TY - THES A1 - Milenkovic, Vladimir M. T1 - Structural and functional analysis of bestrophin N2 - Morbus Best (OMIM 153700), auch als vitelliforme Makuladystrophie Typ 2 (VMD2) bezeichnet, ist eine autosomal dominant vererbte Makuladystrophie mit juvenilem Beginn. Die Erkrankung geht einher mit einer Ansammlung von Lipofuscin-ähnlichem Material im sowie unterhalb des retinalen Pigmentepithels (RPE). Das bei Morbus Best mutierte VMD2- Gen kodiert für ein 585 Aminosäuren langes Transmembranprotein, genannt Bestrophin, und wird vorwiegend im RPE exprimiert. Das Protein hat eine komplexe Membrantopologie mit 4-6 putativen Transmembrandomänen (TMD) und ist vermutlich in den Ca2+-abhängigen Transport von Chloridionen durch die Plasmamembran involviert. Die überwiegende Mehrheit der krankheitsassoziierten Veränderungen bei M. Best Patienten sind Missense-Mutationen, die innerhalb der hochkonservierten N-terminalen Hälfte des Proteins nahe der mutmaßlichen Transmembrandomänen akkumulieren. Der Zusammenhang zwischen Pathologie und identifizierter Mutationen bzw. der Chloridkanal- Funktion von Bestrophin-1 ist noch unklar. Um die biologische Funktion von Bestrohin-1 weiter aufzuklären und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der BMD besser zu verstehen, wurde mit Hilfe des GAL4-basierenden Hefe-Zwei-Hybridsystems (Y2H) nach interagierenden Partnern von Bestrophin-1 gesucht. Ein Screen in einer bovinen RPE cDNABank mit verschiedenen verkürzten Fragmenten von Bestrophin-1 ergab 53 mögliche interagierende Partner. Allerdings schlossen anschließende Verifikationsexperimente die Kandidatengene aus. Somit deuten die Resultate dieser umfangreichen YH2-Studie daraufhin, dass Bestrophin für das herkömmliche Zwei-Hybrid-System nicht geeignet ist. Zum einen könnte dies daran liegen, dass das Protein ein integraler Bestandteil der Membran ist und zum anderen, dass möglicherweise der Transport der gewählten Bestrophin-Fragmente zum Nukleus nicht stattfindet. Dies gilt jedoch als Grundvoraussetzung für eine Proteininteraktion im Hefe-2-Hybridsystem. Bestrophin gehört zu einer großen Familie von integralen Membranproteinen, von der bis heute bereits über 100 Mitglieder bei verschiedenen Organismengruppen wie denSäugern, Insekten und Würmern identifiziert werden konnten. Als auffälligste Besonderheit in der Familie der Bestrophine zeigt sich neben einer nicht-variablen RFP-Domäne (Arginin- Phenylalanin-Prolin) eine evolutionär hochkonservierte N-terminale Region. Um die phylogenetische Beziehung der Bestrophine zu untersuchen sowie den Aufbau und die Funktion von konservierten Motiven innerhalb der Familienmitglieder zu identifizieren, wurde diese konservierte N-terminale Region sowohl bioinformatisch wie auch Chapter Two: Zusammenfassung 4 phylogenetisch weiter untersucht. Die phylogenetische Analyse der Bestrophin Homologen brachte vier evolutionär konservierte Familienmitglieder in Säugern hervor, die jeweils eine starke Homologie zu den Proteinen VMD2, VMD2-L1 bis VMD2-L3 des Menschen zeigen. Die signifikante Ähnlichkeit der Proteinsequenz innerhalb der vier Familienmitglieder lässt die Schlussfolgerungen zu, dass zum einen jedes einzelne Familienmitglied ihre eigene evolutionär konservierte Funktion hat und zum anderen dass die Divergenz des Bestrophins in verschiedene Familienmitglieder zeitlich vor der Divergenz der verschiedenen Säugerspezien erfolgt sein muss. N2 - Best disease, also termed vitelliform macular dystrophy type 2, VMD2, (OMIM #153700), is an autosomal dominant, early onset macular dystrophy associated with a remarkable accumulation of lipofuscin-like material within and beneath the retinal pigment epithelium (RPE). The VMD2 gene mutated in Best disease encodes a 585 amino acid putative transmembrane protein named bestrophin, and is preferentially expressed in the RPE. The protein has a complex membrane topology with 4-6 putative transmembrane domains (TMDs) and is presumably involved in Ca2+-dependent transport of chloride ions across the membrane. The vast majority of known disease-associated alterations are missense mutations nonrandomly distributed across the highly conserved N-terminal half of the protein with clusters near the predicted TMDs. The mechanism connecting Best disease pathology with the identified mutations or the Cl- channel function is not yet clear. To further elucidate the biological function of the bestrophin protein and to identify the molecular mechanisms underlying the disease, a search for interacting partners of bestrophin was performed using the GAL4-based yeast two hybrid system (Y2H). Screening of a bovine RPE cDNA library with various truncated bestrophin baits resulted in the identification of 53 putative interacting partners of bestrophin. However, verification of the interaction has excluded all candidate clones. Our comprehensive Y2H analyses suggest that bestrophin may not be suitable for traditional yeast two hybrid screens likely due to the fact that the protein is integral to the membrane and even fragments thereof may not be transported to the nucleus which is, however a prerequisite for protein interaction in the yeast system. Bestrophin belongs to a large family of integral membrane proteins with more than 100 members identified to date originating from evolutionarily diverse organisms such as mammals, insects and worms. The most distinctive feature of the bestrophin family, besides