TY - THES A1 - Kober, Christina T1 - Characterization of Murine GL261 Glioma Models for Oncolytic Vaccinia Virus Therapy T1 - Charakterisierung onkolytischer Vaccinia Virus Therapie in murinen Gliommodellen N2 - Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most frequent and malignant forms of brain cancer in adults. The prognosis is poor with a median survival time of 12-15 months. There is a broad range of alternative treatment options studied in preclinical and clinical trials for GBM. One alternative treatment option is oncolytic virotherapy, defined as the use of replication‐competent viruses that selectively infect and destroy cancer cells while leaving, non‐transformed cells unharmed. Vaccinia virus (VACV) is one favorable candidate. Although oncolytic viruses can kill tumor cells grown in vitro with high efficiency, they often exhibit reduced replication capacity in vivo suggesting that physiological aspects of the tumor microenvironment decrease the virus’ therapeutic potential. The percentage and composition of immune cells varies between cancer types and patients and is investigated as a biomarker in several studies. Making oncolytic virotherapy successful for GBM, it is necessary to understand the individual tumor biology, the interaction with the microenvironment and immune system. It was demonstrated that the attenuated VACV wild-type (wt) isolate LIVP 1.1.1 replicate and lyse the murine GL261 glioma cell line in vitro. In the following, the replication efficacy was characterized in a comparative approach in vivo. Immunocompetent C57BL/6 (wt) mice and immunodeficient mouse strains of different genetic background C57BL/6 athymic and Balb/c athymic mice were used. In addition, subcutaneous and intracranial locations were compared. The results revealed viral replication exclusively in Balb/c athymic mice with subcutaneous tumors but in none of the other models. In the following, the tumor microenvironment of the subcutaneous tumor models at the time of infection was performed. The study showed that implantation of the same tumor cells in different mouse strains resulted in a different tumor microenvironment with a distinct composition of immune cells. Highest differences were detected between immunodeficient and immunocompetent mice. The study showed major differences in the expression of MHCII with strongest expression in C57BL/6 wt and weakest in Balb/c athymic tumors. In the following, the influence of the phenotypic change associated with the upregulation of MHCII on GL261 tumor cells on viral replication was analyzed. Comparison of C57BL/6 wt and C57BL/6 IFN-γ knockout mice revealed endogenous IFN-γ levels to upregulate MHCII on GL261 tumor cells and to reduce viral replication in C57BL/6 wt mice. Analysis of single cell suspensions of tumor homogenates of C57BL/6 and Balb/c athymic mice showed that the IFN-γ-mediated anti-tumor effect was a reversible effect. Furthermore, reasons for inhibition of virus replication in orthotopic glioma models were elucidated. By immunohistochemical analysis it was shown that intratumoral amounts of Iba1+ microglia and GFAP+ astrocytes in Gl261 gliomas was independent from intratumoral VACV injection. Based on these findings virus infection in glioma, microglia and astrocytes was compared and analyzed in cell culture. In contrast to the GL261 glioma cells, replication was barely detectable in BV-2 microglia and IMA2.1 astrocytic cells. Co-culture experiments revealed that microglia compete for virus uptake in cell culture. It was further shown that BV-2 cells showed apoptotic characteristics after VACV infection while GL261 cells showed signs of necrotic cell death. Additionally, in BV-2 cells with M1-phenotype a further reduction of viral replication and inhibition of cell lysis was detected. Infection of IMA 2.1 cells was independent of the M1/M2-phenotype. Application of BV-2 microglia with M1-phenotype onto organotypic slice cultures with implanted GL261 tumors resulted in reduced infection of BV-2 cells with LIVP 1.1.1, whereas GL261 cells were significantly infected. Taken together, the analyzed GL261 tumors were imprinted by the immunologic and genetic background in which they grow. The experimental approach applied in this thesis can be used as suitable model which reflects the principles of personalized medicine In an additional project, based on gene expression data and bioinformatic analyses, the biological role and function of the anti-apoptotic factor AVEN was analyzed with regard to oncolytic VACV therapy. Besides a comparison of the replication efficacy of GLV-1h68 and VACV-mediated cell killing of four human tumor cell lines, it was shown that AVEN was expressed in all analyzed cells. Further, shown for HT-29 and 1936-MEL, the knockdown of AVEN by siRNA in cell culture resulted in an increase of apoptotic characteristics and a decrease of VACV infection. These findings provide essential insights for future virus development. N2 - Glioblastoma multiforme (GBM) ist einer der häufigsten und bösartigsten Hirntumoren im Erwachsenenalter. Die Prognose für GBM ist mit einer Überlebenszeit von 12-15 Monaten sehr schlecht. Eine alternative Behandlungsmöglichkeit stellt die onkolytische Virustherapie dar. Ein vielversprechender Kandidat ist das Vaccinia-Virus. Die große Diskrepanz zwischen der onkolytischen Effektivität in Zellkultur und den Ergebnissen im Mausmodell ist oftmals auf physiologische Komponenten im Tumor-Mikromilieu zurückzuführen. Die Zusammensetzung von Immunzellen im Mikromilieu variiert zwischen verschiedenen Krebsarten und Patienten und wird als Biomarker angewendet. Um eine erfolgreiche Virustherapie für GBM zu etablieren, wird ein umfangreiches Verständnis der Tumorbiologie, des Tumormikromilieus und des Immunsystems vorausgesetzt. Es wurde gezeigt, dass LIVP 1.1.1, ein attenuiertes wildtypisches VACV-Isolat, in der murinen GL261 Gliom-Zelllinie repliziert und zum Absterben der Zellen führt. Daraufhin wurde die Replikationseffizienz von LIVP 1.1.1 durch einen vergleichenden Ansatz in murinen GL261-Gliomen im Mausmodell untersucht. Es wurden immunkompetente C57BL/6-wildtypische (wt) Mäuse und immundefiziente Mausstämme mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund, C57BL/6 athymisch und Balb/c athymisch, verwendet. Zudem wurden unterschiedliche Tumor-Lokalisationen, subkutan und intrakranial analysiert. Ausschließlich im subkutanen Tumormodell der Balb/c athymischen Mäuse fand eine effektive Replikation der Viren statt. Eine detaillierte Charakterisierung des Mikromilieus zum Zeitpunkt der Infektion zeigte, dass die Implantation derselben Tumorzellen in unterschiedliche Mausstämme zur Entwicklung eines unterschiedlichen Tumormikromilieus und einer variierenden Zusammensetzung von Immunzellen führt. Die C57BL/6-wt-Mäuse wiesen eine starke proinflammatorische Signatur auf. Des Weiteren zeigte die Studie signifikante Unterschiede in der MHCII-Expression: Die prominenteste Expression wurde in C57BL/6-wt-Mäusen detektiert. Im weiteren Verlauf wurde analysiert, wodurch die phänotypischen Veränderungen in den GL261-Zellen, verbunden mit der Hochregulierung von MHCII ausgelöst wurden und welche Konsequenzen dies für die virale Infektion dieser Zellen hat. Durch einen direkten Vergleich von C57BL/6-wt-Mäusen und C57BL/6-IFN-γ-Knockout Mäusen konnte IFN-γ als verantwortlicher Faktor im Tumormikromilieu identifiziert werden, welcher für die Reduktion des Virustiters und für die Hochregulierung von MHCII in den C57BL/6-wt-Mäusen verantwortlich ist. Der durch endogenes IFN-γ ausgelöste anti-virale Effekt war reversibel. Des Weiteren wurden Gründe für die Hemmung der viralen Replikation in den orthotopen Gliom-Modellen aufgeklärt. Durch immunhistochemische Analysen von Mikroglia und Astrozyten konnte gezeigt werden, dass die intratumorale Menge und Verteilung der Gliazellen in diesen Tumoren unabhängig von der Virus-Applikation war. Gliomzellen, Mikroglia und Astrozyten, wurden daraufhin untersucht. Im Vergleich zur starken Replikation in