war das Ziel dieser Arbeit das Differenzierungspotenzial von hpESCs zu verschiedenen neuralen Subtypen zu untersuchen. Außerdem wurden die DNA-Methylierung und Expression imprinted Gene in hpESCs während der neuralen Differenzierung analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass von hpESCs abgeleitete neurale Stammzellen (hpNSCs) die NSC-Marker Sox1, Nestin, Pax6 und Musashi1 (MS1) exprimierten, Pluripotenzmarker-Gene (Oct4, Nanog) abschalteten und keine Aktivierung von Markern der Neuralleistenzellen (Snai2, FoxD3) sowie dem mesodermalen Marker Acta1 stattfand. Immunfärbungen zeigten weiterhin, dass aus hpESCs abgeleitete Stammzellen die NSC-Marker Nestin, Sox1, Sox2 und Vimentin auf Proteinebene exprimierten. Durch gerichtete neurale Differenzierung für 28 Tage konnten aus hpESCs neurale Subtypen abgeleitet werden, die eine neurale Zelltyp-spezifische Morphologie aufweisen und positiv für neuronale und gliale Marker wie Tuj1, NeuN, Map2, GFAP, O4, Tau, Synapsin1 und GABA sind. Um aus hpNSCs dopaminerge und Motoneuronen abzuleiten, wurden während der Differenzierung Morphogene und trophische Faktoren zugegeben. Elektrophysiologische Analysen konnten zeigen, dass die in vitro differenzierten Neuronen, die von hpESCs abgeleitet wurden, für Neurone typische Na+/K+ Ströme sowie Aktionspotentiale (30 Hz) vorweisen ausbilden und auf ausgewählte pharmakologische Natrium- (Tetrodotoxin) und Kalium- (Tetraethylammonium) Kanal-Blocker reagierten. Desweiteren war der Großteil der CpGs von differentiell methylierten Regionen (DMRs) KvDMR1 in hpESCs und hpNSCs methyliert, während DMR1 (H19/Igf2 Locus) eine partiell oder komplett abwesende CpG-Methylierung zeigte, was dem parthenogenetischen Ursprung entspricht. Während der Differenzierung wurde die elternabhängige (parent-of-origin) spezifische Genexpression in hpESCs und hpNSCs aufrechterhalten, wie mit Genexpressionsanalysen imprinted Gene gezeigt werden konnte. In der Summe zeigen die hier dargestellten Ergebnisse, dass hpESCs, die kein paternales Genom besitzen, keine Beeinträchtigung im neuralen Differenzierungspotential zeigten und zu Gliazellen und Neurone differenziert werden konnten. Elektrophysiologische Analysen zeigten ferner, dass von hpESCs abgeleitete Neurone funktionell sind. Zudem wird die Expression maternal-spezifischer Gene und die Imprinting-spezifische DNA-Methylierung während der Differenzierung größtenteils aufrechterhalten. In der Summe stellen hpESCs ein einzigartiges Modell dar, um den Einfluss des Imprintings auf die Neurogenese zu untersuchen.
KW  - Embryonale Stammzelle
KW  - Neurogenese
KW  - Zelldifferenzierung
KW  - Stammzelle
KW  - human parthenogenetic stem cells
KW  - in vitro neural differentiation
KW  - human parthenogenetic neural stem cells
KW  - PG neurons
KW  - imprinting.
