TY - THES A1 - Kraich, Michael T1 - Strukturelle und funktionelle Untersuchungen der Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor im Interleukin-4- und Interleukin-13-System T1 - Structural and functional studies of the interaction between ligand and receptor in the interleukin-4 and interleukin-13 system N2 - Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-13 (IL-13) sind bedeutende Regulatorproteine des Immunsystems. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und dem Verlauf von allergischen Erkrankungen, wie z.B. Asthma. Um ihre Signale in die Zielzelle zu transduzieren, kann von beiden Zytokinen der gleiche Zelloberflächenrezeptor verwendet werden, wodurch sich die überlappenden, biologischen Funktionen erklären lassen. Dieser gemeinsam genutzte Rezeptor ist aus den beiden Untereinheiten IL-4Ralpha; und IL-13Ralpha1 aufgebaut. Da IL-4 und IL-13 auf Aminosäureebene nur etwa 25% Sequenzidentität besitzen und stark unterschiedliche Affinitäten zu den beiden Rezeptorketten besitzen, stellt sich die Frage, durch welchen molekularen Erkennungsmechanismus, die Affinität und die Spezifität der Ligand-Rezeptor-Interaktion unabhängig voneinander reguliert werden kann. In dieser Arbeit gelang es, rekombinante Expressions- und Aufreinigungsstrategien für IL-13 und die extrazellulären Domänen der Rezeptorketten IL-13Ralpha1 und IL-13Ralpha2 zu entwickeln. Dadurch war es mögliche, eine breite Mutations-/Interaktionsanalyse der IL-13Ralpha1-Kette durchzuführen.Es konnte gezeigt werden, dass die N-terminale FnIII-ähnliche Domäne von IL-13Ralpha1 sowohl an der Bindung von IL-13 als auch an der Interaktion mit IL-4 beteiligt ist. Im funktionellen Bindeepitop der IL-13Ralpha1-Kette wurden die Aminosäurereste Arg84, Phe253 und Tyr321 als Hauptbindungsdeterminanten für die Interaktion mit IL-13 identifiziert. Durch die Interaktionsstudien der IL-13Ralpha1-Varianten mit IL-4 wurde gezeigt, dass diese Hauptbindungsdeterminanten auch für die niederaffine Bindung von IL-4 von größter Bedeutung sind. Die funktionellen Bindeepitope für IL-4 und IL-13 auf der IL-13Ralpha1-Kette sind nahezu identisch und überlappen in einem großen Bereich. Aufgrund der Ergebnisse aus der Mutagenesestudie war es möglich, ein Strukturmodell der extrazellulären Domäne der IL-13Ralpha1-Kette zu erstellen. Darin wird eine neuartige Orientierung der N-terminalen FnIII-Domäne und deren Beteiligung an der Ligandeninteraktion dargestellt. Mit Hilfe des Strukturmodells gelang es, neue Aminosäurerest auf der Oberfläche von IL-13 zu identifizieren, die an der Bindung zu IL-13Ralpha1 beteiligt sind, was die Relevanz des Strukturmodells weiter unterstreicht. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde versucht, den molekularen Mechanismus aufzuklären, durch den es den superagonistischen IL-4-Varianten T13D und F82D gelingt, mit dreifach höherer Affinität an die IL-4Ralpha-Kette zu binden, als wildtypischer Ligand. Durch strukturelle und funktionelle Untersuchungen wurde gezeigt, dass der Affinitätssteigerung ein indirekter Mechanismus zugrunde liegt, bei dem eine Konformationsänderung und die Fixierung der Arg85-Seitenkette von IL-4 zur Ausbildung von zusätzlichen Ligand-Rezeptor-Interaktionen führt. Das Bindeepitop zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette besitzt eine modulare Architektur aus drei unabhängig voneinander agierenden Interaktionsclustern. Bei der Interaktion von wildtypischem IL-4 mit IL-4Ralpha tragen nur zwei dieser Cluster in signifikanter Weise zur freien Bindeenergie bei. Im Falle der superagonistischen IL-4-Varianten ist jedoch auch das dritte Cluster an der Generierung von zusätzlicher, freier Bindeenergie beteiligt, wodurch die Affinität zwischen Ligand und Rezeptor erhöht wird. Damit stellt der modulare Aufbau der Interaktionsfläche zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette möglicherweise einen Mechanismus dar, über den Proteine die Affinität von Wechselwirkungen über einen großen Bereicht variieren können, ohne dabei Spezifität einzubüssen. Da IL-4 und IL-13 als interessante Zielmoleküle für die Therapie von allergischen und asthmatischen Erkrankungen erkannt worden sind, können die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Informationen über den Bindemechanismus und die Einblicke in den molekularen Charakter der Interaktion zwischen den beiden Zytokinen und ihren spezifischen Rezeptorketten dabei helfen, neuartige und hoch spezifische, inhibitorische Moleküle zu entwickeln. N2 - Interleukin-4 (IL-4) and Interleukin-13 (IL-13) are important regulatory proteins of the immune system. They play a key role in the development and the progression of allergic diseases like asthma. For signal transduction into the target cell, both cytokines can use an identical cell surface receptor, which is an explanation for many overlapping biological functions of IL-4 and IL-13. This common receptor consists of the two subunits IL-4Ralpha and IL-13Ralpha1. Because IL-4 and IL-13 share only 25% sequence identity on the amino acid sequence level and because they show very different affinities to the two receptor chains, the question has to be raised, by which molecular recognition mechanism it is possible to regulate affinity and specificity of the ligand-receptor-interaction independently. In the course of this work recombinant expression and purification strategies for IL-13 and the extracellular domains of IL-13Ralpha1 and IL-13Ralpha2 were established. Therefore it was possible to perform a broad mutagenesis and interaction analysis of the IL-13Ralpha1 chain. It was shown, that the N-terminal FnIII-like domain of IL-13Ralpha1 participates in the binding of IL-13 as well as in the interaction with IL-4. As part of the functional epitope the amino acid residues Arg84, Phe253 and Tyr321 were identified to be main binding determinants for the interaction with IL-13. By carrying out interaction studies with IL-4 it could be demonstrated, that the same residues are also from great importance for the low affinity binding of IL-4. The functional epitopes for the binding of IL-4 and IL-13 are almost identical and are overlapping in a large area. Due to the results of the mutagenesis study it was possible to generate a structural model of the extracellular domain of the IL-13Ralpha1 chain. A key feature of this model is the novel orientation of the N-terminal FnIII-like domain and its involvement in ligand binding. According to the modelled structure new residues in IL-13 could be identified, that participate in the interaction with the IL-13Ralpha1. This further underlines the relevance of the shown structural model of the extracellulardomain of the IL-13Ralpha1 chain. In a different part of this work it was tried to elucidate the molecular mechanism, which enables the super-agonistic IL-4 variants T13D and F82D bind IL-4Ralpha with three times higher affinity than wildtype IL-4. With the help of structural und functional analysis it could be shown, that an indirect mechanism leads to the gain of affinity. A conformational change in and the fixation of the Arg85 side chain in IL-4 result in the formation of additional interactions between ligand and receptor. The binding interface between IL-4 and IL-4Ralpha exhibits a modular architecture consisting of three independently acting interaction clusters. For the binding of wild-type IL-4 to the IL-4Ralpha chain only two of the three clusters contribute a significant amount to the overall free binding energy. In the case of the super-agonistic IL-4 variants all three interaction clusters are used to generate additional free binding energy and to increase the affinity between ligand and receptor. Therefore the modular design of the IL-4/IL-4Ralpha interaction interface probably represents a mechanism, which enables proteins to alter the affinity of interactions over a broad range without loosing specificity. Because IL-4 and IL-13 were discovered as promising targets for the therapy of allergic and