TY - THES A1 - Herold, Volker T1 - In vivo MR-Mikroskopie am kardiovaskulären System der Maus T1 - In vivo MR-microscopy of the murine cardiovascular system N2 - Als Tiermodell ist die Maus aus der pharmazeutischen Grundlagenforschung nicht mehr wegzudenken. Aus diesem Grund nimmt besonders die Verfügbarkeit nicht invasiver Diagnoseverfahren für dieses Tiermodell einen sehr hohen Stellenwert ein. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von in vivo MR-Untersuchungsmethoden zur Charakterisierung des kardiovaskulären Systems der Maus. Neben der morphologischen Bildgebung wurde ein besonderer Schwerpunkt auf die Quantifizierung funktioneller Parameter der arteriellen Gefäße wie auch des Herzens gelegt. Durch Implementieren einer PC-Cine-Sequenz mit dreidimensionaler Bewegungskodierung war es möglich, die Charakteristik der Bewegung des gesamten Myokards zu untersuchen. Die Aufnahme von Bewegungsvektoren für jeden Bildpunkt und die Bestimmung des Torsionswinkels innerhalb der Messschichten konnte die systolische Kontraktion als dreidimensionale Wringbewegung des Herzens bestätigen. Um die Qualität der morphologischen Gefäßbildgebung zu verbessern, sollte untersucht werden, inwieweit bestehende Verfahren zur Gefäßwanddarstellung optimiert werden können. Implementieren einer Multi-Schicht-Multi-Spin-Echo-Sequenz an einem 17,6 Tesla Spektrometer erlaubte durch das hohe B0-Feld einen deutlichen Signalgewinn. Erstmals wurde es möglich, die gesunde Gefäßwand darzustellen und so morphologische Veränderungen in einem möglichst frühen Zustand zu untersuchen. Neben der Untersuchung morphologischer Veränderungen sollte vor allem ein Schwerpunkt auf das Studium funktioneller Parameter der Gefäßwand gelegt werden. Dazu wurde in einem ersten Schritt mit einem PC-Cine-Verfahren die Umfangsdehnung in ihrem zeitlichen Verlauf ermittelt. Dabei zeigte sich, dass im Laufe einer arteriosklerotischen Plaqueprogression eine Änderung der Umfangsdehnung vor einer Änderung morphologischer Parameter beobachtet werden kann. Deshalb war es Ziel, im Verlauf dieser Arbeit weitere Verfahren zur Charakterisierung funktioneller Parameter des Gefäßsystems zu entwickeln. Um direkt Elastizitätsparameter ermitteln zu können, fehlt als Bezugsgröße der arterielle Pulsdruck (AP). Die Lösung der inkompressiblen Navier-Stokes-Gleichungen unter Anwendung der Lang-Wellen-Näherung und der Näherung für große Pulswellengeschwindigkeiten (PWV) erlaubte die Bestimmung der komplexen Impedanz und somit des arteriellen Pulsdrucks in der Frequenzdomäne. Dadurch war es möglich, den dynamischen Anteil des arteriellen Druckpulses direkt aus einer Messung der Pulswellengeschwindigkeit sowie aus dem Verlauf des Flusspulses zu bestimmen. Zur Ermittlung des AP muss die Pulswellengeschwindigkeit bestimmt werden. Für die MR-Bildgebung in murinen Gefäßen waren hierzu bisher keine Verfahren verfügbar. Da sich die Gefäßdehnung möglicherweise als Indikator für eine frühe Wandveränderung bei der Plaqueprogression zeigt, bestand ein großes Interesse in der Untersuchung von spezifischen gefäßmechanischen Eigenschaften wie beispielsweise der PWV. Im Rahmen dieser Arbeit konnten zwei MR-Methoden für die nicht invasive Bildgebung in der Maus entwickelt werden, die es ermöglichten, die lokale und die regionale Pulswellengeschwindigkeit zu bestimmen. Die Messung der lokalen Pulswellengeschwindigkeit beruht dabei auf der zeitaufgelösten Bestimmung der Gefäßwanddehnung sowie des Blutvolumenflusses. Zur Bestimmung der regionalen Pulswellengeschwindigkeit wurde eine Erweiterung der Zwei-Punkt-Transit-Zeit-Methode verwendet. Durch zeitaufgelöste bewegungskodierte Bildgebung entlang der Aorta konnte anhand von 30 Stützpunkten die Propagation des arteriellen Flusspulses vermessen werden. Die Messzeit gegenüber einer Zwei-Punkt-Methode ließ sich dadurch halbieren. Gleichzeitig bietet die Auswertung von 30 Messpunkten eine größere Sicherheit in der Bestimmung der PWV. Beide Methoden wurden an einem elastischen Gefäßphantom validiert. In vivo Tierstudien an apoE(−/−)-Mäusen und einer Kontrollgruppe zeigten für beide Methoden eine gute Übereinstimmung. Darüber hinaus konnte ein Ansteigen der Pulswellengeschwindigkeit in apoE(−/−)-Mäusen durch arteriosklerotische Veränderungen nachgewiesen werden. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit grundlegende Verfahren zur Untersuchung des kardiovaskulären Systems der Maus optimiert und entwickelt. Die Vielseitigkeit der MR-Bildgebung ermöglichte dabei die Erfassung von morphologischen und funktionellen Parametern. In Kombination können die beschriebenen Methoden als hilfreiche Werkzeuge für die pharmakologische Grundlagenforschung zur Charakterisierung von Herz-Kreislauf-Erkankungen in Mausmodellen eingesetzt werden. N2 - The mouse model is considered as an essential animal model for the basic research in pharmacology. Therefore, the availability of non-invasive diagnostic methods for this species has gained important significance. The objective of this study was the development of methods to investigate the characteristics of the cardio-vascular system of mice with MR-technology. In addition to morphological imaging, the study was focused on the quantification of functional parameters of the arterial system as well as the mouse heart. By implementing a PC-Cine-sequence with three-dimensional motion encoding simultaneously with two dimensional spatial encoding, the comprehensive motion encoded datasets provided the access to motion patterns of the entire myocardium. It could be shown that the movement of the murine myocardium during systole is equivalent to a three-dimensional wring movement. To improve the quality of morphological imaging, this study also focused on the optimization of established methods visualizing the arterial wall. Implementing a multi-slice-multi-spin-(MSME)-echo method at 17.6 T allowed for a significant improvement of the SNR due to the high B0-field. For the first time the healthy vessel wall could thus be imaged; enabling the investigation of morphological changes at an early state of the atherosclerotic disease. In addition to the investigation of morphological changes, this paper was focused on the study of functional parameters of the arterial vessel wall. For that purpose, a PC-Cine-method was applied to determine the time course of the circumferential strain. The interim results thereby revealed that during atherosclerotic plaque progression, changes of the circumferential strain precede significant changes of the arterial wall thickness. These findings indicated the potential superiority of functional parameters over morphological properties and have motivated the development of further methods characterizing different functional parameters of the vessel wall. To calculate direct parameters of the vessel wall elasticity the according arterial pulse pressure (AP) is needed. Therefore the solution of the incompressible Navier-Stokes equations was applied using the long-wave approximation and the assumption of a high pulse wave velocity (PWV) compared to the blood flow velocity. Thus the complex impedance could be calculated enabling the computation of the pressure pulse in the frequency domain. The dynamic fraction of the arterial pulse pressure could be calculated by directly measuring the PWV and the time course of the blood flow velocity. To