GL261-Zellen, ließen BV-2-Mikroglia und IMA 2.1-Astrozyten, nur eine sehr schwache Replikation von LIVP 1.1.1 zu. Ko-Kultivierungsversuche wiesen darauf hin, dass Mikroglia um die Aufnahme der Viruspartikel mit den Tumorzellen konkurrieren. Es wurde gezeigt, dass das LIVP 1.1.1 unterschiedliche Eigenschaften des Zelltods in den Zellen auslösen kann. BV-2 wiesen verstärkte Charakteristika der Apoptose auf während in GL261-Zellen nekrotische Eigenschaften überwogen. In BV-2-Zellen mit M1-Phänotyp wurde eine weitere Reduktion der viralen Infektion festgestellt. Die Infektion von IMA-2.1-Zellen war unabhängig vom induzierten M1/M2 Phänotyp. Die Applikation von BV-2-Zellen mit M1-Phänotyp auf organotypische Schnittkulturen mit implantierten GL261-Tumoren resultierte in einer reduzierten Infektion der BV-2-Zellen und einer verstärkten Infektion der GL261-Zellen. Es wurde gezeigt, dass GL261-Tumore durch den immunologischen und genetischen Hintergrund der Umgebung geprägt wurden. Es wurde ein Modell entwickelt, welches das Prinzip der personalisierten Medizin widerspiegelt. In einem zusätzlichen Projekt wurde, basierend auf Genexpressionsdaten und bioinformatischer Auswertung, die biologische Funktion des anti-apoptotischen Faktors AVEN hinsichtlich der onkolytischen Virustherapie mit dem VACV GLV-1h68 analysiert. Für diese Studie wurden vier humane Zelllinien untersucht. Neben einem Vergleich der Replikationseffizienz des VACV GLV-1h68 und der VACV-vermittelten Zelllyse wurde gezeigt, dass AVEN, in allen untersuchten Zellen exprimiert wird. Am Beispiel von HT-29 und 1936-MEL wurde gezeigt, dass die Herunterregulierung von AVEN durch siRNA zu einer Erhöhung der apoptotischen Eigenschaften und Abnahme der VACV Infektion führt. Die Ergebnisse liefern wichtige Erkenntnisse für die Entwicklung zukünftiger genetisch veränderter VACV. KW - Krebs KW - Vaccinia-Virus KW - Glioblastom KW - Onkolytische Vaccinia Virustherapie KW - Mikroglia KW - Astrozyten KW - Oncolytic Vaccinia Virus Therapy Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118556 ER - TY - THES A1 - Wolter, Patrick T1 - Characterization of the mitotic localization and function of the novel DREAM target GAS2L3 and Mitotic kinesins are regulated by the DREAM complex, often up-regulated in cancer cells, and are potential targets for anti-cancer therapy T1 - Charakterisierung der mitotischen Lokalisation und Funktion von GAS2L3, eines kürzlich gefundenen Zielgens des DREAM Komplexes und Mitotische Kinesine werden vom DREAM Komplex reguliert, sind in Krebszellen häufig hochreguliert und sind potentielle Zielle für die Krebstherapie N2 - The recently discovered human DREAM complex (for DP, RB-like, E2F and MuvB complex) is a chromatin-associated pocket protein complex involved in cell cycle- dependent gene expression. DREAM consists of five core subunits and forms a complex either with the pocket protein p130 and the transcription factor E2F4 to repress gene expression or with the transcription factors B-MYB and FOXM1 to promote gene expression. Gas2l3 was recently identified by our group as a novel DREAM target gene. Subsequent characterization in human cell lines revealed that GAS2L3 is a microtubule and F-actin cross-linking protein, expressed in G2/M, plays a role in cytokinesis, and is important for chromosomal stability. The aim of the first part of the study was to analyze how expression of GAS2L3 is regulated by DREAM and to provide a better understanding of the function of GAS2L3 in mitosis and cytokinesis. ChIP assays revealed that the repressive and the activating form of DREAM bind to the GAS2L3 promoter. RNA interference (RNAi) mediated GAS2L3 depletion demonstrated the requirement of GAS2L3 for proper cleavage furrow ingression in cytokinesis. Immunofluorescence-based localization studies showed a localization of GAS2L3 at the mitotic spindle in mitosis and at the midbody in cytokinesis. Additional experiments demonstrated that the GAS2L3 GAR domain, a putative microtubule- binding domain, is responsible for GAS2L3 localization to the constriction zones in cytokinesis suggesting a function for GAS2L3 in the abscission process. DREAM is known to promote G2/M gene expression. DREAM target genes include several mitotic kinesins and mitotic microtubule-associated proteins (mitotic MAPs). However, it is not clear to what extent DREAM regulates mitotic kinesins and MAPs, so far. Furthermore, a comprehensive study of mitotic kinesin expression in cancer cell lines is still missing. Therefore, the second major aim of the thesis was to characterize the regulation of mitotic kinesins and MAPs by DREAM, to investigate the expression of mitotic kinesins in cancer cell line panels and to evaluate them as possible anti-cancer targets. ChIP assays together with RNAi mediated DREAM subunit depletion experiments demonstrated that DREAM is a master regulator of mitotic kinesins. Furthermore, expression analyses in a panel of breast and lung cancer cell lines revealed that mitotic kinesins are up-regulated in the majority of cancer cell lines in contrast to non-transformed controls. Finally, an inducible lentiviral-based shRNA system was developed to effectively deplete mitotic kinesins. Depletion of selected mitotic kinesins resulted in cytokinesis failures and strong anti-proliferative effects in several human cancer cell lines. Thus, this system will provide a robust tool for future investigation of mitotic kinesin function in cancer cells. N2 - Der vor kurzem entdeckte humane DREAM Komplex (für DP,RB ähnlich, E2F und MuvB Komplex) ist ein Chromatin bindender Pocket-Protein-Komplex involviert in Zellzyklusphase abhängiger Genregulation. DREAM besteht aus fünf Kernproteinen, die entweder zusammen mit dem Pocket-Protein p130 und dem Transkriptionsfaktor E2F4 die Genexpression reprimieren oder zusammen mit den Transkriptionsfaktoren B-MYB und FOXM1 die Genexpression fördern. GAS2L3 wurde vor kurzem als neues Zielgen des DREAM Komplexes identifiziert. Eine anschließende Charakterisierung in humanen Zelllinien offenbarte, dass GAS2L3 in der Lage ist, das F-Aktin und das Mikrotubuli Cytoskelett zu binden und zu vernetzen. Außerdem ist GAS2L3 speziell während der G2/M Phase exprimiert, spielt eine Rolle in der Cytokinese und ist wichtig für die genomische Integrität. Der erste Teil der Arbeit hatte zum Ziel zu ergründen in welcher Art und Weise DREAM GAS2L3 reguliert. Außerdem sollte das Verständnis der Rolle von GAS2L3 in der Cytokinese erweitert werden. Hierzu durchgeführte ChIP Analysen zeigten, dass sowohl der reprimierende als auch der aktivierende DREAM Komplex an den Promoter von GAS2L3 bindet. Experimente, in denen GAS2L3 durch RNA-Interferenz (RNAi) depletiert wurde, demonstrierten, dass GAS2L3 in der Cytokinese am Prozess der Einschnürung der Teilungsfurche beteiligt ist. Anschließende auf Immunfluoreszenzmikroskopie basierende Lokalisationsstudien zeigten, dass GAS2L3 an der mitotischen Spindel in der Mitose und am Midbody in der Cytokinese lokalisiert ist. Weiterführende Studien zeigten, dass die GAR Domäne von GAS2L3, eine mutmaßliche Mikrotubuli- Bindedomäne, für die Lokalisierung von GAS2L3 in der für die Abszission wichtigen Konstriktionszone verantwortlich ist. