TY - THES A1 - Schneider, Nicole T1 - Untersuchung der Expression von SET7 und anderer epigenetischer Enzyme in vitro und vivo im Modell der Atherosklerose T1 - Analysis of the expression of SET7 and other epigenetic enzymes in vitro and vivo in a model of atherosclerosis N2 - Bei der Atherosklerose handelt es sich um eine chronische inflammatorische Erkrankung, die sich an der arteriellen Gefäßinnenwand abspielt. Ihre Haupt-Manifestationsformen Schlaganfall und Herzinfarkt zählen zu den häufigsten Todesursachen weltweit. Eine chronische Endothelbelastung und -funktionsstörung, beeinflusst durch Risikofaktoren wie Diabetes, arterieller Bluthochdruck, Rauchen und Entzündungszustände, führen zur Permeabilitätserhöhung des Endothels, zur Zelleinwanderung, subendothelialen Lipidanreicherung, Migration glatter Muskelzellen und der Ausbildung atherosklerotischer Läsionen. Es kommt zu Aktivierung des Immunsystems und fortschreitender Entzündungsreaktion, schließlich zur Ausbildung eines nekrotischen Kerns und zunehmender Vulnerabilität des Plaques. Epigenetische Veränderungen betreffen klassischerweise das Chromatingerüst. Durch DNA-Methylierung und -Demethylierung sowie verschiedene Modifikationen der Histon-Proteine kann die DNA in ihrer Zugänglichkeit verändert werden. So kann die Transkription eines bestimmten Genes direkt und potenziell längerfristig beeinflusst werden, ohne dass Alterationen der DNA-Basenfolge selbst stattfinden. Das Enzym SET7 nimmt hierbei eine Sonderrolle ein, da es neben einer Methylierung von Histon 3 auch verschiedene zelluläre Zielstrukturen posttranslational direkt methylieren kann. Epigenetische Veränderungen im Kontext der Atherosklerose sind bereits vereinzelt beschrieben. Auch sind sie relevant in der Reaktion auf Umwelteinflüsse und bei inflammatorischen Vorgängen. Der Frage, ob epigenetische Mechanismen im atherosklerotischen Geschehen eine Rolle spielen, sollte in dieser Arbeit nachgegangen werden. Dazu wurde in Zellkulturversuchen für Makrophagen und glatte Muskelzellen geprüft, ob die einzelnen pro-atherosklerotischen Stimuli oxLDL, IL-1β, TNFα und LPS bereits zu relevanten Veränderungen epigenetischer Enzyme führen. Dies erfolgte über Vergleich der entsprechenden mRNA mittels qPCR. Zur Untersuchung der genaueren Dynamik wurde für die Enzyme SET7 und DNMT1 der zeitliche Ablauf dieser Reaktion auf TNFα-Stimulation in Makrophagen genauer betrachtet. Unter gleichen Versuchsbedingungen wurde außerdem die Änderung der mRNA-Expression einiger Matrixmetalloproteasen, TIMP-Enzyme, Zytokine und Transkriptionsfaktoren analysiert,um zukünftig kausale Zusammenhänge weiter aufdecken zu können. Auch die Frage nach Veränderungen epigenetischer Enzyme in der Ldlr-/--Maus nach fettreicher Diät im Vergleich zu Ldlr-/--Mäusen ohne Diät sollte hier beantwortet werden. Dazu wurde die mRNA der Zellsuspensionen aus Milz, Aortenwurzel und gesamter Aorta der Tiere mithilfe der qPCR verglichen. Schließlich sollte ein effizienter Weg für einen individuellen und flexiblen SET7 knock-out etabliert werden, um weitere Studien dieses Enzyms zu ermöglichen. Hierzu wurde die Methode des CRISPR/Cas9 Systems gewählt und abschließend die Funktionalität des Systems überprüft. N2 - Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease which occurs at the inner layer of the artery wall. Its two main manifestations are stroke and myocardial infarction, which are two of the most common causes of death worldwide. Chronical endothelial stress and endothelial dysfunction, affected by different risk factors such as hypertension, diabetes mellitus, smoking, and an inflammatory state, lead to an increased permeability, cell accumulation, subendothelial lipid accumulation and migration of smooth muscle cells, causing immune system activation, a subsequent inflammatory reaction, and the formation of atherosclerotic lesions. Finally, the development of a necrotic core occurs, accompanied by a progressive plaque vulnerability. Epigenetic mechanisms affect the chromatin structure. Therefore, the accessibility of the DNA can be altered by DNA methylation, -demethylation and different modifications of histone proteins. This can directly affect the transcription of a certain gene in a potentially long-lasting way without altering the DNA base sequence itself. The enzyme SET7 is noteworthy because of its ability of direct methylation of different cellular targets in addition to its function as a histone 3 methyltransferase. Some epigenetic alterations in the context of atherosclerosis have already been described. Epigenetic changes also play a role in the reaction to environmental signals and in processes caused by inflammation. The aim of this study was to clarify whether epigenetic mechanisms play a role in atherosclerosis. Therefore, epigenetic alterations in macrophages and smooth muscle cells after pro-atherosclerotic stimulation with oxLDL, IL-1β, TNFα and LPS were tested in cell culture experiments and their mRNA expression was compared via qPCR. Regarding the dynamics, the temporal SET7 and DNMT1 expression after stimulation was investigated for macrophages in detail. Furthermore, changes of mRNA expression for certain matrix-metalloproteases, TIMP-enzymes, cytokines, and transcription factors could be detected under constant experimental conditions. By this, the detection of causal dependencies between individual changes could be facilitated in the future. To answer the question of relevant changes in epigenetic enzyme expression in Ldlr-/--mice after high-fat diet compared to mice without any diet, mRNA expression of cell suspension gained from the mice spleen, aortic sinus and total aorta were compared by using qPCR. Finally, an efficient way of knocking down SET7 was established by the usage of the CRISPR/Cas9 method, and functionality of this approach was demonstrated in this study. KW - Arteriosklerose KW - Epigenetik KW - Atherogenese KW - Atherosklerose KW - Atherosclerosis KW - epigenetics KW - SET7 Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-328952 ER - TY - THES A1 - Pennington, Laura Sophie T1 - The role of Cadherin-13 in serotonergic neurons during different murine developmental stages T1 - Die Rolle von Cadherin-13 in serotonergen Neuronen während verschiedener Entwicklungsstadien in der Maus N2 - Abstract Background: Attention-deficit/ hyperactivity disorder (ADHD) ranges among the most common neurodevelopmental disorders worldwide with a prevalence of 3-12% in childhood and 1-5% for adults. Over the last decade extensive genetic research has been conducted in order to determine its causative genetic factors. None of the so far identified susceptibility genes, however, could explain the estimated ADHD heritability of 76%. In this thesis one of the most promising candidates -Cadherin 13 (Cdh13) - was examined in terms of its influence on the central serotonergic (5-HT) system. In addition to that, the Cdh13 protein distribution pattern was analysed over time. Methods: The developing serotonergic system was compared over three embryonic and postnatal stages (E13.5, E17.5 and P7) in different Cdh13 genotypes (WT, HZ and KO) using immunohistochemistry and various double staining protocols. Results: The raphe nuclei of the 5-HT system develop in spite of Cdh13 absence and show a comparable mature constellation. The cells in the KO, however, are slightly more scattered than in the WT. Furthermore the dynamics of their formation is altered, with a transient delay in migration at E13.5. In early developmental stages the total amount of serotonergic cells is reduced in KO and HZ, though their proportional distribution to the raphe nuclei stays constant. Strikingly, at P7 the absolute numbers are comparable again. Concerning the Cdh13 protein, it shows high concentrations on fibres running through hindbrain