the invariant RFP (arginine-phenylalanine-proline) domain, is an evolutionarily highly conserved N-terminal region. To clarify the phylogenetic relationship among bestrophin homologues and to identify structural and functional motifs conserved across family members, a bioinformatics/phylogenetic study of the conserved N-terminal region was conducted. Phylogenetic analysis of the bestrophin homologues reveals existence of four evolutionary conserved family members in mammals, with high homology to the human VMD2, VMD2-L1 to L3 proteins. The significant level of protein sequence similarity between divergent species suggests that each of the bestrophin family members has a unique, Chapter One: Summary 2 evolutionarily conserved function and that the divergence of bestrophin into several family members occurred before the divergence of individual mammalian species. KW - Makuladegeneration KW - Membranproteine KW - Molekularbiologie KW - VMD2 KW - bestrophin KW - VMD2 KW - bestrophin Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19372 ER - TY - THES A1 - Marquardt, Andreas T1 - Positionsklonierung des Morbus Best-Gens VMD2 T1 - Positional cloning of the Best's Disease gene VMD2 N2 - Die Dissertation beschreibt die Positionsklonierung von VMD2, einem Krankheitsgen des Menschen, dass der dominant vererbten vitelliformen Makuladystrophie Typ 2 (VMD2) zugrundeliegt. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein etwa 1.4 Mbp großer Klon-'Contig' aus artifiziellen Phagenchromosomen ('phage artificial chromosomes', PAC) erstellt, der die VMD2-Kandidatengenregion auf Chromosom 11q12-q13.1 physikalisch repräsentiert. Durch die Identifizierung polymorpher (CA)n-Dinukleotidmarker aus dem kritschen Intervall und anschließender Kopplungsanalyse gelang es, die Kandidatengenregion auf ca. 500 kbp zu reduzieren. In der öffentlichen Datenbank (GenBank) bereitgestellte Nukleinsäuresequenzen zweier genomischer Klone aus dem Kern des relevanten chromosomalen Bereichs von zusammen etwa 290 kbp wurden dazu genutzt, über eine Kombination aus computergestützter Vorhersagen kodierender Sequenzen, Kartierung von EST-Klonen ('expressed sequence tags'), RT-PCR-Analysen und, wenn erforderlich, 5'-RACE-Experimenten, acht neue Gene des Menschen zu isolieren. Von den charakterisierten Genen erwiesen sich mehrere als potentielle Kandidaten für VMD2. Ein Gen, provisorisch als Transkriptionseinheit TU15B bezeichnet, konnte durch eine Mutationsanalyse schließlich eindeutig mit der Erkrankung assoziiert werden und wurde 1998 als VMD2 publiziert. Drei Gene aus der untersuchten Region kodieren Mitglieder einer Familie von Fettsäuredesaturasen (FADS1, FADS2 und FADS3), während ein anderes Gen ('Rabin3 interacting protein-like 1'; RAB3IL1) signifikante Sequenzidentität zu einem Transkript der Ratte besitzt, welches das GTPase-interagierende Protein Rabin3 kodiert. Den putativen Translationsprodukten drei weiterer Gene (C11orf9, C11orf10 und C11orf11) konnte bislang keine präzise Funktion zugeschrieben werden. Mit FTH1 ('ferritin heavy chain 1') und FEN1 ('flap endonuclease 1') liegen zudem zwei bekannte Gene im analysierten Intervall, deren cDNA-Sequenzen bereits 1984 bzw. 1995 von anderen Forschungsgruppen isoliert und publiziert wurden. Zweifellos kann die Region als sehr genreicher Abschnitt des menschlichen Genoms bezeichnet werden. Neben der Erstellung des PAC-'Contigs', der Einengung der VMD2-Kandidatenregion und der Klonierung von VMD2 war die vollständige genetische Charakterisierung der genannten Fettsäuredesaturase-Gene ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit. Unabhängig von der Klonierung und Charakterisierung des VMD2-Gens sowie der chromosomal eng benachbarten Gene, richtete sich mein Interesse schließlich noch auf drei Gene des Menschen, provisorisch als TU51, TU52 und TU53 bezeichnet, die gemeinsam mit VMD2 eine Genfamilie bilden und auf den Chromosomen 19p13.2-p13.12 (TU51), 12q14.2-q15 (TU52) und 1p32.3-p33 (TU53) lokalisiert werden konnten. Durch die Aufklärung der kodierenden Nukleinsäuresequenzen der Gene wurden konservierte Sequenzabschnitte innerhalb der Genfamilie erkennbar, die auf wichtige funktionelle Abschnitte der Translationsprodukte schließen lassen. N2 - This work describes the positional cloning of the VMD2 gene responsible for vitelliform macular dystrophy type 2 (VMD2), a dominantly inherited eye disorder in human. A physical contig of phage artificial chromosomes (PAC clones) covering 1.4 Mbp of genomic sequence was established, representing the entire VMD2 candidate region on chromosome 11q12-q13.1. Identification and subsequently linkage analysis of polymorphic (CA)n-dinucleotide repeats was performed to refine the critical interval to approximately 500 kbp. Genomic sequences of approximately 290 kbp from the central part of the VMD2 candidate region, available at the public database (GenBank), were helpful to reveal the structure of eight novel genes by using computational exon prediction, comprehensive mapping and assembling of expressed sequence tags (ESTs), RT-PCR and 5'-RACE analysis. Some of the identified genes were found to represent excellent candidates for VMD2. One gene, provisionally designated 'transcription unit 15B' (TU15B) has been shown to be associated with the disease and was published as VMD2 in 1998, according to the official gene nomenclature. Three genes encode family members