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75935
ER  - 
TY  - THES
A1  - Adler, Melanie
T1  - New approaches to improve prediction of drug-induced liver injury
T1  - Neue Ansätze zur verbesserten Vorhersage arzneimittelinduzierter Leberschäden
N2  - Das häufige Scheitern neuer Arzneistoffkandidaten aufgrund von Lebertoxizität in präklinischen und klinischen Studien stellt ein erhebliches Problem in der Entwicklung von neuen Arzneimitteln dar. Deshalb ist es wichtig, neue Ansätze zu entwickeln, mit deren Hilfe unerwünschte Wirkungen von Arzneimitteln früher und zuverlässiger erkannt werden können. Um die Vorhersage von Lebertoxizität in präklinischen Studien zu verbessern, wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei wesentliche Ansätze gewählt: 1) die Evaluierung neuer Biomarker, durch die Lebertoxizität zuverlässiger und empfindlicher detektiert werden könnte und 2.) wirkmechanistische Untersuchungen mittels Toxcicogenomics für ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der Arzneimittel-induzierten Toxizität. Ein Ziel dieser Arbeit war, die Fähigkeit einiger neuer potenzieller Biomarker (NGAL, Thiostatin, Clusterin und PON1) zu bewerten, Arzmeimittel-induzierte Lebertoxizität in Ratten frühzeitig zu erkennen. Die Ergebnisse zeigen, dass PON1 und Clusterin infolge eines durch die verabreichten Arzneistoffkandidaten verursachten Leberschadens nicht konsistent verändert waren. Diese beiden Marker sind daher, verglichen mit bestehenden klinisch-chemischen Markern, nicht für eine sichere Vorhersage von Arzneistoff-induzierten Leberschäden geeignet. Bei Thiostatin und NGAL zeigte sich hingegen ein zeit- und dosisabhängiger Anstieg im Serum und Urin behandelter Tiere. Diese Veränderungen, die gut mit der mRNA Expression im Zielorgan übereinstimmten, korrelierten mit dem Schweregrad der Arzneistoff-induzierten Leberschäden. Die Analyse mittels ROC zeigte, Thiostatin im Serum, nicht aber NGAL, ein besserer Indikator für Arzneimittel-induzierte hepatobiliäre Schäden ist als die routinemäßig verwendeten klinische-chemischen Marker, wie z.B. die Leberenzyme ALP, ALT und AST. Thiostatin wird jedoch als Akute-Phase-Protein in einer Vielzahl von Geweben exprimiert und kann somit nicht spezifisch als Lebermarker betrachtet werden. Dennoch zeigen unsere Ergebnisse, dass Thiostatin als sensitiver, minimal-invasiver diagnostischer Marker für Entzündungsprozesse und Gewebeschäden eine sinnvolle Ergänzung in der präklinischen Testung auf Lebertoxizität darstellt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde mittels RNA-Interferenz das pharmakologische Target des Arzneistoffkandidaten BAY16, der Glukagonrezeptor, auf mRNA-Ebene gehemmt und anhand von Genexpressionsanalysen untersucht, ob die pharmakologisch-bedingte Modulation des Glukagonrezeptors eine Rolle in der Toxizität von BAY16 spielt. Desweiteren sollten diese Arbeiten Aufschluss geben, welche molekularen Veränderungen auf die pharmakologische Wirkung des Arzneistoffs zurückzuführen sind, und daher für den Mechanismus der Toxizität möglicherweise wenig relevant sind. Während BAY16 in Konzentrationen von 75 µM starke zytotoxische Wirkungen aufwies, hatte die siRNA vermittelte Depletion des Glukagonrezeptors keinen Einfluss auf die Vitalität primärer Rattenhepatozyten. Daraus lässt sich ableiten, dass die Hepatotoxiziät von BAY16 in vitro und in vivo nicht mit der pharmakologischen Modulation des Glukagonrezeptors assoziiert ist. Diese Ergebnisse wurden durch die Tatsache gestützt, dass die meisten der durch BAY16 induzierten Genexpressionsveränderungen unabhängig von der pharmakologischen Modulation des Glucagonrezeptors auftraten. Diese beobachteten off-target-Effekte beinhalteten Veränderungen im Fremdstoffmetabolismus, oxidativer Stress, erhöhte Fettsäuresynthese und Veränderungen im Cholesterol- und Gallensäuremetabolismus. Obwohl Veränderungen in diesen molekularen Mechanismen zum Fortschreiten eines Leberschadens beitragen können, ist es anhand dieser Daten nicht möglich einen eindeutigen Mechanismus für die Toxizität von BAY16 abzuleiten. In dieser Arbeit konnte jedoch gezeigt werden, dass die Anwendung der siRNA-Technologie einen neuen methodischen Ansatz darstellt, um Mechanismen arzneimittelbedingter Toxizität besser verstehen zu können.