and midbrain areas at E13.5. This, however, changes over time, and it becomes more evenly spread until P7. Furthermore, its presence in serotonergic cells could be visualised using confocal microscopy. Since the described pattern is only in parts congruent to the localisation of serotonergic neurons, it is most likely that Cdh13 is present in other developing neurotransmitter systems, such as the dopaminergic one, as well. Conclusion: It could be proven that Cdh13 is expressed in serotonergic cells and that its knockout does affect the developing serotonergic system to some degree. Its absence, however, only slightly and transiently affects the measured parameters of serotonergic system development, indicating a possible compensation of CDH13 function by other molecules in the case of Cdh13 deficiency. In addition further indicators could be found for an influence of Cdh13 on outgrowth and path finding of neuronal processes. N2 - Zusammenfassung Hintergrund: Das Aufmerksamkeits-Defizit/ Hyperaktivitäts-Syndrom (ADHS) gehört zu den häufigsten psychiatrischen Erkrankungen weltweit und betrifft 3- 12% aller Kinder und 1-5% der Erwachsenen. In den letzten Jahren wurde eine große Anzahl verschiedener genetischer Studien durchgeführt, um die zugrunde liegenden genetischen Ursachen genauer zu bestimmen. Von den vielen hundert bis dato gefundenen Kandidatengenen erreichte jedoch keines eine ausreichende statistische Signifikanz. Diese Arbeit befasst sich mit Cadherin 13, einem der vielversprechendsten Kandidatengene, und untersucht einen möglichen Zusammenhang mit der Entwicklung des serotonergen Systems. Zusätzlich wird das Cdh13 Verteilungsmuster im ZNS über die Zeit analysiert. Methoden: Es wurden embryonale und postnatale Entwicklungsstadien des serotonergen Systems (E13.5, E17.5 und P7) in drei Cdh13 Genotypen mit (WT, HZ, KO) verglichen. Dabei kamen Methoden der Immunhistochemie und diverse Doppelfärbungsprotokolle zum Einsatz. Ergebnisse: Die Raphe Kerne des serotonergen Systems entwickeln sich trotz fehlendem Cdh13 und zeigen im ausgereiften Zustand eine ähnliche Morphologie in allen Genotypen. Allerdings liegen die Neurone der Raphe Kerne im KO etwas weiter verstreut. Zudem hat es den Anschein als wäre die Dynamik ihrer Entwicklung beeinträchtigt. So liegt beispielsweise um E13.5 der KO im Vergleich zum WT vorübergehend etwas zurück. Außerdem weisen die frühen Entwicklungsstadien im KO und HZ deutlich reduzierte Zellzahlen auf, wobei deren anteilmäßige Verteilung zu den einzelnen Raphe Kernen zwischen den Genotypen unverändert ist. Überraschenderweise finden sich in P7 wieder vergleichbare Zellzahlen. Was die Verteilung von Cdh13 betrifft, so liegt es ab E13.5 vor allem auf Fasern von Hirnstamm und Mittelhirn in hohen Konzentrationen vor. Im Laufe der Entwicklung verliert Cdh13 diese begrenzte Lokalisation und zeigt sich homogen in weiten Teilen des ZNS verteilt. Da sein Verteilungsmuster nur teilweise Ähnlichkeiten mit dem 5-HT System aufweist, muss davon ausgegangen werden, dass es noch in anderen Neurotransmittersystemen wie etwa dem dopaminergen System eine Rolle spielt. Schlussfolgerung: Es ist gezeigt worden, dass Cdh13 in serotonergen Zellen exprimiert wird und seine Abwesenheit Einfluss auf die Entwicklung des serotonergen Systems nimmt. Angesichts seiner geringen Auswirkungen lässt sich allerdings vermuten, dass sein Fehlen teilweise von anderen Molekülen kompensiert wird. Darüber hinaus sind weitere Hinweise darauf gefunden worden, dass Cdh13 eine Rolle bei der Lenkung auswachsender neuronaler Fortsätze spielt. KW - Cadherine KW - Serotonerge Nervenzelle KW - Maus KW - Epigenetik KW - Cadherin 13 KW - Raphe Kerne KW - ADHS KW - Neurodevelopment KW - Genetics Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-161331 ER - TY - THES A1 - Wedel, Carolin T1 - The impact of DNA sequence and chromatin on transcription in \(Trypanosoma\) \(brucei\) T1 - Der Einfluss der DNA-Sequenz und der Chromatinstruktur auf die Transkription in \(Trypanosoma\) \(brucei\) N2 - For cellular viability, transcription is a fundamental process. Hereby, the DNA plays the most elemental and highly versatile role. It has long been known that promoters contain conserved and often well-defined motifs, which dictate the site of transcription initiation by providing binding sites for regulatory proteins. However, research within the last decade revealed that it is promoters lacking conserved promoter motifs and transcribing constitutively expressed genes that constitute the majority of promoters in eukaryotes. While the process of transcription initiation is well studied, whether defined DNA sequence motifs are required for the transcription of constitutively expressed genes in eukaryotes remains unknown. In the highly divergent protozoan parasite Trypanosoma brucei, most of the proteincoding genes are organized in large polycistronic transcription units. The genes within one polycistronic transcription unit are generally unrelated and transcribed by a common transcription start site for which no RNA polymerase II promoter motifs have been identified so far. Thus, it is assumed that transcription initiation is not regulated but how transcription is initiated in T. brucei is not known. This study aimed to investigate the requirement of DNA sequence motifs and chromatin structures for transcription initiation in an organism lacking transcriptional regulation. To this end, I performed a systematic analysis to investigate the dependence of transcription initiation on the DNA sequence. I was able to identify GT-rich promoter elements required for directional transcription initiation and targeted deposition of the histone variant H2A.Z, a conserved component during transcription initiation. Furthermore, nucleosome positioning data in this work provide evidence that sites of transcription initiation are rather characterized by broad regions of open and more accessible chromatin than narrow nucleosome depleted regions as it is the case in other eukaryotes. These findings highlight the importance of chromatin during transcription initiation. Polycistronic RNA in T. brucei is separated by adding an independently transcribed miniexon during trans-splicing. The data in this work suggest that nucleosome occupancy plays an important role during RNA maturation by slowing down the progressing polymerase and thereby facilitating the choice of the proper splice site during trans-splicing. Overall, this work investigated the role of the DNA sequence during transcription initiation and nucleosome positioning in a highly divergent eukaryote. Furthermore, the findings shed light on the conservation of the requirement of DNA motifs during transcription initiation and the regulatory potential of chromatin during RNA maturation. The findings improve the understanding of gene expression regulation in T. brucei, a eukaryotic parasite lacking transcriptional Regulation. N2 - Die Transkription ist ein entscheidender Prozess in der Zelle und die DNA-Sequenz nimmt hierbei eine elementare Rolle ein. Promotoren beinhalten spezifische und konservierte DNASequenzen und vermitteln den Start der Transkription durch die Rekrutierung spezifischer Proteine. Jedoch haben Forschungen im vergangenen Jahrzehnt gezeigt, dass die Mehrzahl der Promotoren in eukaryotischen Genomen keine konservierten Promotormotive aufweisen und häufig konstitutiv exprimierte Gene transkribieren. Obgleich der Prozess der Transkriptionsinitiation im Allgemeinen gut erforscht ist, konnte bisher nicht nachgewiesen werden, ob ein definiertes DNA-Motiv während der Transkription von konstitutiv exprimierten Genes erforderlich ist. In dem eukaryotischen und einzelligen Parasiten Trypanosoma brucei ist die Mehrzahl der proteinkodierenden Gene in lange polycistronische Transkriptionseinheiten