of the human fatty acid desaturases (FADS1, FADS2 and FADS3), one gene (rab interacting protein like 1, RAB3IL1) shows high sequence identity to Rabin3, an GTPase-interacting protein first described in rat and another three genes encode proteins of unknown function (C11orf9, C11orf10, C11orf11). Additional two genes localized in the same region, FTH1 (ferritin heavy chain 1) and FEN1 (flap endonuclease 1), have been characterized previously by other research groups. The analyzed interval represents a gene-rich segment of the human genome. In addition to the assembly of PAC clones from the VMD2 candidate region, the refinement of the critical interval using polymorphic dinucleotide repeats and the cloning of VMD2, this work also includes the complete characterization of the three fatty acid desaturase genes. Finally, three genes, provisionally termed TU51, TU52 and TU53 showed high sequence identity to VMD2 and were characterized as paralogous members of the VMD2 gene family. The corresponding gene loci were assigned to chromosome 19p13.2-p13.12 (TU51), 12q14.2-q15 (TU52) and 1p32.3-p33 (TU53), respectively. By determining the coding nucleic acid sequences of the genes conserved sequence elements in the gene family were identified, possibly representing functional important protein domains. KW - Makuladystrophie KW - Genort KW - VMD2 KW - Morbus Best KW - Makuladystrophie KW - Makuladegeneration KW - Positionsklonierung KW - Fettsäuredesaturasen KW - FADS1 KW - FADS2 KW - FADS3 KW - VMD2 KW - Best's Disease KW - macula dystrophy KW - macular degeneration KW - positional cloning KW - fatty acid desaturases KW - FADS1 KW - FADS2 KW - FADS3 Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-414 ER - TY - THES A1 - Krämer, Franziska T1 - Molecular and Biochemical Investigations into VMD2, the gene associated with Best Disease T1 - Molekulare und biochemische Untersuchungen zur Charakterisierung des Morbus Best Gens, VMD2 N2 - Best disease (OMIM 153700) is an early-onset, autosomal dominant maculopathy characterized by egg yolk-like lesions in the central retina. The disease gene, the vitelliform macular dystrophy gene type 2 (VMD2), encodes a 585-aa VMD2 transmembrane protein, termed bestrophin. The protein is predominantly expressed on the basolateral side of the retinal pigment epithelium (RPE) and is thought to be involved in the transport of chloride ions. Bestrophin as well as three closely related VMD2-like proteins (VMD2L1-L3) contain multiple putative transmembrane (TM) domains and an invariant tripeptide (RFP) motif in the N-terminal half of the protein. This and the tissue-restricted expression to polarized epithelial cells are typical features of the VMD2 RFP-TM family. Best disease is predominantly caused by missense mutations, clustering in four distinct „hotspots“ in the evolutionary highly conserved N-terminal region of the protein. To further augment the spectrum of mutations and to gain novel insights into the underlying molecular mechanisms, we screened VMD2 in a large cohort of affected patients. In total, nine novel VMD2 mutations were identified, raising the total number of known Best disease-related mutations from 83 to 92. Eight out of nine novel mutations are hotspot-specific missense mutations, underscoring their functional/structural significance and corroborating the dominant-negative nature of the mutations. Of special interest is a one-basepair deletion (Pro260fsX288) encoding a truncated protein with a deletion of an important functional domain (TM domain four) as well as the entire C-terminal half of bestrophin. For the first time, a nonsense mutation leading to a 50 % non-functional protein has been identified suggesting that on rare occassions Best disease may be caused by haploinsufficiency. Molecular diagnostics strongly requires a reliable classification of VMD2 sequence changes into pathogenic and non-pathogenic types. Since the molecular pathomechanism is unclear at present, the pathogenicity of novel sequence changes of VMD2 are currently assessed in light of known mutations. We therefore initiated a publicly accessible VMD2 mutation database (http://www.uni-wuerzburg.de/humangenetics/vmd2.html) and are collecting and administrating the growing number of mutations, rare sequence variants and common polymorphisms. Missense mutations may disrupt the function of proteins in numerous ways. To evaluate the functional consequences of VMD2 mutations in respect to intracellular mislocalization and/or protein elimination, a set of molecular tools were generated. These included the establishment of an in vitro COS7 heterologous expression assay, the generation of numerous VMD2 mutations by site-directed mutagenesis as well as the development of bestrophin-specific antibodies. Surprisingly, membrane fractionation/Western blot experiments revealed no significant quantitative differences between intact and mutant bestrophin. Irrelevant of the type or location of mutation, incorporation of mutant bestrophin to the membraneous fraction was observed. Thus, impaired membrane integration may be ruled out as causative pathomechanism of Best disease consistent with a dominant-negative effect of the mutations. In a different approach, efforts were directed towards identifying and characterizing the VMD2 RFP-TM protein family in mouse. While clarification of the genomic organization of murine Vmd2 was required as