determine the AP the pulse wave velocity has to be known. Since no MR-methods were available for that purpose, two different approaches to calculate the PWV with MR methods were established in the course of this study. The two different approaches to estimate the PWV in the murine aorta allow the determination of the local PWV at a predefined location along the propagation pathway and the estimation of the regional PWV as the averaged value along a certain vessel wall segment. The measurement of the local pulse wave velocity is based on the time-resolved acquisition of the vessel wall strain and the blood volume flow. Both parameters were accessible by using a PC-Cine-sequence incorporating a specific acquisition scheme to sample the time-dependant data at a temporal resolution of 1000 frames per second. To determine the regional PWV an improvement of the two-point-transit-time method was implemented. By using time-resolved motion encoding along the propagation pathway 30 different interpolation points could be used to identify the respective starting time of the systolic pulse wave. Compared to the conventional two-point-measurement scheme, the total measurement time could thus be halved. Additionally, the use of 30 interpolation points significantly increased the accuracy of the calculation of the pulse wave velocity. Both methods were validated using an elastic vessel wall phantom. In vivo experiments with apoE(−/−)-mice and wild-type animals showed a good correlation between both methods. For the apoE(−/−)-mice an increase of the PWV could be identified when compared to the control group. In summary, this study provides the development and the optimization of MR-applications to investigate the cardiovascular system of mice. Measurements of functional parameters in combination with the study of morphological parameters can serve as a helpful tool for pharmacological research. KW - Maus KW - Kardiovaskuläres System KW - NMR-Bildgebung KW - NMR-Tomographie KW - MR-imaging KW - cardiovascular system KW - mice Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54253 ER - TY - THES A1 - Henig, Kristina Miriam T1 - Einfluss verschiedener Knochenmarkszellpopulationen auf linksventrikuläres Remodeling nach Myokardinfarkt T1 - Impact of different bone marrow cell preparations on left ventricular remodeling after myocardial infarction N2 - Knochenmarksstammzellen werden als mögliche Zellquelle zur Verbesserung kardialer Funktion nach Myokardinfarkt angesehen. Um die Rolle und das Potential verschiedener Knochenmarkszellpopulationen auf das linksventrikuläre Remodeling nach Myokardinfarkt weiter zu untersuchen, wurde auf das Maus-Infarkt-Modell zurückgegriffen. Nach experimentellem Myokardinfarkt durch Ligation der vorderen absteigenden Koronararterie erfolgte entweder die intramyokardiale Injektion von unfraktionierten Knochenmarkszellen oder einer mit Vorläufer- (Lin-) bzw. reifen (Lin+) Zellen angereicherten Knochenmarkszellsubpopulation. Obgleich mit keiner Zellpopulation entscheidend Einfluss auf Überlebensrate und Infarktgröße genommen werden konnte, zeigte sich eine signifikante Verbesserung des linksventrikulären Remodelings nach Injektion von unfraktionierten Knochenmarkszellen, welche hingegen durch Behandlung mit Lin- oder Lin+ Zellen ausblieb. Gemessen wurde dies einerseits auf molekularer Ebene, wo der linksventrikuläre Hypertrophiemarker, bestehend aus betaMHC/alphaMHC-Ratio signifikant gesenkt werden konnte, andererseits auf echokardiographischer Ebene, wo sich eine signifikante Verminderung linksventrikulärer Dilatation nachweisen ließ. Da sich die untersuchten Zellpopulationen hinsichtlich in vitro gemessener Zytokinexpressionslevel teilweise erheblich unterschieden, müssen die beobachteten Resultate im Zusammenhang mit stattgefundener parakrine Zytokinsekretion gesehen werden. N2 - Bone marrow stem cells are considered as a promising cell source to improve cardiac function after myocardial infarction. To further investigate the role and potential of different bone marrow cell preparations on left ventricular remodelling we employed the mouse-infarct-model. After induction of myocardial infarction through ligation of the left descending coronary artery, mice were treated either with intramyocardial injection of unfractionated bone marrow cells, progenitor-enriched (Lin-) or mature (Lin+) cells.Although none of the cell populations showed a pronounced influence on survival rate or infarct size, there was a significant amelioration of left ventricular remodelling after injection of unfractionated bone marrow cells, which could not be accomplished by treatment with Lin- or Lin+ cells. This effect was measured both on molecular basis, where the left ventricular hypertrophie marker, consisting of the betaMHC/alphaMHC-ratio was significantly decreased, and on echocardiographic basis, where a significant reduction of left ventricular dilatation was demonstrated. Considering the substantial differences in in-vitro measured cytokine-levels observed in the investigated cell populations, the results shown could potentially be attributed to paracrine secretion of cytokines. KW - Herzinfarkt KW - Knochenmarkzelle KW - Cytokine KW - Herzerweiterung KW - Herzhypertrophie KW - Adulte Stammzelle KW - Blutstammzelle KW - Remodeling KW - Maus KW - remodelling KW - myocardial KW - infarction KW - bone KW - marrow Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46521 ER - TY - THES A1 - Heinrichs, Susanne Margarete T1 - Myocardial B-cell infiltration following occlusion of the left anterior descending artery in mice is driven by CXCL13 T1 - Die Infiltration des Myokards durch B-Lymphozyten nach Ligatur der linken Koronararterie im Mausmodell wird durch CXCL13 verursacht N2 - Myocardial B-cell infiltration after LAD occlusion in mice is driven by CXCL13 After myocardial infarction, the immune system is activated and regulates wound healing and remodeling processes in the heart. While the role of T cells has been elucidated already, the function of B cells in myocardial infarction remained relatively unclear until now. It is, however, already known that B cells are of importance in healing processes in other tissues, for example in the skin. Our studies therefore addressed the role and function of B cells in healing and early remodeling processes in the myocardium after infarction. Under physiological conditions, only few B cells can be found in the heart. After myocardial infarction, however, which we modelled with a permanent ligation of the left anterior descending artery (LAD) in C57BL/6J mice, we could demonstrate that B lymphocytes accumulate in the early phase after tissue injury (days one to seven) in the myocardium. To detect B cells, we performed immunofluorescence stainings on cryosections of infarcted hearts using an anti-B220 antibody. Quantitative analysis of tissue infiltration revealed that B cells peaked at day seven. In flow cytometry, we further characterized the B cells infiltrating infarcted tissue. We found that most of them were mature B cells (IgM+, IgD+). Next, we wanted to outline a potential mechanism responsible for B-cell infiltration to the site of tissue injury. We therefore performed ELISA experiments revealing that CXCL13 was upregulated in scar tissue. Antibody-mediated neutralization of CXCL13 verifiably attenuated B-cell