arrangiert. Diese werden von einem gemeinsamen Transkriptionsstart durch die RNA Polymerase II transkribiert, allerdings konnten hier bisher keine Promotormotive identifiziert werden. Aus diesem Grund besteht die Annahme, dass Transkription keiner Regulation unterliegt. Allgemein ist der Prozess der Transkriptionsinitiation in T. brucei bisher nur wenig verstanden. Um den Zusammenhang zwischen DNA-Motiven und konstitutiver Genexpression näher zu untersuchen und Schlussfolgerungen über die DNA-Sequenz-Abhängigkeit der Transkriptionsinitiation zu ziehen, habe ich eine systematische Analyse in T. brucei durchgeführt. Ich konnte GT-reiche Promotorelemente innerhalb dieser Regionen identifizieren, die sowohl eine gerichtete Transkriptionsinitiation, als auch den gezielten Einbau der Histonvariante H2A.Z in Nukleosomen nahe der Transkriptionsstartstelle vermittelt haben. Des Weiteren zeigten Nukleosomenpositionierungsdaten, dass in Trypanosomen die Transkripitonsstartstellen nicht die charakteristische, nukleosomendepletierte Region, wie für andere Organismen beschrieben, sondern eine offene Chromatinstruktur enthalten. Zusätzlich konnte ich zeigen, dass die Chromatinstruktur eine wichtige Rolle während der mRNAProzessierung spielt. In T. brucei wird die polycistronische pre-mRNA durch das Anfügen eines Miniexons während des sogenannten trans-Splicens in individuelle mRNAs aufgetrennt. Die Daten dieser Arbeit belegen, dass die Anreicherung von Nukleosomen eine Verlangsamung der transkribierenden Polymerase bewirken und sie somit die richtige Wahl der Splicestelle gewährleisten. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit die Rolle der DNA Sequenz während der Transkriptionsinitiation und Nukleosomenpositionierung in einem divergenten Eukaryoten untersucht. Die Erkenntnisse bringen mehr Licht in die Konservierung der Notwendigkeit eines DNA-Motivs während der Transkriptionsinitiation und das regulatorische Potential der Chromatinstruktur während der RNA-Reifung. Zudem verbessern sie das Verständnis der Genexpressionsregulation in T. brucei, einem eukaryotischen Parasiten, der ohne transkriptionelle Regulation überlebt. KW - Transkription KW - Chromatin KW - Trypanosoma brucei KW - Genexpression KW - Epigenetik KW - RNA polymerase II KW - splicing KW - nuclesosome positioning Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173438 ER - TY - THES A1 - Prell, Andreas T1 - The effects of paternal age on DNA methylation of developmentally important genes in human and bovine sperm T1 - Der väterliche Alterseffekt auf DNA-Methylierung in entwicklungsrelevanten Genen im menschlichen und bovinen Spermienepigenom N2 - Western societies are steadily becoming older undergoing a clear trend of delayed parenthood. Children of older fathers have an undeniably higher risk for certain neurodevelopmental disorders and other medical conditions. Changes in the epigenetic landscape and especially in DNA methylation patterns are likely to account for a portion of this inherited disease susceptibility. DNA methylation changes during the ageing process are a well-known epigenetic feature. These so-called age-DMRs exist in developmentally important genes in the methylome of several mammalian species. However, there is only a minor overlap between the age-DMR datasets of different studies. We therefore replicated age-DMRs (which were obtained from a genome wide technique) by applying a different technical approach in a larger sample number. Here, this study confirmed 10 age-DMRs in the human and 4 in the bovine sperm epigenome from a preliminary candidate list based on RRBS. For this purpose, we used bisulphite Pyrosequencing in 94 human and 36 bovine sperm samples. These Pyrosequencing results confirm RRBS as an effective and reliable method to screen for age-DMRs in the vertebrate genome. To decipher whether paternal age effects are an evolutionary conserved feature of mammalian development, we compared methylation patterns between human and bovine sperm in orthologous regulatory regions. We discovered that the level of methylation and the age effect are both species-specific and speculate that these methylation marks reflect the lineage-specific development of each species to hit evolutionary requirements and adaptation processes. Different methylation levels between species in developmentally important genes also imply a differing mutational burden, representing a potential driver for point mutations and consequently deviations in the underlying DNA sequence of different species. Using the example of different haplotypes, this study showed the great effect of single base variations on the methylation of adjacent CpGs. Nonetheless, this study could not provide further evidence or a mechanism for the transfer of epigenetic marks to future generations. Therefore, further research in tissues from the progeny of old and young fathers is required to determine if the observed methylation changes are transmitted to the next generation and if they are associated with altered transcriptional activity of the respective genes. This could provide a direct link between the methylome of sperm from elderly fathers and the development potential of the next generation. N2 - Unsere westliche Gesellschaft wird immer älter und unterliegt einem eindeutigen Trend zur verzögerten Elternschaft. Kinder von älteren Vätern haben ein unbestreitbar höheres Risiko für bestimmte neurologische Entwicklungsstörungen und andere Erkrankungen. Epigenetische Veränderungen insbesondere im DNA-Methylierungsmuster sind wahrscheinlich für einen Teil dieser vererbten Krankheitsanfälligkeit verantwortlich. Altersbedingte Veränderungen im DNA-Methylierungsmuster sind ein bekanntes und gut erforschtes Phänomen in der Epigenetik. Diese so genannten Alters-DMRs konnten im Methylom mehrerer Säugetierarten nachgewiesen werden, insbesondere in entwicklungsrelevanten Genen. Allerdings gibt es nur geringe Überschneidungen zwischen den Alters-DMR-Datensätzen verschiedener Studien. Unser Ziel war es daher, die Vertrauenswürdigkeit eines laborinternen Datensatzes, der auf Reduced Representation Bisulphite Sequencing (RRBS) basierte, zu erhöhen, indem wir einen anderen technischen Ansatz in einer unabhängigen Kohorte anwenden. Mit der Methode des Bisulphite Pyrosequencing konnten wir in dieser Studie 10 Alters-DMRs im menschlichen und 4 im Rinder-Spermienepigenom aus einer vorläufigen Kandidatenliste basierend auf RRBS validieren. Diese Ergebnisse bestätigen, dass RRBS eine wirksame und zuverlässige Methode ist, um neue Alters-DMRs im Wirbeltiergenom zu finden. Um festzustellen, ob väterliche Alterseffekte in der Evolution verschiedener Säugetierarten konserviert wurden, verglichen wir die Methylierungsmuster orthologer Regionen zwischen dem menschlichem und dem Rinderspermienepigenom. Es zeigte sich, dass sowohl der Methylierungsgrad als auch der Alterseffekt artspezifisch sind. Daher vermuten wir, dass diese Methylierungsmuster die artspezifische Entwicklung als Antwort auf evolutionäre Anforderungen und durchlebte Anpassungsprozesse darstellen. Diese unterschiedlichen Methylierungslevel zwischen verschiedenen Arten in entwicklungswichtigen Genen implizieren auch eine unterschiedliche Mutationslast, die einen potenziellen Treiber für Punktmutationen und folglich Abweichungen in der zugrunde liegenden DNA-Sequenz der verschiedenen Arten darstellt. Am Beispiel verschiedener Haplotypen konnten wir exemplarisch den ausgeprägten Einfluss bereits einzelner DNA-Basenvariationen auf die Methylierung benachbarter CpGs demonstrieren. Allerdings konnte diese Studie keinen weiteren Beweis oder einen Mechanismus für die Übertragung von epigenetischen Markierungen auf künftige Generationen liefern. Daher sind weitere Untersuchungen an embryonalen, fötalen und adulten Geweben von Nachkommen alter