basis to generate Vmd2-targeted animals (see below), the study of closely related proteins (Vmd2L1, Vmd2L2 and Vmd2L3) may provide further clues as to the function of bestrophin. For this, biocomputational as well as RT PCR analyses were performed. Moreover, the novel genes were analyzed by real time quantitative RT PCR, displaying predominant expression in testis, colon and skeletal muscle of Vmd2, Vmd2L1 and Vmd2L3 transcripts, respectively as well as in eye tissue. Interestingly, neither an ORF was determined for murine Vmd2L2 nor was the transcript present in a panel of 12 mouse tissues, suggesting that murine Vmd2L2 may represent a functionally inactive pseudogene. The murine Vmd2L3 gene, as its human counterpart, is a highly differentially spliced transcript. Finally, generating mouse models of Best disease will provide essential tools to investigate the pathophysiology of bestrophin in vivo. We have initiated the generation of two different mouse lineages, one deficient of Vmd2 (knock-out) and the other carrying a human disease-related mutation (Tyr227Asn) in the orthologous murine gene (knock-in). Genetic engineering of both constructs has been achieved and presently, four ES clones harboring the homologous recombination event (Vmd2+/-) have been isolated and are ready for the subsequent steps to generate chimeric animals. The resulting mouse lineages will represent two key models to elucidate the functional role of bestrophin in Best disease, in RPE development and physiology. N2 - Morbus Best (OMIM 153700) ist eine autosomal dominant vererbte Makulopathie mit juvenilem Beginn. Charakteristisch sind Eidotter-ähnliche Läsionen im zentralen Bereich der Retina. Das krankheitsverursachende Gen, das vitelliforme Makuladystrophie-Gen Typ 2 (VMD2), kodiert für ein 585 Aminosäuren langes Transmembranprotein. Das als Bestrophin bezeichnete Protein ist vorwiegend auf der basolateralen Seite des retinalen Pigmentepithels (RPE) exprimiert und wahrscheinlich am Transport von Chloridionen beteiligt. Bestrophin wie auch die drei eng-verwandten VMD2-ähnlichen Proteine (VMD2L1-L3) gehören zur Familie der VMD2 RFP-TM Proteine und sind durch putative Transmembrandomänen (TM) und ein invariantes Tripeptid (RFP) gekennzeichnet. Morbus Best wird hauptsächlich durch „missense“ Mutationen verursacht die in vier Bereichen („hotspots“) akkumulieren. Um das Mutationsspektrum zu erweitern und darüber hinaus den zugrundeliegenden molekularen Mechanismus weitergehend aufzuklären, wurde das VMD2 Gen in betroffenen Patienten untersucht. Insgesamt wurden neun bisher nicht beschriebene Mutationen identifiziert, wodurch sich die Anzahl der bekannten krankheitsassoziierten Mutationen auf 92 erhöhte. Wie die meisten der bisher bekannten Mutationen befinden sich acht „missense“ Mutationen in den sogenannten „hotspots“ des Gens. Dies unterstreicht die funktionelle bzw. strukturelle Bedeutung der betroffenen Regionen sowie den dominant-negativen Effekt der Mutationen. Bemerkenswert ist eine atypische 1-Basenpaar-Deletion (Pro260fsX288) in Exon 7. Denn erstmals wurde eine „nonsense“ Mutation im VMD2 Gen identifiziert, die 50 % nicht-funktionelles Protein zur Folge hat. In seltenen Fällen scheint daher die durch „nonsense“ Mutationen bedingte Haploinsuffizienz der Krankheit zugrunde liegen. Die molekulare Diagnostik verlangt eine zuverlässliche Einteilung der VMD2 Sequenzänderungen in pathogene und nicht-pathogene Gruppen. Da der molekulare Pathomechanismus zurzeit weitgehend ungeklärt ist, wird die Pathogenität neuer Sequenzänderungen aufgrund bereits bekannter Mutationen eingestuft. Es wurde daher eine öffentlich zugängliche VMD2 Mutationsdatenbank eingerichtet (http://www.uni-wuerzburg.de/humangenetics/vmd2.html), in der die wachsende Zahl an Mutationen, Sequenzvarianten und Polymorphismen gesammelt und verwaltet wird. „Missense“ Mutationen können die Proteinfunktion auf verschiedene Weise beeinträchtigen. Geeignete molekulare Assays wurden daher etabliert, um die funkionellen Auswirkungen der VMD2 Mutationen in Hinblick auf die intrazelluläre Lokalisation zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein heterologes COS7 Expressionssystem entwickelt, es wurden verschiedene Mutationen mittels „site-directed mutagenesis“ generiert sowie Bestrophin-spezifische Antikörper hergestellt. Überraschenderweise konnte anhand von Membranfraktionierungs- und Westernblot-Analysen keine signifikanten quantitativen Unterschiede zwischen intakten und mutierten Bestrophin nachgewiesen werden. Unabhängig von Art oder Position der Mutation konnte der Einbau von mutiertem Bestrophin in die Membran gezeigt werden. Die Experimente deuten erstmalig darauf hin daß eine fehlerhafte Membranintegration als kausaler krankheitsverursachender Mechanismus ausgeschlossen werden kann. Dies liegt in Übereinstimmung mit dem dominant-negativen Effekt der Mutationen. In einem alternativen Ansatz wurde die VMD2 RFP-TM Proteinfamilie im Mausgenom identifiziert und charakterisiert. Während die Aufklärung der genomischen Struktur des Vmd2 Gens die Grundlage zur Herstellung Vmd2 transgener Mäuse darstellte (siehe unten), gewährte die Charakterisierung der eng verwandten Vmd2L1-L3 Mausgene weitere Einblicke in die Funktion des Bestrophins. Hierzu wurden bioinformatische sowie RT PCR Analysen durchgeführt. Darüber hinaus wurde die präferientielle Expression der jeweiligen Transkripte in