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass GAS2L3 eine Rolle in diesem Prozess spielt. Der DREAM Komplex ist bekannt dafür G2/M Genexpression zu fördern. G2/M Zielgene des Komplexes sind unter anderem mehrere mitotische Kinesine und mitotische Mikrotubuli-Bindeproteine. Bisher ist die Art und Weise und das Ausmaß der Regulierung dieser Proteingruppen durch DREAM aber nur ungenügend untersucht worden. Des Weiteren fehlt bisher eine umfassende Charakterisierung der Expression von mitotischen Kinesinen in Krebszellen. Deswegen befasste sich der zweite Teil der Arbeit mit der Charakterisierung der Regulation von mitotischen Kinesinen und Mikrotubuli-Bindeproteinen durch DREAM, untersuchte die Expression dieser beiden Proteingruppen in Krebszelllinien und evaluierte diese anschließend als potentielle Ziele für die Krebstherapie. Eine Kombination aus ChIP Analysen und RNAi Experimenten zeigte, dass DREAM eine zentrale Rolle in der Regulierung von mitotischen Kinesinen spielt. Expressions- analysen deckten auf, dass mitotische Kinesine in der Mehrheit der Krebszelllinien hochreguliert sind im Gegensatz zu den nicht entarteten Kontrollzelllinien. Schließlich wurde ein auf Lentiviren basierendes induzierbares shRNA System etabliert, welches mitotische Kinesine effektiv herunterregulieren konnte. Depletion ausgewählter mitotischer Kinesine führte zu Fehlern in der Cytokinese und hatte starke Auswirkungen auf das Wachstumsverhalten von mehreren Krebszelllinien. Aufgrund dieser Erkenntnisse wird das lentivirale System eine solide Ausgangsbasis für zukünftige Untersuchungen von mitotischen Kinesinen in Krebszellen bilden. KW - Zellzyklus KW - GAS2L3 KW - B-MYB KW - DREAM KW - cytokinesis KW - mitosis KW - kinesin KW - cancer KW - FOXM1 KW - regulation KW - Zellteilung KW - Regulation KW - Krebs KW - Biologie / Zellbiologie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-122531 ER - TY - THES A1 - Weinstock [geb. Pattschull], Grit T1 - Crosstalk between the MMB complex and YAP in transcriptional regulation of cell cycle genes T1 - Interaktion zwischen dem MMB-Komplex und YAP bei der transkriptionellen Regulation von Zellzyklusgenen N2 - The Myb-MuvB (MMB) multiprotein complex is a master regulator of cell cycle-dependent gene expression. Target genes of MMB are expressed at elevated levels in several different cancer types and are included in the chromosomal instability (CIN) signature of lung, brain, and breast tumors. This doctoral thesis showed that the complete loss of the MMB core subunit LIN9 leads to strong proliferation defects and nuclear abnormalities in primary lung adenocarcinoma cells. Transcriptome profiling and genome-wide DNA-binding analyses of MMB in lung adenocarcinoma cells revealed that MMB drives the expression of genes linked to cell cycle progression, mitosis, and chromosome segregation by direct binding to promoters of these genes. Unexpectedly, a previously unknown overlap between MMB-dependent genes and several signatures of YAP-regulated genes was identified. YAP is a transcriptional co-activator acting downstream of the Hippo signaling pathway, which is deregulated in many tumor types. Here, MMB and YAP were found to physically interact and co-regulate a set of mitotic and cytokinetic target genes, which are important in cancer. Furthermore, the activation of mitotic genes and the induction of entry into mitosis by YAP were strongly dependent on MMB. By ChIP-seq and 4C-seq, the genome-wide binding of MMB upon YAP overexpression was analyzed and long-range chromatin interaction sites of selected MMB target gene promoters were identified. Strikingly, YAP strongly promoted chromatin-association of B-MYB through binding to distal enhancer elements that interact with MMB-regulated promoters through chromatin looping. Together, the findings of this thesis provide a so far unknown molecular mechanism by which YAP and MMB cooperate to regulate mitotic gene expression and suggest a link between two cancer-relevant signaling pathways. N2 - Der Myb-MuvB (MMB) Multiproteinkomplex spielt eine wichtige Rolle in der Expression Zellzyklus abhängiger Gene, welche erhöhte Expressionsraten in verschiedenen Krebsarten aufweisen und Teil der sogenannten chromosomalen Instabilitätssignatur (CIN) von Lungen-, Gehirn- und Brusttumoren sind. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Deletion von LIN9, einer zentralen Untereinheit des MMB-Komplexes, in primären Lungenkarzinomzellen der Maus zu starken Proliferationsdefekten und Anomalitäten des Zellkerns führt. Analysen des gesamten Transkriptoms mit Hilfe von RNA-Seq ergaben, dass der MMB-Komplex die Expression einer Gruppe von Genen reguliert, die mit dem Voranschreiten des Zellzyklus, der Mitose und der Trennung der Chromosomen in Verbindung stehen. Die Regulation dieser Gene erfolgt durch direkte Bindung des MMB-Komplexes an die dazugehörigen Promotoren, wie die Analyse der genomweiten DNA-Bindung des MMB-Komplexes durch ChIP-Seq erkennbar werden ließ. Weiterhin wurde in dieser Arbeit eine neuartige Interaktion zwischen MMB und YAP, einem transkriptionellen Co-Aktivator und Effektorprotein des Hippo-Signalweges, gefunden. Die Dysregulation von Hippo/YAP ist an der Entstehung verschiedener Tumorentitäten beteiligt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass YAP mit Untereinheiten von MMB interagiert und dass beide Signalwege ein überlappendes Set von Zielgenen, die für die Entstehung von Tumoren relevant sind, regulieren. Es konnte außerdem nachgewiesen werden, dass YAP den MMB-Komplex benötigt, um die Expression mitotischer Gene zu aktivieren und dass der durch YAP induzierte Eintritt in die Mitose vom MMB-Komplex abhängig ist. In einem weiteren Teil der Arbeit wurden mittels ChIP-Seq und 4C-Seq Chromatin-Interaktionen von Promotoren der MMB-Zielgene mit weiter entfernt liegenden Bereichen des Genoms identifiziert. Hierbei konnte festgestellt werden, dass YAP die Bindung der MMB-Untereinheit B-MYB an die Promotoren der MMB-Zielgene verstärkt, indem es an weiter entfernte Enhancer bindet. Diese von YAP gebundenen Enhancer interagieren über Schleifenbildung des Chromatins mit den Promotoren MMB-regulierter Gene. Zusammengefasst konnten die Ergebnisse dieser Arbeit einen bisher unbekannten molekularen Mechanismus für die gemeinsame Regulation von Genen durch den MMB Komplex und YAP enthüllen und somit einen Zusammenhang zwischen zwei krebsrelevanten Signalwegen aufdecken. KW - Krebs KW - Zellteilung KW - Genexpression KW - MMB complex KW - Hippo pathway KW - mitosis KW - cytokinesis KW - mitotic gene expression KW - Lungenkrebs KW - Mitose Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170866 ER - TY - THES A1 - Lohr, Doris T1 - Der inferiore Trapeziuslappen zur Weichgewebsrekonstruktion im Mund-, Kiefer- und Gesichtsbereich T1 - The inferior trapezius muculocutaneous flap for soft tissue reconstruction in the jaw and facial region N2 - Von 1995 bis 2006 wurde in der Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer-, Gesichtschirurgie der Universität Würzburg bei 11 Patienten im Mund-Kiefer-Gesichtsbereich die Rekonstruktion von Defekten mittels des inferioren Trapeziuslappens durchgeführt. Bei allen Patienten lag ein Plattenepithelkarzinom vor. Die Indikation zur Rekonstruktion waren bei allen Patienten Weichgewebsdefekte. Als sein größter Vorteil, im Vergleich zu dem Pectoralis-major-Lappen und dem Latissimus-dorsi-Lappen, ist seine große Reichweite anzusehen, um Defekte im Gesichtsbereich zu versorgen. Insgesamt gesehen ist er aber nicht besser als diese zu bewerten, jedoch stellt er eine wertvolle Ergänzung dar. N2 - Between 1995 and 2006, a reconstruction of defects in the mouth, jaw and facial region with the help of the inferior trapezius musculocutaneous flap was conducted on 11 patients in the Clinic and Polyclinic for Oral and Facial Surgery of the University of Würzburg. The primary diagnosis for all patients was a squamous cell carcinoma. The indication for reconstruction for all patients was a soft tissue defect. Its greatest advantage compared to the pectoralis major myocutaneous flap and the latissimus dorsi myocutaneous flap is to be seen in its wide range of application in the treatment of defects in the facial region. On the whole, however, it is not to be evaluated as better than these, but it still constitutes a valuable additional option. KW - Mundhöhlentumor KW - Krebs KW - Transplantatabstoßung KW - Transplantatentnahme KW - inferiore Trapeziuslappen KW - Trapezius-Osteomuskulokutaneous-Lappen KW - superiore Trapeziuslappen KW - mittlere Trapeziuslappen KW - gefäßgestieltes Transplantat KW - axial pattern flap KW - inferior trapezius musculocutaneous flap Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27093 ER - TY - THES A1 - Hennig, Kathrin Sabine T1 - Der Zusammenhang von Informationszufriedenheit, Geschlecht