asthmatic diseases, the acquired information about the binding mechanism and the molecular characteristics of the interaction between the cytokines IL-4 and IL-13 and their specific receptor chains may help to design novel and highly specific inhibitory molecules. KW - Renaturierung KW - Ligand KW - Biochemie KW - Interleukin 4 KW - Interleukin 13 KW - Interaktion KW - Rezeptor KW - Immunologie KW - Allergie KW - Allerg KW - Proteinbiochemie KW - BIAcore KW - Oberflächenplasmonresonanz (SPR) KW - Strukturbiologie KW - interleukin-4 KW - interleukin-13 KW - protein interaction KW - BIAcore KW - structural biology Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27655 ER - TY - THES A1 - Vögtle, Timo T1 - Studies on receptor signaling and regulation in platelets and T cells from genetically modified mice T1 - Studien zur Signaltransduktion und Regulierung von Rezeptoren in Thrombozyten und T-Zellen genetisch veränderter Mäuse N2 - Receptors with tyrosine-based signaling motifs control essential functions of hematopoietic cells, including lymphocytes and platelets. Downstream of the platelet receptor glycoprotein (GP) VI and the T cell receptor (TCR) the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) initiates a signaling cascade that involves kinases, adapter and effector proteins and finally leads to cellular activation. This thesis summarizes the results of three studies investigating different aspects of receptor signaling and regulation in platelets and T cells. In the first part, the impact of constitutive Ca2+ influx on TCR signaling and T cell physiology was investigated using a transgenic mouse line with a mutation in the Ca2+ sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1). The elevated cytoplasmic Ca2+ level resulted in an altered phosphorylation pattern of the key enzyme phospholipase (PL) Cγ1 in response to TCR stimulation, but without affecting its enzymatic activity. Withdrawal of extracellular Ca2+ or inhibition of the phosphatase calcineurin restored the normal phosphorylation pattern. In addition, there was a decrease in the release of Th2-type cytokines interleukin 4, 5 and 13 upon stimulation in vitro. The second part of the thesis deals with the role of the adapter protein growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) in platelets using a megakaryocyte/platelet-specific knockout mouse line. Loss of Grb2 severely impaired signaling of GPVI and C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2), a related hemITAM receptor. This was attributed to defective stabilization of the linker for activation of T cells (LAT) signalosome and resulted in reduced adhesion, aggregation, Ca2+ mobilization and procoagulant activity downstream of (hem)ITAM-coupled receptors in vitro. In contrast, the signaling pathways of G protein-coupled receptors (GPCRs) and the integrin αIIbβ3, which do not utilize the LAT signalosome, were unaffected. In vivo, the defective (hem)ITAM signaling caused prolonged bleeding times, however, thrombus formation was only affected under conditions where GPCR signaling was impaired (upon acetylsalicylic acid treatment). These results establish Grb2 as an important adapter protein in the propagation of GPVI- and CLEC-2-induced signals. Finally, the proteolytic regulation of the immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM)-bearing receptor CD84 in platelets was investigated. This study demonstrated that in mice CD84 is cleaved by two distinct and independent proteolytic mechanisms upon platelet activation: shedding of the extracellular part, which is exclusively mediated by a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10 and cleavage of the intracellular C-terminus by the protease calpain. Finally, the analysis of soluble CD84 levels in the plasma of transgenic mice revealed that shedding of CD84 by ADAM10 occurs constitutively in vivo. N2 - Rezeptoren mit Tyrosin-basierten Signaltransduktionsmotiven sind von fundamentaler Bedeutung für die Funktion hematopoietischer Zellen wie Lymphozyten und Thrombozyten. Unterhalb des Glykoproteins (GP) VI auf Thrombozyten und des T-Zell Rezeptors (TZR) auf T-Zellen initiiert das immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) eine Signalkaskade, die Kinasen, Adapter- und Effektorproteine mit einbezieht und schlussendlich zur Aktivierung der Zelle führt. Die hier vorgelegte Arbeit fasst die Ergebnisse dreier Studien zusammen, die sich mit verschiedenen Aspekten der Signaltransduktion und Regulation von Rezeptoren in Thrombozyten und T-Zellen befasst. Im ersten Teil wurde der Einfluss eines konstitutiven Ca2+-Einstroms auf die TZR Signalkaskade und T-Zell Funktion untersucht. Hierzu wurde eine transgene Mauslinie mit einer Mutation im Ca2+-Sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1) verwendet. Die erhöhte zytoplasmatische Ca2+-Konzentration veränderte das Phosphorylierungsmuster der Phospholipase (PL) Cγ1, ein Schlüsselenzym der Signalkaskade, nach Stimulation des TZRs. Die enzymatische Aktivität der PLCγ1 blieb hierbei jedoch unverändert. In der Abwesenheit von extrazellulärem Ca2+ oder bei Inhibition der Phosphatase Calcineurin war das Phosphorylierungsmuster hingegen wieder normal. Darüber hinaus zeigten die T Zellen nach Stimulation in vitro eine verringerte Produktion von Interleukinen des Th2-Typs (Interleukin-4, 5 und 13). Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Funktion des Adapterproteins growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) in Thrombozyten, die unter Zuhilfenahme einer Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen Knockout Mauslinie untersucht wurde. Hierbei zeigte es sich, dass der Verlust von Grb2 die Signaltransduktion von GPVI und des verwandten hemITAM-Rezeptors C type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) schwer beeinträchtigt. Dies konnte auf eine mangelnde Stabilisierung des linker for activation of T cells (LAT) Signalosoms zurückgeführt werden und resultierte in einer verminderten Adhäsion, Aggregation, Ca2+-Mobilisierung und prokoagulatorischen Aktivität nach Aktivierung (hem)ITAM gekoppelter Rezeptoren in vitro. Im Gegensatz hierzu blieben die Signaltransduktionswege G-protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) und des Integrins αIIbβ3, die das LAT Signalosom nicht nutzen, unbeeinflusst. In in vivo Studien verursachte die beeinträchtigte (hem)ITAM Signaltransduktion eine verlängerte Blutungszeit der Mäuse, während die Entstehung von Thromben nur bei gleichzeitiger Hemmung von GPCR-Signalwegen (durch Acetylsalicylsäuregabe) vermindert war. Diese Ergebnisse etablieren Grb2 als ein wichtiges Adapterprotein in der Signaltransduktionskaskade von GPVI und CLEC-2. Schließlich wurde im dritten Teil dieser Arbeit die proteolytische Regulation des Rezeptors CD84, der ein immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM) enthält, untersucht. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass CD84 in Mausthrombozyten durch zwei verschiedene und unabhängige proteolytische Mechanismen geschnitten wird: Zum einen durch Shedding des extrazellulären Teils, was ausschließlich durch die a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10 bewerkstelligt wird, und zum anderen durch das Schneiden des intrazellulären C Terminus durch die Protease Calpain. Des Weiteren zeigte eine Untersuchung von Plasmaproben transgener Mäuse, dass das Shedding von CD84 durch ADAM10 konstitutiv in vivo erfolgt. KW - Thrombozyt KW - T-Lymphozyt KW - Rezeptor KW - Signaltransduktion KW - Calcium KW - Platelet KW - Thrombose KW - T cell KW - receptor signaling KW - calcium KW - ITAM KW - Hämostase KW - Metalloproteinasen KW - Adapterprotein Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97114 ER - TY - THES A1 - Rupprecht, Daniel T1 - Synthese und Optimierung sequenzselektiver künstlicher Rezeptoren für biologisch relevante Oligopeptide T1 - Synthesis and Optimization of Sequence Selective Artificial Receptors for Biologically Relevant Oligopeptides N2 - Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung von künstlichen Rezeptoren für biologisch relevante Oligopeptide und besteht aus drei Teilen. Im ersten Teil wurde auf der Basis von computergestützten de novo Berechnungen ein künstlicher Rezeptor für den D-Alanin-D-Alanin-C-Terminus entwickelt. Diese Peptidsequenz befindet sich in bakteriellen Zellwänden und nimmt eine Schlüsselfunktion in der Wirkungsweise des Antibiotikums Vancomycin ein. Zur Entwicklung dieses Rezeptors wurde ein Guanidiniocarbonylpyrrol als Bindungsmotiv für Carboxylate mit einer Cyclotribenzylen-Einheit verknüpft. Letztere ist entsprechend der theoretischen Berechnungen in der Lage, die Methylreste des Alanins größenselektiv durch hydrophobe Wechselwirkungen zu koordinieren. Dieser Rezeptor wurde in umfangreichen Bindungsstudien bezüglich seiner Affinität in Wasser und seiner Substratselektivität untersucht. Zur Erhöhung der Löslichkeit und zur Bestimmung der Komplexstruktur mit NMR-Techniken in Wasser wurde ein weiteres Derivat des Rezeptors synthetisiert, welches in peripherer Position mit Triethylenglykolseitenketten substituiert ist. Auf diese Weise gelang es, einen hoch affinen (log K = 4,7) und hoch selektiven künstlichen Rezeptor für den D-Ala-D-Ala-Terminus darzustellen und umfassend zu charakterisieren. So konnte gezeigt werden, dass ein de novo Design derartiger Rezeptoren prinzipiell möglich ist. In einem weiteren Teilprojekt wurde ein künstlicher Rezeptor für die interne RGD-Peptidsequenz entwickelt. Diese nimmt eine zentrale Funktion in Zell-Zell- und Zell-Matrix-Erkennungsprozessen ein. Dieses Teilprojekt wurde in Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis Schrader (Universität Marburg) durchgeführt. Dazu wurde ein Bindungsmotiv für Alkylguanidine (in der Seitenkette von Arg, R) über einen geeigneten Spacer mit einem Bindungsmotiv für Carboxylate (in der Seitenkette von Asp, D) verknüpft. Nach der Synthese und Charakterisierung einer Reihe von vier Rezeptoren konnte die grundsätzliche Anwendbarkeit dieses Ansatzes bestätigt werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass der verwendete Spacer für die Effektivität der Koordinierung von besonderer Bedeutung ist. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde in einem dritten Teilprojekt ein kombinatorisches Festphasenprotokoll zur Optimierung derartiger Spacer entwickelt. Dabei wurde das Carboxylat-Bindungsmotiv (ein Guanidiniocarbonylpyrrol) auf einem polymeren Träger immobilisiert. Zu diesem Zweck wurden umfangreiche Studien zur Synthese von Pyrrol-Tricarboxylaten und zur Verwendung verschiedener Schutzgruppen unternommen. Die Eigenschaften von drei Schutzgruppen unterschiedlicher Sensitivität (basisch, stark sauer und photolytisch spaltbar) auf dem Acylguanidin wurden in Lösung und an der festen Phase untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein umfangreiches HPLC-Protokoll zur Charakterisierung der Reaktion entwickelt. So gelang die Entwicklung und Etablierung eines universell einsetzbaren Protokolls zur Optimierung derartiger Rezeptoren, womit zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten in der kombinatorischen Chemie aber auch in weiteren Teilbereichen wie der Katalyse oder der Chromatographie ermöglicht werden. N2 - The present thesis deals with the development of artificial receptors for biologically relevant peptides and consists of three parts. In the first part an artificial receptor for the D-Ala-D-Ala-D-Terminus was developed. This target plays an important role in the mode of action of the antibiotic Vancomycin. A carboxylate binding site (CBS) was synthetically combined with a cyclotribenzylene moiety. The cyclotribenzylene is capable of size selective hydrophobic coordination of the alanine methyl side chain at least according to theoretical calculations. After the synthesis the receptor was investigated regarding affinity and selectivity of target coordination in buffered aqueous media. Furthermore, a water soluble analogue with triethylene glycole substitution in peripheric position was synthesized and characterized. By this method a highly effective (log K = 4.7) and highly selective artificial receptor for D-Ala-D-Ala was developed and the usefulness of a de novo receptor design was demonstrated. In the second part an artificial receptor for the internal RGD peptide was developed, which plays an important role in cell-cell- and cell-matrix-recognition. This part was carried out in cooperation with the workgroup of Prof. Schrader (University of Marburg). Therefore, a supramolecular binding motif for alkyl guanidines (as in the side chain of Arg, R) was combined synthetically with a binding motif for carboxylates (as in the side chain of Asp, D) via a suitable spacer. After synthesis and characterization of a series of four receptors with different flexibility this concept was confirmed while lining out the particular importance of the choice of spacer. Based on these insights a solid phase protocol for optimization of such artificial receptors, especially with internal spacers, was developed in a third part. Hence, the guanidiniocarbonyl pyrrole moiety was immobilized on polymeric support. In this context extensive research aimed at the synthesis of pyrrole tricarboxylates and the use of various protective groups was performed. The chemical behavior of the protective groups of ´different sensitivity (basic, strong acidic and photolytic cleavable) for acyl guanidines was characterized in solution and on solid support. Furthermore, an N to C solid phase protocol was established. These results obtained now open the door of a wide range of applications of the CBS for receptor optimization, catalysis or chromatography. KW - Oligopeptide KW - Kombinatorische Synthese KW - Rezeptor KW - supramolekulare Chemie KW - organische Synthese KW - Bioorganik KW - kombinatorische Methodenentwicklung KW - Schutzgruppenstrategie KW - Supramolecular Chemistry KW - Organic Synthesis KW - Bioorganic Chemistry KW - Combinatorial Method Development KW - Protective Group Strategy Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20277 ER - TY - THES A1 - Projahn, Holger T1 - Synthese, Stereochemie und pharmakologische Charakterisierung von 3,7-Diazabicyclo[3.3.1]nonan Derivaten als selektive kappa-Agonisten T1 - Synthesis, stereochemistry and pharmacological characterization of 3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonane derivates as selective kappa-agonists N2 - In der vorliegenden Arbeit wird die Synthese von verschiedenen bicyclischen Substanzklassen gemäß des folgenden Syntheseschemas beschrieben. Es wurden verschiedene 2,4-di-(2-pyridyl)- oder 2,4-di-(3-fluorphenyl)-substituierte 9-Oxo-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-1,5-dicarbonsäurediester (9-Oxo-BNDS: 21-25, 27-55) synthetisiert, welche 1. teilweise als Vorstufen zur Synthese von 1,5-Di-(hydroxymethyl)-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-9-olen (Triole: 56-65) eingesetzt wurden, 2. teilweise als Vorstufen zur Synthese von 9-Hydroxy-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-1,5-dicarbonsäuredimethylestern (9-OH-BNDS: 66-69) verwendet wurden, die ihrerseits zu 9-O-Acyl-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-1,5-dicarbonsäuredimethylestern (9-OAc-BNDS: 70-76) umgesetzt wurden oder 3. als Vorstufe zur Synthese der 9-Oxo-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-1,5-dicarbonsäure 26 dienten. Die 9-Oxo-BNDS wurden aus den kommerziell erhältlichen Aceton-1,3-dicarbonsäuredimethyl- (ADS-Me), -ethylester (ADS-Et) oder den ADS 1-3 synthetisiert, die ihrerseits ausgehend von ADS-Me und den entsprechenden Alkoholen durch Umesterung hervorgehen. Die ADS wurden durch eine Mannich-Kondensation mit zwei Äquivalenten eines aromatischen Aldehyds und einem Äquivalent eines primären Amins in MeOH zu den entsprechenden 4-Piperidon-3,5-dicarbonsäureestern (PDS: 4-20) umgesetzt, die wiederum ebenfalls durch eine Mannich-Kondensation mit zwei