Testis, Kolon und Skelettmuskel sowie Augengewebe anhand von „real-time quantitative“ RT PCR nachgewiesen. Interessanterweise stellt Vmd2L2 wahrscheinlich ein funktionell inaktives Pseudogen dar. Ähnlich wie sein humanes Gegenstück wird das Maus Vmd2L3- Transkript auf mRNA Ebene differentiell prozessiert. Mausmodelle für Morbus Best stellen grundlegende Hilfsmittel dar, die Pathophysiology von Bestrophin in vivo zu untersuchen. Es wurde die Herstellung zweier verschiedener Mauslinien initiiert: zum einen ein Vmd2-defizientes „knock-out“ Modell, zum anderen eine „knock-in“ Maus, die eine humane krankheitsassoziierte Mutation (Tyr227Asn) im mausorthologen Gen trägt. Die entsprechenden Konstrukte wurden hergestellt und in ES Zellen eingeschleust. Ausgehend von bislang vier isolierten ES Klonen, die den Vmd2+/- Genotyp tragen, können nun in nachfolgenden Schritten chimäre Tiere generiert werden. Die resultierenden Mauslinien repräsentieren neue experimentelle Ansätze, die funktionelle Rolle des Bestrophins in Morbus Best sowie in der Entwicklung und Physiologie des RPEs aufzukären. KW - Best-Krankheit KW - Genmutation KW - Morbus Best KW - BMD KW - VMD2 KW - Makuladegeneration KW - Mausmodell KW - Best Disease KW - BMD KW - VMD2 KW - macular degeneration KW - mouse model Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5761 ER - TY - THES A1 - Weindl, Katharina T1 - Langzeitergebnisse der Ranibizumabtherapie der altersabhängigen feuchten Makuladegeneration T1 - Long-term results of ranibizumab treatment for wet age-related macular degeneration N2 - Hintergrund In einer retrospektiven Studie in der Augenklinik Würzburg wurde die Ranibizumabtherapie bei Patienten mit altersabhängiger Makuladegeneration (AMD) im klinischen Alltag ausgewertet. Methoden Patientenakten von Patienten mit AMD, die im Jahr 2007 mit der Ranibizumabtherapie begannen, wurden untersucht. Daten wurden bis zum Ende der Behandlung und/oder Nachbeobachtung bis 2009 gesammelt. Der primäre Endpunkt war das Verhältnis der Patienten, die weniger als 15 Buchstaben (bzw. 0,3 logMAR Einheiten) an Visus verloren zwischen Beginn und nach 12 Monaten. Ergebnisse 375 Patienten wurden einbezogen, nur 298 Patienten beendeten die Untersuchung nach einem Jahr. Nach 12 Monaten verloren 72% der Patienten weniger als 15 Buchstaben. Die Sehschärfe verbesserte sich bis 12 Wochen nach der ersten Injektion und verschlechterte sich danach wieder. Patienten mit mehr als 3 Injektionen profitierten mehr als Patienten mit weniger Injektionen. Durchschnittlich wurden 4,25 Injektionen innerhalb eines Jahres gegeben. Der durchschnittliche Rückgang der Netzhautdicke betrug 50 µm. Schlussfolgerung Intravitreale Injektionen von Ranibizumab in der Augenklinik Würzburg führten zu einer Visusverbesserung. Der Visusgewinn konnte nach 3 Monaten nicht gehalten werden. Bessere Reinjektionskriterien, mehr OCT Untersuchungen und besseres Nachsorgemanagement sollten entwickelt werden. N2 - Background Real-life ranibizumab therapy used in patients with wet age related macular degeneration (AMD) was assessed in a retrospective study in Augenklinik Würzburg Methods Medical records of patients with AMD, who started ranibizumab treatment in 2007, were evaluated. Data were collected until the end of treatment and/or monitoring until 2009. The primary end point was the proportion of patients losing fewer than 15 letters (0,3 logMAR units) from baseline visual acuity at 12 months. Results 375 patients were included, only 298 patients finished one-year examination. At 12 months 72% of the patients lost fewer than 15 letters. Visual acuity improved until 12 weeks after first injection and was not maintained afterwards. Patients with more than 3 Injections profited more than patients with less injections. In average, there were 4,25 injections given in one year. The average decrease in retinal thickness was 50µm. Conclusions Intravitreal administration of ranibizumab in Augenklinik Würzburg improved vision acuity. The vision gain was not maintained after 3 months. Criteria for reinjection, more oct examinations and better control management must be developed. KW - Makuladegeneration KW - Vascular endothelial Growth Factor KW - Macula lutea KW - Ranibizumab KW - ranibizumab Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-180178 ER - TY - THES A1 - Mlynski, Juliane T1 - Klassifikation von Frühstadien der trockenen Makuladegeneration mittels Fundusautofluoreszenz T1 - Classification of early Stages of Macular Degeneration using Fundus Autofluorescence N2 - Es wird eine Beschreibung und Klassifikation der verschiedenen AF Muster bei Augen mit einem Frühstadium der AMD vorgestellt. Definierte Phänotypen ermöglichen eine Identifizierung spezifischer Risikoeigenschaften, sodass betroffene Patienten individuell betreut und Therapien geplant werden können. Die Arbeit dient als Grundlage für weitere klinisch-genetische AMD-Studien mit AF-Bildgebung zur Erhebung einer standardisierten Nomenklatur. N2 - This dissertation describes and classifies various autofluorescence patterns in eyes with early stages of age-related macular degeneration. Defined phenotypes allow an identification of specific risk factors, facilitating the individual care and treatment planning of patients with early stages of age-related macular degeneration. KW - Fundusautofluoreszenz KW - Makuladegeneration KW - Klassifikation KW - Fundus Autofluorescence KW - Macular Degeneration KW - Classification Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69245 ER - TY - THES A1 - Menger, Johannes T1 - Einfluss von Risikofaktoren auf den Behandlungserfolg von VEGF-Inhibitoren bei altersabhängiger Makuladegeneration T1 - Influence Of AMD-Risk Factors On The Effectiveness Of Anti-VEGF Therapy N2 - Hintergrund: In dieser retrospektiven Studie soll der Einfluss von Rauchen, Alter und systemischer Medikation auf den Behandlungserfolg einer Anti-VEGF Therapie bei altersbedingter Makuladegeneration (AMD) über einen Zeitraum von 24 Monaten untersucht werden. Patienten und Methode: 100 Patienten mit choroidalen Neovaskularisationen bei AMD wurden in die Studie eingeschlossen. Best korrigierter Visus (BV), Anzahl der Injektionen in 24 Monaten sowie Rauchgewohnheiten und systemische Medikation wurden für die Analysen berücksichtigt. Ausschlusskriterium war ein BV < 0,1 zu Beginn der Behandlung. Resultate: 42 Raucher (inkl. 31 Exraucher) mit 23,5 Packyears (Py) im Median wurden identifiziert. Je mehr Py ein Patient rauchte, umso niedriger war sein BV nach der letzten Injektion (p = 0,009). Je mehr Zigaretten pro Tag ein Raucher rauchte, umso mehr Injektionen erhielt er in 24 Monaten (p = 0,0042). Bluthochdruckpatienten hatten einen niedrigeren BV nach der letzten Injektion (p = 0,045). Schlussfolgerungen Rauchen ist nicht nur ein Risikofaktor für die Entwicklung einer AMD, sondern auch für die Effektivität der Anti-VEGF Therapie. Auch unter sozioökonomischen Gesichtspunkten ist dies ein weiterer Grund, Patienten zur Aufgabe des Rauchens aufzufordern. N2 - Background: To investigate the influence of smoking, age and systemic medication on the effectiveness of an anti-VEGF therapy in patients with exsudative age-related macular degeneration (AMD). Patients and methods: A total of 100 patients were included in the retrospective analysis. Data included best-corrected visual acuity (BCVA) and number of injections in 24 months. Subjects with BCVA < 0.1 at baseline were rejected. All patients were interviewed about smoking habits and current systemic medication. Results: The study comprised 42 smokers (including 31 past-smokers) with a median of 23.5 packyears (py). The more py a patient had smoked, the lower BCVA was after the last injection (p = 0.009). The more cigarettes per day a smoker had smoked the more injections he had received (p = 0.0042). Patients with arterial hypertension had a lower BCVA after the last injection (p = 0.045). Conclusions: Smoking is not only a risk factor for the development of AMD but also for the effectiveness of an anti-VEGF treatment. Also from a socio-economic point of view AMD patients should be instructed to quit smoking. KW - Augenheilkunde KW - Makuladegeneration KW - Vascular endothelial Growth Factor KW - Rauchen KW - Risikofaktor KW - PRN-Schema Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-110935 ER - TY - THES A1 - Ziegler, Susanne T1 - Die altersabhängige Makuladegeneration : Untersuchung zur genetischen Assoziation des Apolipoproteins E und des Alpha-2-Makroglobulins T1 - Analysis of genetic association of apolipoprotein E and alpha-2-macroglobulin with age-related macular degeneration N2 - Die Arbeit dient der Aufklärung genetischer Ursachen der altersabhängigen Makuladegeneration (AMD) – einer komplexen Erkrankung mit bisher unklarer Ätiologie. Ziel der Arbeit war die Untersuchung einer möglichen Assoziation der AMD mit Polymorphismen in den Genen für Apolipoprotein E (ApoE) und Alpha-2-Makroglobulin. Voraussetzung für diese Arbeit waren Studien von Klaver et al. (1998) und Souied et al. (1998). Beide Studien belegen die Assoziation eines ApoE-Polymorphismus, dem ApoE-4-Allel, mit der AMD im Sinne eines protektiven Faktors: Bei den untersuchten AMD-Patienten war die Häufigkeit des ApoE-4-Allels signifikant geringer als in den Kontrollgruppen. Diese Assoziation sollte in der vorliegenden Arbeit an einem neuen und größeren Patientenkollektiv untersucht werden. Das ApoE-4-Allel ist ein Risikofaktor für Morbus Alzheimer (Corder et al, 1993). Wie AMD ist die Alzheimer Erkrankung eine neurodegenerative Erkrankung des Alters mit komplexer Ätiologie und Pathogenese. Deshalb wurde folgende Hypothese aufgestellt: Wenn das ApoE-4-Allel sowohl mit Morbus Alzheimer als auch mit der AMD assoziiert ist, sind möglicherweise auch andere, mit Morbus Alzheimer assoziierte Polymorphismen an den pathogenetischen Vorgängen der AMD beteiligt. Ausgehend von dieser Überlegung wurden neben den ApoE-Polymorphismen zwei häufige Polymorphismen eines weiteren Risikofaktors für Alzheimer untersucht: das Alpha-2-Makroglobulin (A2M). Die in den Studien vorbeschriebene, signifikant geringere Häufigkeit des ApoE-4-Allels bei AMD-Patienten konnte am vorliegenden Patientenkollektiv nicht nachvollzogen werden. Die ApoE-4-Allelfrequenz betrug in der Gruppe der AMD-Patienten 9,5% und in der Gruppe der altersgemäßen Kontrollpersonen ebenfalls 9,5% (p=0,998). Ein signifikantes Ergebnis brachte der Vergleich der ApoE-4-Allelhäufigkeit bei AMD-Patienten mit der Häufigkeit in der Gruppe „Normalbevölkerung“, die sich durch ein geringeres Durchschnittsalter auszeichnet (p= 0,001; Altersdurchschnitt 82,3 vs. 39,8 Jahre). Hier liegt aber vermutlich ein „selection bias“ zugrunde. Eine von Schachter et al. (1994) veröffentlichte Studie belegt die generelle Abnahme der Häufigkeit des ApoE-4-Allels