infiltration. Treated mice also showed – in the tendency – smaller infarct sizes and an improved survival. In conclusion, we could show that B lymphocytes infiltrate the myocardium after MI in mice following a local CXCL13 gradient and that it is, most likely, beneficial to inhibit this process. N2 - Nach einem Herzinfarkt wird das Immunsystem aktiviert und bestimmt die Wundheilung sowie das Remodeling im Herzen. Während die Rolle von T-Zellen [dabei] bereits relativ gut untersucht ist, war die Funktion von B-Zellen beim Myokardinfarkt bis heute relativ unklar. Man weiß bisher allerdings, dass B-Zellen eine wichtige Rolle in Heilungsprozessen in anderen Geweben spielen, z.B. in der Haut. Unsere Untersuchungen beschäftigten sich daher mit der Rolle und Funktion von B-Zellen nach experimentellem Herzinfarkt im Mausmodell. Unter physiologischen Bedingungen finden sich nur wenige B-Zellen im Herzen. Nach Herzinfarkt, den wir mithilfe einer permanenten Ligatur der linken Herzkranzarterie in C57BL/6J-Mäusen induzierten, konnten wir jedoch zeigen, dass B-Zellen in der frühen Phase nach Gewebeschädigung (Tag eins bis sieben) im Myokard akkumulieren. Um B-Zellen zu detektieren, führten wir Immunfluoreszenz-Färbungen mit einem monoklonalen Anti-B220-Antikörper auf Gefrierschnitten des Herzens durch. Eine quantitative Auswertung der Gewebeinfiltration ergab, dass die Anzahl der B-Zellen an Tag sieben ihren Höhepunkt erreicht. In durchflusszytometrischen Untersuchungen charakterisierten wir [anschließend] die das infarzierte Gewebe infiltrierenden B-Zellen (weiter). Wir stellten dabei fest, dass es sich bei den meisten dieser Zellen um reife B-Zellen (IgM+, IgD+) handelte. Als nächsten Schritt wollten wir einen möglichen Mechanismus, der die B-Zell-Infiltration am Ort der Gewebeschädigung erklärt, umreißen. Wir führten daher ELISA-Messungen durch, die ergaben, dass CXCL13 im Narbengewebe hochreguliert war. Eine Antikörper-vermittelte Neutralisation von CXCL13 konnte nachweisbar die B-Zell-Infiltration hemmen. So behandelte Mäuse zeigten – in der Tendenz – kleinere Infarktgrößen und ein verbessertes Überleben. Zusammenfassend konnten wir somit zeigen, dass B-Lymphozyten nach Myokardinfarkt in der Maus das Myokard aufgrund eines lokalen CXCL13-Gradienten infiltrieren und dass es höchstwahrscheinlich vorteilhaft ist, diesen Prozess zu unterbinden. KW - Maus KW - CXCL13 KW - Herzinfarkt KW - B-Lymphozyt KW - LAD Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-168554 ER - TY - THES A1 - Harder, Friedrich T1 - Untersuchungen zum in vivo Differenzierungspotenzial muriner und humaner hämatopoetischer sowie muriner neuraler Stammzellen T1 - Analysis of the in vivo differentiation potential of murine and human hematopoietic as well as murine neural stem cells N2 - Zusammenfassung Im Zuge der Säugerentwicklung entsteht aus der totipotenten Eizelle ein Organismus aus mehr als 200 verschiedenen Zelltypen. Dabei wird die Entwicklung und der Erhalt des Tieres von Stammzellen gewährleistet. Während der Embryonalentwicklung gibt es nur transient vorkommende Stammzelltypen, während der adulte Körper die Homoeostase mittels permanent vorhandener somatischer Stammzellen aufrechterhält. Als kennzeichnend für die somatischen Stammzellen galt, dass sie nur die Zellen ihres Gewebes ersetzen können. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob SSZ tatsächlich auf die Bildung von Zellen ihres Stammzellkompartiments beschränkt sind. Dazu wurden drei verschiedene Stammzelltypen, murine hämatopoetische und humane HSZ sowie murine NSZ in murine Präimplantationsblastozysten injiziert. Da dies die Zellen mit einer Umgebung exponiert, von der die Bildung aller Zelltypen des erwachsenen Tieres ausgeht. Es konnte gezeigt werden, dass zur Mitte der Schwangerschaft Nachkommen aller drei injizierten Stammzelltypen sich präferentiell in den fötalen hämatopoetischen Geweben befinden. Für humane hämatopoetische und murine NSZ wurde gezeigt, dass diese hämatopoetische Vorläufer in hämatopoetischen Geweben der Embryonen bilden, sowie dass Nachkommen dieser Zellen ein erythroides Genexpressionsmuster aktivieren. Der Vergleich adulter chimärer Tiere zeigte, dass HSZ zu nahezu gleichen Teilen neurale und hämatopoetische Gewebe besiedelt hatten. Nachkommen neuraler Stammzellen dagegen vor allem in neuralen Geweben adulter Tiere gefunden wurden. Aus diesen Ergebnisssen lässt sich ableiten, dass SSZ durch die Exposition mit der frühen embryonalen Mikroumgebung zur Bildung heterologer Zelltypen angeregt werden können. Außerdem demonstrieren diese Ergebnisse das unterschiedliche Entwicklungspotenzial von HSZ und NSZ und grenzen es gegenüber dem pluripotenten Differenzierungspotenzial von ES-Zellen ab. N2 - Summary During mammalian ontogeny an organism develops from a totipotent zygot that is composed of more than 200 distinct cell types. The development and the maintanance of the organism is dependent on somatic stem cells. Transient stem cell types exist during early embryonic development, but homoestasis of the adult is maintained by resident somatic stem cells. The restriction in committent to the exclusive generation of cells of their own stem cell system was considered as a hallmark of adult stem cells. The objective of the present thesis was to investigate whether somatic stem cells are truly restricted to the generation of cells belonging to their own stem cell system only. To this end three somatic stem cell types, murine hematopoietic, human hematopoietic and murine neural stem cells were injected into murine blastocysts. The blastocysts provides the injected stem cells with a microenvironment permissive for the generation of all cell types of the adult organism. It could be shown using this method that progeny of murine and human hematopoietic and murine neural stem cells preferentially engrafted the hematopoietic tissues of the developing embryo. Furthermore, injection of human hematopoietic and murine neural stem cells gave rise to hematopoietic progenitors cells in fetal hematopoietic tissues, and generated cells with an erythroid gene expression pattern. Comparison of adult chimeric animals revealed that progeny of hematopoietic stem cells had engrafted hematopoietic and neural tissues to a similar extent, whereas progeny of neural stem cells was preferentially detected in neural tissues. This result indicates, that somatic stem cells can generate heterologous cells if exposed to the early embryonic environment. Furthermore, it demonstrates the distinct and different developmental potentials of hematopoietic and neural stem cells and and distinguishes them from the pluripotent differentiation potential of ES-cells. KW - Maus KW - Mensch KW - Stammzelle KW - Neurogenese KW - Blutstammzelle KW - Zelldifferenzierung KW - Stammzellen KW - Hämatopoese KW - murin KW - human KW - Neurogenese KW - Stem cells KW - hematopoiesis KW - murine KW - human KW - neurogenesis Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4214 ER - TY - THES A1 - Hagedorn, Ina T1 - Novel mechanisms underlying arterial thrombus formation: in vivo studies in (genetically modified) mice T1 - Neue Mechanismen der arteriellen Thrombusbildung: in vivo-Studien in (genetisch veränderten) Mäusen N2 - Thrombus formation at sites of vascular lesions is a dynamic process that requires a defined series of molecular events