Äquivalenten Formaldehyd und einem Äquivalent eines primären Amins in THF oder Aceton zu den entsprechenden 9-Oxo-BNDS reagieren. Dieser Syntheseschritt wurde hinsichtlich Ausbeute, Vereinfachung und Beschleunigung der Aufarbeitung optimiert. Die Stereochemie der so erhaltenen 9-Oxo-BNDS, die in Abhängigkeit vom Substitutionsmuster als cis- oder trans-Isomere entstehen, konnte mittels NMR-Spektroskopie aufgeklärt werden. Der 1,5-Dibenzylester 25 konnte durch katalytische Hydrierung mit Pd/C als Katalysator in EtOAc zur freien 1,5-Dicarbonsäure 26 umgesetzt werden. Die Triole 56-62 wurden ausgehend von den 9-Oxo-BNDS HZ2, 3FLB, 21-24, 28, 33 in einer Eintopfsynthese mittels NaBH4 in THF/MeOH durch Reduktion hergestellt. Die N3- und/oder N7-benzyl-substituierten Triole 57-59 wurden mittels katalytischer Hydrierung mit Pd/C als Katalysator in MeOH zu den entsprechenden NH-substituierten Triolen 63-65 umgesetzt. Mit Hilfe von selektiven 1D-NOESY-Messungen konnte die Stereochemie der Triole bezüglich der Stellung der Hydroxygruppe an C9 zugeordnet werden. Die 9-OH-BNDS 66-69 wurden durch Reduktion der entsprechenden 9-Oxo-BNDS HZ2, 3FLB, 32, 33 mit Na(CN)BH3 in MeOH synthetisiert. Die Reduktion verläuft nicht stereoselektiv, sodass die dabei entstehenden 9-OH-BNDS als Diastereomerengemische durch syn/anti-Isomerie der C9-OH-Gruppe anfallen. Das Diastereomerengemisch 66 konnte durch präparative Säulenchromatographie in die beiden reinen Isomere 66a (anti) und 66b (syn) getrennt werden. Das Gemisch 67 konnte durch Entwicklung einer HPLC-Methode und anschließender Übertragung auf ein Flashchromatographiesystem präparativ in die diastereomerenreinen Isomere 67a (anti) und 67b (syn) getrennt werden. Die stereochemische Zuordnung der Konfiguration an C9 wurde durch selektive 1D-NOESY-Messungen erreicht. Die Synthese der 9-OAc-BNDS 70-76 erfolgte durch Umsetzen des entsprechenden 9-OH-BNDS 66a, 67a, 67-69 mit einer äquimolaren Menge eines entsprechenden Carbonsäurechlorids und DBU als Hilfsbase in CHCl3. Im Fall der Synthese von Verbindung 76 musste das eingesetzte Decanoylchlorid mit Zinkstaub aktiviert werden. Die Zuordnung der Stereochemie der so erhaltenen Verbindungen basiert auf selektiven 1D-NOESY-Messungen. Die Verbindungen 25-27, 31, 56, 60, 63-66, 66a/b, 67, 67a/b, 70a, 71, 71a wurden auf pharmakologische Affinität zum kappa-Opioidrezeptor (OR) untersucht. Dadurch konnten die Verbindungen 71, 71a und 67a/b als hochaffine Liganden des kappa-OR identifizert werden. Durch die qualitative Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehungen, die auf dem Vergleich der pharmakologischen Daten dieser Arbeit und vorangegangener Arbeiten basiert, konnten folgende Anforderungen an selektive Liganden des kappa-OR mit 3,7-Diazabicyclo[3.3.1]nonan-Grundgerüst ermittelt werden: 1. Das Grundgerüst sollte an Position 2/4 mit 2-Pyridylresten substituiert sein. 2. An Position N3 und N7 dürfen keine Substituenten angebracht sein, die größer als ein Methylrest sind. 3. Das Molekül sollte an Position 1/5 mit Methylestergruppen versehen sein. 4. Der 3,7-Diazabicyclus kann an Position 9 eine -OH, -OAc oder möglicher-weise auch entsprechende, sterisch anspruchsvollere Funktionen besitzen. 5. Die Stellung des Substituenten an Position 9 sollte vorzugsweise anti-konfiguriert sein, bezogen auf den höher substituierten Piperidinring. N2 - The aim of the present work was the synthesis of several bicyclic compound classes as described in the following synthetic pathway. Various 2,4-di-(2-pyridyl)- or 2,4-di-(3-fluorphenyl)-substituted 9-oxo-3,7-diazabicyclo[3.3.1]-nonan-1,5-dicarboxylates (9-Oxo-BNDS: 21-25, 27-55) have been synthesized, which 1. were partially used as templates for the synthesis of 1,5-di-(hydroxymethyl)-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-9-oles (trioles: 56-65), 2. were partially used as starting compounds for the synthesis of dimethyl-9-hydroxy-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-1,5-dicarboxylates (9-OH-BNDS: 66-69), which in turn were used for the preparation of dimethyl-9-O-acyl-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-1,5-dicarboxylates (9-OAc-BNDS: 70-76), 3. served as starting compound for the synthesis of the 9-oxo-3,7-diazabicyclo-[3.3.1]nonan-1,5-dicarboxylic acid 26. The 9-Oxo-BNDS were prepared starting from the commercially available di-methyl- (ADS-Me) or diethylacetone-1,3-dicarboxylate (ADS-Et) or the ADS 1-3, which themselves were synthesized by transesterification of ADS-ME with the corresponding alcohols. The ADS were converted to the respective 4-piperidon-3,5-dicarboxylates (PDS: 4-20) by means of a Mannich-condensation with two equivalents of an aromatic aldehyde and one equivalent of a primary amine in MeOH as a solvent. The PDS were subjected to a second Mannich-condensation with two equivalents of formaldehyde and one equivalent of a primary amine in THF or acetone to form the corresponding 9-Oxo-BNDS. This step was optimized with respect to the yields, simplification and acceleration of the refurbishment. The stereochemistry of the so achieved 9-Oxo-BNDS, which can emerge as cis- or trans-isomers dependent on their substitution pattern, was elucidated by means of NMR-spectroscopy. The dibenzylcarboxylate 25 could be converted to the free dicarboxylic acid 26 by means of catalytic hydrogenation with Pd/C as catalyst in EtOAc as solvent. The trioles 56-62 were synthesized starting from the the 9-Oxo-BNDS HZ2, 3FLB, 21-24, 28, 33 in a one-pot-reduction-step by means of NaBH4 in THF/MeOH. The N3- and/or N7-benzyl-substituted trioles 57-59 were converted to the respective NH-substituted trioles 63-65 by catalytic hydrogenation with Pd/C in MeOH. The assignment of the hydroxy-group at C9 was achieved via selective 1D-NOESY measurements. The 9-OH-BNDS 66-69 were perpared by reduction of of the appropriate 9-Oxo-BNDS HZ2, 3FLB, 32, 33 with Na(CN)BH3 in MeOH. The reduction does not proceed in a stereoselective manner, which in consequence leads to the isolation of syn/anti-isomers with respect to the hydroxygroup at C9. The isomeric mixture 66 could be resolved into both pure isomers 66a (anti) and 66b (syn) by means of preparative column chromatography. The isomeric mixture 67 was separated in order to obtain the pure isomers 67a (anti) and 67b (syn) by preparative flash-chromatography. The stereochemical assignment of the hydroxygroup at C9 was accomplished by selective 1D-NOESY measurements. The synthesis of the 9-OAc-BNDS 70-76 was carried out by reaction of the respective 9-OH-BNDS 66a, 67a, 67-69 with an equimolar amount of the congruent acylchloride and DBU as an auxilary base in CHCl3. In the case of compound 76 the deployed decanoylchloride had to be activated with zinc dust. The stereochemical assignment of the so obtained compounds is based on selective 1D-NOESY measurements. The compounds 25-27, 31, 56, 60, 63-66, 66a/b, 67, 67a/b, 70a, 71, 71a were investigated with respect to their pharmacological affinity to the kappa-opioid receptor (OR). Compounds 71, 71a and 67a/b were identified to be highly affine ligands to the kappa-OR. By means of the analysis of structure-affinity-relationships, which are based upon the comparison of the pharmacological data of the present work and previous findings, the following prerequisites for high affinity towards the kappa-OR were derived for compounds bearing the 3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-skeleton: 1. The skeleton at position 2/4 should be substituted by 2-pyridyl moieties. 2. No substituents being larger than a methyl-group should be attached to the nitrogens N3 and N7. 3. The molecule should carry a methyl carboxylate at positions 1/5. 4. The 3,7-diazabicycle may possess a -OH, -OAc or probably a respective, even sterically larger substituent at position 9. 