in höheren Altersgruppen. Die Untersuchung der beiden A2M-Polymorphismen ergab keinen Hinweis auf eine mögliche Assoziation mit der AMD. Weder die A2M-Allelverteilung (p=0,649) noch die Verteilung der Genotypen (p=0,1) zeigte signifikante Unterschiede. Der Vergleich der Ergebnisse mit den bisher publizierten Studien zur Assoziation des ApoE-4-Allels mit der AMD ergibt ein widersprüchliches Bild. Obwohl die Studien von Klaver et al. (1998) und Souied et al. (1998) eine Assoziation des ApoE-4-Allels mit der AMD nachweisen, ist die Häufigkeitsverteilung des Allels in vier nachfolgenden Assoziationsstudien (Schmidt et al., 2000; Pang et al., 2000; Simonelli et al., 2001; Schultz et al. 2003) sowie in der vorliegenden Arbeit nicht signifikant. Allerdings belegen auch neuere Studien eindeutig eine Assoziation des Allels mit der AMD (Baird et al., 2004; Zareparsi et al., 2004). Möglicherweise stellt das ApoE-4-Allel einen protektiven Faktor dar, der Effekt ist aber in verschiedenen Populationen unterschiedlich stark ausgeprägt. Für Populationen mit schwächerer Ausprägung sind vermutlich große Studien¬gruppen notwendig, um bei einer Assoziationsstudie signifikante Frequenzunterschiede zu erhalten. Weiterhin könnte die Heterogenität der AMD ein Problem bei Assoziationsstudien darstellen. Denkbar wäre, dass unterschiedliche Formen der AMD auch mit unterschiedlichen genetischen Risikokonstellationen assoziiert sind. Eine mögliche Assoziation mit einem Polymorphismus würde in einem großen Patientenkollektiv, das unterschiedliche Formen der AMD enthält, statistisch nicht auffallen. Erst Untersuchungen an ausgewählten Patientengruppen, die nur einen streng definierten Phänotyp enthalten, würden den Effekt sichtbar machen. Einen Beleg hierfür bietet die Studie von Souied et al. (1998), die sich auf die exsudative Form der AMD beschränkt und eine deutlich signifikante Assoziation dieses Phänotyps mit dem ApoE-4-Allel nachweist. Der Aussagewert der bisher durchgeführten Studien zur Assoziation des ApoE-4-Allels mit der AMD ist noch begrenzt. Dennoch können Assoziationsstudien dazu beitragen, die genetischen Ursachen der AMD zu entschlüsseln und damit die Grundlage für neue Therapieansätze schaffen. Eine erfolgversprechende Strategie für zukünftige Assoziationsstudien ist sicherlich die Untersuchung an zahlenmäßig adäquaten und klinisch klar definierten Patientengruppen sowie einwandfreien, altersgemäßen Kontrollpersonen. N2 - Age-related macular degeneration (AMD) is the most common geriatric eye disorder in developed countries with almost 8 million affected individuals worldwide. AMD is characterized by pathologic changes in the central retina involving the choriocapillaris, Bruchs membrane, the retinal pigment epithelium and the neurosensory retina. Although exogenous as well as genetic factors have been implicated in the etiology of AMD, little is known about the basic mechanisms underlying this neurodegenerative disorder. Both apolipoprotein E (APOE), a major lipoprotein of the central nervous system, and alpha-2-macroglobulin (A2M), a serum protease inhibitor, have been associated with increased risk for several neurodegenerative conditions, in particular Alzheimer disease (AD). In contrast to its role in AD, some studies have associated the APOE4 allele with a decreased risk for AMD (Klaver et al., 1998; Souied et al., 1998). To further assess a possible association between AMD and APOE/A2M we analyzed the allele frequencies of the three alleles (APOE2, APOE3, APOE4) of the APOE gene as well as the two allele insertion/deletion polymorphism in the acceptor splice site of exon 18 of A2M in a sample of 400 AMD patients and 153 age-matched controls and 200 population-based controls. Our results show that the A2M-1/A2M-2 allele frequency in the AMD group is not significantly different from the controls (p=0,649). In addition, the reported association of the APOE4 allele with decreased risk was not confirmed in our study (frequency of APOE4 in patients vs.age-matched controls was 0,09 vs. 0,09; p=0,998). In conclusion, our results do not provide genetic support for a direct or indirect role of APOE or A2M in the development of AMD. KW - AMD KW - altersabhängig KW - Makuladegeneration KW - Assoziation KW - Apolipoprotein KW - age-related KW - macular KW - degeneration KW - association Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15472 ER - TY - THES A1 - Willmann, Lukas T1 - Altersabhängige Makuladegeneration - Regeneration des retinalen Pigmentepithels durch Anregung zur Proliferation durch den Transkriptionsfaktor E2F2 T1 - Age-related macular degeneration - regeneration of retinal pigment epithelium by stimulation of proliferation by transcription factor E2F2 N2 - Altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist weltweit die häufigste Ursache von irreversibler Erblindung des alternden Menschen. Mit der anti-VEGF-Behandlung steht für die deutlich seltenere feuchte AMD eine zugelassene Therapie bereit, die deutlich häufigere trockene AMD entzieht sich aktuell jedoch jeglicher Therapie. Ein zentraler Pathomechanismus der AMD ist der progrediente Untergang des retinalen Pigmentepithels (RPE). Die Rarifizierung und letztendlich Atrophie des RPEs führt zum Untergang der funktionellen Einheit aus RPE, Photorezeptoren und Bruch’scher Membran und somit zum irreversiblen Funktionsverlust. Ein möglicher therapeutischer Ansatz, der