N2  - The high failure rate of new drug candidates in preclinical or clinical studies due to hepatotoxicity represents a considerable problem in the drug development. Hence, there is an urgent need to develop new approaches for early and reliable prediction of drug-induced hepatotoxicity that enables a better identification of drug candidates with high potential for toxicity at early stages of drug development. Therefore, the aim of this work was to improve the prediction of drug-induced liver injury in preclinical studies through evaluation of more reliable and sensitive biomarkers of hepatotoxicity and a better understanding of the underlying mechanistic basis for drug-induced toxicity. First, the ability of a set of potential markers (NGAL, thiostatin, clusterin, PON1) to detect early signs of liver injury was assessed in rats treated with drug candidates that were dropped from further development, in part due to toxic adverse effects in the liver. In summary, PON1 and clusterin were not consistently altered in response to liver injury and thus provide no additive information to the traditional liver enzymes in detecting drug-induced hepatotoxicity. In contrast, thiostatin and NGAL were increased in serum and urine of treated animals in a time- and dose-dependent manner. These changes correlated well with mRNA expression in the target organ and generally reflected the onset and degree of drug-induced liver injury. Receiver-operating characteristics analyses supported serum thiostatin, but not NGAL, as a better indicator of drug-induced hepatobiliary injury than conventional clinical chemistry parameters, such as ALP, ALT and AST. Although thiostatin, an acute phase protein expressed in a range of tissues, may not be specific for liver injury, our results indicate that thiostatin may serve as a sensitive, minimally-invasive diagnostic marker of inflammation and tissue damage in preclinical safety assessment. In the second part of this work, combined application of genomics profiling technology and RNAi to inhibit the pharmacological target of a drug candidate BAY16, a glucagon receptor (GCGR) antagonist, was used to determine if interference with the pharmacological target plays a role in the toxic response to BAY16, and to narrow down those molecular changes that are associated with toxicity, and not the pharmacological action of BAY16. In contrast to Bay 16, which was found to be cytotoxic at concentrations of 75 µM, silencing of the glucagon receptor did not affect cell viability in primary rat hepatocytes. Thus, it can be concluded that hepatotoxicity of Bay 16 was not related to the drugs inhibitory effect on the glucagon receptor in vitro and in vivo. These findings were supported by the fact that most of BAY16-induced changes in gene expression occurred independently of the pharmacological modulation of GCGR. These off-target effects include altered xenobiotic metabolism, oxidative stress, increased fatty acid synthesis, and alterations in cholesterol and bile acid metabolic processes. Although it was not possible to draw a final conclusion about the mechanism of BAY16 hepatotoxicity, changes in these molecular mechanisms appear contribute to progression of hepatic injury. With regard to drug safety assessment in preclinical studies, the utilization of siRNA technology in vitro represents a new approach to improve mechanistic understanding of the nature of drug’s toxicity, being either chemically mediated or due to primary or secondary pharmacological mode of action.
KW  - Biomarker
KW  - Leber
KW  - Hepatotoxizität
KW  - Lebertoxizität
KW  - biomarker
KW  - liver
KW  - hepatotoxicity
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69512
ER  - 
TY  - THES
A1  - Adelfinger, Marion
T1  - Präklinische Verwendung verschiedener onkolytischer Vaccinia-Viren zur Therapie von Human- und Hundetumoren
T1  - Preclinical application of different oncolytic vaccinia viruses in human and canine tumor therapy