5. The orientation of the substituent at position 9 should be preferably of anti-configuration according to the higher substituted piperidine ring. KW - Opioide KW - Rezeptor KW - Diazabicyclononanone KW - Chemische Synthese KW - Stereochemie KW - Synthese KW - Pharmakologie KW - Opioide KW - Kappa KW - Diazabicyclononan KW - Synthesis KW - Pharmacology KW - Opioids KW - Kappa KW - Diazabicyclononane Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14072 ER - TY - THES A1 - Schartner, Christoph T1 - The regulation of corticotropin releasing hormone receptor 1 gene expression and its role in panic disorder T1 - Die Regulation der Corticotropin Releasing Hormon Rezeptor 1 Genexpression und ihre Rolle bei der Panikstörung N2 - Panic Disorder (PD) is characterized by unexpected, recurrent panic attacks, which are not restricted to certain situations, medication or stimuli. Like other anxiety disorders, PD is a multifactorial disorder and develops through the interaction of genetic and environmental risk factors. Despite an estimated heritability of up to 48%, no distinct genetic mechanism could be revealed yet. A dysregulation of the stress response has been shown in patients with PD and several studies could find an association of components of the corticotropin-releasing factor (CRF) system with PD. The corticotropin releasing hormone receptor 1 (CRHR1) is the main receptor of CRF in the brain and thus a crucial regulator of cerebral CRF signaling. Recent genetic studies found an association of certain CRHR1 single nucleotide polymorphisms (SNPs) with PD and other anxiety disorders. Among the associated CRHR1 SNPs, rs17689918 showed further evidence in a multilevel study regulating CRHR1 gene expression in panic-relevant brain regions and affecting brain activation in fMRI experiments, as well as flight behavior in a behavioral avoidance task (Weber et al, 2015). Here, we aimed to investigate the underlying neurogenetic and neurobiological mechanisms, by which the rs17689918 risk allele affects CRHR1 gene expression and receptor function, and its putative function in the pathophysiology of PD. Due to its intronic position and the predicted change of splicing regulatory elements by the risk allele of rs17689918, the expression of alternative spliced CRHR1 isoforms was investigated using quantitative real-time PCR (qPCR) in a human post-mortem brain tissue sample. Of eight known CRHR1 isoforms, expression of three CRHR1 isoforms and the CRHR1-IT1-CRHR1 readthrough transcript variant 5 – all expressing the seven transmembrane domains needed for functional receptors – was analyzed. Subsequently, electrophysiological assays were developed to measure the receptor activity of differentially expressed CRHR1 isoforms via co-expressed Kir2.3 potassium channels in vitro. In a second approach, possible epigenetic regulation of CRHR1 expression by rs17689918 was investigated by analyses of DNA methylation patterns of a CpG Island within the CRHR1 promoter region, firstly in a case-control sample for PD and secondly in a healthy control sample, separated in high and low anxious individuals. To investigate a possible gene × epigene × environment interaction, the impact of early life stress by means of childhood trauma was evaluated via the childhood trauma questionnaire (CTQ). Finally, consequences of differential DNA methylation of the CRHR1 promoter region on gene expression were investigated by luciferase-based reporter gene assays in vitro. The expression of CRHR1β was significantly decreased in amygdalae and midbrains of risk allele carriers. The expression of CRHR1-IT1-CRHR1 readthrough transcript variant 5 was significantly increased in forebrains and midbrains of risk allele carriers. All other analyzed isoforms showed no differences in expression between non-risk and risk allele carriers of rs17689918. The electrophysiological recordings of membrane potential showed an activation of Kir2.3 channels by CRHR1β in contrast to an inconsistent mix of activation and inhibition of Kir2.3 by the main isoform CRHR1α. DNA methylation of the CRHR1 promoter region was significantly reduced in panic disorder patients, as well as in high anxious individuals of an independent healthy control sample, but no direct relation to the rs17689918 risk allele could be discerned. However, the combination of carrying the risk allele, low DNA methylation and high CTQ scores lead to increased sum scores in the Beck Anxiety Inventory (BAI) in healthy individuals. Functional analyses revealed an activation of gene expression by decreased DNA methylation of the promoter region in vitro. Our results revealed that rs17689918 regulates CRHR1 function by increasing the expression of alternative transcript variants with altered function. Our analyses of DNA methylation revealed decreased methylation as a new risk factor for panic disorder and high anxious behavior, which in combination with other risk factors like childhood trauma and the rs17689918 risk allele might further increase cognitive and somatic anxiety symptoms. This supports the role of CRHR1 as a plasticity gene of anxiety behavior, i.e. a gene that is highly regulated by epigenetic or post-transcriptional mechanisms in response to environmental stressors. By its role in CRF signaling, the dysregulation of CRHR1 might extensively affect the stress response and contribute to the pathophysiology of stress-related disorders like PD. The understanding of the underlying mechanisms, especially the genetic and epigenetic regulation, would however enhance CRHR1 as a target of improved future therapeutics for PD and other anxiety disorders. N2 - Die Panikstörung manifestiert sich durch unerwartete, wiederkehrende Panikattacken, welche sich nicht auf bestimmte Situationen, Medikationen oder Stimuli zurückführen lassen. Bei der Panikstörung handelt es sich, wie bei allen psychischen Erkrankungen, um eine sogenannte multifaktorielle Erkrankung, d.h. sie entwickelt sich aus einem Zusammenspiel von genetischen Faktoren und Umweltfaktoren. Trotz einer geschätzten Heritabilität von bis zu 48% ist bisher kein eindeutiger genetischer Mechanismus bekannt, der zur Entwicklung einer Panikstörung führt. Mehrere Studien konnten eine Fehlregulation der Stressantwort bei Patienten mit Panikstörung feststellen. Dabei konnten mehrfach Polymorphismen in Genen des Corticotropin-Releasing Faktor (CRF) Systems mit Panikstörung assoziiert werden. Insbesondere der Hauptrezeptor von CRF im Gehirn, der Corticotropin Releasing Hormon Rezeptor 1 (CRHR1), konnte in mehreren Studien mit Panikstörung und anderen Angsterkrankungen assoziiert werden. In einer kürzlich erschienenen Studie wurde gezeigt, dass der CRHR1 Einzelnukleotid-Polymorphismus rs17689918 die Genexpression von CRHR1 in Gehirnregionen reguliert, die auch in Angsterkrankungen eine Schlüsselrolle spielen. Zusätzlich zeigten Risikoallelträger eine veränderte Gehirnaktivierung in fMRT Experimenten und ein verändertes Fluchtverhalten in einem Verhaltenstest (Weber et al, 2015). In der vorliegenden Studie wurden die zugrundeliegenden neurogenetischen und neurobiologischen Mechanismen untersucht, anhand derer das Risikoallel von rs17689918 die CRHR1 Genexpression und Rezeptorfunktion beeinflusst, und welche Rolle diese in der Pathophysiologie der Panikstörung spielen. Aufgrund der Position von rs17689918 im Intron von CRHR1 und der in silico berechneten Änderung der Erkennungssequenz für Spleißregulatoren durch das Risikoallel von rs17689918 wurde die Expression alternativer Spleißformen von CRHR1 mittels quantitativer real-time PCR in humanen post-mortem Gehirnproben analysiert. Insgesamt wurde die Expression von vier CRHR1 Isoformen und die Expression der CRHR1-IT1-CRHR1 readthrough Transkriptvariante 5 analysiert. Für funktionelle Analysen wurden elektrophysiologische Assays entwickelt, um durch die Messung der Aktivität von ko-exprimierten Kir2.3 Kaliumkanälen die Rezeptoraktivität der CRHR1 Isoformen in vitro bestimmen zu können. Zusätzlich wurde eine mögliche epigenetische Regulation der CRHR1 Genexpression durch rs17689918 untersucht. Hierfür wurden DNA Methylierungsmuster eines Abschnittes