including the action of platelet adhesion/activation receptors, intracellular signal transduction, cytoskeletal rearrangements and activation of plasma coagulation factors. This process is essential to limit post-traumatic blood loss but may also contribute to acute thrombotic diseases such as myocardial infarction and stroke. With the help of genetically modified mice and the use of specific protein inhibitors and receptordepleting antibodies, the work presented in this thesis identified novel mechanisms underlying thrombus formation in hemostasis and thrombosis. In the first part of the study, it was shown that von Willebrand Factor (vWF) binding to glycoprotein (GP)Iba is critical for the formation of stable pathological thrombi at high shear rates, suggesting GPIba as an attractive pharmacological target for antithrombotic therapy. The subsequent analysis of recently generated phospholipase (PL)D1-deficient mice identified this enzyme, whose role in platelet function had been largely unknown, as a potential target protein downstream of GPIba. This was based on the finding that PLD1- deficient mice displayed severely defective GPIba-dependent thrombus stabilization under high shear conditions in vitro and in vivo without affecting normal hemostasis. The second part of the thesis characterizes the functional relevance of the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-bearing collagen receptor GPVI and the recently identified hemITAM-coupled C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) for in vivo thrombus formation. Genetic- and antibody-induced GPVI deficiency was found to similarly protect mice from arterial vessel occlusion in three different thrombosis models. These results confirmed GPVI as a promising antithrombotic target and revealed that antibody-treatment had no obvious off-target effects on platelet function. Similarly, immunodepletion of CLEC-2 by treating mice with the specific antibody INU1 resulted in markedly impaired thrombus growth and stabilization under flow in vitro and in vivo. Furthermore, it could be demonstrated that double-immunodepletion of GPVI and CLEC-2 resulted in severely decreased arterial thrombus formation accompanied by dramatically prolonged bleeding times. These data revealed an unexpected redundant function of the two receptors for in vivo thrombus formation and might have important implications for the potential development of anti-GPVI and anti-CLEC-2 antithrombotic agents. The third part of the thesis provides the first functional analysis of megakaryocyte- and platelet-specific RhoA knockout mice. RhoA-deficient mice displayed a defined signaling defect in platelet activation, leading to a profound protection from arterial thrombosis andand ischemic brain infarction, but at the same time also strongly increased bleeding times. These findings identified the GTPase as an important player for thrombus formation in hemostasis and thrombosis. Based on the previous proposal that the coagulation factor (F)XII might represent an ideal target for safe antithrombotic therapy without causing bleeding side effects, the last part of this thesis assesses the antithrombotic potential of the newly generated FXIIa inhibitor rHAInfestin- 4. It was found that rHA-Infestin-4 injection into mice resulted in virtually abolished arterial thrombus formation but no change in bleeding times. Moreover, rHA-Infestin-4 was similarly efficient in a murine model of ischemic stroke, suggesting that the inhibitor might be a promising agent for effective and safe therapy of cardio- and cerebrovascular diseases. N2 - Thrombusbildung an einer verletzten Gefäßstelle ist ein dynamischer Prozess, der ein definiertes Zusammenspiel von Thrombozytenadhäsions-/aktivierungsrezeptoren, intrazellulären Signalen, Zytoskelettumstrukturierungen sowie die Aktivierung von Plasma Koagulationsfaktoren benötigt. Dieser Prozess ist essenziell um Blutungen nach einer Gefäßverletzung zu stoppen, kann aber auch zu akuten thrombotischen Erkrankungen wie Herzinfarkt und Schlaganfall führen. Mit Hilfe von genetisch veränderten Mäusen und der Verwendung von spezifischen Proteininhibitoren und Rezeptor-depletierenden Antikörpern wurden in der hier vorliegenden Dissertation neue Mechanismen der Thrombusbildung in Hämostase und Thrombose identifiziert. In dem ersten Teil der Studie konnte gezeigt werden, dass die Interaktion zwischen von Willebrand Faktor (vWF) und Glykoprotein (GP)Iba entscheidend für die Bildung von pathologischen Thromben bei hohen Scherraten ist, was auf die Eignung von GPIba als eine attraktive pharmakologische Zielstruktur (Target) für eine antithrombotische Therapie hindeutet. Die anschließende Analyse von vor kurzem generierten Phospholipase (PL)D1- defizienten Mäusen identifizierte dieses Enzym, dessen Rolle in der Thrombozytenfunktion bislang unbekannt war, als eine mögliches Targetprotein im Signalweg von GPIba. Dies basierte vor allem auf der Erkenntnis, dass PLD1-defiziente Mäuse eine stark gestörte GPIba-abhängige Thrombusstabilisierung unter hohen Scherbedingungen aufwiesen, ohne jedoch dabei die normale Hämostase zu beeinflussen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die funktionelle Relevanz des immunoreceptor tyrosinebased activation motif (ITAM)-gekoppelten Kollagenrezeptors GPVI und des vor kurzem entdeckten hemITAM-gekoppelten C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) für die in vivo Thrombusbildung charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass genetisch- und durch Antikörperinduzierte GPVI-Defizienz Mäuse gleichermaßen vor arteriellem Gefäßverschluss in drei verschiedenen Thrombosemodellen schützt. Diese Ergebnisse bestätigten GPVI als ein viel versprechendes antithrombotisches Target und zeigten, dass eine Antikörperbehandlung in Mäusen keine offensichtlichen unspezifischen Effekte auf die Thrombozytenfunktion hatte. Eine gleichermaßen induzierte Immunodepletion von CLEC-2 durch die Behandlung von Mäusen mit dem spezifischen Antikörper INU1 führte zu deutlich vermindertem Thrombuswachstum und reduzierter Thrombusstabilisierung unter Flussbedingungen in vitro und in vivo. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass eine Doppel-Immunodepletion von GPVI und CLEC-2 zu einer stark reduzierten arteriellen Thrombusbildung führte, die mit dramatisch verlängerten Blutungszeiten einherging. Diese Ergebnisse machten eineunerwartete funktionelle Redundanz der beiden Rezeptoren deutlich und könnten möglicherweise einen wichtigen Einfluss auf eine eventuelle Entwicklung von anti-GPVI und anti-CLEC-2 antithrombotischen Wirkstoffen haben. Der dritte Teil der Arbeit liefert die erste funktionelle Analyse von Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen RhoA-Knockout Mäusen. RhoA-defiziente Mäuse zeigten einen definierten Signaldefekt in der Thrombozytenaktivierung, der zu einem deutlichen Schutz vor arterieller Thrombose und ischämischen Hirninfarkt aber gleichzeitig auch zu stark erhöhten Blutungszeiten führte. Dieses Ergebnis identifizierte die GTPase als einen wichtigen Spieler für die Thrombusbildung in Hämostase und Thrombose. Basierend auf dem vorausgegangenen Vorschlag, dass der Koagulationsfaktor XII (FXII) ein ideales Target für eine sichere antithrombotische Therapie darstellen könnte, ohne Blutungsnebenwirkungen zu verursachen, untersucht der letzte