und Tumorstadium mit der Lebensqualität von Krebspatienten T1 - The influence of satisfaction with information, gender and cancer stage on quality of life in cancer patients N2 - Krebserkrankungen gehen neben körperlichen Einschränkungen auch mit psychischer Belastung einher. Krebspatienten leiden unter Unsicherheit, Unwissen und Angst. Hierbei kann die Informationsvermittlung eine wichtige Rolle für den Patienten spielen. Die vorliegende Studie untersucht den Zusammenhang von Informationszufriedenheit, Geschlecht und Tumorstadium mit der Lebensqualität von Krebspatienten. Hierzu wurde eine Querschnittsstudie mit Patienten unterschiedlicher Tumorlokalistationen durchgeführt. Zur Datenerhebung dienten Fragebögen zur Selbsteinschätzung der Informationszufriedenheit und der Lebensqualität (EORTC QLQ-C30). N2 - This study investigates the influence of satisfaction with information, gender and cancer stage on quality of life in cancer patients. Therefore cancer patients with different tumor sites were asked in a cross-sectional study design to fill out questionnaires evaluating patients' satisfaction with information and quality of life (EORTC QLQ-C30). KW - Psychoonkologie KW - Krebs KW - Lebensqualität KW - Informationsbedarf KW - Geschlecht KW - Informationszufriedenheit KW - Tumorstadium KW - satisfaction with information KW - cancer stage Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76875 ER - TY - THES A1 - Junker, Markus T1 - Development and characterization of monoclonal antibodies to GDF-15 for potential use in cancer therapy T1 - Die Entwicklung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen GDF-15 zur potenziellen Anwendung in der Krebstherapie N2 - Background GDF-15 is a divergent member of the TGF-superfamily, which was first described as macrophage inhibitory cytokine-1 (MIC-1), revealing an immune modulatory function. GDF-15 is a soluble protein which is, under physiological conditions, highly expressed in the placenta and found in elevated levels in blood sera of pregnant women. Apart from the placenta, GDF-15 is expressed in healthy tissue, albeit to a lower extent and overexpressed in many solid tumors. A variety of different functions are attributed to GDF-15 in healthy as well as diseased humans. On the one hand, GDF-15 is required for successful pregnancy and low GDF-15 serum levels during pregnancy correlate with fetal abortion. On the other hand, overexpression of GDF-15, which can be observed in several malignancies is correlated with a poor prognosis. Furthermore, tumor derived GDF-15 leads to cancer associated anorexia-cachexia syndrome in mice. The aim of my PhD thesis was to further investigate the role of GDF-15 as an immune modulatory factor in cancer, in particular, by inhibiting the target molecule in vitro and in vivo. Therefore, the main focus was placed on the generation and characterization of monoclonal GDF-15 specific blocking antibodies, which were tested in vitro and in vivo, which represents a substantial part of my work. Results Here, GDF-15 was shown to be highly expressed in human gynecological cancer and brain tumors. We could then demonstrate that GDF-15 modulates effector immune cells in vitro. GDF-15 mediated a slight downregulation of the activating NKG2D receptor on NK and CD8+ T cells, which is crucial for proper anti-tumoral immune responses. Furthermore, we could demonstrate that GDF-15 reduces the adhesion of CD4+ and CD8+ T cells on endothelial cells in vitro. A negatively affected trans-endothelial migration of leukocytes into inflamed tissue could explain the low T cell infiltration in GDF-15 expressing tumors, which were observed in vivo, where mice bearing (shRNA mediated) GDF-15 deficient glioma cells revealed enhanced immune cell infiltrates in the tumor microenvironment, compared with the GDF-15 expressing control group. Those animals further exhibited a decreased tumor growth and prolonged survival. GDF-15 is a soluble protein, secreted by more than 50 % of solid tumors and associated with grade of malignancy. Therefore a neutralizing monoclonal antibody to GDF-15 was assumed to be an auspicious therapeutically anti-cancer tool. Such an antibody was thus generated in GDF-15 knock out mice against human GFD-15. Amongst many clones, the GDF-15 antibody clone B1-23 was found to be applicable in Western Blot as well as in ELISA techniques, detecting a three-dimensional epitope of the mature GDF-15 dimer with high affinity and specificity. To enable the humanization for a later administration in humans, the variable regions of antibody B1-23 were identified by a special PCR method using degenerate primers and cloned into a sequencing vector. The sequence obtained thereby enabled the generation of chimeric and humanized B1-23 variants. After further comprehensive characterization, the original mouse antibody B1-23 as well as the chimeric antibody (ChimB1-23) and the humanized B1-23 antibody (H1L5) were applied in a melanoma xenograft study in vivo. None of the antibodies could significantly inhibit tumor growth. .However of utmost importance, body weight loss mediated by tumor derived GDF-15 could be significantly prevented upon administration of all three GDF-15 specific antibodies, which confirmed the antagonizing functionality of the immunoglobulin. Conclusion GDF-15 is a promising cancer target, involved in tumor progression and cancer related cachexia. A monoclonal GDF-15 antibody was generated, which served on one hand as a tool for molecular biological applications (Western Blot, ELISA, etc.) and on the other hand was applied as an antagonizing antibody in vitro and in vivo. Even though tumor growth inhibition by GDF-15 depletion in T cell deficient athymic mice failed using B1-23, the same antibody and derivates thereof (chimeric and humanized) impressively prevented tumor associated cachexia in UACC-257 melanoma bearing nude mice. The missing anti-tumor effect in our own melanoma model in nude mice can only partially be explained by the missing secondary immunity, in particular cytotoxic T cells, in the athymic animals, since in a similar melanoma model, performed by an external company, a tumor reduction in immunocompromised animals was observed, when B1-23 was administered. These findings support the idea that T cells are substantial for an effective tumor immunity and are in line with the results of the syngeneic, T cell comprising, mouse glioma model, where silencing of tumor expressed GDF-15 led to an enhanced intratumoral T cell infiltration and a prolonged survival. Taken together our data allow for the conclusion that tumor associated cachexia can be combatted with the GDF-15 antibody B1-23. Further, B1-23 might elicit direct anti-tumor effects in immune competent models, which contain T cells, rather than in an athymic, T cell deficient nude mouse model. N2 - Hintergrund GDF-15 ist ein divergentes Mitglied der TGF-Superfamilie, welches zuerst als „macrophage inhibitory cytokine-1“ (MIC-1) mit immunmodulatorischen Eigenschaften beschrieben wurde. GDF-15 ist ein lösliches Protein, das unter physiologischen Bedingungen hauptsächlich in der Plazenta exprimiert wird und welches im Serum von Schwangeren in erhöhten Konzentrationen nachgewiesen werden kann. Mit Ausnahme der Plazenta wird GDF-15 in verschiedenen gesunden Geweben gefunden, hier jedoch in deutlich niedrigeren Konzentrationen, und ist in vielen soliden Tumoren überexprimiert. GDF-15 werden sowohl bei gesunden, als auch bei kranken Menschen, unterschiedlichste Funktionen zugeschrieben. Zum einen ist GDF-15 für eine erfolgreiche Schwangerschaft notwendig. Niedrige GDF-15 Spiegel im Serum während der Schwangerschaft korrelieren mit dem Verlust des Fötus. Zum anderen korreliert die Überexpression von GDF-15, welche bei unterschiedlichen Malignitäten beobachtet werden kann, mit einer schlechten Prognose. Darüber hinaus verursacht das von Tumorzellen sezernierte GDF-15 das sogenannte „Anorexie-Kachexie Syndrom“ in Mäusen. Das Ziel meiner Arbeit war es, die immunmodulatorische Funktion von GDF-15 im Tumorkontext zu untersuchen, insbesondere durch eine Hemmung des Zielmoleküls in vitro und in vivo. Aus diesem Grund wurde der Schwerpunkt auf die Generierung und Charakterisierung monoklonaler, GDF-15 spezifischer, blockierender Antikörper gelegt. Diese wurden sowohl in vitro als auch in vivo getestet, was einen großen Teil dieser Arbeit darstellt. Ergebnisse Es konnte gezeigt werden, dass GDF-15 in humanen gynäkologischen Tumoren wie auch in Hirntumoren überexprimiert ist. Weiterhin ließ sich zeigen, dass GDF-15 Effektorzellen des Immunsystems in vitro moduliert. Dabei verursacht GDF-15 eine moderate Herunterregulation des aktivierenden Killing Rezeptors NKG2D auf NK und CD8+ T Zellen, welcher eine hohe Bedeutung für eine effektive anti-tumorale Immunantwort hat. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass GDF-15 die Adhäsion von CD4+ und CD8+ T Zellen auf Endothelzellen in vitro herabsetzt. Eine daraus resultierende Reduktion der trans-endothelialen Migration von Leukozyten in entzündetes Gewebe erklärt möglicherweise die niedrige T Zell Infiltration in GDF-15 exprimierenden Tumoren, welche in vivo beobachtet werden konnten. Mäuse, denen (auf shRNA basierende) GDF-15-defiziente Gliomzellen appliziert wurden, zeigten im Vergleich zur Kontrollgruppe, welche GDF-15-exprimierenden Gliomzellen erhalten hatte, ein verlängertes Überleben, vermindertes Tumorwachstum und eine erhöhte Immunzellinfiltration in das Tumormikromillieu. GDF-15 ist ein lösliches Protein, das von mehr als 50 % aller soliden Tumore sezerniert wird und mit dem Grad der Malignität korreliert. Daher wurde postuliert, dass ein neutralisierender monoklonaler Antikörper gegen GDF-15 eine effektive neue Antikrebstherapie ermöglichen sollte. Solch ein Antikörper wurde entsprechend in GDF-15-defizienten Mäusen generiert. Unter verschiedenen Klonen wurde der Antikörper Klon B1-23 identifiziert, welcher sowohl im Western Blot als auch im ELISA anwendbar ist. Dieser Klon detektiert ein drei-dimensionales Epitop des maturen GDF-15 Dimers mit hoher Affinität und Spezifität. Um den Antikörper für eine spätere Anwendung im Menschen humanisieren zu können, wurden die variablen Regionen des Klons B1-23 durch eine spezielle PCR Methode unter Verwendung degenerierter Primer und nachfolgender Klonierung in einen Sequenzierungsvektor identifiziert. Die hierdurch gewonnenen Sequenzen ermöglichten die Generierung von chimären und humanisierten Varianten von B1-23. Nach anschließender intensiver Charakterisierung konnte sowohl der ursprüngliche Maus-Antikörper B1-23 als auch der chimäre B1-23 Antikörper (ChimB1-23) und der humanisierte B1-23 Antikörper (H1L5) in einer Melanom Xenograft Studie in vivo getestet werden. Zwar ließ sich mit keinem der Antikörper eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums beobachten. Als herausragendes Ergebnis zeigte sich allerdings, dass der durch GDF-15 induzierte Gewichtsverlust signifikant durch die Verabreichung der GDF-15 spezifischen Antikörper verhindert werden konnte, was die antagonisierende Funktionalität des entwickelten Immunglobulins bestätigte. Schlussfolgerung GDF-15 ist ein vielversprechendes Zielmolekül bei Krebserkrankungen, welches bei der Tumorprogression und Tumor-assoziierter Kachexie beteiligt ist. Es konnte ein monoklonaler Anti-GDF-15 Antikörper generiert werden, welcher zum einen molekularbiologisch zum Einsatz kam (z.B. Western Blot, ELISA, etc.) und zum anderen als antagonisierender Antikörper sowohl in vitro als auch in vivo Anwendung fand. Auch wenn B1-23 scheinbar keine Tumorwachstumshemmung durch die Depletion von GDF-15 in T Zell defizienten athymischen Mäusen zeigte, konnte derselbe Antikörper wie auch die abgeleiteten Varianten (chimärisiert und humanisiert) eindrücklich die Tumor assoziierte Kachexie im UACC-257 Melanom Modell verhindern. Der ausgebliebene antitumorale Effekt in unserem Melanom Modell in Nacktmäusen lässt sich nur zum Teil durch eine fehlende sekundäre Immunkomponente, insbesondere das Fehlen zytotoxischer T Zellen, erklären, da es in einem ähnlichen Xenograft Melanom Modell, welches in Auftragsforschung (CRO) durchgeführt wurde, zu einer Reduktion des Tumorwachstums durch die Applikation von B1-23 kam. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass T Zellen unerlässlich für eine effektive antitumorale Antwort sind, eine Annahme, die durch die Ergebnisse des syngenen Gliom Maus-Modells unterstützt wird, in welchem es durch das Ausschalten von Tumor produziertem GDF-15 zu einer erhöhten intratumoralen T Zell Infiltration und einem längeren Überleben kam. Zusammengenommen erlauben uns diese Daten den Schluss, dass eine tumorbedingte Kachexie durch den GDF-15-Antikörper B1-23 bekämpft werden kann. Allerdings sind direkte B1-23 vermittelte antitumorale Effekte eher in immunkompetenten Modellen mit T Zellen als in einem athymischen, T Zell defizienten Nacktmaus-Modell zu erwarten. KW - Growth-differentiation Factor 15 KW - GDF-15 KW - Monoklonaler Antikörper KW - Krebs KW - Therapie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-132424 ER - TY - THES A1 - Heisig, Martin T1 - Development of novel Listeria monocytogenes strains as therapeutic agents for targeted tumor therapy T1 - Entwicklung von neuen Listeria monocytogenes Stämmen zur Anwendung in der Tumortherapie N2 - Despite marked progress in development and improvement of cancer therapies the rate of cancer related death remained stable over the last years. Especially in treating metastases alternative approaches supporting current therapies are required. Bacterial and viral vectors have been advanced from crude tools into highly sophisticated therapeutic agents detecting and treating neoplastic leasions. They might be potent enough to fill in this therapeutic demand. In this thesis Listeria monocytogenes was investigated as carrier for targeted bacterial cancer therapy. One part of the study focussed on modification of a functional bacterial mRNA delivery system. Genomic integration of T7 RNA polymerase driving mRNA production allowed reduction to an one-plasmid-system and thereby partially relieved the growth retardation exerted by mRNA delivery. Importantly the integration allowed metabolic attenuation of the mRNA delivery mutant potentially enabling in vivo applications. Further expansion of the bacterial RNA delivery system for transfer of shRNAs was examined. Bacterial mutants producing high amounts of RNA containing shRNA sequences were constructed, however a functional proof of gene silencing on delivery in eukaryotic cell lines was not achieved. The second part of this thesis focussed on increasing tumor colonization by Listeria monocytogenes in vivo. Coating bacteria with antibodies against receptors overexpressed on distinct tumor cell lines enabled specific bacterial internalization into these cells in vitro. Optimization of the bacterial antibody coating process resulted in an up to 104-fold increase of intracellular bacteria. Combination of this antibody-mediated targeting with the delivery of prodrug-converting enzymes showed a cytotoxic effect in cell lines treated with the corresponding prodrug. Since incubation in murine serum completely abrogated antibodymediated bacterial internalization the antibodies were covalently linked to the bacteria for application in xenografted tumor mice. Bacteria coated and crosslinked in this manner showed enhanced tumor targeting in a murine tumor model demonstrating antibodymediated bacterial tumor targeting in vivo. Independent of antibody-mediated tumor targeting the intrinsic tumor colonization of different Listeria monocytogenes mutants was examined. Listeria monocytogenes ΔaroA ΔinlGHE colonized murine melanoma xenografts highly efficient, reaching up to 108 CFU per gram of tumor mass 7 days post infection. Taken together the presented data shows highly promising aspects for potential bacterial application in future tumor therapies. Combination of the delivery systems with antibodymediated- and intrinsic bacterial