bzw. junger Väter unabdingbar, um festzustellen, ob die beobachteten Methylierungsveränderungen auch auf die nächste Generation übertragen werden. Ferner ist festzustellen, ob sie die Transkriptionsaktivität der betroffenen Gene beeinflussen. Dies könnte einen direkten Einfluss des Spermienmethyloms älterer Väter auf das Entwicklungspotenzial der nächsten Generation belegen. KW - Epigenetik KW - Spermium KW - Methylierung KW - DNA-Methylation KW - Paternal age effect Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-347866 ER - TY - THES A1 - Varagnolo, Linda T1 - PRC2 inhibition counteracts the culture-associated loss of engraftment potential of human cord blood-derived hematopoietic stem/progenitor cells T1 - Die Inhibition des PRC2 wirkt dem Kultur-bedingten Verlust des Repopulationspotenzials in humanen hämatopoetischen Stammzellen/Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut entgegen N2 - Cord blood hematopoietic stem cells (CB-HSCs) are an outstanding source for the treatment of a variety of malignant and non-malignant disorders. However, the low amount of cells collected per donor is often insufficient for treatment of adult patients. In order to make sufficient numbers of CB-HSCs available for adults, expansion is required. Different approaches were described for HSC expansion, however these approaches are impeded by the loss of engrafting potential during ex vivo culture. Little is known about the underlying molecular mechanisms. Epigenetic mechanisms play essential roles in controlling stem cell potential and fate decisions and epigenetic strategies are considered for HSC expansion. Therefore, this study aimed to characterize global and local epigenotypes during the expansion of human CB-CD34+, a well established CB progenitor cell type, to better understand the molecular mechanisms leading to the culture-associated loss of engrafting potential. Human CB-CD34+ cells were cultured using 2 different cytokine cocktails: the STF cocktail containing SCF, TPO, FGF-1 and the STFIA cocktail, which combines STF with Angiopoietin-like 5 (Angptl5) and Insulin-like growth factor-binding protein 2 (IGFBP2). The latter expands CB-HSCs ex vivo. Subsequently, the NOD-scid gamma (NSG) mouse model was used to study the engraftment potential of expanded cells. Engraftment potential achieved by fresh CB-CD34+ cells was maintained when CB-CD34+ cells were expanded under STFIA but not under STF conditions. To explore global chromatin changes in freshly isolated and expanded CB-CD34+ cells, levels of the activating H3K4me3 and the repressive H3K27me3 histone marks were determined by chromatin flow cytometry and Western blot analyses. For analysis of genome-wide chromatin changes following ex vivo expansion, transcriptome profiling by microarray and chromatin immunoprecipitation combined with deep sequencing (ChIP-seq) were performed. Additionally, local chromatin transitions were monitored by ChIP analyses on promoter regions of developmental and self-renewal factors. On a global level, freshly isolated CD34+ and CD34- cells differed in H3K4me3 and H3K27me3 levels. After 7 days of expansion, CD34+ and CD34- cells adopted similar levels of active and repressive marks. Expanding the cells without IGFBP2 and Angptl5 led to a higher global H3K27me3 level. ChIP-seq analyses revealed a cytokine cocktail-dependent redistribution of H3K27me3 profiles. Chemical inhibition of the H3K27 methyltransferase EZH2 counteracted the culture-associated loss of NSG engraftment potential. Collectively, the data presented in this study revealed that by adding epigeneticly active compounds in the culture media we observed changes on a chromatin level which counteracted the loss of engraftment potential. H3K27me3 rather than H3K4me3 may be critical to establish a specific engraftment supporting transcriptional program. Furthermore, I identified a critical function for the Polycomb repressive complex 2-component EZH2 in the loss of engraftment potential during the in vitro expansion of HPSCs. Taken together this thesis provides a better molecular understanding of chromatin changes upon expansion of CB-HSPCs and opens up new perspectives for epigenetic ex vivo expansion strategies. N2 - Hämatopoetische Stammzellen aus Nabelschnurblut (CB-HSCs) sind eine bedeutende Quelle für die Behandlung einer Vielzahl maligner und nicht-maligner Erkrankungen. Allerdings ist die geringe Anzahl an Stammzellen, die von einem Spender gewonnen werden kann, meist nicht ausreichend für die Rekonstitution des hämatopoetischen Systems erwachsener Patienten. Um eine ausreichende Menge an CB-HSCs zu gewinnen, ist eine Expansion der Zellen erforderlich. Verschiedene Ansätze zur ex vivo Expansion von HSCs wurden beschrieben, allerdings waren diese Ansätze durch den Verlust des Repopulationspotentials während der ex vivo Kultivierung nicht umsetzbar. Über die zugrundeliegenden Mechanismen ist wenig bekannt. Epigenetische Mechanismen spielen eine entscheidende Rolle in der Kontrolle von Selbsterneuerung und Differenzierung von Stammzellen. Aus diesem Grund werden epigenetische Strategien zur HSC-Expansion in Betracht gezogen. Das Ziel dieser Studie war, globale und lokale Epigenotypen während der Expansion humaner CB-CD34+-Zellen (CB-Vorläuferzellen) zu charakterisieren. Diese Studien sollten zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen, welche zum Kultivierungs-assoziierten Verlust des Repopulationspotentials führen. Humane CB-CD34+-Zellen wurden in zwei verschiedene Zytokin-Cocktails kultiviert: Der sogenannte STF-Cocktail, welcher SCF, TPO und FGF-1 enthält und der STFIA-Cocktail, welcher STF mit Angptl5 und IGFBP2 kombiniert. Aus der Literatur war zu Beginn dieser Doktorarbeit war bekannt, dass CB-HSCs ex vivo in STFIA, nicht aber in STF expandiert werden können. In Übereinstimmung mit diesem Befund zeigen die hier vorgestellten heterologen Transplantationsexperimente, dass das Repopulationspotential frischer CB-CD34+-Zellen nur erhalten blieb, wenn die Zellen unter STFIA, jedoch nicht, wenn sie unter STF-Bedingungen expandiert waren. Um die globalen Chromatinveränderungen frisch isolierter und expandierter Zellen zu untersuchen, wurden die Level der aktivierenden Histonmodifikation H3K4me3 und der repressiven H3K27me3-Modifikation durch Chromatin-Durchflusszytometrie und Western Blot Analyse bestimmt. Zur Analyse der genomweiten Chromatinveränderungen nach ex vivo Expansion wurden Transkriptomprofile durch Mikroarray und Chromatin-Immunpräzipitation, in Kombination mit Deep-Sequencing (ChiP-Seq) durchgeführt. Zusätzlich wurden lokale Chromatinveränderungen durch ChiP-Analysen an Promotorregionen von Entwicklungs- und Selbsterneuerungs-Faktoren analysiert. Auf globaler Ebene unterschieden sich frisch isolierte CD34+ und CD34- Zellen in ihren H3K4me3 und H3K27me3 Leveln. Nach siebentägiger Expansion nahmen CD34+ und CD34- Zellen ähnliche Level aktiver und repressiver Markierungen an. Die Expansion der Zellen ohne IGFBP2 und Angptl5 führte zu höheren globalen H3K27me3 Leveln. ChiP-seq Analysen zeigten eine Zytokin-Cocktail-abhängige Neuverteilung von H3K27me3 Mustern. Die chemische Inhibition der H3K27me-Transferase EZH2 wirkte dem Kultivierungs-assoziierten Verlust des NSG Repopulationspotentials entgegen. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass durch die Zugabe von spezifischen Zytokinen in das Kulturmedium Veränderungen auf Chromatinebene verbunden sind, die dem kultivierungs-assoziierten Verlust des Repopulationspotentials entgegen wirken. Diese Daten zeigen weiterhin, dass die durch die PRC2 Komponente EZH2 vermittelte H3K27me3, nicht jedoch die H3K4me3 Histonmodifikation ein kritischer Faktor für die Etablierung eines die Repopulation fördernden Transkriptionsprogrammes ist. Somit dient diese Arbeit einem besseren molekularen Verständnis der Chromatinveränderungen während der Expansion von CB-HSPCs und eröffnet eine Perspektive für neue epigenetische ex vivo Expansionsstrategien. KW - Epigenetik KW - Hämatopoese KW - PRC2 KW - Cord blood-derived hematopoietic stem and progenitor cells KW - Hematopoietic stem cell ex-vivo expansion Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108073 ER - TY - THES A1 - Kropp, Anna Marlene T1 - Pharmakotherapie-Epigenetik der Depression – DNA-Methylierung des Serotonin-Transporter-Gens (5-HTT, SLC6A4) T1 - Pharmacotherapy-epigenetics of depression – DNA-methylation of the serotonin transporter gene (5-HTT, SLC6A4) N2 - Die unipolare Depression ist eine der häufigsten psychiatrischen Erkrankungen und geht mit einem hohen Leidensdruck für die Betroffenen einher. Die Symptomatik der Depression besteht v.a. aus gedrückter Stimmung, Interessenverlust und Antriebslosigkeit und führt bei den Betroffenen zu Einbußen in der sozialen und beruflichen Funktionalität. Daneben leiden die Patienten aber auch unter wechselnden Therapieversuchen u.a. aufgrund von fehlendem Ansprechen auf Medikamente. Trotz intensiver Forschung sind die Mechanismen der Krankheitsentstehung und die Wirkweise der antidepressiven Therapie nur teilweise verstanden. Genetische Studien identifizierten einige Suszeptibilitätsgene, die jedoch die Erblichkeit der depressiven Erkrankung nicht ausreichend erklären. Diese „missing heritability“ könnte durch epigenetische Faktoren wie z.B. Veränderungen in der DNA-Methylierung bedingt sein. Neben einer ätiopathogenetischen Rolle kommen epigenetische Modifikationen auch als Marker zur Prädiktion des Therapieerfolgs sowie als Korrelat des biologischen Wirkmechanismus der antidepressiven Therapie infrage. Die vorliegende Arbeit untersuchte daher die Pharmakotherapie-Epigenetik eines Suszeptibilitätsgens (SLC6A4, 5 HTT), das den Serotonin-Transporter kodiert. Hierbei wurde die wechselseitige Beziehung zwischen der antidepressiven Pharmakotherapie und der DNA-Methylierung von neun CpG-Dinukleotiden des Serotonin-Transporter-Gens in Hinblick auf den Therapieerfolg analysiert. Dabei kamen molekularbiologische Methoden wie die Bisulfitsequenzierung zur Ermittlung der DNA-Methylierung sowie psychometrische Diagnostik zur Quantifizierung des Therapieansprechens zum Einsatz. Stationär aufgenommene Patienten mit einer aktuellen depressiven Episode wiesen einen eher geringen durchschnittlichen Methylierungsgrad des Serotonin-Transporter-Gens von 5,5 % auf, wobei die Werte der einzelnen CpG-Dinukleotide von 1,6 % bis 9,8 % reichten. Die mittlere Methylierung zu Studienbeginn sowie die Methylierung der einzelnen CpG-Dinukleotide zeigte dabei keine Korrelation mit dem Therapieerfolg, d.h. der Änderung im Hamilton-Score. Patienten mit hoher und niedriger Methylierung unterschieden sich nicht eindeutig im Wochenverlauf der Hamilton-Scores und auch eine Einteilung der Patienten nach Response bzw. Remission ergab keine Unterschiede der SLC6A4-Methylierung in den jeweiligen Gruppen. Der Methylierungsstatus des 5 HTT-Gens sowie die Methylierungswerte einzelner CpG-Dinukleotide sind demnach diesen Daten zufolge nicht zur Prädiktion des Therapieerfolgs geeignet. Nach sechswöchiger Psychopharmakotherapie lag die mittlere Methylierung bei 6,0 %, wobei keine signifikante Veränderung nachgewiesen werden konnte. Einzelne CpG-Dinukleotide zeigten jedoch einen Trend zu einer Methylierungszunahme. Die mittlere Methylierungänderung korrelierte nicht mit der Änderung des Hamilton-Scores, nur für CpG6 und CpG9 ergaben sich nominell signifikante positive Korrelationen. Gruppiert nach Response bzw. Remission konnte kein signifikanter Unterschied der mittleren Methylierungsänderungen nachgewiesen werden. Bei Therapie-Respondern schien die Methylierung an den meisten CpG-Dinukleotiden zuzunehmen. Lediglich bei CpG6, CpG8 und CpG9 wiesen Non-Responder eine stärkere Methylierungszunahme auf. Auffällig war v.a. CpG1, das bei Non-Respondern eine nominell signifikante Methylierungsabnahme zeigte. Demnach besteht möglicherweise ein Zusammenhang zwischen der Methylierungsänderung einzelner CpG-Dinukleotide des 5 HTT-Gens unter antidepressiver Therapie und dem Therapieerfolg der Patienten. In Bezug auf die Pharmakotherapie hatten ausschließlich SSRI einen signifikanten Einfluss auf die Änderung der SLC6A4-Methylierung. Dabei zeigten Patienten unter SSRI-Therapie eine deutliche Methylierungszunahme, die synergistisch mit der Blockade des Serotonin-Transporters wirken könnte. Epigenetische Modifikationen des 5 HTT-Gens kommen folglich als molekularer Wirkmechanismus dieser Behandlung in Betracht und implizieren neue Ansätze für innovative Pharmakotherapeutika. Die vorliegende Arbeit liefert somit einen Beitrag zum Verständnis der zugrundeliegenden molekularbiologischen Prozesse der antidepressiven Therapie. Zur Sicherung und Replikation der gefundenen Ergebnisse sind jedoch weitere Studien mit größeren und genauestens charakterisierten Stichproben nötig. N2 - Unipolar Depression is one of the most frequent psychiatric diseases and is characterized by an enormous strain for the persons affected. The symptoms of depression are composed of depressed mood, loss of interest and reduced energy and cause deficits in social and professional functionality. Additionally, patients suffer from changing treatment attempts due to non-response to medication. Despite intensive research, mechanisms of disease development and antidepressant action are only partly understood. Genetic studies identified several susceptibility genes which however cannot completely explain the heritability of depressive disorder. This „missing heritability” could be due to epigenetic factors like e.g. changes in DNA methylation. Besides an etiopathogenetic role, epigenetic modifications can also be considered as predictive markers of therapy success as well as biological mechanisms of antidepressant therapy. Thus the present study investigated the pharmacotherapy-epigenetics of a susceptibility gene (SLC6A4, 5 HTT) which codes for the serotonin transporter. The reciprocal relation between antidepressant pharmacotherapy and DNA methylation of nine CpG dinucleotides of the serotonin transporter gene was analysed with regard to therapy success. Therefore molecular biological methods like bisulfite sequencing to determine DNA methylation as well as psychometric diagnostics to quantify therapy response were used. In-patients with acute depressive episode showed a rather low mean methylation level of the serotonin transporter gene of 5,5 % while values of the individual CpG dinucleotides ranged from 1,6 % to 9,8 %. The mean methylation at baseline as well as the methylation of the individual CpG dinucleotides did not show a correlation with therapy success that is the change in Hamilton score. Patients with high and low methylation did not differ in weekly Hamilton scores and a classification of patients by response or remission status did not yield any difference in SLC6A4 methylation between the respective groups. According to this data, the methylation status of the 5-HTT gene as well as the methylation values of the individual CpG dinucleotides are therefore not applicable for the prediction of therapy success. After six weeks of psychopharmacotherapy the mean methylation was 6,0 % whereas no significant change could be detected. However, individual CpG dinucleotides showed a trend towards an increase of methylation. The mean change in methylation did not correlate with the change in Hamilton score, only for CpG6 and CpG9 nominally significant positive correlations were demonstrated. Grouped by response and remission respectively, no significant difference in mean methylation change was detected. The methylation of the most CpG dinucleotides seemed to increase in therapy