Teil der Arbeit das antithrombotische Potential des neu generierten FXIIa Inhibitors rHA-Infestin-4. Es konnte gezeigt werden, dass eine Injektion von rHA-Infestin-4 in Mäuse die arterielle Thrombusbildung nahezu aufhob aber Blutungszeiten nicht veränderte. Außerdem war rHAInfestin- 4 gleichermaßen effizient in einem Mausmodell des ischämischen Schlaganfalls, was darauf schließen lässt, dass der Inhibitor ein vielversprechender Wirkstoff für eine effektive und sichere Therapie von kardio- und zerebrovaskulären Erkrankungen sein können KW - Thrombus KW - Gerinnungsfaktor KW - Arterielles Blut KW - Zielstruktur KW - Maus KW - biomedicine KW - cell KW - blood KW - vascular system KW - Allgemeine Zelle KW - Zellkern KW - Blutgefäßsystem KW - Blut-Hirn-Schranke Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85752 ER - TY - THES A1 - Göb, Eva T1 - Die Kernhülle in Keimzellen: Strukturelle Besonderheiten, dynamische Prozesse und die Umgestaltung des Zellkerns während der Spermatogenese der Maus T1 - The nuclear envelope in germ cells: structural peculiarities, dynamic processes und the reorganization of the cell nucleus during murine spermatogenesis N2 - Die Kernhülle umgibt als geschlossenes Membransystem einen jeden Zellkern und ist damit ein gemeinsames Merkmal aller eukaryotischen Zellen. Sie besteht aus einer inneren und einer äußeren Kernmembran sowie der nukleoplasmatischen Kernlamina, die aufgrund zahlreicher assoziierter Proteine in enger Wechselbeziehung mit der inneren Kernmembran steht. Neben der rein räumlichen Trennung nukleärer und zytoplasmatischer Strukturen hat die Kernhülle bedeutenden regulatorischen Einfluss auf die gesamte Zelle. So ist sie unter anderem an der Steuerung der genomischen Aktivität, an der nukleo- und zytoplasmatischen Signalübertragung und in hohem Maße an der Positionierung und Formerhaltung des Zellkerns beteiligt. Es mehren sich die Hinweise, dass die Kernhülle auch während der Gametogenese, der Differenzierung befruchtungsfähiger Keimzellen, eine zentrale Rolle einnimmt und folglich auch mit bislang ungeklärten Ursachen humaner Infertilität in Kontext stehen könnte. Um die Bedeutung der Kernhülle für die Keimbahn der Säuger generell besser verstehen zu können, wurden in dieser Arbeit ausgewählte Bestandteile der Keimzellkernhülle untersucht. Dadurch sollte der Kenntnisstand erweitert werden, in welcher Weise die Kernhülle dynamische, morphologische und vor allem für die Keimbahn essentielle Prozesse beeinflusst; insbesondere während der meiotischen und der postmeiotischen Differenzierungsphase bei männlichen Mäusen. Im Mittelpunkt stand dabei einerseits Lamin C2, ein meiosespezifisches A-Typ Lamin, dessen Verlust zu einer schwer geschädigten Meiose und infolgedessen zu vollständiger männlicher Infertilität führt. Es zeigte sich, dass Lamin C2-defiziente männliche Mäuse schwerwiegende Defekte bei der Paarung und Synapsis der homologen Chromosomen in der meiotischen Prophase I aufweisen und aufgrund apoptotischer Spermatocyten keine reifen Spermien bilden können. Es wird angenommen, dass die Assoziation homologer Chromosomen bzw. die Abstoßung nicht-homologer durch gerichtete Telomerbewegungen entlang der Kernhüllenperipherie vorangetrieben bzw. verhindert wird. Da Lamin C2 seinerseits diese Wanderung der Telomere durch eine Flexibilisierung der Spermatocytenkernhülle vereinfachen soll, ist es durchaus vorstellbar, dass sein Verlust verlangsamte Telomerbewegungen, eine gestörte Homologenfindung und folglich Fehlpaarungen zur Folge hat. Ein weiteres zentrales Thema war die Erforschung potentieller LINC-Komplexe während der Differenzierungs- und morphologischen Umgestaltungsphase postmeiotischer Keimzellen. LINC-Komplexe sind kernhüllendurchspannende Proteingebilde aus SUN-Proteinen in der inneren und Nesprinen in der äußeren Kernmembran, die nukleäre Strukturen an das Zytoskelett binden. Da sie aufgrund dieser strukturellen Eigenschaft die Kernmorphologie beeinflussen können, erscheinen sie als äußerst geeignet, an der Formierung des Spermienkopfes beteiligt zu sein. Die detaillierte Untersuchung spermiogeneserelevanter LINC-Komplex-Bestandteile ergab, dass während der Spermiogenese tatsächlich zwei neue, strukturell einzigartige LINC-Komplexe gebildet werden, die darüber hinaus auf den entgegengesetzten Seiten differenzierender Spermatiden polarisieren. Da sie den Kern dort an jeweils spezielle Zytoskelettelemente binden könnten, wurde in dieser Arbeit das Modell der LINC-Komplex vermittelten Umformung des Spermienkopfes aufgestellt. Insgesamt trägt diese Arbeit durch die funktionelle Analyse von Lamin C2 und die Identifizierung neuer LINC-Komplexe dazu bei, die Wichtigkeit der Kernhülle für die Spermatogenese zu vertiefen und auszuweiten. N2 - The nuclear envelope is a double membranous structure enclosing the most typical eukaryotic feature, the cell nucleus. It is composed of an inner and an outer nuclear membrane as well as a nucleoplasmic lamina which is closely connected to the inner nuclear membrane by a number of associated proteins. Thus, besides just separating nuclear and cytoplasmic structures the nuclear envelope is functionally involved in many regulatory processes; i.e. controlling of the genomic activity, nucleo- and cytoplasmic signal transduction and, importantly, nuclear positioning and maintenance of nuclear architecture. Evidence emerges that the nuclear envelope also plays a fundamental role in the differentiation process of germ cells, gametogenesis, likely being responsible for yet unexplained human infertility. In order to expand the knowledge concerning impact and functions of the nuclear envelope for the mammalian germ line selected components and special characteristics of the germ cell nuclear envelope have been investigated in this thesis. Thus, this might help to understand germ line specific dynamic, morphological and other essential processes - particularly in course of meiotic and postmeiotic differentiation in male mice. Of great interest was lamin C2, a meiosis-specific A-type lamin essential for accurate meiosis and fertility of male mice. It has been shown that the targeted depletion of lamin C2 results in a severely defective meiosis and consequently in complete male infertility. Lamin C2-deficient male mice exhibit serious defects concerning pairing and synapsis of the homologous chromosomes. Thus, these mice are characterized by apoptotic spermatocytes and the complete absence of postmeiotic stages. It has been proposed that telomere movements along the nuclear periphery during prophase I might promote homologous but prevent heterologous chromosome association. Lamin C2 in turn is suggested to facilitate those meiotic telomere migrations by providing local flexibility to the telomeres attached to the nuclear envelope. Given that loss of lamin C2 causes decelerated telomere movements and defective homologous pairing afterwards, the situation in lamin C2-deficient spermatocytes could be explained. Another central focus was the investigation of potential LINC complexes in differentiating and morphologically reorganizing postmeiotic cells. LINC complexes are proteinaceous structures formed by SUN-proteins at the inner and nesprins at the outer nuclear membrane that tether the cell nucleus to the surrounding cytoskeleton. Since this structural property is suggested to influence