progredienten Atrophie des RPEs entgegenzuwirken, ist, das prinzipiell post- mitotischen RPE zur Proliferation anzuregen. Grundlage unserer in vitro Untersuchungen ist das ARPE-19 Zellmodell. Um die Proliferation anzuregen wurden die RPE-Zellen mit E2F2, einem Zellzyklus- regulierendem Transkriptionsfaktor, transfiziert. Zunächst wurde ein nicht-proliferatives RPE-Zellmodell mit spontanem Wachstumsarrest etabliert. Innerhalb von zwei Wochen konnte die Ausbildung von Zonulae occludentes als Zeichen der Integrität des adhärenten Zellmonolayers beobachtet werden. Die chemische Transfektion von E2F2 unter einem CMV-Promoter führte zur Überexpression von E2F2-Protein. Der proliferationssteigernde Effekt von E2F2 konnte durch die Proliferationsmarker Cyclin D1 sowie Ki67, dem Anstieg der BrdU-Aufnahme und der nach Transfektion mit E2F2 zunehmenden Gesamtzellzahl nachgewiesen werden. Der Zellzahlerhöhung standen jedoch potentiell qualitative und funktionelle Einbußen entgegen. So zeigten sich nach Behandlung mit E2F2 die Zellviabilität reduziert und die Apoptoserate sowie die Permeabilität des Epithels erhöht. Diese Einschränkungen waren jedoch nur passager bis 7 Tage nach Transfektion sichtbar und reversibel. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass diese Defizite nicht durch E2F2 selbst, sondern durch das Transfektionsreagenz PEI bedingt waren. Weitere funktionelle Defizite könnten durch epithelial-mesenchymale Transition (EMT) verursacht werden. Hier zeigte sich durch E2F2 keine De-Differenzierung im Sinne einer typischen EMT-Marker- Expression. Die vorliegende Arbeit zeigt in einem in vitro Zellmodell die Grundlagen eines vielversprechenden Ansatzes zur Therapie der trockenen AMD: Durch Überexpression eines den Zellzyklus regulierenden Gens (hier E2F2) wurde die RPE-Regeneration angeregt. Analog zur schon zugelassenen Gentherapie des RPEs bei RPE65-assoziierten Netzhautdystrophien durch den Transfer von funktionstüchtigem RPE65-Gen mittels Adeno-assoziierten Viren könnte mittels E2F2, übertragen mit einem lentiviralen Verktor, eine Stimulation des RPEs zur Proliferation möglich sein. Entscheidend ist der möglichst gute Struktur- und Funktionserhalt des Photorezeptor-Bruch-Membran-RPE Komplexes. Eine Therapie sollte daher in frühen Krankheitsstadien erfolgen, um die Progression zu fortgeschrittenen Erkrankungsstadien mit irreversiblem Funktionsverlust zu verzögern oder zu verhindern. N2 - Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of irreversible blindness in the ageing population worldwide. While for wet AMD an approved therapy is available in form of anti-VEGF treatment, the by far more common dry AMD is currently outside the scope of any therapy. A central pathomechanism of AMD is the progressive degeneration of the retinal pigment epithelium (RPE). Rarefication and finally atrophy of the RPE leads to the collapse of the functional unit consisting of RPE, photoreceptors and Bruch’s membrane, resulting in irreversible loss of function. A possible therapeutic strategy to prevent RPE atrophy is to stimulate the post-mitotic RPE to proliferate. The basis of our in vitro investigations is an ARPE-19 cell culture model. To stimulate proliferation, the RPE cells were transfected with E2F2, a cell cycle regulating transcription factor. First, a non-proliferative RPE cell model with spontaneous growth arrest was established. Within two weeks, the formation of zonulae occludentes was observed as a sign of the integrity of the adherent cell monolayer. Chemical transfection of E2F2 under a CMV promoter led to overexpression of E2F2 protein. The proliferation enhancing effect of E2F2 was demonstrated by proliferation markers cyclin D1 and Ki67, the increase in BrdU uptake, and the increase in total cell number after transfection with E2F2. However, the increase in cell proliferation was potentially offset by qualitative and functional losses. After treatment with E2F2, cell viability was reduced, and apoptosis rate and permeability of the epithelium were increased. These shortcomings were only temporarily detectable up to 7 days after transfection and were reversible. Our results suggest that these deficits were not caused by E2F2 itself, but by the transfection reagent PEI. Further functional deficits could be caused by epithelial-mesenchymal transition (EMT). Here, E2F2 did not show any de-differentiation in the form of typical EMT marker expression. The present study shows the basics of a promising approach for the therapy of dry AMD in an in vitro cell model: RPE regeneration was stimulated by overexpression of a gene regulating the cell cycle (here E2F2). Analogous to approved gene therapy of the RPE for RPE65-associated retinal dystrophies through transfer of functional RPE gene by adeno-associated viruses, a lentiviral vector delivering E2F2 could stimulate the RPE to proliferate. It is essential to preserve the structure and function of the photoreceptor-Bruch's membrane-RPE complex. Therapy therefore needs to take place in early stages of the disease to prevent or slow down progression to advanced stages with irreversible loss of function. KW - Netzhaut KW - Senile Makuladegeneration KW - In vitro KW - Regeneration KW - Makuladegeneration KW - E2F2 KW - transcription factor KW - RPE KW - retinal pigment epithelium KW - retina KW - Transkriptionsfaktor Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-291833 ER -