responders. Only at CpG6, CpG8 and CpG9 non-responder revealed a stronger increase in methylation. Noticeable above all was CpG1, that showed a nominally significant decrease in methylation in non-responders. Therefore a relation possibly might exist between methylation change of individual CpG dinucleotides of the 5-HTT gene under antidepressant therapy and therapy success of the patients. With regard to pharmacotherapy only SSRI had a significant influence of the change in SLC6A4 methylation. Patients under SSRI therapy showed a clear increase in methylation, which could act synergistic with the blockade of the serotonin transporter. Therefore epigenetic modifications of the 5-HTT gene should be considered as molecular mechanism of action of this treatment and implicate new approaches for innovative pharmacotherapeutics. The present work thus provides a contribution to the understanding of underlying molecular biological processes of antidepressant therapy. To assure and replicate the detected results further studies with larger and precisely characterized samples are necessary. KW - Depression KW - Epigenetik KW - Serotonin KW - Pharmakoepigenetik KW - Serotonin-Transporter-Gen KW - DNA-Methylierung KW - Antidepressiva Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-166064 ER - TY - THES A1 - Reichenbach, Juliane Renate T1 - Paternal age effects on sperm DNA methylation and its impact on the next generation T1 - Der väterliche Alterseffekt auf das Spermienmethylom und seine Auswirkungen auf die nächste Generation N2 - The effect of late parenthood on the offspring´s physical and mental health status has recently become an increasingly important topic of discussion. Studies on neurodevelopmental disorders in children of older parents (Naserbakht et al., 2011) outline the negative consequences of aging fathers as unpredictable compared to the better-understood unfavorable maternal influences (Cedars et al. 2015). This may be due to the fact that lifelong production of male gametes becomes more susceptible to error, not only for somatic mutations. Non-genomic mechanisms such as epigenetic methylation also alter DNA dynamically throughout life (Jones et al., 2015) and influence the aging human sperm DNA (Jenkins et al., 2014). These methylation changes may be transmitted to the next generation via epigenetic inheritance mechanisms (Milekic et al., 2015), which may negatively impact the sensitive epigenetic regulation of cell differentiation in the embryonic period (Curley et al., 2011; Spiers et al., 2015). Accordingly, Nardone et al. (2014) reported several hypomethylated regions in autistic patients, illustrating potential epigenetic influences on the multifactorial pathogenesis of neuropsychiatric disorders. In the present study, the methylation status of five gene regions in the sperm DNA of males of different ages was analyzed by two techniques - pyrosequencing and deep bisulfite sequencing. Two gene regions, FOXK1 and DMPK, showed a highly significant age-related methylation loss and FOXK1 a reduced methylation variation at the level of single alleles. In addition, the examined gene region of FOXK1 showed significant methylation changes in the fetal cord blood DNA of the respective offspring of the sperm donor. This fact suggests a transfer of age-related methylation loss to the next generation. Interestingly, a methylation analysis at the level of single alleles showed that the methylation loss was inherited exclusively by the father. FOXK1 is a transcription factor that plays an important role in the epigenetic regulation of the cell cycle during embryonic neuronal development (Huang et al., 2004; Wijchers et al., 2006). For this reason, the methylation status of FOXK1 in the blood of autistic patients and an age- and sex-matched control group was investigated. While both groups showed age-associated FOXK1 methylation loss, a faster dynamics of methylation change was observed in the autistic group. Although further studies are needed to uncover inheritance mechanisms of epigenetic information, the present results show an evident influence of age-related methylation changes on offspring. When advising future fathers, it is important to consider how the paternal epigenome is altered by aging and can have a negative impact on the developing embryo. N2 - Die Auswirkungen einer späten Elternschaft auf die körperliche und geistige Gesundheit der Nachkommen wurde in letzter Zeit zunehmend diskutiert. Studien zu neurologischen Entwicklungsstörungen bei Kindern älterer Eltern (Naserbakht et al. 2011) skizzieren insbesondere die negativen Folgen alternder Väter (Cedars et al. 2015). Dies ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass die lebenslange Produktion männlicher Gameten im Laufe des Lebens nicht nur für somatische Mutationen fehleranfälliger wird. Auch nicht-genomische Mechanismen wie die epigenetische Methylierung verändert die DNA im Laufe des Lebens dynamisch (Jones et al. 2015) und beeinflussen die alternde menschliche Spermien-DNA (Jenkins et al. 2014). Möglicherweise werden diese Methylierungsveränderungen über epigenetische Vererbungsmechanismen an die nächste Generation übertragen (Milekic et al. 2015), was sich negativ auf die empfindliche epigenetische Regulation der Zelldifferenzierung in der Embryonalperiode auswirken kann (Curley et al. 2011; Spiers et al. 2015). Mögliche epigenetische Einflüsse auf die multifaktorielle Pathogenese neuropsychiatrischer Erkrankungen veranschaulichend, zeigten Nardone et al. (2014) mehrere hypomethylierte Regionen bei autistischen Patienten auf. In der vorliegenden Arbeit wurde der Methylierungsstatus von fünf Genregionen in der Spermien-DNA von Männern unterschiedlichen Alters durch zwei Techniken analysiert – das Pyrosequencing und das Deep Bisulfite Sequencing. Zwei Genregionen, FOXK1 und DMPK, zeigten einen hochgradig signifikanten altersbedingten Methylierungsverlust und FOXK1 auf der Ebene einzelner Allele eine verringerte Methylierungsvariation. Darüber hinaus zeigte die untersuchte Genregion von FOXK1 signifikante Methylierungsveränderungen in der Nabelschnurblut-DNA der jeweiligen Nachkommen der Samenspender. Diese Tatsache spricht für eine Übertragung des altersbedingten Methylierungsverlustes auf die nächste Generation. Anhand einer Methylierungsanalyse auf der Ebene einzelner Allele konnte interessanterweise gezeigt werden, dass der Methylierungsverlust ausschließlich durch den Vater vererbt wurde. FOXK1 ist ein Transkriptionsfaktor, der eine wichtige Rolle bei der epigenetischen Regulation des Zellzyklus während der embryonalen neuronalen Entwicklung spielt (Huang et al. 2004; Wijchers et al. 2006). Aus diesem Grund wurde der Methylierungsstatus von FOXK1 im Blut autistischer Patienten und einer alters- und geschlechtsentsprechenden Kontrollgruppe untersucht. Während beide Gruppen einen altersassoziierten FOXK1-Methylierungverlust zeigten, wurde in der autistischen Gruppe eine schnellere Dynamik der Methylierungsänderung beobachtet. Obwohl weitere Studien erforderlich sind, um Vererbungsmechanismen epigenetischer Information aufzudecken, zeigen die vorliegenden Ergebnisse einen offensichtlichen Einfluss altersbedingter Methylierungsveränderungen auf die Nachkommen. Bei der Beratung zukünftiger Väter ist es wichtig zu berücksichtigen, wie das väterliche Epigenom durch das Altern verändert wird und negative Auswirkungen auf den sich entwickelnden Embryo haben kann. KW - Epigenetik KW - Vater KW - Spermium KW - Autismus KW - Methylierung KW - paternal age KW - epigenetics KW - sperm KW - methylation KW - reproduction KW - autism KW - Väterliches Alter KW - Epigenetik KW - Spermien KW - Methylierung Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199805 ER - TY - THES A1 - Riemens, Renzo J. M. T1 - Neuroepigenomics in Alzheimer’s disease: The single cell ADds T1 - Neuroepigenomik bei der Alzheimer-Krankheit: Die Einzelzell ADds N2 - Die Forschung, die in dieser Arbeit zusammengestellt wird, kann in zwei Teile geteilt werden. Der erste Teil, bestehend aus vier Kapiteln, konzentriert sich auf die Rolle der epigenetischen Dysregulation in der Ätiopathophysiologie der sporadischen Alzheimer-Krankheit (sAD). Neben Einblicken in die neuesten Entwicklungen in neuroepigenomischen Studien zu dieser Krankheit geht der erste Teil der Arbeit auch auf verbleibende Herausforderungen ein und gibt einen Ausblick auf mögliche Entwicklungen auf diesem Gebiet. Der zweite Teil, der drei weitere Kapitel umfasst, konzentriert sich auf die Anwendung von auf induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) basierenden Krankheitsmodellen für das Studium der AD, einschließlich, aber nicht beschränkt auf mechanistische Studien zur epigenetischen Dysregulation unter Verwendung dieser Plattform. Neben der Skizzierung der bisherigen Forschung mit iPSC-basierten Modellen für sAD gibt der zweite Teil der Arbeit auch Einblicke in die Gewinnung krankheitsrelevanter Nervenkulturen auf Basis der gezielten Differenzierung von iPSCs und beinhaltet darüber hinaus einen experimentellen Ansatz für den Aufbau eines solchen Modellsystems. N2 - The research that is compiled in this thesis can be divided in two parts. The first part, consisting of four chapters, is centered around the role of epigenetic dysregulation in the etiopathophysiology of sporadic alzheimer's disease (sAD). In addition to providing insights into the most recent developments in neuroepigenomic studies of this disease, the first part of the thesis also touches upon remaining challenges, and provides a future outlook on possible developments in the field. The second part, which includes three more chapters, is focused on the application of induced pluripotent stem cell (iPSC)-based disease models for the study of AD, including but not limited to mechanistic studies on epigenetic dysregulation using this platform. Aside from outlining the research that has been conducted using iPSC-based models for sAD to date, the second part of the thesis also provides insights into the acquisition of disease-relevant neural cultures based on directed differentiation of iPSCs, and furthermore includes an experimental approach for the establishment of such a model system. KW - Epigenetik KW - Alzheimerkrankheit KW - Neuroepigenomics KW - Alzheimer's disease Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-254574 SN - 978-94-6423-524-1 ER - TY - THES A1 - Jakob, Sissi T1 - Molecular mechanisms of early-life stress in 5-Htt deficient mice: Gene x environment interactions and epigenetic programming T1 - Molekulare Mechanismen von Entwicklungsstress bei 5-Htt defizienten Mäusen: Gen x Umwelt Interaktionen und epigenetische Programmierung N2 - Early-life stress has been shown to influence the development of the brain and to increase the risk for psychiatric disorders later in life. Furthermore, variation in the human serotonin transporter (5-HTT, SLC6A4) gene is suggested to exert a modulating effect on the association between early-life stress and the risk for depression. At the basis of these gene x environment (G x E) interactions, epigenetic mechanisms, such as DNA-methylation, seem to represent the primary biological processes mediating early-life programming for stress susceptibility or resilience, respectively. The exact molecular mechanisms however remain to be elucidated, though. In the present study, we used two different stress paradigms to assess the molecular mechanisms mediating the relationship between early-life stress and disorders of emotion regulation later in life. First, a 5-Htt x prenatal stress (PS) paradigm was applied to investigate whether the effects of PS are dependent on the 5-Htt genotype. For this purpose, the effects of PS on cognition and anxiety- / depression-related behavior were examined using a maternal restraint stress paradigm of PS in C57BL/6 wild-type (WT) and heterozygous 5-Htt deficient (5-Htt+/-) mice. Additionally, in female offspring, a genome-wide hippocampal gene expression and DNA methylation profiling was performed using the Affymetrix GeneChip® Mouse Genome 430 2.0 Array and the AffymetrixGeneChip® Mouse Promoter 1.0R Array. Some of the resulting candidate genes were validated by quantitative real-time PCR. Further, the gene expression of these genes was measured in other brain regions of the PS animals as well as in the hippocampus of offspring of another, 5-Htt x perinatal stress (PeS) paradigm, in which pregnant and lactating females were stressed by an olfactory cue indicating infanticide. To assess resilience to PS and PeS, correlation studies between gene expression and behaviour were performed based on an initial performance-based LIMMA analysis of the gene expression microarray. 5-Htt+/- offspring of the PS paradigm showed enhanced memory performance and signs of reduced anxiety as compared to WT offspring. In contrast, exposure of 5-Htt+/- mice to PS was associated with increased depression-like behavior, an effect that tended to be more pronounced in female offspring. Further, 5-Htt genotype, PS and their interaction differentially affected the expression and DNA methylation of numerous genes and related pathways within the female hippocampus. Specifically, MAPK and neurotrophin signaling were regulated by both the 5-Htt+/- genotype and PS exposure, whereas cytokine and Wnt signaling were affected in a 5-Htt genotype x PS manner, indicating a gene x environment interaction at the molecular level. The candidate genes of the expression array could be validated and their expression patterns were partly consistent in the prefrontal cortex and striatum. Furthermore, the genotype effect of XIAP associated factor 1 (Xaf1) was also detected in the mice of the PeS paradigm. Concerning resilience, we found that the expression of growth hormone (Gh), prolactin (Prl) and fos-induced growth factor (Figf) were downregulated in WTPS mice that performed well in the forced swim test (FST). At the same time, the results indicated that Gh and Prl expression correlated positively with adrenal weight, whereas Figf expression correlated positively with basal corticosteron concentration, indicating an intricate relationship between depression-like behavior, hippocampal gene expression and the hypothalamo-pituitary-adrenal (HPA) axis activity. Correlation studies in the PeS animals revealed a link between Gh / Prl expression and anxiety-like behavior. In conclusion, our data suggest that although the 5-Htt+/- genotype shows clear adaptive capacity, 5-Htt+/- mice, particularly females, appear to be more vulnerable to developmental stress exposure when compared to WT offspring. Moreover, hippocampal gene expression and DNA methylation profiles suggest that distinct epigenetic mechanisms at the molecular level mediate the behavioral effects of the 5-Htt genotype, PS exposure, and their interaction. Further, resilience to early-life stress might be conferred by genes whose expression is linked to HPA axis function. N2 - Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass Stress während der Entwicklung die Gehirnentwicklung beinflusst und das Risiko an psychischen Störungen zu erkranken erhöht. Weiterhin wird vermutet, dass eine Variation im humanen Serotonintransportergen (5-HTT, SLC6A4) einen modulierenden Einfluss auf die Assoziation zwischen Entwicklungsstress und dem Risiko für Depression ausübt. Als Basis dieser Gene x Umwelt (GxE)-Interaktion scheinen epigenetische Mechanismen, wie DNA-Methylierung, die biologischen Prozesse darzustellen, die die Programmierung von Stressanfälligkeit oder Resilienz vermitteln. Die exakten molekularen Mechanismen sind jedoch noch unbekannt. In