nuclear morphology and shaping, LINC complexes appear to be good candidates for participating in mammalian sperm head shaping. Detailed analysis of LINC complex components relevant for spermiogenesis revealed that two novel uniquely assembled LINC complexes are established in the male post meiotic germ line. Moreover, those LINC complexes were shown to polarize to opposite cell poles in differentiating spermatids probably linking to specialized cytoskeletal elements. Therefore, a model for the LINC complex mediated shaping and elongation of the mammalian sperm head has been proposed in this thesis. Together, the functional analysis of lamin C2 as well as the identification of novel LINC complexes described in this thesis substantiates the fundamental role of the nuclear envelope for entire spermatogenesis. KW - Spermatogenese KW - Kernhülle KW - Lamina KW - Maus KW - Meiose KW - meiosis KW - spermiogenesis KW - nuclear envelope KW - lamina KW - LINC complex Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56839 ER - TY - THES A1 - Göb [née Klaus], Vanessa Aline Domenica T1 - Pathomechanisms underlying ischemic stroke T1 - Pathomechanismen des ischämischen Schlaganfalles N2 - Every year, stroke affects over 100 million people worldwide and the number of cases continues to grow. Ischemic stroke is the most prevalent form of stroke and rapid restoration of blood flow is the primary therapeutic aim. However, recanalization might fail or reperfusion itself induces detrimental processes leading to infarct progression. Previous studies identified platelets and immune cells as drivers of this so-called ischemia/reperfusion (I/R) injury, establishing the concept of ischemic stroke as thrombo-inflammatory disease. Reduced cerebral blood flow despite recanalization promoted the hypothesis that thrombus formation within the cerebral microcirculation induces further tissue damage. The results presented in this thesis refute this: using complementary methodologies, it was shown that infarct growth precedes the occurrence of thrombi excluding them as I/R injury-underlying cause. Blood brain barrier disruption is one of the hallmarks of ischemic stroke pathology and was confirmed as early event during reperfusion injury in the second part of this study. Abolished platelet α-granule release protects mice from vascular leakage in the early reperfusion phase resulting in smaller infarcts. Using in vitro assays, platelet α-granule-derived PDGF-AB was identified as one factor contributing to blood-brain barrier disruption. In vivo visualization of platelet activation would provide important insights in the spatio-temporal context of platelet activation in stroke pathology. As platelet signaling results in elevated intracellular Ca2+ levels, this is an ideal readout. To overcome the limitations of chemical calcium indicators, a mouse line expressing an endogenous calcium reporter specifically in platelets and megakaryocytes was generated. Presence of the reporter did not interfere with platelet function, consequently these mice were characterized in in vivo and ex vivo models. Upon ischemic stroke, neutrophils are among the first cells that are recruited to the brain. Since for neutrophils both, beneficial and detrimental effects are described, their role was investigated within this thesis. Neither neutrophil depletion nor absence of NADPH-dependent ROS production (Ncf-/- mice) affected stroke outcome. In contrast, abolished NET-formation in Pad4-/- mice resulted in reduced infarct sizes, revealing detrimental effects of NETosis in the context of ischemic stroke, which might become a potential therapeutic target. Cerebral venous (sinus) thrombosis, CV(S)T is a rare type of stroke with mainly idiopathic onset. Whereas for arterial thrombosis a critical contribution of platelets is known and widely accepted, for venous thrombosis this is less clear but considered more and more. In the last part of this thesis, it was shown that fab-fragments of the anti-CLEC-2 antibody INU1 trigger pathological platelet activation in vivo, resulting in foudroyant CVT accompanied by heavy neurological symptoms. Using this novel animal model for CVT, cooperative signaling of the two platelet receptors CLEC-2 and GPIIb/IIIa was revealed as major trigger of CVT and potential target for treatment. N2 - Jährlich sind weltweit über 100 Millionen Menschen von einem Schlaganfall betroffen, wobei die Zahl der Fälle weiter zunimmt. Der ischämische Schlaganfall ist die häufigste Form des Schlaganfalls, und die sofortige Wiederherstellung des Blutflusses ist das oberste Therapie¬ziel. Allerdings kommt es vor, dass die Rekanalisierung des betroffenen Gefäßes fehlschlägt oder die Reperfusion selbst zu schädlichen Prozessen führt, die das Fortschreiten des Infarkts begünstigen. In vorangegangen Studien wurden Thrombozyten und Immunzellen als treibende Kräfte dieser so genannten Ischämie/Reperfusion (I/R)-Schädigung identifiziert und der ischämische Schlaganfall als thrombo-inflammatorische Erkrankung definiert. Eine verminderte zerebrale Durchblutung trotz Rekanalisation führte zu der Hypothese, dass die Bildung von Thromben in der zerebralen Mikrozirkulation zu weiteren Gewebeschäden führt. Die hier vorgestellten Ergebnisse widerlegen dies: Mit Hilfe komplementärer Methoden konnte gezeigt werden, dass das Infarktwachstum dem Auftreten von Thromben vorausgeht, was diese als Ursache für die I/R-Verletzung ausschließt. Die Störung der Blut-Hirn-Schranke ist eines der charakteristischen Kennzeichen der Pathologie des ischämischen Schlaganfalls und wurde im zweiten Teil dieser Studie als frühes Ereignis während des Reperfusionsschadens bestätigt. Mit Hilfe transgener Mäuse konnte gezeigt werden, dass die Ausschüttung von α-Granula aus Thrombozyten in der frühen Reperfusionsphase an Störungen der Blut-Hirn-Schranke beteiligt ist und somit zum Infarktwachstum beiträgt. In in-vitro-Versuchen konnte gezeigt werden, dass PDGF-AB, ein Bestandteil der α-Granula, an Prozessen, die für die Beeinträchtigung der Blut-Hirn-Schranke verantwortlich sind, beteiligt ist. Die Sichtbarmachung von aktivierten Thrombozyten in vivo, würde wichtige Erkenntnisse über den räumlichen und zeitlichen Kontext der Aktivierung von Thrombozyten im Verlauf des Schlaganfalls liefern. Da alle aktivierenden Signalwege zum Anstieg des intrazellulären Kalziumspiegels führen, ist Kalzium ein idealer Indikator der Thrombozytenaktivierung. Um die Grenzen chemischer Kalziumindikatoren zu überwinden, wurde eine transgene Mauslinie erzeugt, welche einen endogenen Kalziumreporter speziell in Thrombozyten und Megakaryozyten exprimiert. Die Anwesenheit des Reporters hatte keine Auswirkung auf die Funktionalität der Thrombozyten und die Mäuse wurden in vivo sowie ex vivo in verschiedenen Experimenten charakterisiert. In der Folge eines ischämischen Schlaganfalles gehören Neutrophile zu den am frühesten ins Gehirn einwandernden Zellen. Dabei werden Neutrophilen sowohl günstige als auch schädliche Wirkungen auf den Verlauf des ischämischen Schlaganfalls zugeschrieben. Aus diesem Grund wurde ihre Rolle in dieser Arbeit näher untersucht. Weder die Abwesenheit von Neutrophilen noch das Fehlen der NADPH-abhängigen Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (Ncf1-/- Mäuse) beeinflussen den Ausgang eines Schlaganfalls. Im Gegensatz dazu, führte die