einer CpG-Insel im Promoterbereich des CRHR1 Gens in einer Fall-Kontroll-Stichprobe für Panikstörung und einer weiteren gesunden Kontrollstichprobe – unterteilt in eine hoch-ängstliche und eine niedrig-ängstliche Gruppe – analysiert. Um mögliche Gen-Epigen-Umweltinteraktionen zu untersuchen, wurde zusätzlich der Einfluss belastender Lebensereignisse in frühen Lebensabschnitten mittels dem Childhood Trauma Questionnaire (CTQ) erfasst. Die Funktionalität von differenziell methylierten Abschnitten der CRHR1 Promoterregion wurde mittels Luziferase-basierten Reportergenassays in vitro untersucht. Die Ergebnisse der Expressionsanalyse zeigen eine signifikant verminderte Expression der Isoform CRHR1β in Amygdala- und Mittelhirnproben von Risikoallelträgern. Gleichzeitig war CRHR1-IT1-CRHR1 Transkriptvariante 5 in Vorderhirn- und Mittelhirnproben von Risikoallelträgern signifikant höher exprimiert. Alle anderen Isoformen zeigten keinen Expressionsunterschied zwischen Risiko- und Nicht-Risikoallelträgern von rs17689918. Elektrophysiologische Messungen des Membranpotentials fanden eine Aktivierung der ko-exprimierten Kir2.3 Kanäle durch Isoform CRHR1β, im Gegensatz zu einer inkonsistenten Regulation aus Aktivierung und Inhibition der Kanäle durch die Hauptvariante CRHR1α. Patienten mit Panikstörung zeigten eine geringere DNA-Methylierung der CRHR1 Promoterregion im Vergleich zu gesunden Kontrollen. Gleichzeitig haben hoch-ängstliche gesunde Probanden eine geringere DNA Methylierung der CRHR1 Promoterregion als weniger ängstlichen Probanden. Allerdings konnte kein Einfluss von rs17689918 auf die DNA-Methylierung gefunden werden. Probanden mit einer Akkumulation von Risikofaktoren wie dem Risikoallel von rs17689918, geringer DNA-Methylierung und hohen CTQ-Werten erreichen außerdem höhere Summenwerte im BAI. Die funktionellen Analysen zeigten eine Aktivierung der Genexpression infolge einer geringen DNA-Methylierung der differenziell methylierten CpG-Stellen. Die Ergebnisse zeigen, dass rs17689918 die Funktion von CRHR1 durch eine Verschiebung der Expression zu alternativen, weniger oder nicht-funktionellen Spleißvarianten steuert. Zusätzlich zeigen die Analysen, dass eine verringerte DNA-Methylierung der CRHR1 Promoterregion ein Risikofaktor für Panikstörung und erhöhtes Angstverhalten ist, welcher in Kombination mit weiteren Risikofaktoren wie Kindheitstraumata oder dem rs17689918 Risikoallel ängstliche Verhaltenszüge begünstigt. Dies unterstützt die Hypothese, dass CRHR1 die Funktion eines sogenannten „Plastizitätsgens“ für ängstliches Verhalten und Angsterkrankungen hat, d.h. ein Gen dessen Expression durch epigenetische und posttranskriptionale Modulation in Reaktion auf Umwelteinflüsse reguliert wird. Durch seine wichtige Funktion im CRF-Signalweg könnte eine Fehlregulation von CRHR1 einen weitreichenden Einfluss auf die humane Stressantwort haben und somit auch zur Pathophysiologie von stress-bedingten Erkrankungen wie Panikstörung beitragen. Das Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen, besonders der genetischen und epigenetischen Regulation, würde dazu beitragen CRHR1 als möglichen Ansatzpunkt zukünftiger Therapien für Panikstörung und anderen Angsterkrankungen zu erschließen. KW - Panic Disorder KW - CRHR1 KW - Corticoliberin KW - Rezeptor KW - Paniksyndrom Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-150586 ER - TY - THES A1 - Subbarayal, Prema T1 - The role of human Ephrin receptor tyrosine kinase A2 (EphA2) in Chlamydia trachomatis infection T1 - Die Rolle der humanen Rezeptor-Tyrosinkinase EphrinA2 (EphA2) in der Chlamydia trachomatis Infektion N2 - Chlamydia trachomatis (Ctr), an obligate intracellular gram negative human pathogen, causes sexually transmitted diseases and acquired blindness in developing countries. The infectious elementary bodies (EB) of Ctr involved in adherence and invasion processes are critical for chlamydial infectivity and subsequent pathogenesis which requires cooperative interaction of several host cell factors. Few receptors have been known for this early event, yet the molecular mechanism of these receptors involvement throughout Ctr infection is not known. Chlamydial inclusion membrane serves as a signaling platform that coordinates Chlamydia-host cell interaction which encouraged me to look for host cell factors that associates with the inclusion membrane, using proteome analysis. The role of these factors in chlamydial replication was analyzed by RNA interference (RNAi) (in collaboration with AG Thomas Meyer). Interestingly, EphrinA2 receptor (EphA2), a cell surface tyrosine kinase receptor, implicated in many cancers, was identified as one of the potential candidates. Due to the presence of EphA2 in the Ctr inclusion proteome data, I investigated the role of EphA2 in Ctr infection. EphA2 was identified as a direct interacting receptor for adherence and entry of C. trachomatis. Pre-incubation of Ctr-EB with recombinant human EphA2, knockdown of EphA2 by siRNA, pretreatment of cells with anti-EphA2 antibodies or the tyrosine kinase inhibitor dasatinib significantly reduced Ctr infection. This marked reduction of Ctr infection was seen with both epithelial and endothelial cells used in this study. Ctr activates EphA2 upon infection and invades the cell together with the activated EphA2 receptor that interacts and activates PI3K survival signal, promoting chlamydial replication. EphA2 upregulation during infection is associated with Ctr inclusion membrane inside the cell and are prevented being translocated to the cell surface. Ephrins are natural ligands for Ephrin receptors that repress the activation of the PI3K/Akt pathway in a process called reverse signaling. Purified Ephrin-A1, a ligand of EphA2, strongly interferes with chlamydial infection and normal development, supporting the central role of these receptors in Chlamydia infection. Overexpression of full length EphA2, but not the mutant form lacking the intracellular cytoplasmic domain, enhanced PI3K activation and Ctr infection. Ctr infection induces EphA2 upregulation and is mediated by activation of ERK signaling pathway. Interfering with EphA2 upregulation sensitizes Ctr-infected cells to apoptosis induced by tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) suggesting the importance of intracellular EphA2 signaling. Collectively, these results revealed the first Ephrin receptor “EphA2” that functions in promoting chlamydial infection. In addition, the engagement of a cell surface receptor at the inclusion membrane is a new mechanism how Chlamydia subverts the host cell and induces apoptosis resistance. By applying the natural ligand Ephrin-A1 and targeting EphA2 offers a promising new approach to interfere with Chlamydia infection. Thus, the work provides the evidence for a host cell surface tyrosine kinase receptor that is exploited for invasion as well as for receptor-mediated intracellular signaling to facilitate the chlamydial replication. N2 - Chlamydia trachomatis (Ctr) ist ein obligat intrazellulär lebendes Gram negatives Bakterium, das Geschlechtskrankheiten verursachen kann. In Entwicklungsländern führt es zudem häufig zu erworbener Blindheit. Die infektiösen Elementarkörper (EB) sind für die Anheftung an die Wirtszelle sowie die Aufnahme von Ctr in die Wirtzelle verantwortlich. Dies ist ein wichtiger Schritt, da nur so die sich anschließende Krankheitsentwicklung stattfinden kann. Diese ist auch abhängig vom engen Zusammenspiel der Ctr Proteine mit den Wirtszellfaktoren. Obgleich dieser Schritt so wichtig ist, wurden erst wenige Wirtszellrezeptoren gefunden und welche Rolle diese Rezeptoren im weiteren Verlauf der Infektion spielen, ist noch nicht richtig verstanden. Die chlamydiale Inklusionsmembran fungiert als Signalplattform, die das Zusammenspiel von Chlamydien und Wirtszelle koordiniert. In dieser Arbeit wurden die Wirtszellproteine, die an der Inklusionsmembran lokalisiert sind, mit Hilfe einer Proteomanalyse identifiziert. Anschließend