N2  - Nach Einschätzung der Weltgesundheitsorganisation WHO wird Krebs im Jahr 2013 die weltweit häufigste Todesursache bei Menschen und Haustieren sein. Diese Situation erfordert die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze. Hauptziel einer Tumortherapie ist es, sowohl den Primärtumor als auch die Metastasen möglichst vollständig zu entfernen. Dabei wird nach Methoden gesucht, die im Gegensatz zu den meisten gegenwärtigen therapeutischen Einsätzen, wie der chirurgischen Entfernung bösartiger Neubildungen, Chemotherapie und Strahlentherapie, selektiv die bösartigen Zellen erkennen und zerstören können. Eine faszinierende Möglichkeit in dieser Hinsicht ist die Verwendung von onkolytischen Viren, die die Fähigkeit besitzen, sich selektiv sowohl in Primärtumoren als auch in Metastasen anzusiedeln und die Krebszellen dort zu zerstören. Das Konzept, dass Viren nützlich für die Bekämpfung von Krebs sein könnten, ist nicht neu. Allerdings konnte erst in den letzten Jahren durch zahlreiche Studien bestätigt werden, dass verschiedene Viren in der Lage sind, eine signifikante Antitumorwirkung in vivo auszuüben. Zu den erfolgversprechenden onkolytischen Viren zählen insbesondere Adenovirus, Herpes simplex Virus, Reovirus und Vaccinia-Virus, die sich bereits in Phase III der klinischen Studien befinden oder kurz davor sind. Die therapeutische Nutzung von tumorspezifischen onkolytischen Viren beim Menschen hat bereits begonnen. Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurden verschiedene Aspekte der Wirkungsweise von Vaccinia-Virus-Stämmen bei der Therapie verschiedener Tumore aus Mensch und Hund im Xenotransplantat-Mausmodell bearbeitet: die Onkolyse der Krebszellen und Inhibition des Tumorwachstums sowie die Effekte der Virusinfektion auf das Tumormikromilieu und die Mitwirkung des angeborenen Immunsystems bei der Virotherapie. Das Tumormikromilieu (Stroma) setzt sich aus einer Vielzahl verschiedener Zellen und Komponenten der extrazellulären Matrix zusammen. Die Krebszellen bilden unter anderem mit Endothelzellen des Blut- und Lymphsystems und verschiedenen Immunzellen eine komplexe Organ-ähnliche Struktur. Weitere wichtige Bestandteile des Stromas sind Wachstumsfaktoren, Chemokine und Zytokine und die Tumorvaskulatur. Diese ist durch zahlreiche strukturelle und funktionelle Abnormalitäten charakterisiert, wodurch die Effektivität von Strahlen- und Chemotherapie herabgesetzt wird. Weiterhin ist das Tumormikromilieu durch seine Ähnlichkeit mit einer chronischen Entzündungsreaktion gekennzeichnet und wirkt immunsupprimierend auf rekrutierte Leukozyten, die wiederum die Inflammation verstärken und die Angiogenese und das Tumorwachstum weiter fördern. Aufgrund dieser vielen Komponenten ist die Zusammensetzung jedes Tumors einzigartig, weswegen Standardtherapien häufig nicht zu einer Heilung führen. Die Wirkung der Viren bei der Virotherapie beruht vermutlich auf 4 Mechanismen, die einzeln oder in Kombination auftreten können: die direkte Onkolyse der Krebszellen, die Zerstörung des Tumorblutgefäßsystems, die Aktivierung des Immunsystems des Wirts und die Suppression der microRNA-Expression des Wirtes. Zusätzlich kann die Expression therapeutischer Gene die onkolytische Wirkung verstärken. Zum Nachweis der Onkolyse der Krebszellen und Inhibition des Tumorwachstums wurde zuerst das Virus GLV-1h68 in einem autologen humanen Melanomzellpaar, 888-MEL und 1936-MEL, eingesetzt. Das GLV-1h68-Virus wurde auf Basis des Wildtyp Vaccinia-Virus LIVP durch die Insertion von 3 Expressionskassetten in den drei Genloci F14.5L, J2R und A56 genetisch konstruiert. 888-MEL, eine zu einem frühen Zeitpunkt der Krebserkrankung aus einer Metastase isolierte Zelllinie, zeigt nach Infektion mit GLV-1h68 im Mausmodell Tumornekrose („Responder“), während 1936-MEL aus einer späten Metastasierungsphase kaum mit Onkolyse auf eine Virusinfektion reagiert („Poor-Responder“). Die onkolytische Wirkung konnte mittels Durchflusszytometrie in Tumoren beider Zelllinien zu einem frühen Zeitpunkt nach Virusinfektion nachgewiesen werden. In 888-MEL-Tumoren wurde hierbei eine große Zahl infizierter und toter Zellen nach Virusinfektion gefunden. Gleichzeitig wurde eine hohe Zahl an Immunzellen detektiert, die nach Virusinfektion reduziert war. In den schwächer reagierenden 1936-MEL-Tumoren konnte eine Onkolyse bei Infektion mit höherer Virusmenge und zu einem früheren Zeitpunkt demonstriert werden, wodurch mehr Zellen infiziert wurden. Zusätzlich wurde eine Steigerung der nur in geringer Zahl vorhandenen Immunzellen nachgewiesen. Trotz des unterschiedlichen Tumormikromilieus konnte somit ein onkolytischer Effekt in beiden Tumormodellen erzielt werden. ...