Verhinderung der NET-Bildung (NET = neutrophil extracellular traps) in Pad4-/- Mäusen zu verringerten Infarktgrößen, was auf eine schädliche Wirkung der NETose im Zusammenhang des Schlaganfalls hinweist und somit ein therapeutisches Angriffsziel darstellen könnte. Sinusvenenthrombosen sind eine seltene Form des Schlaganfalls, die meist ohne bekannte Ursache auftreten. Während für die arterielle Thrombose ein kritischer Beitrag der Thrombozyten bekannt und weithin akzeptiert ist, ist dies für venöse Thrombosen weniger klar, wird aber immer mehr in Betracht gezogen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Fab-Fragmente des anti-CLEC-2-Antikörpers INU1 in vivo eine pathologische Aktivierung von Thrombozyten auslösen, die zu einer fulminanten Sinusvenenthrombose mit schweren neurologischen Symptomen führt. Mit Hilfe dieses neuartigen Tiermodells wurde die zusammenwirkende Signalübertragung der beiden Thrombozytenrezeptoren CLEC-2 und GPIIb/IIIa als Hauptauslöser der Sinusvenenthrombose und damit potenzielles Ziel für eine Behandlung identifiziert. KW - Schlaganfall KW - Thrombozyt KW - Maus KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Sinusthrombose KW - thrombo-inflammation KW - ischemic stroke KW - blood brain barrier KW - CVT KW - platelets Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-286727 ER - TY - THES A1 - Grünig, Sebastian T1 - Vergleich zwischen physiologisch vs. pathologischer linksventrikulärer Hypertrophie - Eine Studie an drei Mausmodellen T1 - Relation between physiological vs. pathological left ventricular hypertrophy - A study on three mouse models N2 - Herzerkrankungen sind die Haupttodesursache in den westlichen Nationen. Unter den Herzerkrankungen spielt die linksventrikuläre Hypertrophie mit Entwicklung einer Herzinsuffizienz eine tragende Rolle. In der gängigen Praxis ist es schwierig ein durch körperliches Training physiologisch hypertrophiertes Herz von einem pathologisch hypertrophierten Herz zu unterscheiden. Da sich immer mehr Menschen einem intensiven körperlichen Training unterziehen, hat die Differentialdiagnose im klinischen Alltag erhebliche therapeutische Konsequenzen. Noch herrscht Unklarheit darüber, ob eine physiologische Herzhypertrophie per se nicht auch pathologisch ist. In der vorliegenden Arbeit wurden drei experimentelle Mausmodelle der linksventrikulären Hypertrophie miteinander verglichen: 1. Pathologische Herzhypertrophie durch chronisch adrenergen Streß, bedingt durch 15 fache Überexpression des kardialen ß1- Adrenorezeptor 2. Pathologische Herzhypertrophie durch chronische Druckbelastung mittels Aortenkonstriktion (Aortenbanding) 3. Physiologische Herzhypertrophie durch Lauftraining in einem Käfiginternen Laufrad. Wir konnten zeigen, dass es bei beiden Formen der linksventrikulären Hypertrophie einerseits zu einer signifikanten Kardiomyozytenhypertrophie kommt, sich beim Vergleich mit den pathologischen Formen der Herzhypertrophie bei der physiologischen Form aber andererseits keine signifikanten Veränderungen der volumetrischen Parameter zeigen. Bei den pathologischen Formen der Herzhypertrophie kommt es zu einer interstitiellen Fibrose, die durch Erhöhung der Wandsteifigkeit zu einer Einschränkung der diastolischen Relaxation (dp/dtmin) und systolischen Kontraktion (dp/dtmax) des linken Ventrikels führt. Unsere Studie unterstreicht zudem die Hypothese, dass die Hypertrophie des Sportlers einen physiologischen Anpassungsmechanismus an eine chronische oder intermittierende Druckbelastung darstellt, wenn auch die linksventrikuläre Hypertrophie für sich alleine ein wichtiger Prädiktor für kardiale Ereignisse ist. N2 - The aim of this study was to show the relation between physiological and pathological left ventricular hypertrophy. Therefore we used three mouse models of left ventricular hypertrophy. We could show, that physiological left ventricular hypertrophy illustrates an adjustment to the chronical or intermittent exposure, whether left ventricular hypertrophy illustrates an independent predictor on cardiovascular events. KW - Herzhypertrophie KW - Maus KW - NMR-Tomographie KW - Left ventricular hypertrophy KW - NMR-tomography KW - mice Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48103 ER - TY - THES A1 - Große-Wilde, Anne T1 - Klonierung, molekulare Charakterisierung und konditionale Inaktivierung eines murinen Todesrezeptors für TRAIL (mTRAIL-R) T1 - Cloning, molecular characterization and konditional inactivation of a murine death receptor for TRAIL (mTRAIL-R) N2 - TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) ist ein Apoptose-induzierendes Mitglied der TNF-Superfamilie (TNF-SF). Bislang sind zwei humane TRAIL-Todesrezeptoren, TRAIL-R1 und TRAIL-R2, bekannt, die zur TNF-Rezeptor-Superfamilie gehören. TRAIL induziert Apoptose in einer Vielzahl von Tumorzelllinien, wohingegen die meisten primären Zellen resistent gegenüber TRAIL sind. In präklinischen Studien mit Mäusen und nichthumanen Primaten wurde keine systemische Toxizität von TRAIL nachgewiesen. Diese Beobachtungen haben beträchtliches Interesse an dem Einsatz von TRAIL zur Tumortherapie geweckt. Über die physiologische Rolle von TRAIL ist jedoch noch wenig bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war, Werkzeuge zum Studium des Apoptose-induzierenden TRAIL-Systems in Mäusen zu etablieren. Zunächst mussten das oder die murinen Homologe der beiden Apoptose-induzierenden TRAIL-Rezeptoren identifiziert werden. Dazu wurden murine TRAIL-bindende Proteine biochemisch über 2D-Gelanalysen identifiziert. Anhand einer Sequenzinformation aus einer Datenbank wurde ein muriner TRAIL-Rezeptor kloniert, der aufgrund seines biochemisch bestimmten Molekulargewichts p54_mTRAIL-R genannt wurde. Der Sequenzvergleich sowie die Funktionsanalyse von p54_mTRAIL-R ergab, dass dieser Rezeptor das funktionelle murine Homolog zu den humanen TRAIL-Todesrezeptoren TRAIL-R1 und TRAIL-R2 ist. So war p54_mTRAIL-R ebenfalls in der Lage, nach Überexpression Caspase-abhängig Apoptose zu induzieren. Wie die Transkripte der humanen TRAIL-Todesrezeptoren wurden die Transkripte von p54_mTRAIL-R in allen untersuchten Geweben detektiert. Es wurde ein lösliches p54_mTRAIL-R:Fc-Fusionsprotein hergestellt, welches zur TRAIL-Inaktivierung in vivo und in vitro verwendet werden kann. Um die physiologische Rolle des p54_mTRAIL-Rs in vivo studieren zu können, sollten mTRAIL-R-defiziente Mäuse generiert werden. Zur Modifikation des für p54_mTRAIL-R kodierenden tar-Locus wurde das Gen kloniert und charakterisiert. Um eine durch die Gendefizienz hervorgerufene eventuelle Letalität oder sekundäre kompensierende Effekte zu vermeiden, wurden mit Hilfe des Cre/loxP-Systems und des Flp/FRT-Systems konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse hergestellt. Die Werkzeuge, die in dieser Arbeit generiert wurden, wie lösliches p54_mTRAIL-R:Fc Fusionsprotein und konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse, können nun in vivo für die Erforschung der physiologischen Rolle des TRAIL-Systems sowie seines Potentials und dessen Grenzen bei der Tumortherapie benutzt werden. N2 - TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) is an apoptosis-inducing member of the tumor necrosis factor superfamily (TNF-SF). Currently two human death receptors, namely TRAIL-R1 and TRAIL-2, belonging to the TNF receptor superfamily (TNFR-SF) are