dieser Studie wurden zwei verschiedene Stressparadigma verwendet um die molekularen Mechanismen zu klären, die Stress während der Entwicklung und emotionalen Störungen später im Leben zu Grunde liegen. Zuerst wurde ein 5-Htt x pränatales Stress (PS)-Paradigma verwendet um zu untersuchen, ob die Effekte von pränatalem Stress abhängig von dem 5-Htt Genotypen sind. Aus diesem Grund wurden die Effekte von PS auf Kognition, Angst- und Depressions-ähnliches Verhalten untersucht indem ein “maternal restraint stress”-Paradigma in C57BL/6-Wildtyp (WT) und heterozygoten 5-Htt defizienten (5-Htt+/-) Mäusen angewandt wurde. Zusätzlich wurde mit Hilfe des Affymetrix GeneChip® Mouse Genome 430 2.0 Arrays und des AffymetrixGeneChip® Mouse Promoter 1.0R Arrays bei den weiblichen Nachkommen ein Genexpressions- und DNA-Methylierungsprofil erstellt. Einige der daraus resultierenden Kandidatengene wurden mit quantitativer real-time PCR (qRT-PCR) validiert. Weiterhin wurde die Genexpression von diesen Genen auch in anderen Gehirnregionen der PS-Mäuse und im Hippocampus von Nachkommen aus einem perinatalem (PeS) Paradigma gemessen. In dem PeS-Paradigma wurden schwangere und stillende Weibchen durch einen olfaktorischen Stimulus, der Infantizid anzeigt, gestresst und die Nachkommen (WT und 5-Htt+/-) untersucht. Um PS- und PeS-Resilienz zu messen wurden Korrelationsstudien durchgeführt. Zuvor wurde eine LIMMA-Analyse, die auf dem Verhalten von den Mäusen im Forced swim-Test (FST) beruht, gerechnet. Im Vergleich zu WT Nachkommen zeigten 5-Htt+/- Nachkommen des PS-Paradigmas verbesserte Gedächtnisleistung und Zeichen von reduzierter Angst. Im Gegensatz dazu war PS-Exposition von 5-Htt+/- Mäusen mit erhöhtem Depressions-ähnlichem Verhalten assoziiert, ein Effekt, der tendenziell eher in den weiblichen Nachkommen auffiel. Weiterhin beeinflussten der 5-Htt-Genotyp, PS und die Interaktion von beiden die Genexpression und DNA-Methylierung zahlreicher Gene und damit verbundene Signalwege im weiblichen Hippocampus. Der MAPK- und Neurotrophin-Signalweg wurden zum Beispiel durch den 5-Htt-Genotyp und PS-Exposition reguliert, wohingegen der Zytokin-und Wnt-Signalweg in einer 5-Htt x PS Art beeinflusst wurden, was Gen x Umwelt-Interaktionen auf der molekularen Ebene andeutet. Die Kandidatengene konnten zumeist validiert werden und waren zum Teil auch im präfrontalen Kortex sowie im Striatum differentiell exprimiert. Weiterhin konnte der Genotypeffekt von XIAP associated factor 1 (Xaf1) in den Mäusen des PeS-Paradigmas nachgewiesen werden. Bezüglich der Resilienz konnten wir eine Herunterregulierung der Expression des Wachstumshormons (Gh), Prolaktins (Prl) und des fos-induzierten Wachstumsfaktors (Figf) in den WTPS-Mäusen detektieren, die eine gute Leistung im FST gezeigt haben. Gleichzeitig korrelierten die Gh- und Prl-Expression positiv mit dem Gewicht der Nebennieren, wohingegen die Figf-Expression mit dem basalen Kortikosteron-Konzentration positiv korrelierte, was eine komplizierte Beziehung zwischen Depressions-ähnlichem Verhalten, hippocampaler Genexpression und der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren (HPA)-Achsenaktivität andeutet. Korrelationsstudien über die PeS-Tiere deckten einen Link zwischen der Gh- und Prl-Expression und Angst-ähnlichem Verhalten auf. Schließlich lassen unsere Daten den Schluss zu, dass, auch wenn der 5-Htt-Genotyp eine klare adaptive Kapazität aufweist, die 5-Htt+/- Mäuse, insbesondere die Weibchen im Vergleich zu den WT-Mäusen eine erhöhte Vulnerabilität für Entwicklungsstress zu zeigen scheinen. Weiterhin könnten die hippocampale Genexpressions- und DNA-Methylierungsprofile darauf schließen lassen, dass epigenetische Mechanismen auf der molekularen Ebene die Verhaltenseffekte des 5-Htt Genotyps, PS-Exposition und ihrer Interaktion vermitteln. Darüber hinaus könnte Resilienz zu Entwicklungsstress durch Gene reguliert werden, die mit der HPA-Achsen-Funktion assoziiert sind. KW - Stressreaktion KW - Serotonin KW - Epigenetik KW - pränataler Stress KW - Serotonintransporter KW - Gen Umweltinteraktion KW - prenatal stress KW - serotonin transporter KW - gene environment interaction Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74150 ER - TY - THES A1 - Hilligardt [geb. Rück], Deborah T1 - Methylierung pro- und antiinflammatorischer T-Helfer-Zell-spezifischer Transkriptionsfaktoren bei ausgewählten Krankheitsbildern T1 - Methylation of pro- and anti-inflammatory t-helper cell specific transcription factors in different disease pattern N2 - Die Regulation krankheitsrelevanter Gene und deren Proteine über Veränderungen in der DNA-Methylierung stellen einen wichtigen und zugleich noch unzureichend erforschten Bereich bei Erkrankungen mit inflammatorischer Komponente dar. In dieser Arbeit wurde die Methylierung pro- und antiinflammatorischer Gene im hypoxischen Setting hervorgerufen durch Präeklampsie, Angsterkrankung und Inflammation bei Sklerodermie untersucht. Zur Bestimmung der prozentualen Methylierung wurde Pyrosequenzierung durchgeführt. Bei einem Teil der Proben erfolgte zusätzlich die Bestimmung der Genexpression mittels Real Time PCR. Bei Angsterkrankung zeigte sich eine signifikante Hypermethylierung am Promotor des Treg spezifischen Transkriptionsfaktors FOXP3. Daraus könnte eine beeinträchtigte Funktion der Tregs und somit eine erhöhte Komorbidität resultieren. In der Gruppe der an Sklerodermie erkrankten Personen zeigte sich entgegen den Erwartungen eine signifikant höhere RORC1 und RORC2 Methylierung. Eine Genexpressionsanalyse erbrachte eine signifikant niedrigere Expression von RORC bei Sklerodermie im Vergleich zu gesunden Kontrollen. Diese überraschenden Ergebnisse könnten der Methodik geschuldet sein. Auf eine Auftrennung der verschiedenen T-Zellen vor Messung der Methylierung wurde verzichtet. Plazentagewebe bei Präeklampsie zeigte eine signifikant geringere Methylierung am FOXP3 Promotor als Plazentagewebe von gesunden Schwangeren. Die Veränderbarkeit der DNA-Methylierung durch äußere Einflüsse und Medikamente stellt hierbei einen vielversprechenden Ansatzpunkt für zukünftige Therapien dar und sollte in weiteren Studien konkretisiert werden. N2 - Epigenetic research offers new insights about the regulation of gene activities and provides important knowledge of the pathogenesis of diseases. Hypoxic conditions through preeclampsia, panic disease and inflammation in systemic sclerosis were used to measure the methylation level of pro- and anti-inflammatory genes. The analyses were performed with PBMCs and placental tissue. To determine the methylation level pyrosequencing was used. Gene expression through real time PCR was additionally analyzed with part of the samples. A significant hypermethylation of the promoter of the Treg specific transcription factor FOXP3 in patients with panic diseases was shown. This could be a reason for the impaired function of Tregs in panic disorder and could cause the comorbidity of several diseases. Against expectations the transcription factor RORC was significantly higher methylated in patients with scleroderma and the gene expression was lower compared to the healthy control group. This surprising result might be caused through the used methods: t-cells were not divided into their subgroups. It could be possible that Th1- and Th2-cells are responsible for the hypermethylation of RORC. Placental tissue of patients with preeclampsia showed significant lower methylation levels of the FOXP3 promoter than tissue of healthy pregnant women. The convertibility of DNA methylation with external factors and pharmaceuticals is a promising approach for therapies and should be substantiated in future studies. KW - Methylierung KW - Epigenetik KW - Präeklampsie KW - Angststörung KW - Sklerodermie Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249499 ER -