tumor targeting might open novel dimensions utilizing Listeria monocytogenes as therapeutic vector in targeted tumor therapy. N2 - Die Weiterentwicklung der Therapiemöglichkeiten bei Krebserkrankungen hat trotz deutlicher Fortschritte nicht zu einer grundsätzlichen Verringerung der krebsbedingten Sterberate geführt. Besonders in der Behandlung von Metastasen werden alternative Therapieansätze zur Unterstützung der etablierten Standardmethoden benötigt. Insbesondere bakterielle und virale Vektoren wurden von groben Werkzeugen zu hochtechnischen therapeutischen Instrumenten verfeinert und könnten in der Zukunft diese therapeutische Lücke schliessen. In dieser Arbeit wurden verschiedene Aspekte der Anwendung von Listeria monocytogenes in der bakteriellen Tumortherapie untersucht. Im ersten Teil der Arbeit wurde das bereits publizierte System zur bakteriellen Übertragung von mRNAs modifiziert. Die genomische Integration der T7 RNA Polymerase, welche die mRNA herstellt, erlaubte die Reduktion der Plasmidzahl und verringerte die Stoffwechselbelastung auf die RNA-übertragenden Bakterien. Diese Integration erlaubte zum ersten Mal die metabolische Attenuation von RNAübertragenden Listerien und ermöglicht damit den in vivo Einsatz dieser Stämme. Als Erweiterung zur bakteriellen mRNA Übertragung wurde die Übetragung von shRNAs untersucht. Obwohl große Mengen an bakteriellen RNAs nachgewiesen wurden, die die shRNA Sequenz enthielten, konnte nach Infektion eukaryotischer Zellen mit diesen Bakterienmutanten keine funktionale Genregulation nachgewiesen werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde mit verschiedenen Methoden die Kolonisierung von Tumoren durch Listeria monocytoges verbessert. Durch Beladung der Bakterien mit Antikörpern gegen Rezeptoren, die auf bestimmten Tumorzellen überexprimiert werden, wurde die bakterielle Internalisierung in diese Zelllinien ermöglicht. Durch Optimierung des Antikörper-Beladungsprozesses konnte die Antikörper-vermittelte bakterielle Internalisierung auf das 104 fache der Kontrollen gesteigert werden. In Verbindung mit der Übertragung von Enzymen, die Medikamentenvorstufen in cytotoxische Medikamente umwandeln, konnten in Zellen, die mit der Medikamentenvorstufe inkubiert wurden, zytotoxische Effekte beobachtet werden. Da aber die Behandlung Antikörper-beladener Bakterien mit murinem Serum die spezifische Internalisierung vollständig verhindert, wurden die Antikörper für die Anwendung in Xenograft Tumormäusen kovalent an die Bakterien gebunden. Auf diese Weise behandelte Bakterien zeigten eine verbesserte Tumorzielsteuerung bei Beladung mit tumorbindenden Antikörpern. Unabhängig von der Antikörper-vermittelten Tumorzielsteuerung wurde die Tumorkolonisation verschiedener Listeria monocytogenes Mutanten untersucht. Insbesondere Listeria monocytogenes ΔaroA ΔinlGHE kolonisierte Melanom-Xenograft Tumoren sehr effizient und erreicht bis zu 108 CFU pro Gramm Tumormasse. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit verschiedene vielversprechende Aspekte der bakteriellen Tumortherapie, die möglicherweise in Zukunft angewandt werden können. Durch Verbindung der RNA-Transfersysteme mit Antikörper-vermittelter- und intrinsischer Tumorzielsteuerung können neue Möglichkeiten für den Einsatz von Listeria monocytogenes als therapeutischer Vektor geschaffen werden. KW - Krebs KW - Therapie KW - Angewandte Mikrobiologie KW - bacterial cancer therapy KW - bacterial tumor targeting Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48628 ER - TY - THES A1 - Merwart, Moritz T1 - Die Inanspruchnahme von psychosozialen Unterstützungsangeboten bei Krebskranken - eine geschlechtsspezifische Untersuchung T1 - Utilization of psychosocial interventions amongst cancer patients - a gender specific analysis N2 - Untersuchung der Inanspruchnahme von psychosozialen Unterstützungsangeboten bei Krebspatienten. In einer multizentrischen Studie wurde untersucht, welche Unterstützungsangebote bevorzugt in Anspruch genommen werden und ob es hinsichtlich der Inanspruchnahme einen Geschlechterunterschied gibt. Außerdem wurden diverse andere Prädiktoren untersucht, die einen Einfluss auf die Inanspruchnahme haben können (z.B. Depressivität, psychische Störung, Alter, Bildungsstand). Zur Datenerhebung dienten Selbstbeurteilungsinstrumente in Form von Fragebögen und ein standardisiertes klinisches Interview (CIDI). N2 - Analysis of cancer patients´desire for psychosocial support and identification of patients´sociodemographic and disease related factors (such as gender, age, depression, education) with the utilization of psychosocial interventions. KW - Psychoonkologie KW - Geschlechtsunterschied KW - Krebs KW - Inanspruchnahme KW - Nichtinanspruchnahme KW - Composite international diagnostic interview KW - Psychooncology KW - Cancer KW - Gender difference KW - psychsosocial interventions KW - depression Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74324 ER - TY - THES A1 - Engelmann, Julia Cathérine T1 - DNA microarrays: applications and novel approaches for analysis and interpretation T1 - DNA Mikroarrays: Anwendungen und neue Ansätze für die Analyse und Interpretation N2 - In der vorliegenden Dissertation wird die Entwicklung eines phylogenetischen DNA Microarrays, die Analyse von mehreren Microarray-Genexpressionsdatensätzen und neue Ansätze für die Datenanalyse und Interpretation der Ergebnisse vorgestellt. Die Entwicklung und Analyse der Daten eines phylogenetischen DNA Microarrays wird in der ersten Publikation dargestellt. Ich konnte zeigen, dass die Spezies-Detektion mit phylogenetischen Microarrays durch die Datenanalyse mit einem linearen Regressionsansatz signifikant verbessert werden kann. Standard-Methoden haben bislang nur Signalintensitäten betrachtet und eine Spezies als an- oder abwesend bezeichnet, wenn die Signalintensität ihres Messpunktes oberhalb eines willkürlich gesetzten Schwellenwertes lag. Dieses Verfahren ist allerdings aufgrund von Kreuz-Hybridisierungen nicht auf sehr nah verwandte Spezies mit hoher Sequenzidentität anwendbar. Durch die Modellierung des Hybridisierungs und Kreuz-Hybridisierungsverhaltens mit einem linearen Regressionsmodell konnte ich zeigen, dass Spezies mit einer Sequenzähnlichkeit von 97% im Markergen immer noch unterschieden werden können. Ein weiterer Vorteil der Modellierung ist, dass auch Mischungen verschiedener Spezies zuverlässig vorhergesagt werden können. Theoretisch sind auch quantitative Vorhersagen mit diesem Modell möglich. Um die großen Datenmengen, die in öffentlichen Microarray-Datenbanken abgelegt sind besser nutzen zu können, bieten sich Meta-Analysen an. In der zweiten Publikation wird eine explorative Meta-Analyse auf Arabidopsis thaliana-Datensätzen vorgestellt. Mit der Analyse verschiedener Datensätze, die den Einfluss von Pflanzenhormonen, Pathogenen oder verschiedenen Mutationen auf die Genexpression untersucht haben, konnten die Datensätze anhand ihrer Genexpressionsprofile in drei große Gruppen eingeordnet werden: Experimente mit Indol-3-Essigsäure (IAA), mit Pathogenen und andere Experimente. Gene, die charakteristisch für die Gruppe der IAA-Datensätze beziehungsweise für die Gruppe der Pathogen-Datensätze sind, wurden näher betrachtet. Diese Gene hatten Funktionen, die bereits mit Pathogenbefall bzw. dem Einfluss von IAA in Verbindung gebracht wurden. Außerdem wurden Hypothesen über die Funktionen von bislang nicht annotierten Genen aufgestellt. In dieser Arbeit werden auch Primäranalysen von einzelnen Arabidopsis thaliana Genexpressions-Datensätzen vorgestellt. In der dritten Publikation wird ein Experiment beschrieben, das durchgeführt wurde um herauszufinden ob Mikrowellen-Strahlung einen Einfluss auf die Genexpression einer Zellkultur hat. Dazu wurden explorative Analysemethoden angewendet. Es wurden geringe aber signifikante Veränderungen in einer sehr kleinen Anzahl von Genen beobachtet, die experimentell bestätigt werden konnten. Die Funktionen der regulierten Gene und eine Meta-Analyse mit öffentlich zugänglichen Datensätzen