wurde die Rolle dieser Proteine bei der Chlamydienvermehrung in einem RNAi screen untersucht (in Zusammenarbeit mit der AG Thomas Meyer). Hier wurde überraschenderweise der EphrinA2 Rezeptor, eine sich auf der Oberfläche der Zellen befindliche Rezeptor Tyrosin Kinase, die vor allem mit Krebs in Verbindung gebracht wird, als ein potentieller Kandidat identifiziert. Da die Proteomdaten gezeigt haben, dass EphrinA2 an der Inklusionsmembran lokalisiert ist, wurde die Rolle von EphrinA2 während der Ctr Infektion hier näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass EphrinA2 ein direkter Rezeptor für Ctr ist, der sowohl die Adhärenz als auch die Aufnahme von Ctr in die Wirtszelle bewerkstelligt. Vorinkubation von Ctr- EB mit rekombinantem menschlichen EphrinA2, das herunterregulieren von EphrinA2 mit Hilfe einer siRNA oder das Vorinkubieren der menschlichen Zelle mit Antikörpern gegen EphrinA2 oder dem Tyrosinkinase Inhibitor Dasatinib, reduzierten die Ctr Infektion signifikant. Diese drastische Reduktion der Ctr Infektion wurde sowohl in Epithelzellen als auch in Endothelzellen beobachtet. Ctr aktiviert EphrinA2 während der Infektion und invadiert die Wirtszelle zusammen mit dem aktivierten Rezeptor, dieser interagiert mit dem aktivierten PI3K Überlebenssignal, was die Replikation der Chlamydien ermöglicht. An der Inklusionsmembran akkumuliert EphrinA2, da der Transport von neuem Rezeptor zur Zellmembran unterbunden ist. Ephrine sind die natürlichen Liganden der Ephrinrezeptoren, sie unterdrücken die Aktivierung des PI3K/Akt Signalweges in einem Prozess, der reverse Signalübertragung genannt wird. Aufgereinigtes Ephrin-A1, ein Ligand des EphrinA2 Rezeptors, verhindert eine normale Chlamydieninfektion, was eine zentrale Rolle dieses Rezeptors weiterhin bestätigt. Die Überexpression von EphrinA2, erhöhte die PI3K Aktivierung und Ctr Infektion. Dies war nicht der Fall, wenn eine Mutante, der die intrazelluläre Domäne fehlt, überexprimiert wurde. Eine Ctr Infektion induziert die Hochregulierung von EphrinA2, welche durch die Aktivierung des ERK Signalwegs bewerkstelligt wird. Wenn die Hochregulierung von EphrinA2 verhindert wird, werden Ctr infizierte Zellen sensitiver für Apoptose induziert durch tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), was ein weiter Hinweis für die Bedeutung der intrazellulären EphrinA2 Signalübermittlung ist. Insgesamt haben diese Ergebnisse den ersten Ephrin Rezeptor "EphA2" offenbart, der in der Förderung chlamydialer Infektionen fungiert. Hinzu kommt, dass die Bindung eines Oberflächenrezeptors an die Inklusionsmembran ein neuer Mechanismus ist, die Wirtszelle zu verändern und eine Apoptoseresistenz in der Zelle zu induzieren. Die Zugabe des natürlichen Liganden Ephrin-A1 eröffnet eine neue vielversprechende Möglichkeit Chlamydieninfektionen zu bekämpfen. Daher liefert diese Arbeit erste Hinweise, das eine Wirtszelltyrosinkinase, die sich an der Zelloberfläche befindet, notwendig ist für die Invasion und die intrazelluläre Signalübermittlung, welche für die chlamydiale Replikation notwendig ist, essentiell ist. KW - Chlamydia trachomatis KW - ctr KW - Ephrine KW - Rezeptor KW - endocytosis KW - Ephrin ligand KW - chlamydia KW - signalling KW - PI3K KW - EphA2 Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114778 ER - TY - THES A1 - May, Frauke T1 - The role of the (hem)ITAM-coupled receptors C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) and Glycoprotein (GP) VI for platelet function: in vitro and in vivo studies in mice T1 - Die Rolle der (hem)ITAM-gekoppelten Rezeptoren C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) und Glykoprotein (GP) VI in der Thrombozytenfunktion: in vitro- und in vivo-Studien in Mäusen N2 - Die Thrombozytenaktivierung und –adhäsion sowie die nachfolgende Thrombusbildung ist ein essentieller Prozess in der primären Hämostase, der aber auch irreversible Gefäßverschlüsse und damit Herzinfarkt oder Schlaganfall verursachen kann. Erst kürzlich wurde beschrieben, dass der C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) auf der Thrombozytenoberfläche exprimiert wird, jedoch wurde für diesen Rezeptor noch keine Funktion in den Prozessen der Hämostase und Thrombose gezeigt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von CLEC-2 in der Thrombozytenfunktion und Thrombusbildung im Mausmodel untersucht. In dem ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Behandlung von Mäusen mit dem neu generierten monoklonalen Antikörper INU1, der gegen murines CLEC-2 gerichtet ist, zu dem vollständigen und hochspezifischen Verlust des Rezeptors in zirkulierenden Thrombozyten führte, ein Prozess, der als „Immundepletion“ bezeichnet wird. Die CLEC-2-defizienten Thrombozyten waren nicht mehr durch den CLEC-2-spezifischen Agonisten Rhodozytin aktivierbar, während die Aktivierung durch alle anderen getesteten Agonisten nicht beeinträchtigt war. Dieser selektive Defekt führte unter Flussbedingungen ex vivo zu stark verminderter Aggregatbildung der Thrombozyten. Außerdem zeigten in vivo-Thrombosestudien, dass die gebildeten Thromben instabil waren und vermehrt embolisierten. Infolgedessen war die CLEC-2 Defizienz mit einem deutlichen Schutz vor arterieller Thrombose verbunden. Außerdem ließ die in INU1-behandelten Mäusen beobachtete variable Verlängerung der Blutungszeit auf einen moderaten hämostatischen Defekt schließen. Diese Ergebnisse zeigen zum ersten Mal, dass CLEC-2 in vitro und in vivo signifikant zur Thrombusstabilität beiträgt und eine essentielle Rolle in der Hämostase und arteriellen Thrombose spielt. Daher stellt CLEC-2 eine potentiell neue antithrombotische Zielstruktur dar, die in vivo inaktiviert werden kann. Diese in vivo-Herabregulierung von Thrombozytenoberflächenrezeptoren könnte einen vielversprechenden Ansatz für zukünftige antithrombotische Therapien darstellen. Der zweite Teil dieser Arbeit behandelte den Effekt einer Doppelimmundepletion der immunoreceptor tyrosine-based activation motiv (ITAM)- und hemITAM-gekoppelten Rezeptoren Glykoprotein (GP) VI und CLEC-2 auf Hämostase und Thrombose mittels einer Kombination der GPVI- beziehungsweise CLEC-2-spezifischen Antikörper JAQ1 und INU1. Eine Einzeldepletion von GPVI oder CLEC-2 in vivo beeinträchtigte nicht die Expression und Funktion des jeweils anderen Rezeptors. Eine gleichzeitige Behandlung mit beiden Antikörpern führte jedoch zu dem nachhaltigen Verlust der GPVI- und CLEC-2-vermittelten Signale in Thrombozyten, während andere Signalwege nicht betroffen waren. Im Gegensatz zu den Einzeldefizienzen, wiesen die GPVI/CLEC-2 doppeldefizienten Mäuse einen schwerwiegenden Blutungsphänotyp auf. Außerdem führte die Behandlung zu einer starken Beeinträchtigung der arteriellen Thrombusbildung, die die Effekte der Einzeldefizienzen weit übertraf. Von Bedeutung ist auch, dass gleiche Ergebnisse in Gp6-/- Mäusen gefunden wurden, die mittels INU1-Behandlung CLEC-2-depletiert wurden. Dies veranschaulicht, dass der Blutungsphänotyp nicht durch Sekundäreffekte der kombinierten Antikörperbehandlung hervorgerufen wurde. Diese Daten deuten darauf hin, dass GPVI und CLEC-2 sowohl unabhängig voneinander als auch gleichzeitig in vivo von der Thrombozytenoberfläche herabreguliert werden können und lassen unerwartete redundante Funktionen der beiden Rezeptoren in Hämostase und Thrombose erkennen. Da beide Rezeptoren, GPVI und CLEC-2, als neue antithrombotische Zielstrukturen diskutiert werden, könnten diese Ergebnisse wichtige Auswirkungen auf die Entwicklung von anti-GPVI oder anti-CLEC-2-basierenden Antithrombotika haben. N2 - Platelet activation and adhesion results in thrombus formation that is essential for normal hemostasis, but can also cause irreversible vessel occlusion leading to myocardial infarction or stroke. The C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) was recently identified to be expressed on the platelet surface, however, a role for this receptor in hemostasis and thrombosis had not been demonstrated. In