known to bind TRAIL. Interestingly, TRAIL has been shown to induce apoptosis in a variety of tumor cell lines whereas most primary cells were resistant. In addition, preclinical studies with mice and nonhuman primates have indicated that TRAIL does not induce substantial systemic toxicity. These observations have raised considerable interest in the use of TRAIL in tumor therapy. Yet little is known about the physiological function of TRAIL. In order to examine the physiological function of TRAIL in vivo, the aim of this work was to establish tools to study the apoptosis-inducing TRAIL system in mice. First the murine homologue/s of the two death-inducing TRAIL receptors needed to be identified. Therefore the first aim was to biochemically identify murine TRAIL-binding proteins via 2D-gel analysis. With the help of the information from an EST sequence contained in a public database a murine TRAIL receptor was cloned, which was termed p54_mTRAIL-R due to its molecular weight as determined by biochemical analysis. Sequence comparison and functional analysis of p54_mTRAIL-R revealed that mTRAIL-R is homologous to both human TRAIL death receptors. Like its human counterparts p54_mTRAIL-R was capable of inducing apoptosis in a caspase-dependent fashion upon overexpression. As transcripts of the human TRAIL death receptors, also transcripts of p54_mTRAIL-R could be detected in all tissues examined. A soluble p54_mTRAIL-R:Fc-protein was generated, which could be used to block TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. To be able to study the physiological role of the p54_mTRAIL-R in vivo TRAIL-R deficient mice were generated. For modification of the tar-locus coding for p54_mTRAIL the gene was cloned and characterized. In order to avoid lethality or secondary complementing effects the Cre/loxP system and Flp/FRT system was used to generate conditional p54_mTRAIL-R deficient mice. The tools generated in this work as soluble p54_mTRAIL-R:Fc fusion protein and conditional p54_mTRAIL-R deficient mice can now be used in vivo to deduce the physiological role of the TRAIL system and to determine its potential and limitations for cancer therapy. KW - Maus KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Apoptosis KW - TRAIL KW - Rezeptor KW - Apoptose KW - Klonierung KW - 2D-Gel-Analyse KW - konditionale Knockout-Maus KW - TRAIL KW - receptor KW - apoptosis KW - cloning KW - 2D gel analysis KW - conditional knockout mouse Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-559 ER - TY - THES A1 - Groneberg, Dieter T1 - Funktion der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase in der glatten Muskulatur T1 - The function of NO-sensitive guanylyl cyclase in smooth muscle N2 - Die Stickstoffmonoxid (NO)-cGMP-Signalkaskade spielt eine entscheidende Rolle in der Kontrolle des glatten Muskeltonus. NO ist einer der wichtigsten vaskulären Faktoren für die Relaxation der Blutgefäße sowie für die Regulation des Blutdruckes und fungiert ebenfalls als wichtigster inhibitorischer Neurotransmitter im gastrointestinalen Trakt. Es wirkt hauptsächlich über die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC), die aus zwei Untereinheiten aufgebaut ist (α und ß). Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen führt zu einem vollständigen NO-GC-Knockout (GCKO). GCKO-Mäuse zeigen keine NO-induzierte Relaxation der vaskulären und gastrointestinalen glatten Muskulatur. Die Mäuse zeigen eine arterielle Hypertonie und eine verlängerte Magen-Darm-Transportzeit, die in eine gastrointestinale Dysfunktion mündet. Allerdings erlaubt eine vollständige Deletion der NO-GC in den Mäusen keine Identifikation des Zell- bzw. Gewebe-Typs, der für den erhöhten Blutdruck und die gastrointestinale Dysfunktion verantwortlich ist. Um die relative Beteiligung der glatten Muskelzellen an der Hypertonie und der gestörten Darm-Motilität zu bestimmen, wurden Glattmuskel-spezifische Knockout-Mäuse für die ß1-Untereinheit der NO-GC (SM-GCKO) generiert. Die SM-GCKO-Mäuse entwickelten im Verlauf der Deletion eine arterielle Hypertonie in Kombination mit einem Verlust der NO-induzierten Glattmuskelrelaxation. Diese Daten zeigen, dass die Deletion der NO-GC in den glatten Muskelzellen völlig ausreichend ist, eine Hypertonie zu erzeugen. Überraschenderweise ist die Darm-Motilität der SM-GCKO-Mäuse im Vergleich zu den WT-Mäusen unverändert. In gastrointestinaler Muskulatur exprimieren neben den glatten Muskelzellen auch die interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) die NO-GC. Mithilfe einer Cre-spezifischen Maus für ICC wurde eine Mauslinie generiert, der die NO-GC in beiden Zelltypen fehlt. Der gastrointestinale Phänotyp dieser Doppel-Knockouts ähnelt dem der totalen GCKO-Tiere: Die nitrerge Relaxation fehlt und die Magen-Darm-Transportzeit ist verlängert. Zusammenfassend führt eine Deletion der NO-GC in glatten Muskelzellen und gleichzeitig in den ICC zu einer vollständigen Unterbrechung der nitrergen Relaxation in GI Trakt. N2 - The nitric oxide (NO)-cGMP signaling pathway plays a prominent role in the control of smooth muscle tone. NO is one of the main vascular factors responsible for the relaxation of blood vessels, regulation of blood pressure and also acts as major inhibitory neurotransmitter in the gastrointestinal (GI) tract. It acts predominantly via NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) which is made up of 2 different subunits (α and ß). Deletion of the ß1 subunit in the mouse leads to a global NO-GC knockout (GCKO). GCKO mice do not reveal NO-induced relaxation of vascular and GI smooth muscle. They show hypertension and an increased gut transit time resulting in GI dysfunction. However, global deletion of NO-GC in mice does not allow identification of the cell/tissue type responsible for the elevated blood pressure and GI dysfunction. To determine the relative contribution of smooth muscle cells to the hypertension and GI dysfunction seen in NO-GC knockout mice were generated smooth muscle–specific knockout mice for the ß1 subunit of NO-GC (SM-GCKO) using a tamoxifen-inducible system. SM-GCKO animals develop hypertension over time in combination with a loss of NO-induced smooth muscle relaxation. In sum, these data provide evidence that deletion of NO-GC solely in smooth muscle is sufficient to cause hypertension. Surprisingly, NO-induced relaxation of GI smooth muscle was only slightly reduced in SM-GCKO mice and gut motility was unchanged compared to wild-type mice. Taken together, lack of NO-GC in smooth muscle cells does not impair NO induced relaxation of GI tissues or GI motility. To determine the cell type expressing NO-GC we used immunhistochemistry. We found that, in addition to smooth muscle, interstitial cells of Cajal (ICC) express NO GC. With a Cre specific mouse model for ICC we generated a mouse line lacking NO-GC in both smooth muscle and ICC. In these double knockouts we observed a phenotype similar to that seen in total GCKO mice including lack of nitrergic relaxation and increased gut transit time. In conclusion, lack of NO-GC in both SMC and ICC totally abolishes nitrergic signaling in GI tract. KW - Knockout KW - Glatte Muskulatur KW - Hypertonie KW - Motilität KW - Maus KW - knockout KW - smooth muscle KW - hypertension KW - motility KW - mouse Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67689 ER -