einer Datenbank deuten darauf hin, dass die pflanzliche Zellkultur die Strahlung als eine Art Energiequelle ähnlich dem Licht wahrnimmt. Des weiteren wird in der vierten Publikation die funktionelle Analyse eines Arabidopsis thaliana Genexpressionsdatensatzes beschrieben. Die Analyse der Genexpressions eines pflanzlichen Tumores zeigte, dass er seinen Stoffwechsel von aerob und auxotroph auf anaerob und heterotroph umstellt. Gene der Photosynthese werden im Tumorgewebe reprimiert, Gene des Aminosäure- und Fettstoffwechsels, der Zellwand und Transportkanäle werden so reguliert, dass Wachstum und Entwicklung des Tumors gefördert werden. In der fünften Publikation in dieser Arbeit wird GEPAT (Genome Expression Pathway Analysis Tool) beschrieben. Es besteht aus einer Internet- Anwendung und einer Datenbank, die das einfache Hochladen von Datensätzen in die Datenbank und viele Möglichkeiten der Datenanalyse und die Integration anderer Datentypen erlaubt. In den folgenden zwei Publikationen (Publikation 6 und Publikation 7) wird GEPAT auf humane Microarray-Datensätze angewendet um Genexpressionsdaten mit weiteren Datentypen zu verknüpfen. Genexpressionsdaten und Daten aus vergleichender Genom-Hybridisierung (CGH) von primären Tumoren von 71 Mantel-Zell-Lymphom (MCL) Patienten ermöglichte die Ermittlung eines Prädiktors, der die Vorhersage der Überlebensdauer von Patienten gegenüber herkömmlichen Methoden verbessert. Die Analyse der CGH Daten zeigte, dass auch diese für die Vorhersage der Überlebensdauer geeignet sind. Für den Datensatz von Patienten mit großzellig diffusem B-Zell-Lymphom DLBCL konnte aus den Genexpressionsdaten ebenfalls ein neuer Prädiktor vorgeschlagen werden. Mit den zwischen lang und kurz überlebenden Patienten differentiell exprimierten Genen der MCL Patienten und mit den Genen, die zwischen den beiden Untergruppen von DLBCL reguliert sind, wurden Interaktionsnetzwerke gebildet. Diese zeigen, dass bei beiden Krebstypen Gene des Zellzyklus und der Proliferation zwischen Patienten mit kurzer und langer Überlebensdauer unterschiedlich reguliert sind. N2 - In this thesis, the development of a phylogenetic DNA microarray, the analysis of several gene expression microarray datasets and new approaches for improved data analysis and interpretation are described. In the first publication, the development and analysis of a phylogenetic microarray is presented. I could show that species detection with phylogenetic DNA microarrays can be significantly improved when the microarray data is analyzed with a linear regression modeling approach. Standard methods have so far relied on pure signal intensities of the array spots and a simple cutoff criterion was applied to call a species present or absent. This procedure is not applicable to very closely related species with high sequence similarity because cross-hybridization of non-target DNA renders species detection impossible based on signal intensities alone. By modeling hybridization and cross-hybridization with linear regression, as I have presented in this thesis, even species with a sequence similarity of 97% in the marker gene can be detected and distinguished from related species. Another advantage of the modeling approach over existing methods is that the model also performs well on mixtures of different species. In principle, also quantitative predictions can be made. To make better use of the large amounts of microarray data stored in public databases, meta-analysis approaches need to be developed. In the second publication, an explorative meta-analysis exemplified on Arabidopsis thaliana gene expression datasets is presented. Integrating datasets studying effects such as the influence of plant hormones, pathogens and different mutations on gene expression levels, clusters of similarly treated datasets could be found. From the clusters of pathogen-treated and indole-3-acetic acid (IAA) treated datasets, representative genes were selected which pointed to functions which had been associated with pathogen attack or IAA effects previously. Additionally, hypotheses about the functions of so far uncharacterized genes could be set up. Thus, this kind of meta-analysis could be used to propose gene functions and their regulation under different conditions. In this work, also primary data analysis of Arabidopsis thaliana datasets is presented. In the third publication, an experiment which was conducted to find out if microwave irradiation has an effect on the gene expression of a plant cell culture is described. During the first steps, the data analysis was carried out blinded and exploratory analysis methods were applied to find out if the irradiation had an effect on gene expression of plant cells. Small but statistically significant changes in a few genes were found and could be experimentally confirmed. From the functions of the regulated genes and a meta-analysis with publicly available microarray data, it could be suspected that the plant cell culture somehow perceived the irradiation as energy, similar to perceiving light rays. The fourth publication describes the functional analysis of another Arabidopsis thaliana gene expression dataset. The gene expression data of the plant tumor dataset pointed to a switch from a mainly aerobic, auxotrophic to an anaerobic and heterotrophic metabolism in the plant tumor. Genes involved in photosynthesis were found to be repressed in tumors; genes of amino acid and lipid metabolism, cell wall and solute transporters were regulated in a way that sustains tumor growth and development. Furthermore, in the fifth publication, GEPAT (Genome Expression Pathway Analysis Tool), a tool for the analysis and integration of microarray data with other data types, is described. It consists of a web application and database which allows comfortable data upload and data analysis. In later chapters of this thesis (publication 6 and publication 7), GEPAT is used to analyze human microarray datasets and to integrate results from gene expression analysis with other datatypes. Gene expression and comparative genomic hybridization data from 71 Mantle Cell Lymphoma (MCL) patients was analyzed and allowed proposing a seven gene predictor which facilitates survival predictions for patients compared to existing predictors. In this study, it was shown that CGH data can be used for survival predictions. For the dataset of Diffuse Large B-cell lymphoma (DLBCL) patients, an improved survival predictor could be found based on the gene expression data. From the genes differentially expressed between long and short surviving MCL patients as well as for regulated genes of DLBCL patients, interaction networks could be set up. They point to differences in regulation for cell cycle and proliferation genes between patients with good and bad prognosis. KW - Microarray KW - Differentielle Genexpression KW - Genexpression KW - Statistische Analyse KW - Cluster-Analyse KW - Datenanalyse KW - Explorative Datenanalyse KW - Non-Hodgkin-Lymphom KW - B-Zell-Lymphom KW - Metabolom KW - Tumorklassifikation KW - Tumor KW - Krebs KW - Schmalwa KW - phylogenetische Arrays KW - Interaktionsnetzwerke KW - lineare Regression KW - DNA microarray KW - gene expression KW - statistical analysis KW - clustering KW - classification KW - interaction networks Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29747 ER - TY - THES A1 - Monjezi, Razieh T1 - Engineering of chimeric antigen receptor T cells with enhanced therapeutic index in cancer immunotherapy using non-viral gene transfer and genome editing T1 - Entwicklung chimärer Antigenrezeptor T-Zellen mit verbessertem Therapeutischen Index in der Krebsimmuntherapie durch die Verwendung von nicht-viralen Gentransfer und Genomeditierung N2 - The advances in genetic engineering have enabled us to confer T cells new desired functions or delete their specific undesired endogenous properties for improving their antitumor function. Due to their efficient gene delivery, viral vectors have been successfully used in T-cell engineering