the current study, the involvement of CLEC-2 in platelet function and thrombus formation was investigated using mice as a model system. In the first part of the thesis, it was found that treatment of mice with a newly generated monoclonal antibody against murine CLEC-2 (INU1) led to the complete and highly specific loss of the receptor in circulating platelets (a process termed “immunodepletion”). CLEC-2-deficient platelets were completely unresponsive to the CLEC-2-specific agonist rhodocytin, whereas activation induced by all other tested agonists was unaltered. This selective defect translated into severely decreased platelet aggregate formation under flow ex vivo; and in vivo thrombosis models revealed impaired stabilization of formed thrombi with enhanced embolization. Consequently, CLEC-2 deficiency profoundly protected mice from occlusive arterial thrombus formation. Furthermore, variable bleeding times in INU1-treated mice indicated a moderate hemostatic defect. This reveals for the first time that CLEC-2 significantly contributes to thrombus stability in vitro and in vivo and plays a crucial role in hemostasis and arterial thrombosis. Thus, CLEC-2 represents a potential novel anti-thrombotic target that can be functionally inactivated in vivo. This in vivo down-regulation of platelet surface receptors might be a promising approach for future anti-thrombotic therapy. The second part of the work investigated the effect of double-immunodepletion of the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)- and hemITAM-coupled receptors, platelet glycoprotein (GP) VI and CLEC-2, on hemostasis and thrombosis using a combination of the GPVI- and CLEC-2-specific antibodies, JAQ1 and INU1, respectively. Isolated targeting of either GPVI or CLEC-2 in vivo did not affect expression or function of the respective other receptor. However, simultaneous treatment with both antibodies resulted in the sustained loss of GPVI and CLEC-2 signaling in platelets, while leaving other activation pathways intact. In contrast to single deficiency of either receptor, GPVI/CLEC-2 double-deficient mice displayed a dramatic hemostatic defect. Furthermore, this treatment resulted in profound impairment of arterial thrombus formation that far exceeded the effects seen in single-depleted animals. Importantly, similar results were obtained in Gp6-/- mice that were depleted of CLEC-2 by INU1-treatment, demonstrating that this severe bleeding phenotype was not caused by secondary effects of combined antibody treatment. These data suggest that GPVI and CLEC-2 can be independently or simultaneously down-regulated in platelets in vivo and reveal an unexpected functional redundancy of the two receptors in hemostasis and thrombosis. Since GPVI and CLEC-2 have intensively been discussed as potential anti-thrombotic targets, these results may have important implications for the development of novel, yet save anti-GPVI or anti-CLEC-2-based therapies. KW - Thrombozyt KW - Rezeptor KW - Thrombose KW - Biologie KW - Zelle KW - Biology KW - Cell Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65383 ER - TY - THES A1 - Rebhan, Benjamin T1 - Untersuchung des Blutdrucks und der Endothelfunktion ETB-Rezeptor-defizienter Mäuse unter Salz-angereicherter Diät T1 - Endothelin B receptor-deficient mice develop endothelial dysfunction independently of salt loading N2 - ETB-Rezeptoren nehmen innerhalb der endothelialen Regulationsprozesse eine zentrale Rolle ein. In der vorliegenden Arbeit wurde der Frage nachgegangen, welchen Einfluss eine Salzbelastung auf den Blutdruck und die vaskuläre Funktion von ETB-Rezeptor-Knockout-Mäusen hat. In diesem Zusammenhang wurden männliche ETB-Rezeptor-Knockout-Mäuse parallel mit Wildtyp-Kontroll-Mäusen 15 Tage lang mit Standard- bzw. salzreichem Futter gehalten. Der systolische Blutdruck wurde ebenfalls dokumentiert. Nach 15 Tagen wurde den narkotisierten Tieren die Aorta descendens entnommen. An isolierten Aortenringen wurden in der Organkammer die Endothel-abhängige und -unabhängige vaskuläre Funktion untersucht. Die ETB-Rezeptor defizienten Mäuse bleiben – unter einer Haltung mit Standardfutter – normotensiv. Eine Hypertonie entwickeln die Tiere erst bei Verabreichung von salzreichem Futter. Die Endothel-abhängige Gefäßfunktion ist jedoch nicht nur bei den hypertensiven Tieren verändert, sondern bei allen ETB-Rezeptor defizienten Mäusen – unabhängig von Salzgehalt der Nahrung und Blutdruck. N2 - The ETB receptor is involved in endothelial function. In the present study, we analysed whether salt alters endothelial function in rescued ETB receptor-deficient mice. Adult ETB-deficient mice were kept in parallel with wild-type control animals for 15 days on standard or salt-enriched chow, respectively. Systolic blood pressure was measured also and endothelium-dependent and endothelium-independent vascular function was assessed in isolated aortic rings. Systolic blood pressure increased on salt-enriched chow in ETB receptor-deficient mice, but neither in wild-type mice on high-salt diet nor in ETB receptor-deficient mice on standard chow. KW - Hypertonie KW - Rezeptor KW - Mäuse KW - Aorta KW - Endothelin KW - Salz KW - ETB-Rezeptor KW - knockout-Mäuse KW - salzinduziert KW - Herzfrequenz KW - normotensiv KW - Schwanmessmethode KW - ETB-receptor KW - knockout mice KW - salt-dependend KW - hearrate KW - normotensive KW - tail cuff method Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51972 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Johann T1 - Wasserstoffbrückengesteuerte Ausrichtung von Merocyaninfarbstoffen für photorefraktive Materialien T1 - Hydrogen-Bond-Directed Orientation of Merocyanine Dyes for Photorefractive Materials N2 - Merocyaninchromophore spielen eine herausragende Rolle bei der Entwicklung von photorefraktiven Materialien für Anwendungen in der Holographie. Der photorefraktive Effekt beruht auf einer Orientierung der dipolaren Merocyanine in einem elektrischen Feld. Diese können umso effektiver ausgerichtet werden, je größer ihr Dipolmoment ist. Folglich sollten Merocyanine mit sehr großen Dipolmomenten den gewünschten Effekt hervorbringen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass solche Merocyanine Dimere mit antiparalleler zentrosymmetrischer Struktur bilden. In dieser Anordnung addieren sich die Dipolmomente destruktiv, so dass die dipolare Eigenschaft des Materials verloren geht. In dieser Arbeit ist es gelungen, Merocyanine über sechsfache Wasserstoffbrückenbindungen zu supramolekularen Strukturen mit großen resultierenden Dipolmomenten zu assoziieren. Diese Komplexe werden in schwach polaren Lösungsmitteln sogar bei sehr niedrigen Farbstoffkonzentrationen gebildet. N2 - Merocyanine dyes play a major role in the development of photorefractive materials to be applied in holography. The photorefractive effect is based on the orientation of dipolar merocyanine dyes by an external electric field. Merocyanine dyes with very high dipole moments are supposed to be the most suitable for achieving an optimal effect because, with increasing dipole moment, a higher degree of orientation can be achieved are the more efective is the their orientation. However, strongly dipolar merocyanine dyes form antiparallel dimers with vanishing dipole moment due to their dipolar interaction. Thus, the dimers can not be oriented by an electric field. In this thesis, merocyanine dyes were successfully assembled through six-fold hydrogen-bonding into supramolecular structures with large resulting dipole moments. In less polar solvents, these complexes are formed even at very low dye concentration. KW - Merocyanine KW - Wasserstoffbrückenbindung KW - Supramolekulare Chemie KW - Ausrichtung KW - Polymethinfarbstoff KW - Rezeptor KW - Dipolmoment KW - Dipol-Dipol-Wechselwir KW - Hamilton-Rezeptor KW - Merocyanine Dye KW - Hydrogen-Bond KW - Orientation KW - Supramolecular Chemistry KW - Synthesis Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27156 ER -