N2  - The cancer mortality rate is increasing steadily in man and pet animals and it is estimated by the World Health Organisation (WHO) to be number one cause of deaths in 2013. This situation raises the need for developing new therapeutic approaches whereby the main goal of tumor therapy always is the complete elimination of primary tumor and metastases. In contrast to most current therapies, like surgical resection of malignant neoplasia, chemotherapy and radiation, the new cancer treatments should selectively recognize and destroy malignant cells. The application of oncolytic viruses offers fascinating opportunities, because of their ability to selectively colonize primary tumors and metastases and directly destroy cancer cells. The concept of fighting cancer with viruses is not new, but the significant anti-tumoral effect of different viruses in vivo was demonstrated by several studies in the last few years. Promising oncolytic viruses are adenovirus, Herpes simplex virus, reovirus and vaccinia virus. These viruses are currently in or entering phase III clinical trials but the therapeutic use of tumor specific oncolytic viruses for humans has already started. In this work, different aspects of the effects of vaccinia virus strains during therapy of canine and human tumors in mouse xenograft models were analyzed: oncolysis of cancer cells, inhibition of tumor growth, influence of virus infection on the tumor microenvironment and participation of the innate immunity in virotherapy. The tumor microenvironment (stroma) is composed of many different cells and components of the extracellular matrix. Cancer cells form structures similar to organs including endothelial cells of the blood and lymph system, different immune cells and many other cell types. Other important components of the stroma are growth factors, chemokines and cytokines as well as the tumor vasculature that is characterized by numerous structural and functional abnormalities which decrease the efficacy of radiation and chemotherapy. Another hallmark of the tumor microenvironment is its similarity to chronic inflammation and its immunosuppressive effect on recruited leukocytes which in turn increase the inflammation and angiogenesis and promote tumor growth. Due to the many different components the composition of each tumor is unique and that is why standard therapies often do not result in cure. The effects of the viruses in the virotherapy are propably based on four mechanisms working alone or in combination: direct oncolysis of cancer cells, destruction of tumor vasculature, activation of host immune system and suppression of host microRNA expression. Additionally the expression of therapeutic genes can increase the oncolytic effect of the viruses. To analyze the oncolysis of cancer cells and the inhibition of tumor growth first the GLV-1h68 virus was used in an autologous pair of human melanoma 888-MEL and 1936-MEL. GLV-1h68 was genetically constructed on the basis of wild-type vaccinia virus LIVP by insertion of 3 expression cassettes into F14.5L, J2R and A56 gene loci. 888-MEL was isolated from metastases early during cancer disease and exhibits tumor necrosis after infection with GLV-1h68 in mouse xenograft model (responder) whereas 1936-MEL which was isolated in the late phase of metastases formation hardly shows oncolysis following virus treatment (poor-responder). The oncolytic effect was demonstrated by flow cytometric analysis of tumors of both cell lines at an early time after virus infection. In 888-MEL tumors high numbers of infected and dead cells were found after virus infection. Simultaneously, a high number of immune cells were detected which was reduced after infection. In the lower responding 1936-MEL tumors oncolysis was only observed after infection with higher amount of virus at an earlier time whereby the number of infected cells increased. Additionally, the low number of immune cells increased after infection. Despite the different tumor microenvironment an oncolytic effect was achieved in both tumor models. ...
KW  - Vaccinia-Virus
KW  - Tumortherapie
KW  - Tumorimmunologie
KW  - Hundetumor
KW  - onkolytisches Virus
KW  - vaccinia virus
KW  - tumor therapy
KW  - tumor immunology
KW  - canine tumor
KW  - oncolytic virus
KW  - Tumor
KW  - Therapie
KW  - Onkolyse
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70688
ER  -