to provide gene transfer medicinal products for the treatment of human disease. One example is adoptive cell therapy with T cells that were genetically modified with gamma-retroviral and lentiviral (LV) delivery vectors to express a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) for cancer treatment. This therapeutic approach has shown remarkable results against B-cell malignancies in pilot clinical trials. Consequently, there is a strong desire to make CAR T cell therapy scalable and globally available to patients. However, there are persistent concerns and limitations with the use of viral vectors for CAR T cell generation with regard to safety, cost and scale of vector production. In order to address these concerns, we aimed to improve non-viral gene transfer and genome editing tools as an effective, safe and broadly applicable alternative to viral delivery methods for T-cell engineering. In the first part of the study, we engineered CAR T cells through non-viral Sleeping Beauty (SB) transposition of CAR genes from minimalistic DNA vectors called minicircles rather than conventional SB plasmids. This novel approach dramatically increased stable gene transfer rate and cell viability and resulted in higher yield of CAR+ T cells without the need of long ex vivo expansion to generate therapeutic doses of CAR+ T cells. Importantly, CD19-CAR T cells modified by MC-based SB transposition were equally effective as LV transduced CD19-CAR T cells in vitro and in a murine xenograft model (NSG/Raji-ffLuc), where a single administration of CD8+ and CD4+ CAR T cells led to complete eradication of lymphoma and memory formation of CAR T cells after lymphoma clearance. To characterize the biosafety profile of the CAR T cell products, we did the most comprehensive genomic insertion site analysis performed so far in T cells modified with SB. The data showed a close-to-random integration profile of the SB transposon with a higher number of insertions in genomic safe harbors compared to LV integrants. We developed a droplet digital PCR assay that enables rapid determination of CAR copy numbers for clinical applications. In the second part of the study, we ablated expression of PD-1, a checkpoint and negative regulator of T cell function to improve the therapeutic index of CAR T cells. This was accomplished using non-viral CRISPR/Cas9 via pre-assemble Cas9 protein and in vitro-transcribed sgRNA (Cas9 RNP). Finally, we combined our developed Cas9 RNP tool with CAR transposition from MC vectors into a single-step protocol and successfully generated PD-1 knockout CAR+ T cells. Based on the promising results achieved from antibody-mediated PD-1 blockade in the treatment of hematological and solid tumors, we are confident that PD-1 knockout CAR T cells enhance the potency of CAR T cell therapies for treatment of cancers without the side effects of antibody-based therapies. In conclusion, we provide a novel platform for virus-free genetic engineering of CAR T cells that can be broadly applied in T-cell cancer therapy. The high level of gene transfer rate and efficient genome editing, superior safety profile as well as ease-of-handling and production of non-viral MC vectors and Cas9 RNP position our developed non-viral strategies to become preferred approaches in advanced cellular and gene-therapy. N2 - Die Fortschritte des genetischen Engineerings erlauben uns, T-Zellen neue, erwünschte Funktionen zu verleihen oder ihnen bestimmte, unerwünschte endogenen Eigenschaften zu nehmen, um ihre Antitumorfunktion zu verbessern. Aufgrund ihrer Effizienz im Gentransport, werden virale Vektoren für das TZellengineering verwendet, um gentransferierte, medizinische Produkte zur Behandlung humaner Krankheiten herzustellen. Ein Beispiel hierfür ist die adoptive Zelltherapie mit T-Zellen, die mit gamma-retroviralen und lentiviralen (LV) Vektoren genetisch modifiziert wurden, so dass sie einen CD19-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) exprimieren. In klinischen Pilotstudien zu B-Zellerkrankungen zeigte dieser therapeutische Ansatz bereits beachtliche Erfolge. Hieraus resultiert das Bestreben, die CAR-T-Zelltherapie für Patienten skalierbar und weltweit zugänglich zu machen. Aufgrund gesundheitlicher Risiken, finanzieller Kosten und dem Umfang der Vektorenproduktion bestehen jedoch anhaltende Bedenken und Grenzen bezüglich der Verwendung viraler Vektoren für die Herstellung von CAR-T-Zellen. Um diese Problematiken zu umgehen, beabsichtigten wir, den nicht-viralen Gentransfer sowie genomverändernde Techniken soweit zu verbessern, dass sie als eine effiziente, sichere und umfassend einsetzbare Alternative zum virusbasierten T-Zellengineering verwendet werden können. Im ersten Teil dieser Arbeit stellten wir durch die Sleeping Beauty (SB) Transposition von CAR-Genen auf minimalistischen DNA Vektoren (sogenannten Minicircles) CART-Zellen her. Die Minicircles wurden anstelle von konventionellen SB Plasmiden verwendet. Mithilfe dieser neuen Vorgehensweise wurden die Rate des stabilen Gentransfers sowie das Überleben der Zellen drastisch erhöht und führte zu einer gesteigerten Rate an CAR+ T-Zellen, ohne dass eine langwierige ex vivo Expansion zur Herstellung therapeutisch relevanter CAR-T-Zelldosen nötig wurde. CD19-CART-Zellen, die mit MC-basierter SB-Transposition modifiziert wurden, zeigten in vitro und in einem murinen Xenograftmodell (NSG/Raji-ffLuc) eine vergleichbar hohe Effizienz, wie LV-transduzierte CD19-CAR-T-Zellen. Hierbei genügte eine einzige Verabreichung von CD4+ und CD8+ CAR-T-Zellen für eine komplette Eliminierung des Lymphoms und der anschließenden Gedächtnisbildung von CAR-T-Zellen. Um die Biosicherheit der CAR-T-Zellprodukte zu charakterisieren, führten wir die bislang umfassendste vergleichende Analyse von Genominsertionsstellen nach SB-basierter Modifikation von T-Zellen durch. Im Vergleich zur LV Integration zeigten diese Daten ein beinahe zufälliges Integrationsmuster des SB Transposons mit höheren Integrationsraten in genomisch „sicheren Häfen“. Wir entwickelten eine Analyse basierend auf digitaler Tröpfchen-PCR, um eine rasche Ermittlung der Anzahl an CAR-Genkopien in klinischen Anwendungen zu ermöglichen. Im zweiten Teil der Arbeit verminderten wir die Expression von PD-1, einer Prüfstelle und negativen Regulator der T-Zellfunktion, um den therapeutischen Index der CART- Zellen zu verbessern. Dies wurde durch die Verwendung eines nicht-viralen CRISPR/Cas9, durch das Zusammensetzen von Cas9 Protein und in vitrotranskribierter sgRNA (Cas9 RNP), erzielt. Schließlich verwendeten wir unsere entwickelte Cas9 RNP-Technik in Kombination mit CAR-Transposition von MCVektoren, um PD-1-knock out, CAR-positive T-Zellen herzustellen. Da die antikörperbasierte PD-1-Blockade in der Behandlung hämatologischer und solider Tumore vielversprechende Ergebnisse zeigt, sind wir zuversichtlich, dass PD-1-knock out CAR-T-Zellen die Effizienz von CAR-T-Zelltherapien verschiedener Krebsarten verbessern können und dabei die Nebenwirkungen der antikörperbasierten Therapien umgehen. Wir zeigen in der vorliegenden Arbeit Möglichkeiten mit virusfreien, gentechnischen Methoden CAR-T-Zellen herzustellen, die in der T-Zellkrebstherapie umfassend Anwendung finden können. Das hohe Level der Gentransferraten und der effizienten Genomeditierung, ein zu bevorzugendes Sicherheitsprofil sowie die einfache Handhabung und Produktion nichtviraler MC-Vektoren und Cas9 RNP machen es möglich, dass unser neuentwickelter, nichtviraler Ansatz zu einer bevorzugten Herangehensweise in der künftigen Zell- und Gentherapie werden kann. KW - Krebs KW - Cancer immunotherapy KW - Immuntherapie KW - T-Lymphozyt KW - Chimeric antigen receptor KW - T-cell therapy KW - T-cell engineering KW - Sleeping Beauty transposon KW - Non-viral genome engineering KW - Genome editing KW - CRISPR/Cas9 KW - Krebsimmuntherapie KW - nicht-viraler Gentransfer KW - Genomeditierung KW - Entwicklung chimärer Antigenrezeptor T-Zellen Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-152521 ER -